CN101979562B - 一种利用rna干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列为抗玉米粗缩病的目的基因序列，通过四次PCR反应，获得目的基因序列，经限制性内切酶酶切、分离、回收、连接，构建植物表达载体；将植物表达载体利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈伤组织，通过除草剂筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。该方法利用RNA干扰技术，可培育出优良的抗粗缩病的玉米转基因植株，从根本上解决玉米粗缩病问题，显著提高玉米产量，提高其经济价值。

Description

一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法

技术领域

本发明属于转基因植物的培育技术领域，特别涉及一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法。

背景技术

玉米粗缩病是由玉米粗缩病毒(MRDV)所引起的一种病毒病。国内学者研究表明，此病是由灰飞虱传播的一种病毒性病害，其病原是一种具有双层衣壳的双链RNA球形病毒，主要由灰飞虱传播，只侵染单子叶植物。其寄主范围较广，有玉米、小麦、水稻、谷子和黑麦等。另外，还有一年生禾本科杂草，如狗尾、马塘、画眉、蟋蟀和白茅草等。田间冬小麦“绿矮型病株”及与丛矮病毒(WRSV)混生的矮缩病株，即是玉米粗缩病的初侵染源。研究资料表明，在玉米上传毒并造成危害的主要是灰飞虱第1代成虫，而灰飞虱则又是玉米粗缩病的主要传毒介体。研究结果表明，麦套夏玉米一般3～5片叶即可感病，而且感病越早，发病越重，经济产量损失也越大！

近年来，山东、山西、河北、北京、天津、陕西、云南等地都有发病严重甚至绝产的报道。玉米粗缩病已成为我国乃至世界玉米生产中的主要病害。发展到了不可忽视的地步。针对玉米粗缩病的发生与环境条件、播种日期、品种抗病性等因素有关，目前也采取了调整播期、加强田间管理、药物防治等措施来控制其发生，但是由于病毒繁殖快，易于变异，用传统的防治方法不能从根本上解决这一问题。

解决这一问题的有效策略是选育并推广抗病毒玉米品种。近年来逐渐兴起的RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)，为各种作物的抗病毒育种研究开辟了一条新的途径。利用基因工程的方法可以将病毒基因导入优良玉米品种，获得对病毒的抗性。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。

作为一种古老的生物体自我监督机制，RNAi是植物抵御外来核酸入侵，保持自身基因组结构完整性的一种有效策略。由双链RNA(dsRNA)介导的干扰现象作为细胞的一种防御机制可针对性地降解细胞内与之具有同源性的核酸(如病毒的核酸)，达到对病毒的抵抗，同时还调节细胞内编码基因的表达，为利用RNA介导的病毒抗性进行抗病毒基因工程的研究奠定了基础。

目前有分析玉米粗缩病基因序列以及寻找和筛选一些与玉米粗缩病抗性相关的分子标记的报道。如：Bai等分离鉴定了引起中国禾本科作物矮化症状的水稻黑条纹矮化病毒(Identification of rice black streaked dwarf virus in different cereal crops withdwarfing symptoms in China.Acta Virol.2001；45(5-6)：335-9.)。Azuhata等研究表明水稻黑条纹矮化病毒与玉米粗缩病病毒基因同源性很高(Close similarity betweengenome structures of rice black-streaked dwarf and maize rough dwarf viruses.JGen Virol.1993，74(7)：1227-32.)。李常保等人利用RAPD标记方法寻找与玉米粗缩病(MRDV)基因紧密连锁的分子标记(李常保等，玉米抗粗缩病病毒(MRDV)基因的RAPD标记及其辅助选择效果研究，作物学报，2002年7月，28(4)：564～568)；何龙等人利用SSR标记方法，寻找与玉米粗缩病抗性基因连锁的SSR分子标记(何龙等，玉米粗缩病抗性基因SSR标记初步研究，广东农业科学，2008年，8：5～8)；陈艳萍等人利用SSR-BSA技术筛选玉米粗缩病抗性基因分子标记(陈艳萍等，利用SSR-BSA技术筛选玉米粗缩病抗性基因分子标记，江苏农业学报，2008，24(5)：590～594)。

通过上述方法找到了一些可能与玉米粗缩病抗性有关的分子标记，张举仁等也利用分子标记进行了抗粗缩病玉米选育(利用分子标记选育抗粗缩病的玉米，发明专利公开号：CN 101138313A)。但目前还未见利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米成功的报道。

发明内容

本发明的主要目的就是针对上述抗粗缩病玉米的研究现状，提供一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法：

以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，以SEQ ID NO.2所述的F0核苷酸序列作为初始模板，分别以下述四对引物f1/r1、f2/r2、f3/r3、f4/r4依次进行PCR扩增，下一对引物上下游的3’端分别与上一对引物上下游的5’端有部分碱基重叠，第一对引物以F0为模板，以后每一对引物以上一对引物的产物为模板，这样每次PCR之后都在5’和3’端将目的序列延伸，最终扩增得到目的基因序列；四对引物分别如下：

f1：TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，

r1：GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG；

f2：TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，

r2：AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG；

f3：GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，

r3：TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA；

f4：CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，

r4：AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT；

将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pSK-int，于0.8％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入pSK-int载体中，形成含正反向重复目的片段的中间载体，命名为pSK-int-FR303；

用不同的两种限制性内切酶分别酶切中间载体pSK-int-FR303和植物表达载体pJIM19(BAR^R)，将含正反向重复序列的目的片段连接到pJIM19(BAR^R)载体中，即为构建成功的植物表达载体；新构建的载体能转录出发夹结构RNA(hairpin RNA)，命名为pJIM19-MRDV303；

将植物表达载体pJIM19-MRDV303利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈伤组织，通过除草剂筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。

上述利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，更具体的可包括下述主要步骤：

(1)、玉米粗缩病病毒的RNAi载体的构建

A.重叠PCR法扩增获得如SEQ ID NO.1所述的目的基因序列

通过NCBI数据库的Blast序列比对，选择MRDV的保守序列共303bp作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，在本发明中命名为MRDV-303，其核苷酸序列从左至右从5’端至3’端碱基组成如SEQ ID NO.1所述。

