CN109486819A - 木薯u6启动子基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了3个木薯U6启动子基因及应用，该3个启动子序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，通过GUS染色瞬时表达验证，能高效的在木薯上表达。在转基因技术领域，这些启动子不仅适用于木薯，除用于启动功能基因表达外，在构建RNAi表达载体时可用于启动发夹结构的表达，在CRISPR/Cas9系统中可用于启动sgRNA引导序列的表达等。

Description

木薯U6启动子基因及应用

技术领域

本发明属生物技术领域，特别是植物转基因技术领域，具体涉及木薯U6启动子的克隆和应用。

背景技术

木薯(Manihot esculenta Crantz)属大戟科(Euphorbiaceae)木薯属(ManihotP.Mill.)植物，是世界三大薯类(木薯、甘薯和木薯)作物之一，同时也是热带地区继水稻、玉米、高粱之后的第四大粮食作物，是热带和亚热带地区重要的热能来源，为世界上近6亿人提供食物。木薯广泛分布于全球南、北纬30°之间的热带及部分亚热带地区。我国木薯主产区有海南、广东、广西、福建、云南，在四川、贵州、湖南、江西、浙江等地也有种植。木薯对光、热和水资源的利用非常高，单位面积生物能产量几乎高于其它栽培作物，具有抗旱、耐贫瘠、适应性广以及储藏根(块根)淀粉含量高(占干重的85％)等独特而优良的生物学特性。木薯淀粉是食品加工、工业变性淀粉、饲料和生物质产品(燃料乙醇)的重要原料。木薯已有几千年的栽培历史，因植株基因型高度杂合、基因冗余、花粉育性低、有性子代严重分离等自身特征和种质资源的局限性，其常规育种困难且进展较慢。

近年来，通过转基因途径改良木薯品种获得阶段性进展，例如在降低氰化物、提高块根淀粉含量、改良直(支)淀粉比例以及抗病、耐寒、抗旱转基因育种都取得良好进展。尽管如此，木薯转基因育种仍然存在不少亟待解决的问题。其中，挖掘适合木薯本身的特异启动子。目前广泛用于木薯的启动子是CaMV35s，CaMV35s并不适宜驱动块根基因的表达。虽然已有马铃薯块茎patatin蛋白特意启动子、Pt214等相继用于木薯转化，但相较于水稻、小麦等粮食作物，木薯自身的启动子资源相对匮乏。

U6启动子是二型启动子，与真核生物RNA聚合酶III结合后，负责转录U6RNA，这类启动子的特点是几乎所有启动子元件(除了+1位的转录起点)都位于转录起始位点的上游，也即它对转录起点后的序列无特殊选择或要求，能保证转录序列的结构特征。U6启动子+1位是鸟苷酸。RNA聚合酶III启动子识别的终止信号是连续4-5个胸苷酸，转录产物末端一般有4个尿苷酸。几乎所有的真核生物都具有U6启动子，U6启动子在真核生物体内一般发现是启动小片段，不带PolyA尾的序列，由RNA聚合酶III聚合U6启动子转录产生shRNA，经剪切后产生成熟siRNA，产生干扰效果；shRNA的表达量取决于启动子的强弱，与同类的RNA聚合酶III的启动子H1相比，U6启动子启动能力更强，表达时间也长。

目前，在转基因技术领域，U6启动子多用在构建RNAi表达载体上，用于启动干扰发夹结构的表达；此外，随着基因编辑技术的兴起，U6启动子也被开始广泛用于CRISPR系统中sgRNA引导序列的启动表达，以保证引导序列的结构特征。U6启动子具有种属特异性，在转基因技术中，使用转化物种本身或接近物种的U6启动子能取得更高的的启动效率。前人研究表明，人U6启动子有几个明显的特点：1、具有TATA box，位于-30～-25bp，被Pol III转录；2、在转录起点上游-66～-47bp处存在PSE(proximal sequence element)，该元件是snRNA 激活因子蛋白复合物的结合位点；3、在-244～-214存在DSE(distal sequenceelement)；4、启动子下游存在5'-TTTT-3'序列为Pol III提供转录终止信号；5、PSE和DSE之间的距离变化可显著影响转录效率；6、+1位的G对转录效率影响较大。根据这些特点，在使用U6启动子构建RNAi表达载体时，U6启动子的长度最好在300bp左右，尽量不改变PSE和DSE的间距，同时保留TATA box和+1位的G，在下游应有5'-TTTTT-3'序列作为终止信号。另外可以根据需要在启动子上游或终止信号下游设计测序引物序列、酶切位点等等。

