CN102776210B - 猪捷申病毒dbn‑10021株全基因组序列，测定其的引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了猪捷申病毒DBN‑10021株全基因组序列，测定其的引物及其应用。本发明提供的猪捷申病毒DBN‑10021株全基因组序列如SEQ ID No.1所示。本发明的提供用于扩增所述猪捷申病毒DBN‑10021株全基因组序列的引物，其包括序列如SEQ ID No.2~13所示的引物。本发明将病毒基因组序列分为6个片段，用RT‑PCR方法扩增相应的cDNA，可以有效地扩增出目的片段，提供了全基因组序列，有利于研究病毒的分类、进化、致病性及分子流行病学等。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及捷申病毒4型全基因组序列测定方法，具体的说是猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列测定方法。
背景技术
猪捷申病毒（Porcine teschovirus,猪捷申病毒）可引起猪的脑脊髓灰质炎、繁殖障碍、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎、皮肤损伤及无症状等多种临床表现。捷申病毒基因型众多，目前至少存在11个基因型，并且同一基因型的不同分离株的基因组间也存在较大差异。我国许多研究显示，猪群中猪捷申病毒的阳性率比较高，而在我国仅见有关猪捷申病毒2型和猪捷申病毒8型基因组的研究报道，其主要原因在于猪捷申病毒基因组变异大，不易设计引物，直接影响到猪捷申病毒基因组全长序列的测定。
针对上述问题，目前急需一种有效、简单、准确可靠的猪捷申病毒4型全基因组测序方法，并通过该方法得到猪捷申病毒4型的全基因组序列。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供猪捷申病毒（Porcine teschovirus）DBN-10021株全基因组序列，测定其的引物及其应用。
本发明提供的猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列，序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供用于扩增猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列的引物，其包括序列如SEQ ID No.2~13所示的引物。
进一步地，所述的引物还可包括SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的引物。
本发明还提供一种测定扩增猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列的方法，其包括如下步骤：
1）提取猪捷申病毒DBN-10021株RNA，反转录成cDNA；
2）用SEQ ID No.2~15所示引物对全基因组序列进行分段PCR扩增，分别为：SEQ IDNo.2和14扩增后再用SEQ ID No.3和15嵌套扩增；SEQ ID No.4和5；SEQ ID No.6和7；SEQID No.8和9；SEQ ID No.10和11；SEQ ID No.12和13；
3）目的片段回收、连接、转化、阳性菌的鉴定、测序；
4）利用生物软件对所测定的序列进行比对分析、序列拼接，将6个片段首尾相连，得到猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列。
其中，所述PCR反应条件参数为：94℃预变性5min，然后94℃30~60s；50℃30~60s；72℃20s-2min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。
本发明提供的用于测定猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列的引物可以用于制备猪捷申病毒DBN-10021株全基因组测序试剂盒，因此本发明还提供含有所述引物的猪捷申病毒DBN-10021株全基因组测序试剂盒。所述试剂盒还可含有常规的PCR试剂，如Taq酶，dNTPs等。
本发明将病毒基因组序列分为6个片段，用RT-PCR方法扩增相应的cDNA，将扩增片段克隆到T载体进行测序，在扩增中所用的引物是根据猪捷申病毒保守区域的核苷酸序列所设计的，引物3’端尽可能终止在兼并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基尽可能避免终止在氨基酸密码子的第三位碱基上。本发明可以有效地扩增出目的片段，提供了全基因组序列，有利于研究病毒的分类、进化、致病性及分子流行病学等。
本发明的猪捷申病毒DBN-10021株属于猪捷申病毒4型毒株，于2011年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.5573。
附图说明
图1所示为捷申病毒各亚型进化树。
图2所示为扩增片段1~6的琼脂凝胶电泳图片。1~6：表示基因组第1~6段；M1、M2、M3分别表示不同的DNA Marker；N1、N2、N3分别表示阴性对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列的克隆
（1）病毒RNA的提取
取猪捷申病毒DBN-10021株（CGMCC No.5573），经PK15细胞传代，收集第5代细胞毒液，反复冻融3次，然后12000r/min，4℃离心5分钟。取病毒悬液250μl放在1.5ml EP管中，加入0.75mlTranszol（北京全式金生物技术有限公司），混匀；再加入200μl氯仿，剧烈震荡15秒，室温孵育3分钟。12000r/min4℃离心10分钟。离心后转移上层水相到新的1.5ml EP管中，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温孵育10分钟。12000r/min4℃离心10分钟，弃去上清，留沉淀。加入1ml75%乙醇（DEPC处理的水配制），剧烈震荡。12000r/min4℃离心5分钟，弃上清，室温晾干沉淀，后将沉淀用50~100μl RNA溶解液中。
（2）病毒RNA的反转录
利用TransScriptTM First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）制备cDNA。
以提取的病毒RNA为模板进行cDNA的合成，反应体系为：RNA8μl，Random Primer1μl，2×TS Reaction Mix10μl，TransScript RT/RI Enzyme Mix1μl。25℃孵育10min，42℃孵育30min。之后85℃加热5min使TransScript RT/RI Enzyme失活。
（3）引物设计与合成