具体步骤如下：

1)PCR扩增获得第一段序列：

首先合成目的基因片段的中间部分片段F0(123bp-179bp)，即具有如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列，再以F0为初始模板、以下述上游引物f1和下游引物r1进行PCR扩增：

f1：TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，

r1：GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer  2μL，

dNTPs           1.6μL，

Mg²⁺            1.2μL，

DNA模板         1μL，

上游引物f1      0.5μL，

下游引物r1      0.5μL，

rTaq酶        0.2μL，

ddH₂O         13.0μL；

扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，59℃，30s，72℃，30s(30个循环)；

72℃，5min；10℃保温；

扩增得到第一段序列。

2)PCR扩增获得第二段序列：

以步骤1)的产物(第一段序列)为模板，以下述上游引物f2和下游引物r2进行PCR扩增：

f2：TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，

r2：AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer   2μL，

dNTPs            1.6μL，

Mg²⁺             1.2μL，

DNA模板          1μL，

上游引物f2       0.5μL，

下游引物r2       0.5μL，

rTaq酶           0.2μL，

ddH₂O            13.0μL；

扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s(30个循环)；

72℃，5min；10℃保温；

扩增得到第二段序列。

3)PCR扩增获得第三段序列：

以步骤2)的产物(第二段序列)为模板，以下述上游引物f3和下游引物r3进行PCR扩增：

f3：GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，

r3：TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer      2.0μL，

dNTPs               1.6μL，

Mg²⁺                1.2μL，

DNA模板             1μL，

上游引物f3          0.5μL，

下游引物r3          0.5μL，

rTaq酶              0.2μL，

ddH₂O               13.0μL。

扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s(30个循环)；

72℃，5min；10℃保温；

扩增得到第三段序列。

4)PCR扩增获得目的基因序列：

以步骤3)的产物(第三段序列)为模板，以下述上游引物f4和下游引物r4进行PCR扩增：

f4：CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，

r4：AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer   2.0μL，

dNTPs            1.6μL，

Mg²⁺             1.2μL，

DNA模板          1μL，

上游引物f4       0.5μL，

下游引物r4       0.5μL，

rTaq酶           0.2μL，

ddH₂O            13.0μL。

扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，59℃，30s，72℃，30s(30个循环)；

72℃，5min；10℃保温。

扩增得到目的基因序列。

将扩增产物目的基因序列在1％琼脂糖凝胶上分离、回收和纯化，得到纯化的回收产物。

5)连接和转化：

①回收产物连接到pMD-18T

反应体系如下：pMD-18T载体1μL(约50ng)，10×连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收PCR产物加至终反应体积10μL。

16℃连接12h，得到连接产物。

②转化大肠杆菌DH5α

感受态细胞的制备：

a.取在无抗生素平板上生长良好的单个DH5α菌落，接种于1mL LB液体培养基中，37℃振荡培养(225r/min)过夜；

b.取500μL活化过夜的菌液于50mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4；

c.将菌液倒入50mL离心管中，冰浴10min；

d.在预冷至4℃的离心机中，4000r/min离心10min后去掉上清液，收集菌体；

e.加入20mL冰冷的0.1mol/L CaCl₂于离心管中，均匀悬浮菌体后，冰浴中30min；

f.4℃下，4000r/min离心10min后去掉上清液，收集菌体，加入2mL冰冷的0.1mol/LCaCl₂溶液均匀悬浮菌体后，放入冰中待用。

转化步骤如下：

a.将连接产物加入200μL感受态细胞中，充分混匀置于冰上30min；

b.42℃热击1min 30s，冰浴2min后加入预热至37℃的LB液体培养基600μL；

c.37℃低速(100r/min)振荡培养50min；

d.在每个含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB固体培养基平板上加100μL菌液，均匀涂于平板上；

e.37℃培养箱中培养16小时。

6)阳性克隆的筛选：

以前述步骤A4)的目的基因序列为模板，以下述引物f5和r5扩增全长目的基因序列：

f5：CCTGCTCAAATGGGAATA

r5：AACGAATGACGCTACTGC

①挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12小时。

②以菌液为模板进行PCR扩增，反应体系如下：

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer      2.0μL，

dNTPs               1.6μL，

Mg²⁺                1.2μL，

DNA模板             1μL，

上游引物f5          0.5μL，

下游引物r5          0.5μL，

rTaq酶              0.2μL，

ddH₂O               13.0μL；

③PCR反应扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s(30个循环)；

72℃，5min；10℃保温；

将得到的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离。

④测序：通过测序确定扩增得到的序列与目的基因序列是否一致。

B.构建含正向序列的中间载体pSK-int-F303

1)PCR扩增获得正向片段：

以上述步骤A6)得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物F₁和R₁，其5’端分别引入限制性内切酶位点XhoI和HindIII，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全。引物序列如下：

F₁：5’ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3’(Xho I)，

R₁：5’CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3’(HindIII)；

PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1-10ng，dNTPs 100μmol/L，上游引物F₁ 5pmol，下游引物R1 5pmol，Taq DNA聚合酶1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR反应程序为：先94℃ 4min；再94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，循环30次；最后72℃延伸5min；

将扩增得到的产物在1％琼脂糖凝胶上分离，得到正向片段PCR产物。

2)PCR产物与中间载体的酶切、回收和纯化：

①PCR产物30μL酶切体系为：10×H缓冲液3.0μL，正向片段PCR产物  10.0μL(约2μg)，XhoI 5U，HindIII 5U，ddH₂O加至终体积30μL

②中间载体20μL酶切体系为：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int中间载体5.0μL(约1μg)，XhoI 5U，HindIII 5U，ddH₂O加至终体积20μL。

37℃温育4小时，将得到的酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶上分离，再回收和纯化，得到纯化的回收产物。

3)正向片段连入中间载体：

①回收产物连接到中间载体pSK-int

10μL反应体系为：pSK-int中间载体2μL(约300ng)，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收正向片段酶切产物5μL(约800ng)，ddH₂O加至终反应体积10μL；

16℃连接10小时；

②连接产物转化大肠杆菌DH5α，方法同上述步骤A5)；

4)正向片段阳性克隆的筛选：

①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12小时。

②取培养后的菌液进行PCR扩增，反应体系如下：10×PCR缓冲液        2.0μL，DNA1.0μL菌液，dNTPs100μmol/L，引物F₁ 5pmol，引物R15pmol，Taq DNA聚合酶1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL。

PCR扩增程序同上述步骤B1)。

③对PCR呈阳性的克隆，取500μL菌液进行测序，完全正确的样品用于下一步载体构建，命名为pSK-int-F303。

C.构建含反向重复序列的中间载体pSK-int-FR303

1)PCR扩增获得反向片段：

以上述步骤A6)得到的目的基因序列为模板，设计引物上下游引物F₂和R₂，其5’端分别引入限制性内切酶位点SpeI和PstI，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全。

引物序列如下：

F₂：5’AAAACTAGTCCTGCTCAAATGGGAAT 3’(SpeI)