木薯转基因研究对块根、块茎类植物生物技术的研究越来越重要，木薯U6启动子的克隆和应用，必将推进这些植物相关技术领域的研究，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供3个克隆的木薯U6启动子，并将这3个启动子与GUS基因融合表达转化木薯胚性愈伤，通过瞬时表达验证了3个启动子能够在木薯上高效表达，为木薯及相近植物的转化研究提供了高效的启动子序列。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供木薯U6启动子基因，包括3个木薯U6启动子基因，分别具有序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

启动子序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2均来自于木薯Chr_04染色体，启动子序列SEQ ID NO.3来自于Chr_12染色体。

本发明的另一目的在于提供木薯U6启动子基因在转基因技术领域中的应用。

该3个启动子还包括含有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示基因序列的其它序列。

本发明利用snRNA序列在真核生物体内非常保守的序列特征，用拟南芥AtU6启动子的snRNA序列与木薯的基因组序列进行比对，通过比对序列结果设计多对引物，PCR克隆出木薯的3个U6启动子，并构建与GUS基因融合表达载体转化木薯胚性愈伤，GUS染色瞬时表达验证表明，克隆出的3个木薯U6启动子在木薯上具有很强的启动效率，能在木薯上很好的启动GUS基因的表达。

附图说明

图1：从木薯DNA上克隆出3个U6启动子序列；

图2：从木薯N、O、P序列上PCR出构建GUS融合表达载体具有粘性末端的3个U6启动子序列；

图3：用于转化的pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)质粒载体图；

图4：是用于转化的pMaU6N-GUS(MaU6N-HPH)质粒载体图；

图5：是用于转化的pMaU6O-GUS(MaU6O-HPH)质粒载体图；

图6：是用于转化的pMaU6P-GUS(MaU6P-HPH)质粒载体图；

图7：木薯胚性愈伤GUS基因瞬时表达情况。Ubi是对照载体pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)载体，N是pMaU6N-GUS(MaU6N-HPH)载体，O是pMaU6O-GUS(MaU6O-HPH)载体，P是pMaU6P-GUS(MaU6P-HPH)载体CK是空白对照；

图8：各处理均值比较图(5％显著水平)。

具体实施方式

木薯U6启动子的克隆和功能验证方法，其具体步骤如下：

1、利用U6启动子snRNA序列的保守性，在https://phytozome.jgi.doe.gov网站上，利用拟南芥AtU6启动子的snRNA序列(gtcccttcggggacatccgataaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcataaatcgagaaatggtccaaatttt)与木薯的基因组(Manihot esculenta v6.1)序列进行比对(BLAST)。检查比对结果，从中挑选出序列同源性大于95％的位置(Chr_04、Chr_11、Chr_12、Chr_13)，下载这些位置的序列信息，并在http://seqtool.sdsc.edu/CGI/BW.cgi#！网站上对挑选出的序列进行BOXSHADE(盒式)序列分析比对，找到这些启动序列的USE位置和TATA框位置。

2、木薯U6启动子的PCR克隆：在下载的U6启动序列USE和TATA框位置前寻找和设计引物，引物设计参考http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/网站，尽量选择能区别克隆目标启动序列的引物对。然后以木薯华南8号品系DNA为模版，PCR克隆目标启动序列，PCR后跑胶观察，回收通过PCR克隆出的目标条带进行测序比对。最后能克隆出启动子序列，测序后符合预期启动序列的启动子序列位于Chr_04、Chr_12染色体的不同位置上，克隆出启动子序列的位置、引物对及序列大小(见表1，图1)。PCR试剂购于BBI生命科学有限公司，反应条件：95℃5min，94℃30s，53℃45s，72℃1min，32循环，72℃5min，4℃保存。

