CN109970853A - 寨卡病毒的纳米抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
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    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®

Abstract

本发明涉及生物纳米材料技术领域，具体涉及寨卡病毒的纳米抗体及其制备方法和应用，利用寨卡病毒的病毒颗粒，免疫羊驼，然后通过克隆，再将克隆得到的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，经过亲和淘选的方式选择亲和力较高的，最后进行单克隆ELISA的鉴定，之后抗体的表达纯化，得到寨卡病毒的纳米抗体。本发明提供的寨卡病毒的纳米抗体，利用免疫羊驼，再结合噬菌体展示技术，得到纳米抗体，不仅能够在原核或真核系统中高表达，而且特异性强，亲和力高，更加适合寨卡病毒的特异性血清学检测。

Description

寨卡病毒的纳米抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物纳米材料技术领域，具体涉及寨卡病毒的纳米抗体及其制备方法和应用。
背景技术
寨卡病毒的血清学检测，可以利用寨卡病毒的抗体检测。但现在市面上的一般都是利用免疫小鼠或者兔子得到的抗体(多克隆抗体)，或者利用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，该类抗体的存在分子量大、亲和力较弱等特点。
发明内容
本发明旨在提供一种寨卡病毒的纳米抗体及其制备方法，解决寨卡病毒的酶联免疫检测的灵敏度问题，以实现在献血人群中进行寨卡病毒的血清学检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
寨卡病毒的纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)制备寨卡病毒颗粒：利用A549细胞系培养寨卡病毒，然后收集上清，通过密度梯度离心得到寨卡病毒颗粒，浓度为1mg/ml；
2)羊驼免疫：首次免疫将1mg Zika抗原与CFA开乳化后，后皮下多点注射；其次加强免疫将0.5mg Zika抗原与IFA乳化后，后皮下多点注射；最终免疫将0.5mg Zika抗原与IFA乳化后，后皮下多点注射，之后进行血清学效价验证；
3)目的片段克隆：首先分离血液中的外周淋巴细胞，然后进行RNA的提取，逆转率以及两轮的巢式PCR，最后将PCR产物连接到pComb3XSS噬菌粒载体上，之后进行电转化到大肠杆菌中，经测序验证正确后用于后面的相关筛选；
4)亲和淘选：将靶分子Zika用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为10μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，每个靶分子包被2孔，4℃包被12小时；
弃包被液，PBS洗涤3次，每孔加入300μL 3％BSA-PBS封闭液，37℃封闭1h；PBS洗涤3次，加入100μL噬菌体文库，37℃孵育1h；吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤6次，PBS洗涤2次；加入100μL Gly-HCl洗脱液，37℃孵育8min，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至1.5mL无菌离心管中，迅速用15μLTris-HCl中和缓冲液中和；取10μL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选，改变淘选条件；
淘选条件如下：
5)淘选后的文库扩增：将淘选洗脱物与处于对数生长前期的E.coli TG1培养物20mL混匀，37℃，静置30min；加入1mL 20％葡萄糖和4μL Amp+，37℃，180r/min振荡培养30min；按cell：phage＝1：20的比例加入M13K07噬菌体，37℃，静置30min后，补加20mL 2×YT，37℃，180r/min振荡培养30min；将培养物分装于离心管中，25℃，5000r/min离心10min，细胞沉淀以50mL 2×YT-AK液体培养基重悬，30℃，230r/min振荡培养12小时；将培养物4℃，10000r/min离心20min，将上清转移至新离心管，加入1/5体积的PEG/NaCl，混匀后置于4℃中2h；4℃，10000r/min离心20min，去除上清，将沉淀重悬于1mL PBS中，加入1/5体积的PEG/NaCl，混匀后置于4℃中1h；4℃，10000r/min离心20min，去除上清，将沉淀悬浮于200μLPBS中，即为扩增产物，测定滴度。