R₂：5’AAACTGCAGAACGAATGACGCTACTGC 3’(PstI)

PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1-10ng，dNTPs100μmol/L，引物F₂ 5pmol，引物R₂ 5pmol，Taq DNA聚合1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL。

PCR扩增程序同上述步骤B1)；

2)反向片段PCR产物与载体pSK-int-F303的酶切：

①PCR产物30μL酶切体系：10×H缓冲液3.0μL，反向片段PCR产物10.0μL(约2μg)，SpeI 5U，PstI 5U，ddH₂O加至终体积30μL。

②中间载体20μL酶切体系：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int-F303中间载体5.0μL(约1μg)，SpeI 5U，PstI 5U，ddH₂O加至终体积20μL。

37℃温育2小时。

③酶切产物的回收、纯化、连接和转化等操作与正向片段的相同。

10μl连接体系为：pSK-int-F303中间载体2μL(约300ng)，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收反向片段酶切产物5μL(约800ng)，ddH₂O加至终反应体积10μL。

16℃连接12小时。

3)反向片段阳性克隆的筛选：

①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12h。

②取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系如下：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1.0μL菌液，dNTPs100μmol/L，引物F₂ 5pmol，引物R₂ 5pmol，Taq DNA聚合1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL。

PCR扩增程序同上述步骤B1)；

③对PCR呈阳性的克隆，取500μL菌液进行测序，完全正确的即为含反向重复目的片段的中间载体，命名为pSK-int-FR303。

D.构建含反向重复序列的表达载体pJIM19-MRDV303

1)XhoI和SpeI双酶切含反向重复目的片段的中间载体pSK-int-FR303

30μL酶切体系为：10×K缓冲液1.5μL(终浓度0.5K)，pSK-int-FR30315.0μL(约3μg)，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH₂O加至终体积30μL。

37℃温育30分钟。

2)XhoI和SpeI双酶切植物表达载体pJIM19

30μL酶切体系如下：10×K缓冲液3.0μL，pJIM19 10.0μL(约2μg)，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH₂O加至终体积30μL。

37℃温育2小时。

3)酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后分别回收反向重复序列和植物表达载体的大片段，所有操作按说明书进行。T4DNA连接酶连接。

10μL连接体系为：10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，正反向重复序列5μL(约1μg)，植物表达载体的大片段2μL(约200ng)，T4DNA连接酶350U，ddH₂O加至终反应体积10μL。16℃连接10小时。

4)阳性克隆的筛选

①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12小时。

②取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系为：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1.0μL菌液，dNTPs100μmol/L，引物F₂ 5pmol，引物R₂5pmol，Taq DNA聚合酶1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL。

PCR反应体系及扩增程序同上述步骤B1)。

③PCR呈阳性的克隆在20mL含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中扩大培养，提取质粒；XhoI和SpeI双酶切鉴定，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的条带，即为构建好的植物表达载体，在本发明中命名为pJIM19-MRDV303。

(2).农杆菌介导法转化优良玉米的胚性愈伤组织及植株的再生

A.植物表达载体pJIM19-MRDV303转化农杆菌：

①农杆菌感受态细胞的制备

取-70℃保存的EHA105于含有50μg/mL利福霉素平板划线，28℃培养2天。挑取单菌落接种于5mL YEP液体培养基中，225r/min，28℃振荡培养12小时左右。将5mL菌液转接于100mL YEP液体培养基中，28℃，225r/min，振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；转入无菌50mL的离心管，5000g离心5min，去上清液。加入1mL预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，4℃下，5000g离心5min，去上清。加入200L预冷的含15％甘油的0.1mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-70℃，备用。

②表达载体pJIM19-MRDV303转化农杆菌

取0.5g左右的pJIM19-MRDV303质粒DNA加入到200l EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；液氮中速冻1min；取出后37℃水浴5min；冰浴2min；加入800L YEP液体培养基，28℃，150r/min振荡培养4h；然后取200L涂布在含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福霉素的YEP平板上，28℃培养到形成单菌落。

③阳性克隆的鉴定

挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50g/mL卡那霉素和50μg/mL利福霉素的YEP液体培养基中，28℃，225r/min振荡培养12h，直接用菌液做PCR。PCR反应体系及扩增程序同上述步骤(1)D4)。

B.农杆菌浸染：

将含有目标载体pJIM19-MRDV303的农杆菌接种到含50mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的YEP培养基，于28℃培养2天；挑取单个菌落于含相应抗生素的1mL YEP培养基中，28℃、225r/min振荡培养12h，再将其加入含相应抗生素的50mL培养基扩大培养至OD600＝0.5；4℃、4000r/min离心5min收集菌体，用等体积的液体浸染培养基悬浮。将待转化优良玉米自交系的愈伤组织分别浸入含AS的浸染培养基，浸染5-10min。

C.共培养：

浸染了农杆菌的愈伤组织置于灭菌纸上，吸干多余水分后接种到共培养基。用保鲜膜封好平板，22℃暗培养3d。

D.清洗及恢复培养：

共培养3天后的愈伤组织用5mL含250mg/L噻孢霉素钠的灭菌蒸馏水清洗3次，置于灭菌滤纸上吸干多余水分后，接种到恢复培养基上。用保鲜膜封好平板，25℃暗培养5d。

E.筛选转化子：

恢复培养后的愈伤组织转接到含1.5mg/L除草剂草丁膦的选择培养基上。每两周后将抗性愈伤组织转接到新鲜的选择培养基上；连续筛选3代，草丁膦浓度按1.5mg/L、3.0mg/L、5.0mg/L递增；每次转接都淘汰褐色的愈伤组织。

F.转基因植株的再生：

选取抗性愈伤组织，转接到分化培养基(N6盐和维生素+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+水解酪蛋白100mg/L+KT 1mg/L，pH 5.8)上，25℃光照培养16小时/d；2-3周后，将分化出的幼苗转接到生根壮苗培养基(MS盐和维生素+肌醇100mg/L+生根粉ABT 0.25g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8)上，25℃光照培养16小时/d，即得到T0转基因植株，经过自交繁育、分子检测、接毒鉴定等，表明该株系是一种对玉米粗缩病具有较好抗病性的转基因作物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明方法利用RNA干扰技术，可培育出具有优良抗粗缩病的玉米转基因植株，从根本上解决玉米粗缩病问题，显著提高玉米产量，提高其经济价值。