表1：克隆出木薯3个U6启动子的引物序列及克隆位置与大小

3、木薯U6启动子与GUS基因融合植物表达载体构建：以带GUS基因的pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)质粒(见图2)为骨架质粒(HygR植物筛选基因，KanR菌落筛选基因)，质粒由美国Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P.Brutnell实验室提供；以表1克隆的N、O、P U6启动子序列为模版，设计带骨架质粒GUS基因启动子粘性末端的引物对(见表2)PCR克隆目标启动子序列，通过酶切连接将质粒GUS基因前的ZmUbi启动子替换为克隆的木薯U6启动子，构建木薯U6启动子与GUS基因融合植物表达载体。融合植物表达载体通过DNA测序检测目标启动序列构建情况。PCR使用北京博迈德生物技术有限公司的2×Taq PCRMaster Mix，反应条件：94℃3min，94℃30s，50℃30S，72℃1min，34循环，72℃5min，4℃保存。

表2从CASSAVA 12(N)、CASSAVA 04(O)、CASSAVA 04(P)启动子序列上克隆产物PCR目标启动子序列到GUS基因融合植物表达载体上的引物对

4、木薯U6启动子农杆菌转化验证：将对照质粒pZmUbi-GUS(ZmUbis-HPH)(图3)，木薯U6启动子与GUS基因融合植物表达载体pMaU6N-GUS(MaU6N-HPH)(图4)，pMaU6O-GUS(MaU6O-HPH)(图5)，pMaU6P-GUS(MaU6P-HPH)(图6)转化到农杆菌AGL 1菌株，以木薯幼叶胚性愈伤为转化外植体材料，进行农杆菌转化，共培养5天后取出胚性愈伤进行GUS染色观察，从GUS基因的GUS染色表达情况评估克隆的U6启动子的启动能力和表达活性。GUS染色液按照常规方法配制X-Gluc母液和X-Gluc基液，然后按比例混合后储存于4℃冰箱备用，取用于检测的组织块，加入GUS染色液中37℃过夜染色，倒掉染色液，70％酒精脱色1～3次，95％的酒精脱色1～2次，观察GUS染色情况(见图7)。最后收集胚性愈伤在体视显微镜下观察拍照。同时，取同等重量的每种愈伤GUS染液的蓝色上清液在620nm波长(蓝色上清液的最大吸收波长)处测定光吸收值(见表3)，各处理均值比较见图8。数据、图标处理在Excel 2010下进行，通过Sigma Plot 10.0软件对数据进行统计分析、差异显著性检验和相关性分析。从分析结果可知，目标载体启动子P与Ubi、N、O启动子启动能力差异极显著，启动能力弱于Ubi、N、O启动子，Ubi、N、O启动子间没有极显著差异；O启动子与Ubi启动子在5％和10％显著水平都没有差异，启动能力相当；N启动子与Ubi启动子在5％和10％显著水平都有显著差异，启动能力稍弱；O启动子与N启动子在5％和10％显著水平都没有差异，启动能力稍强。

表3染色液OD620测定

备注：目标载体启动子P与Ubi、N、O启动子启动能力差异极显著，启动能力弱于Ubi、N、O启动子，Ubi、N、O启动子间没有极显著差异；O启动子与Ubi启动子在5％和10％显著水平都没有差异，启动能力相当；N启动子与Ubi启动子在5％和10％显著水平都有显著差异，启动能力稍弱；O启动子与N启动子在5％和10％显著水平都没有差异，启动能力稍强。

本发明第一次克隆了木薯U6启动子，并在木薯上验证了其启动功能，为木薯及相近物种转基因研究提供了很好的启动子工具。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 木薯U6启动子基因及应用