由于羊驼产生的抗体天然缺失轻链，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位，分子量只有15KD，因此也被成为纳米抗体。
本发明制备寨卡病毒的纳米抗体的方法，利用寨卡病毒的病毒颗粒，免疫羊驼，然后通过克隆，再将克隆得到的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，经过亲和淘选的方式选择亲和力较高的，最后进行单克隆ELISA的鉴定，之后抗体的表达纯化，得到寨卡病毒的纳米抗体。
本发明提供的寨卡病毒的纳米抗体，利用免疫羊驼，再结合噬菌体展示技术，得到纳米抗体，不仅能够在原核或真核系统中高表达，而且特异性强，亲和力高，更加适合寨卡病毒的特异性血清学检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此：
1)制备寨卡病毒颗粒：利用A549细胞系培养寨卡病毒，然后收集上清，通过密度梯度离心得到寨卡病毒颗粒，浓度为1mg/ml；
2)羊驼免疫：首次免疫将1mg Zika抗原与CFA开乳化后，后皮下多点注射；其次加强免疫将0.5mg Zika抗原与IFA乳化后，后皮下多点注射；最终免疫将0.5mg Zika抗原与IFA乳化后，后皮下多点注射，之后进行血清学效价验证；
3)目的片段克隆：首先分离血液中的外周淋巴细胞，然后进行RNA的提取，逆转率以及两轮的巢式PCR，最后将PCR产物连接到pComb3XSS噬菌粒载体上，之后进行电转化到大肠杆菌中，经测序验证正确后用于后面的相关筛选；
4)亲和淘选：将靶分子Zika用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为10μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，每个靶分子包被2孔，4℃包被12小时；
弃包被液，PBS洗涤3次，每孔加入300μL 3％BSA-PBS封闭液，37℃封闭1h；PBS洗涤3次，加入100μL噬菌体文库，37℃孵育1h；吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤6次，PBS洗涤2次；加入100μL Gly-HCl洗脱液，37℃孵育8min，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至1.5mL无菌离心管中，迅速用15μLTris-HCl中和缓冲液中和；取10μL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选，改变淘选条件；
淘选条件如下：
5)淘选后的文库扩增：将淘选洗脱物与处于对数生长前期的E.coli TG1培养物20mL混匀，37℃，静置30min；加入1mL 20％葡萄糖和4μL Amp+，37℃，180r/min振荡培养30min；按cell：phage＝1：20的比例加入M13K07噬菌体，37℃，静置30min后，补加20mL 2×YT，37℃，180r/min振荡培养30min；将培养物分装于离心管中，25℃，5000r/min离心10min，细胞沉淀以50mL 2×YT-AK液体培养基重悬，30℃，230r/min振荡培养12小时；将培养物4℃，10000r/min离心20min，将上清转移至新离心管，加入1/5体积的PEG/NaCl，混匀后置于4℃中2h；4℃，10000r/min离心20min，去除上清，将沉淀重悬于1mL PBS中，加入1/5体积的PEG/NaCl，混匀后置于4℃中1h；4℃，10000r/min离心20min，去除上清，将沉淀悬浮于200μLPBS中，即为扩增产物，测定滴度。
单克隆ELISA鉴定：以Zika抗原为靶分子，采用Gly-HCl酸洗脱方法，洗脱特异噬菌体。从第一轮和第二轮滴度测定平板随机各挑选24个克隆(第一轮滴度平板上挑选克隆编号25-48，第二轮滴度平板上挑选克隆编号1-24)，采用间接ELISA筛选阳性克隆。

Claims (4)