附图说明

图1为中间载体pBluescript SK+，构建正反向重复序列的中载体pSK-int在pBluescript SK+的MCS区插入了一段内含子；

图2为植物表达载体pJIM19(BAR^R)。MCS为多克隆位点区，酶切位点依次为XbaI，XhoI，Stul，Spel，Sacl；

图3为重叠PCR扩增目的基因电泳检测结果图；

图4为含正向序列中间载体pSK-int-F303用XhoI/HindIII双酶切鉴定电泳检测结果图；

图5为含反向重复序列中间载体pSK-int-FR303用XhoI/SpeI双酶切鉴定电泳检测结果图；

图6为转基因18-599白再生植株；

图7为再生植株目的基因PCR检测电泳结果图；

图8为田间接种病毒15天后的18-599红植株；

图9为实施例2中，部分转化植株Bar基因检测结果：1：阳性对照；2：阴性对照；3-15：转化植株；

图10为实施例2中，部分转化植株目的基因片段检测结果：5，8，15为转化植株；

图11为实施例2中，转基因植株PCR扩增产物测序结果

图12为实施例2中，部分转基因植株Southern杂交检测电泳图，TW2、TW6和TW4为不同的转基因株系；

图13、图14分别为实施例4中，MRDV目的基因标准曲线图及熔解曲线分析图；

图15、图16分别为实施例4中，18S内参基因标准曲线及熔解曲线分析图；

图17为实施例4中，qRT-PCR检测接毒鉴定的转基因植株及对照中MRDV基因表达量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

实施例1

本实施例利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，包括下述主要步骤：

(1)、玉米粗缩病病毒的RNAi载体的构建

A.重叠PCR法扩增获得如SEQ ID NO.1所述的目的基因序列

通过NCBI数据库的Blast序列比对，选择MRDV的保守序列共303bp作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，在本发明中命名为MRDV-303，其核苷酸序列从左至右从5’端至3’端碱基组成如SEQ ID NO.1所述。

具体步骤如下：

1)PCR扩增获得第一段序列：

首先合成目的基因片段的中间部分片段F0(123bp-179bp)，即具有如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列，再以F0为初始模板、以下述上游引物f1和下游引物r1进行PCR扩增：

f1：TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，

r1：GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer   2.0μL，

dNTPs            1.6μL，

Mg²⁺             1.2μL，

DNA模板          1μL，

上游引物f1       0.5μL，

下游引物r1       0.5μL，

rTaq酶           0.2μL，

ddH₂O            13.0μL；

扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，59℃，30s，72℃，30s(30个循环)；

72℃，5min；10℃保温；

扩增得到第一段序列。

2)PCR扩增获得第二段序列：

以步骤1)的产物(第一段序列)为模板，设计上游引物f2和下游引物r2，分别与步骤1)产物的5’和3’端部分碱基重叠，进行PCR扩增：

f2：TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，

r2：AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer   2.0μL，

dNTPs            1.6μL，

Mg²⁺             1.2μL，

DNA模板          1μL，

上游引物f2       0.5μL，

下游引物r2    0.5μL，

rTaq酶        0.2μL，

ddH₂O         13.0μL；

扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s(30个循环)；

72℃，5min；10℃保温；

扩增得到第二段序列。

3)PCR扩增获得第三段序列：

以步骤2)的产物(第二段序列)为模板，设计上游引物f3和下游引物r 3，分别与步骤2)产物的5’和3’端部分碱基重叠，进行PCR扩增：

f3：GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，

r3：TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer   2.0μL，

dNTPs            1.6μL，

Mg²⁺             1.2μL，

DNA模板          1.0μL，

上游引物f3       0.5μL，

下游引物r3       0.5μL，

rTaq酶           0.2μL，

ddH₂O            13.0μL。

扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s(30个循环)；

72℃，5min；10℃保温；

扩增得到第三段序列。

4)PCR扩增获得目的序列：

以步骤3)的产物(第三段序列)为模板，设计上游引物f4和下游引物r4，分别与步骤3)产物的5’和3’端部分碱基重叠，进行PCR扩增：

f4：CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，

r4：AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer   2.0μL，

dNTPs            1.6μL，

Mg²⁺             1.2μL，

DNA模板          1.0μL，

上游引物f4       0.5μL，

下游引物r4       0.5μL，

rTaq酶           0.2μL，

ddH₂O            13.0μL。

扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，59℃，30s，72℃，30s(30个循环)；

72℃，5min；10℃保温。

PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行，扩增产物即为目的基因序列。

将扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，80V恒定电压电泳45min。

在步骤4)引物扩增电泳分离后，使用TIANGEN公司琼脂糖凝胶回收和纯化试剂盒，所有操作均按说明书进行，得到纯化的回收产物。

5)连接和转化：

①回收产物连接到pMD-18T

反应体系如下：pMD-18T载体1μL(约50ng)，10×连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收PCR产物加至终反应体积10μL。

16℃连接12h。

②转化大肠杆菌DH5α

感受态细胞的制备：

a.取在无抗生素平板上生长良好的单个DH5α菌落，接种于1mL LB液体培养基中，37℃振荡培养(225r/min)过夜；

b.取500μL活化过夜的菌液于50mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4；

c.将菌液倒入50mL离心管中，冰浴10min；

d.在预冷至4℃的离心机中，4000r/min离心10min后去掉上清液，收集菌体；

e.加入20mL冰冷的0.1mol/L CaCl₂于离心管中，均匀悬浮菌体后，冰浴中30min；

f.4℃下，4000r/min离心10min后去掉上清液，收集菌体，加入2mL冰冷的0.1mol/LCaCl₂溶液均匀悬浮菌体后，放入冰中待用。

转化步骤如下：

a.将连接产物加入200μL感受态细胞中，充分混匀置于冰上30min；

b.42℃热击1min 30s，冰浴2min后加入预热至37℃的LB液体培养基600μL；

c.37℃低速(100r/min)振荡培养50min；

d.在每个含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB固体培养基平板上加100μL菌液，均匀涂于平板上；

e.37℃培养箱中培养16h。

6)阳性克隆的筛选：

以前述步骤A4)的目的基因序列为模板，以下述引物f5和r5扩增全长目的基因序列：

f5：CCTGCTCAAATGGGAATA

r5：AACGAATGACGCTACTGC

①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12h。

②以菌液为模板进行PCR扩增，反应体系如下：DNA1μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物f₄5pmol，引物r₄5pmol，Taq DNA聚合酶1U，10×PCR缓冲液2.0μL，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL。

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer   2.0μL，

dNTPs            1.6μL，

Mg²⁺             1.2μL，

DNA模板          1.0μL，

上游引物f5       0.5μL，

下游引物r5       0.5μL，

rTaq酶           0.2μL，

ddH₂O            13.0μL；

③PCR反应扩增程序为：

94℃，5min；

94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s(30个循环)；

72℃，5min；10℃保温；

将得到的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，80V恒定电压电泳45min，检测有无目的片段。