通过对多个猪捷申病毒全基因组序列的比对，选取保守的序列作为引物，引物3’端尽可能终止在兼并密码子较少的氨基酸位置且最后一个碱基尽可能避免终止在氨基酸密码子的第三位碱基上，相邻的扩增片段之间有长短不等的重叠。共设计12条引物，将病毒的全基因组序列分为6段，具体引物序列及其对应位点如表1所示，SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3分别为与5’RACE试剂盒配套使用的反向引物，SEQ ID No.14为正向外套引物（试剂盒提供），SEQ ID No.2为反向外套引物，SEQ ID No.15为正向内套引物（试剂盒提供），SEQIDNo.3为反向内套引物；SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为正反引物对；SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7为正反引物对；SEQ ID No.8和SEQ ID No.9为正反引物对；SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11为正反引物对；SEQ ID No.12和SEQ ID No.13为正反引物对。“F”代表正向引物，“R”代表反向引物。引物位置以捷申病毒4型PS36株（GenBank登录号：AF296089）的基因组为参考。
表1引物信息
注：“/”表示此引物序列在捷申病毒序列中的位置不确定。该引物中的15个“T”与捷申病毒3’端的Poly A尾巴相对应，引物中的“CCGGGGGCC”具有稳定该引物的作用，属于额外添加的碱基。
（4）基因片段的PCR扩增
将全基因组分为6个片段分别扩增，引物如SEQ ID No.2至SEQID No.15所示。第1段为基因组的5'末端，设计长度为300bp左右，其余5段扩增长度为1500~2000bp，第2段至第6段依次位于基因组的5'端至3'端。第1段采用Takara5'Fμll RACE Kit，并利用套式PCR扩增基因组5'序列，其中正向的外套（SEQ ID No.14）、内套引物（SEQ ID No.15）由试剂盒提供，反向的外套、内套引物由自己设计。PCR扩增反应体系为：2×EasyTaq PCR SuperMix（北京全式金生物技术有限公司）25μl，正向引物1μl，反向引物1μl，cDNA1μl，ddH2O22μl。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃30sec；50℃30sec；72℃2min进行30个循环，最后72℃延伸10min。在扩增第1段的时候，将其循环过程中的延伸时间设为20sec。
（5）目的基因片段的回收
回收基因片段的试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，具体回收方法如下：
使用TAE缓冲液制备1%琼脂凝胶，对扩增的DNA进行凝胶电泳。在长波紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂凝胶，称量胶块重量，以100mg≈100μl换算，加入3倍体积的GSB溶液，于55℃水浴中融化凝胶块。当胶融化后，待凝胶溶液降至室温，将其加入吸附柱中，静置1分钟，1000×g离心1分钟，弃滤液。加入650μl WB溶液，1000×g离心1分钟，弃滤液。1000×g离心2分钟，去除残留的WB。将吸附柱放入新的离心管中，开盖静置1分钟，使残留乙醇挥发干净。往柱中加入30~50μl去离子水，室温静置1分钟，1000×g离心1分钟，洗脱DNA。
（6）将目的基因片段与pEASY T5ZERO载体连接：
纯化的目的DNA与pEASY-T5Zero载体（北京全式金生物技术有限公司），具体操作为：在0.2ml PCR管中加入4μl目的DNA，1μl克隆载体，轻轻混匀，于25℃连接15min。反应结束后，将PCR管置于冰上冷却。
（7）连接产物的转化
取连接产物，加入250μl感受态细胞BL21（DE3）中，轻轻混匀，冰浴30min；然后，42℃热激30sec，立即置于冰上2min；加750平衡至室温的LB培养基，200r/min，37℃培养1h。取200μl菌液涂布在LB/Amp+平板，培养过夜。
（8）阳性克隆菌的挑选和鉴定
挑取克隆，接种于含Amp的LB培养基，37℃震荡培养。PCR方法鉴定阳性克隆，以培养菌液为模板，以M13F和M13R为引物，进行扩增。PCR反应条件同（4）所述。
（9）序列测定
将PCR鉴定为阳性的菌液，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。
（10）序列拼接
使用DNAStar软件包中的SeqMan软件，将各片段的测序结果进行序列拼接、编辑和校正。同时，结合测序峰图对不同批次的测序结果进行碱基校对，最终得到猪捷申病毒DBN10021株的全基因组序列，如SEQ ID No.1所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列，其序列如SEQ ID No.1所示。
2.用于扩增权利要求1所述序列的引物，其包括序列如SEQ ID No.2~ 13所示的引物。
3.如权利要求2所示的引物，其特征在于，还包括序列如SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示的引物。
4.一种测定权利要求1所述序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）提取猪捷申病毒DBN-10021株RNA，反转录成cDNA；
2）用SEQ ID No.2~15所示引物对全基因组序列进行分段PCR扩增，分别为：SEQ IDNo.2和14扩增后再分别用SEQ ID No.3和15、SEQ ID No.4和5、SEQ ID No.6和7、SEQ IDNo.8和9、SEQ ID No.10和11、SEQ ID No.12和13进行嵌套扩增；
3）目的片段回收、连接、转化、阳性菌的鉴定、测序；
4）利用生物软件对所测定的序列进行比对分析、序列拼接，将6个片段首尾相连，得到猪捷申病毒DBN-10021株全基因组序列。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反应条件参数为：94℃预变性5min，然后94℃ 30~60s；50℃ 30~60s；72℃ 20s-2min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。
6.权利要求2或3所述引物在制备猪捷申病毒DBN-10021株全基因组测序试剂盒中的应用。
7.含有权利要求2或3所述引物的猪捷申病毒DBN-10021株全基因组测序试剂盒。
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