<160> 3

<210> 1

<211> 214

<212> DNA

<213>木薯（Manihot esculenta Crantz）的U6启动子基因序列

<400> 1

TCCCCATTCT TCATCCAACA TTATTCTATA CAAGGCTAAA CAAATATAGC TAGAAATTGG 60

GCCTCATGAT AAATTGGGCT GTAGCCCATA GAGAGTCTAA AACTTGCTAG GTGCAGCCTT 120

GCTAGTGAAC GCGCGTCAGG AGAGAATCAA ATCCCACATC GCTTGATTAC ATGTAATTGG 180

CAGCTTTATA AGAAACCGCG AAGCAGAGGA CAGC 214

<210> 2

<211> 628

<212> DNA

<213> 木薯（Manihot esculenta Crantz）的U6启动子基因序列

<400> 2

CGTTGGAAAA AGAAGCAAGC AATTTGATGG ACCGAAAAAT AATCTAGACC GATGTTGGGC 60

CGAAAATGTA TTTGATTTTG GGCATGAAAG CCCATTAAAT GTCCATCAAA TACATTAGGT 120

AAAATCACAA GTTTGCCTGC TCAGGGTTTG CGTTTCGATT TCACTCCATC CTCAAACAGA 180

TCATACACAT TACACGCAGT ACACACCGTA TTCTCTATTC CTTGTGATGA ATCTTGATGC 240

GTTGGATTCA TCTGATGATC ATGGGATCTC TTTTGTCAAC GGTTAAAACT TATTGTCACT 300

GTACCAATAA CCAGACTCTT CCTACTCAAG GACACACGCA ATCATCTTGA ACAATTGATC 360

AATTGCCCGC CCATATTCAC CTATCGAGTG GGGCCACCTT ATATTACCAC AGACAGGTGT 420

CGCACTTCCA AGCATGATCT ACAGGTCACT GACCCTTGGT TGAGACACAT CATCAGTGGA 480

GGGCCCACGC GTATGGTGTT ATCAAGGTGG CTTAAGATGG CCAGATAGTC AGGTGGTCTG 540

GTTGAAATCA AACTAAAATC TAAACCCACA TCGTTCATTG AGTTCATTAT AATATTCTTT 600

ATAATGCGAA GCGAAATGTG CAACGCTT 628

<210> 3

<211> 484

<212> DNA

<213> 木薯（Manihot esculenta Crantz）的U6启动子基因序列

<400> 3

GCGTTTCGAT TTCACTCCAT CCTCAAACAG ACCATACACG TTACACTCAG TACACACCGT 60

ATTCTCTGTT CCTTGTGATG AATCTTGATG CGATGGGTAA GATTCATCTG ATGATCATGG 120

GATCTCTTTT ATCAACGGTT AAAACTTATT GTCACTGTAC CATTAACCAG ACTCTTCCTA 180

CTCAAGGACA CACGCAATCA TCGTGAACAA TTGATCAATT GCCCACCCAT ATTCACCTAT 240

CGAGTGGAGC CACCTTATAT TACCACAGAC AGGTGTCGCA CTTCCAAGCA TGATCTACAG 300

GTCACTGACC ATTCGTTGAG ACACATCATC AGTGGAGGGC CCACGCGTAT GGTGTTATCA 360

AGGTGGCTTA AGATGGGCAG CTAGTCAGGT GGTCTGGTTG AAATCAAACT AAAATCTAAA 420

CCCACATCGT TCATTGACTT CATTTTAATA TTCTTTATAA TGCGAAGCGA AATATACAAT 480

GCTT 484

Claims (3)

1.木薯U6启动子基因，其特征在于：包括3个木薯U6启动子基因，分别具有序列表中SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的木薯U6启动子基因，其特征在于：启动子序列SEQ ID NO:1、SEQID NO:2均来自于木薯Chr_04染色体，启动子序列SEQ ID NO.3来自于Chr_12染色体。

3.如权利要求1所述的木薯U6启动子基因在转基因技术领域中的应用。