④测序：将目的片段送Invitrogen公司测序，测序结果表明扩增序列与设计的目的片段完全一致。

B.构建含正向序列的中间载体pSK-int-F303

1)PCR扩增获得正向片段：

以上述步骤A 6)得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物F₁和R₁，其5’端分别引入限制性内切酶位点XhoI和HindIII，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全。引物序列如下：

F₁：5’ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3’(Xho I)，

R₁：5’CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3’(HindIII)；

PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1-10ng，dNTPs 100μmol/L，上游引物F1 5pmol，下游引物R1 5pmol，Taq DNA聚合酶1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR反应程序为：先94℃4min；再94℃30s，58℃30s，72℃30s，循环30次；最后72℃延伸5min；

PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，80V恒定电压电泳45min，得到正向片段PCR产物。

2)PCR产物与中间载体的酶切、回收和纯化：

①PCR产物30μL酶切体系为：10×H缓冲液3.0μL，正向片段PCR产物10.0μL(约2μg)，XhoI 5U，HindIII 5U，ddH₂O加至终体积30μL。

②中间载体20μL酶切体系为：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int中间载体5.0μL(约1μg)，XhoI 5U，HindIII 5U，ddH₂O加至终体积20μL。

37℃温育2小时，酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶上分离，80V恒定电压电泳50分钟。

③使用TIANGEN公司琼脂糖凝胶回收和纯化试剂盒，所有操作均按说明书进行，得到纯化的回收产物。

3)正向片段连入中间载体：

①回收产物连接到中间载体pSK-int的10μL反应体系为：酶切的pSK-int中间载体2μL(约300ng)，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收正向片段酶切产物5μL(约800ng)，ddH₂O加至终反应体积10μL。

16℃连接10小时。

②转化大肠杆菌DH5α，方法同上述步骤A 5)。

4)正向片段阳性克隆的筛选：

①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12h。

②取培养后的菌液进行PCR扩增，反应体系如下：10×PCR缓冲液    2.0μL，DNA1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₁ 5pmol，引物R₁ 5pmol，TaqDNA聚合酶1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL。

PCR扩增程序同上述步骤B1)；

③PCR呈阳性的克隆取500μL菌液送Invitrogen公司测序，完全正确的样品用于下一步载体构建，命名为pSK-int-F303。

C.构建含反向重复序列的中间载体pSK-int-FR303

1)PCR扩增获得反向片段：

以上述步骤A 6)得到的目的基因序列为模板，上下游引物F₂和R₂，其5’端分别引入限制性内切酶位点SpeI和PstI(下划线)，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全。引物序列如下：

F₂.5’AAAACTAGTCCTGCTCAAATGGGAAT 3’(SpeI)

R₂：5’AAACTGCAGAACGAATGACGCTACTGC 3’(PstI)

PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1-10ng，dNTPs 100μmol/L，引物F₂5pmol，引物R₂ 5pmol，Taq DNA聚合1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL。

PCR扩增程序同上述步骤B1)；

2)反向片段PCR产物与载体pSK-int-F303的酶切：

①PCR产物30μL酶切体系：10×H缓冲液3.0μL，反向片段PCR产物10.0μL(约2μg)，SpeI 5U，PstI 5U，ddH₂O加至终体积30μL。

②中间载体20μL酶切体系：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int-F303中间载体5.0μL(约1μg)，SpeI 5U，PstI 5U，ddH₂O加至终体积20μL。

37℃温育2h。

③酶切产物的回收、纯化、连接和转化等操作与正向片段的相同。

10μL连接体系为：pSK-int-F303中间载体2μL(约300ng)，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收反向片段酶切产物5μL(约800ng)，ddH₂O加至终反应体积10μL。

16℃连接12h。

3)反向片段阳性克隆的筛选：

①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12h。

②取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系如下：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₂ 5pmol，引物R₂ 5pmol，Taq DNA聚合酶1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL。

PCR扩增程序同上述步骤B1)；

③PCR呈阳性的克隆取500μL菌液送Invitrogen公司测序，完全正确的即为含反向重复目的片段的中间载体，命名为pSK-int-FR303。

D.构建含反向重复序列的表达载体pJIM19-MRDV303

1)XhoI和SpeI双酶切含反向重复目的片段的中间载体pSK-int-FR303

30μL酶切体系为：10×K缓冲液1.5μL(终浓度0.5K)，pSK-int-FR303 15.0μL(约3μg)，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH₂O加至终体积30μL。

37℃温育30min。

2)XhoI和SpeI双酶切植物表达载体pJIM19

30μL酶切体系如下：10×K缓冲液3.0μL，pJIM19 10.0μL(约2μg)，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH₂O加至终体积30μL。

37℃温育2h。

3)酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后分别回收反向重复序列和植物表达载体的大片段，所有操作按说明书进行。T4DNA连接酶连接。

10μL连接体系为：10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，正反向重复序列5μL(约1μg)，植物表达载体的大片段2μL(约200ng)，T4DNA连接酶350U，ddH₂O加至终反应体积10μL。16℃连接10h。

4)阳性克隆的筛选

①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12h。

②取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系为：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₂ 5pmol，引物R₂ 5pmol，Taq DNA聚合1U，Mg²⁺1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL。

PCR扩增程序同上述步骤B1)；

③PCR呈阳性的克隆在20ml含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中扩大培养，提取质粒，使用TIANGEN公司的质粒小提试剂盒，所有操作按说明书进行。XhoI和SpeI双酶切鉴定，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的条带，即为构建好的植物表达载体，命名为pJIM19-MRDV303。

(2).农杆菌介导法转化优良玉米自交系的胚性愈伤组织及植株的再生

1)植物表达载体pJIM19-MRDV303转化农杆菌：

①农杆菌感受态细胞的制备

取-70℃保存的EHA105于含有50μg/mL利福霉素平板划线，28℃培养2天。挑取单菌落接种于5mL YEP液体培养基中，225r/min，28℃振荡培养12小时左右。将5mL菌液转接于100mL YEP液体培养基中，28℃，225r/min，振荡培养至OD₆₀₀＝0.5；转入无菌50mL的离心管，5000g离心5min，去上清液。加入1mL预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，4℃下，5000g离心5min，去上清。加入200L预冷的含15％甘油的0.1mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-70℃。

②表达载体p JIM19-MRDV303转化农杆菌

取0.5g左右的pJIM19-MRDV303质粒DNA加入到200L EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；液氮中速冻1min；取出后37℃水浴5min；冰浴2min；加入800LYEP液体培养基，28℃，150r/min振荡培养4h；取200L菌液涂布在含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福霉素的YEP平板上，28℃培养形成单菌落。