1.寨卡病毒的纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备寨卡病毒颗粒：利用A549细胞系培养寨卡病毒，然后收集上清，通过密度梯度离心得到寨卡病毒颗粒，浓度为1mg/ml；
2)羊驼免疫：首次免疫将1mg Zika抗原与CFA开乳化后，后皮下多点注射；其次加强免疫将0.5mg Zika抗原与IFA乳化后，后皮下多点注射；最终免疫将0.5mg Zika抗原与IFA乳化后，后皮下多点注射，之后进行血清学效价验证；
3)目的片段克隆：首先分离血液中的外周淋巴细胞，然后进行RNA的提取，逆转率以及两轮的巢式PCR，最后将PCR产物连接到pComb3XSS噬菌粒载体上，之后进行电转化到大肠杆菌中，经测序验证正确后用于后面的相关筛选；
4)亲和淘选：将靶分子Zika用pH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为10μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，每个靶分子包被2孔，4℃包被12小时；
弃包被液，PBS洗涤3次，每孔加入300μL3％BSA-PBS封闭液，37℃封闭1h；PBS洗涤3次，加入100μL噬菌体文库，37℃孵育1h；吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤6次，PBS洗涤2次；加入100μL Gly-HCl洗脱液，37℃孵育8min，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至1.5mL无菌离心管中，迅速用15μLTris-HCl中和缓冲液中和；取10μL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选，改变淘选条件，一共进行三轮筛选；
5)淘选后的文库扩增：将淘选洗脱物与处于对数生长前期的E.coli TG1培养物20mL混匀，37℃，静置30min；加入1mL20％葡萄糖和4μL Amp+，37℃，180r/min振荡培养30min；按cell：phage＝1：20的比例加入M13K07噬菌体，37℃，静置30min后，补加20mL2×YT，37℃，180r/min振荡培养30min；将培养物分装于离心管中，25℃，5000r/min离心10min，细胞沉淀以50mL2×YT-AK液体培养基重悬，30℃，230r/min振荡培养12小时；将培养物4℃，10000r/min离心20min，将上清转移至新离心管，加入1/5体积的PEG/NaCl，混匀后置于4℃中2h；4℃，10000r/min离心20min，去除上清，将沉淀重悬于1mL PBS中，加入1/5体积的PEG/NaCl，混匀后置于4℃中1h；4℃，10000r/min离心20min，去除上清，将沉淀悬浮于200μL PBS中，即得到纳米抗体。
2.根据权利要求1所述的寨卡病毒的纳米抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)的淘选条件如下：
3.寨卡病毒的纳米抗体，其特征在于，根据权利要求1或2制备方法所得。
4.根据权利要求3所述的寨卡病毒的纳米抗体的应用，其特征在于，用于寨卡病毒的血清学检测。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112812180A (zh) * 2021-02-07 2021-05-18 佛山科学技术学院 一种bax纳米抗体库及其制备方法与应用
CN116063469A (zh) * 2022-08-29 2023-05-05 中山大学 一种寨卡病毒中和性纳米抗体及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105037547A (zh) * 2015-07-21 2015-11-11 南昌大佳科技有限公司 基于afp抗原的afp纳米抗体a18
US20170298119A1 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Visterra, Inc. Antibody molecules to zika virus and uses thereof
CN109160948A (zh) * 2018-09-21 2019-01-08 成都阿帕克生物科技有限公司 一种乙肝表面抗原纳米抗体及核酸分子和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105037547A (zh) * 2015-07-21 2015-11-11 南昌大佳科技有限公司 基于afp抗原的afp纳米抗体a18
US20170298119A1 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 Visterra, Inc. Antibody molecules to zika virus and uses thereof
CN109160948A (zh) * 2018-09-21 2019-01-08 成都阿帕克生物科技有限公司 一种乙肝表面抗原纳米抗体及核酸分子和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
丁金花等: "牛病毒性腹泻病毒纳米抗体文库构建与筛选", 《动物医学进展》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112812180A (zh) * 2021-02-07 2021-05-18 佛山科学技术学院 一种bax纳米抗体库及其制备方法与应用
CN112812180B (zh) * 2021-02-07 2023-02-28 佛山科学技术学院 一种bax纳米抗体库及其制备方法与应用
CN116063469A (zh) * 2022-08-29 2023-05-05 中山大学 一种寨卡病毒中和性纳米抗体及其制备方法与应用
CN116063469B (zh) * 2022-08-29 2023-09-22 中山大学 一种寨卡病毒中和性纳米抗体及其制备方法与应用

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