③阳性克隆的鉴定

挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50g/mL卡那霉素和100μg/mL利福霉素的YEP液体培养基中，28℃，225r/min振荡培养12h，直接用菌液做PCR。

PCR反应体系及扩增程序同上述步骤(1)D4)。

2)农杆菌浸染：

将含有目标载体pJIM19-MRDV303的农杆菌接种到含50mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的YEP培养基，于28℃培养2天。挑取单个菌落于含相应抗生素的1mL YEP培养基中，28℃、225r/min振荡培养12h，再将其加入含相应抗生素的50mL培养基扩大培养至OD600＝0.5；4℃、4000r/min离心5min收集菌体，用等体积的液体浸染培养基(含100μmol/L乙酰丁香酮即AS)悬浮。将18-599红、18-599白的愈伤组织分别浸入含AS的浸染培养基，浸侵染5-10min。

3)共培养：

浸染了农杆菌的愈伤组织置于灭菌纸上，吸干多余水分后接种到共培养基。用保鲜膜封好平板，22℃暗培养3d。

4)清洗及恢复培养：

共培养3天后的愈伤组织用5mL含250mg/L噻孢霉素钠的灭菌蒸馏水清洗3次，置于灭菌滤纸上吸干多余水分后，接种到恢复培养基上。用保鲜膜封好平板，25℃暗培养5d。

5)筛选转化子：

恢复培养后的愈伤组织转接到含1.5mg/L除草剂草丁膦的选择培养基上。每两周后将愈伤组织转接到新鲜的选择培养基上；连续筛选3代，草丁膦浓度按1.5mg/L、3mg/L、5mg/L递增；每次转接都淘汰褐色的愈伤组织。

6)转基因植株的再生：

选取抗性愈伤组织，转接到分化培养基(N6盐和维生素+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+水解酪蛋白100mg/L+KT 1mg/L，pH 5.8)上，25℃光照培养16小时/d；2-3周后，将分化出的幼苗转接到生根壮苗培养基(MS盐和维生素+肌醇100mg/L+生根粉ABT 0.25g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8)上，25℃光照培养16小时/d，即得到T0转基因植株。

经分子检测和田间接种鉴定，确定将MRDV基因转入到玉米自交系18-599红、18-599白中。

实施例2本实施例为转基因植株的分子检测

A.玉米基因组DNA提取

取T₀代转化植株幼嫩叶片，用CTAB法提取总DNA，试剂及配方见表1。

表1CTAB提取液的配置(500mL)

将5g左右新鲜叶片放入研钵中，加入液氮快速研磨成粉末状，转入5mL离心管，加入2mL 65℃预热的CTAB提取液充分混匀，65℃保温45～60min，在此期间轻轻颠倒离心管几次，使植株组织与CTAB充分接触。加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)混合液轻轻摇动15min。10,000r/min离心10min。

取上清液，再用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次，10,000r/min离心10min。

小心吸出上清液于另一支5mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，置于-20℃冰箱中沉淀DNA。

挑出成团的DNA，用70％乙醇洗2-3次，无水乙醇洗1-2次，烘干，加200L TE溶解，再加入RNase于37℃保温30min。0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA合格后，保存于-20℃备用。

B.选择标记基因Bar和目的基因片段的PCR检测

利用primer premier5.0软件设计一对筛选标记Bar基因和目的基因片段的特异引物，对T0代植株DNA进行PCR扩增。引物序列分别如下：

Bar-s：ATGAGCCCAGAACGACGC//Bar-x：CTAAATCTCGGTGACGGGC

f1：CCTGCTCAAATGGGAATA//r1：AACGAATGACGCTACTGC

PCR扩增体系(20μL)：DNA 1L，dNTP 1.6L，Mg₂+2L，10×buffer 2L，正向引物和反向引物各0.3L，Taq酶0.3L，ddH₂O 12.5L。PCR程序：94℃变性5min，58℃退火30S，72℃延伸45S，30个循环，最后72℃再延伸5min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，见图9、图10，并送博迈德公司测序。PCR扩增和测序结果表明(见图11)，外源目的基因片段已成功导入玉米中。

C.Southern杂交检测结果

T₀代阳性植株套袋自交结实，并于云南南繁加代，用上述PCR方法继续检测后代植株的阳性情况。PCR阳性的株系进一步用Southern杂交检测外源基因是否整合到玉米基因组上及其在玉米基因组中的拷贝数。

以MRDV目的基因片断作为探针，质粒pJIM19-MRDV303作为阳性对照，用Roche公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II试剂盒进行基因组DNA Southern杂交，检测目的基因拷贝数，步骤如下：

A.SpeI酶切基因组DNA

用限制性内切酶SpeI酶切转基因植株基因组DNA，酶切体系见表2，反应条件为37℃，过夜。

表2SpeI酶切反应体系

消化后的DNA加入1/10体积的10×Loading缓冲液，以终止反应。取5μL电泳检测消化效果。

B.酶切产物电泳及变性

制备0.8％的琼脂糖凝胶，酶切产物全部点样电泳，电压：1-2V/cm，电泳过夜。将电泳后的凝胶去除胶孔，切成适当大小并切去左上角用做标记，于变性液中轻微振荡变性40min。

将凝胶转移到中和液中，振荡中和30min。

C.毛细管法转膜及固定

取一方盘，在放盘内加入适量的20×SSR溶液，在方盘上架一玻璃板，在玻璃板上铺上一张Whatman 3mm滤纸作为盐桥，两端浸没在20×SSR溶液中，滤纸与玻璃板之间无气泡。

将凝胶倒扣(点样孔向下)在Whatman 3mm滤纸上，凝胶与滤纸之间无气泡。按凝胶的大小剪裁尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入20×SSR溶液中浸泡5min。将膜准确覆盖在凝胶上，接触后不再移动。

将两张与膜大小相同的Whatman 3mm滤纸置于2×SSR溶液中湿润，覆盖在膜上，去除气泡。滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，吸水纸上再置一玻璃板，玻板上压0.5～1Kg的重物，水平转膜过夜。

取下尼龙膜，置于2×SSC中漂洗5min，放于滤纸上凉干，将膜放在浸有10×SSR的厚滤纸上，DNA面向上，置于紫外交联仪中，紫外光下自动交联。

D.标记探针

取阳性质粒pJIM19-MRDV303经PCR扩增，得到目的基因序列产物。将1μg此产物溶于16μL ddH₂O，100℃水浴10min，迅速冰浴冷却，加入4μL DIG-High Prime的探针标记液(vial1)，37℃标记20h，加入0.2mol/L EDTA(pH 8.0)2μL终止标记。

E.预杂交

42℃预热10mL的杂交液DIG Easy Hyb Granules(bottle 7)，将尼龙膜放入装有预杂交液的杂交管中，置于杂交炉中，42℃预杂交2h。

F.杂交

将标记的探针(25ng/mL DIG High Hyb)于100℃水浴变性5min，使其变性，迅速置于冰上冷却。加变性的标记探针于预热的杂交液中(3.5mL/100cm²膜)，置于杂交炉，42℃杂交过夜。

G.洗膜及显色

取出尼龙膜，按试剂盒说明书步骤及要求进行洗膜和显色。部分阳性植株的分子杂交结果见图12。

由于Spe I在RNAi载体上是单一的酶切位点，因此Southern杂交的条带数即为外源基因的拷贝数。Southern杂交结果表明，外源目的基因片段均以低拷贝形式插入玉米基因组。

实施例3本实施例为阳性株系抗病性接种鉴定

具体步骤为：

A.传毒介体昆虫灰飞虱的饲养

沙土与蛭石按1∶1混合灭菌，用于培养水稻幼苗。待幼苗长至5cm左右，转入灰飞虱若虫饲养，视幼苗生长情况及时更换新鲜幼苗用于灰飞虱取食(饲养条件：温度24℃，相对湿度60％，光照14小时)，经过多代繁殖可获得大量灰飞虱。

B.带毒灰飞虱的获得

因为我国玉米粗缩病病原主要是水稻黑条矮缩病病毒，遗传转化玉米的外源基因也是此病毒衣壳蛋白基因的保守序列。所以，将饲养1-2龄的无毒灰飞虱转入水稻黑条矮缩病病株上饲喂一周，而后转入健康的水稻苗继续饲养10天，待灰飞虱度过病毒循回期后，此灰飞虱即为带毒灰飞虱，可用于转基因株系病毒接种的介体毒源。

C.转基因株系接种传毒介体

将阳性转基因株系(TW1、TW2、TW3、TW4、TW5、TW6、TW7、TW8、TW9)与未转基因对照“18白”及抗病自交系“87-1”(是否是已知的？)种植于温室内，随机区组设计，单行区，每行14株，双株种植，株行距30cm×70cm，两次重复。三叶一心时，接入带毒灰飞虱，接虫量约每株5头，接种植株用纱网隔离，同时设不接虫对照。温室温度约25-30℃，自然光照。

D.转基因株系发病情况调查

接虫一周后，用杀虫剂杀灭灰飞虱，10天后观察病情发展情况，开花期调查病情指数，记录发病率。表3中发病率和病情指数为两次重复的平均值。不同平均数后的相同字母表示0.0.5水平差异不显著，不同字母表示0.0.5水平差异显著。R抗病；MR中抗；S感病。

表3转基因株系田间对MRDV抗性鉴定

实施例4本实施例为荧光定量PCR检测接毒转基因株系及对照MRDV CP基因表达量

(1)引物设计

以转化303bp MRDV目的基因为模板，18S rRNA为内参基因设计引物，引物序列见表4。

表4定量PCR用引物

(2)荧光定量PCR引物的特异性检测

以感病对照18白cDNA样品5倍稀释后用作荧光定量PCR(qRT-PCR)反应的模板，采用50～65℃的退火温度梯度进行qRT-PCR反应来确定最佳的退火温度，采用25μL反应体系，见表5。

表5qRT-PCR反应体系

qRT-PCR在iQ^TM 5thermal cycler(Bio-Rad USA)进行。反应程序为：95℃预变性10s；然后按95℃变性10s，50～65℃退火20s，72℃延伸20s，并在此温度收集荧光，读板(Plateread)的程序进行40个循环。之后从50℃开始，以每步0.5℃的温度梯度升高至95℃，每步温度保持5s，绘制熔解曲线。

(3)qRT-PCR标准品的制备

将含有目的基因和看家基因的克隆载体质粒DNA按如下梯度：1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8、1×10^-9进行稀释制备定量标准品。用1×10^-2～1×10^-8梯度稀释的标准品来制作目的基因和内参基因的标准曲线。

(4)qRT-PCR反应

将逆转录的cDNA样品5倍稀释后用作qRT-PCR扩增的模板，采用25μL反应体系(表6)，并设立以ddH₂O为模板的阴性对照。单个逆转录的cDNA样品设三次重复。

qRT-PCR反应程序为：95℃预变性10s，然后按95℃变性10s，56℃退火20s，72℃延伸20s，并在此温度收集荧光，读板(Plate read)的程序进行40个循环。之后最后从50℃开始，以每步0.5℃的速度升高至95℃，每个温度保持5s，绘制熔解曲线。

数据分析采用iQ^TM 5thermal cycler(Bio-Rad USA)自带的分析软件中的ddCt模式。

(5)MRDV目的基因和18S内参基因标准曲线

MRDV目的基因定量PCR扩增效率为91.5，R²值为0.999；18S PCR扩增效率为95.8，R²值为0.999，表明标准曲线的制作满足定量PCR的要求(可见图13、14、15、16)。

(6)接毒鉴定的转基因植株及对照MRDV目的基因表达量

qRT-PCR检测接毒鉴定的转基因植株及对照MRDV目的基因表达量的结果见图17。结果表明，感病对照即非转基因18白叶片中MRDV的基因表达量最高。在田间抗病性表现最好的转基因株系TW2其叶片中MRDV的基因表达量最低。TW5、TW7叶片中MRDV的基因表达量均低于抗病对照自交系87-1。说明转基因株系能够通过RNA干扰的作用抵抗病毒的入侵，从而减轻粗缩病病毒对玉米的危害。荧光定量PCR检测结果与田间抗病性鉴定的结果一致。

序列表

<110>四川农业大学

<120>一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法

<150>CN2009102164170

<151>2009-11-27

<160>23

<210>1

<211>303

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因的核苷酸序列

<400>1

cctgctcaaa tgggaatact tactgatgaa gttagactgt taatgcgaac tggtaaatta   60

agaattgacg gtggttatga tttcaattgt cccgcaagta ctacagacgt tactcactac  120

ggtggatatg atcaattttc acgtcaaatg tttgaacgtt tgaatctctt ttacaatatt  180

agtcttagca taatacccgt ttcagcttta aaaaccgttc atctatttga aaaggaatta  240

agtgttttgg atgcagacaa atctttgctt gaacaaactt ggagcgcagt agcgtcattc  300

gtt                                                                303

<210>2

<211>57

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因中间片段FO的核苷酸序列

<400>2

tggatatgatcaattttcac gtcaaatgtttgaacgtttgaatctcttttacaatat   57

<210>3

<211>53

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因扩增引物f1的核苷酸序列

<400>3

tcccgcaagtactacagacg ttactcacta cggtggatatgatcaattttcac      53

<210>4

<211>50

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因扩增引物r1的核苷酸序列

<400>4

gctgaaacgg gtattatgctaagactaata ttgtaaaaga gattcaaacg        50

<210>5

<211>51

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因扩增引物f2的核苷酸序列

<400>5

ttaagaattg acggtggtta tgatttcaattgtcccgcaa gtactacaga c      51

<210>6

<211>58

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因扩增引物r2的核苷酸序列

<400>6

aacacttaattccttttcaa atagatgaac ggttttaaa gctgaaacgg gtattatg    58

<210>7

<211>46

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因扩增引物f3的核苷酸序列

<400>7

gttagactgt taatgcgaac tggtaaatta agaattgacg gtggtt   46

<210>8

<211>50

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因扩增引物r3的核苷酸序列

<400>8

ttgttcaagc aaagatttgtctgcatccaa aacacttaattccttttcaa    50

<210>9

<211>51

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因扩增引物f4的核苷酸序列

<400>9

cctgctcaaa tgggaatacttactgatgaa gttagactgttaatgcgaact   51

<210>10

<211>47

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因扩增引物r4的核苷酸序列

<400>10

aacgaatgac gctactgcgc tccaagttg ttcaagcaaa gatttgt  47

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因扩增引物f5的核苷酸序列

<400>11

cctgctcaaa tgggaata  18

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因扩增引物r5的核苷酸序列

<400>12

aacgaatgacgctactgc    18

<210>13

<211>26

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因正向片段扩增引物F₁的核苷酸序列

<400>13

atcctcgagc ctgctcaaatgggaat  26

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因正向片段扩增引物R₁的核苷酸序列

<400>14

ctcaagctta acgaatgacg ctactgc   27

<210>15

<211>26

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因反向片段扩增引物F₂的核苷酸序列

<400>15

aaaactagtc ctgctcaaatgggaat    26

<210>16

<211>27

<212>DNA

<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因反向片段扩增引物R₂的核苷酸序列

<400>16

aaactgcaga acgaatgacg ctactgc                27

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>转基因植株筛选标记Bar基因扩增引物Bar-s的核苷酸序列

<400>17

atgagcccag aacgacgc    18

<210>18

<211>19

<212>DNA

<213>转基因植株筛选标记Bar基因扩增引物Bar-x的核苷酸序列

<400>18

ctaaatctcg gtgacgggc    19

<210>19

<211>22

<212>DNA

<213>荧光定量PCR检测MRDV目的基因扩增上游引物的核苷酸序列

<400>19

ttaattgtcc tgcaagcactac    22

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>荧光定量PCR检测MRDV目的基因扩增下游引物的核苷酸序列

<400>20

ctgcgctcca agtttgttc  19

<210>21

<211>19

<212>DNA

<213>荧光定量PCR 18S内参基因扩增上游引物的核苷酸序列

<400>21

ctgagaaacg gctaccaca    19

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>荧光定量PCR 18S内参基因扩增下游引物的核苷酸序列

<400>22

cccaaggtcc aactacgag    19

<210>

<211>303

<212>DNA

<213>PCR检测转基因植株中MRDV目的基因的核苷酸序列测序结果

<400>23

cctgctcaaa tgggaatact tactgatgaa gttagactgt taatgcgaac tggtaaatta  60

agaattgacg gtggttatga tttcaattgtc ccgcaagta ctacagacgt tactcactac 120

ggtggatatg atcaattttc acgtcaaatg tttgaacgtt tgaatctctt ttacaatatt 180

agtcttagca taatacccgt ttcagcttta aaaaccgttc atctatttga aaaggaatta 240

agtgttttgg atgcagacaa atctttgctt gaacaaactt ggagcgcagt agcgtcattc 300

gtt                                                               303

Claims (2)

1.一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，其特征在于：

以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，以SEQ ID NO.2所述的F0核苷酸序列作为初始模板，分别以下述四对引物f1/r1、f2/r2、f3/r3、f4/r4依次进行PCR扩增，下一对引物上下游的3’端分别与上一对引物上下游的5’端有部分碱基重叠，第一对引物以F0为模板，以后每一对引物以上一对引物的产物为模板，这样每次PCR之后都在5’和3’端将目的序列延伸，最终扩增得到目的基因序列；四对引物分别如下： 

f1：TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，

r1：GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG；

f2：TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，

r2：AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG；

f3：GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，

r3：TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA；

f4：CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，

r4：AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT；

将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pSK-int，于1.0％ 琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入pSK-int载体中，形成含正反向重复目的片段的中间载体pSK-int-FR303；

用不同的两种限制性内切酶分别酶切中间载体pSK-int-FR303和植物表达载体pJIM19，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到pJIM19载体中，即为构建成功的植物表达载体pJIM19-MRDV303；

将植物表达载体pJIM19-MRDV303利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈伤组织，通过除草剂筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株；

其中，含正向序列的中间载体pSK-int-F303通过如下步骤构建，

1）PCR扩增获得正向片段：

以上述步骤A 6）得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物F₁和R₁，其5’端分别引入限制性内切酶位点XhoI和HindIII，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全；引物序列如下：

F₁：5’ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3’，

R₁：5’CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3’；

PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1-10ng，dNTPs 100μmol/L，上游引物F1 5 pmol，下游引物R1 5 pmol，Taq DNA聚合酶1U，Mg²⁺ 1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR反应程序为：先94℃ 4 min；再94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，循环30次；最后72℃延伸5 min；

将扩增得到的产物在1% 琼脂糖凝胶上电泳分离，得到正向片段PCR产物；

2）PCR产物与中间载体的酶切、回收和纯化：

PCR产物30μL酶切体系为：10×H缓冲液3.0μL，正向片段PCR产物    10.0μL，XhoI 5 U，HindⅢ 5 U，ddH₂O加至终体积30μL；

中间载体20μL酶切体系为：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int中间载体5.0μL，XhoI 5 U，HindⅢ 5 U，ddH₂O加至终体积20μL；

37℃温育4小时，将得到的酶切产物在1.0%琼脂糖凝胶上分离，再回收和纯化，得到纯化的回收产物；

3）正向片段连入中间载体：

回收产物连接到中间载体pSK-int

10μL反应体系为：pSK-int中间载体2μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4 DNA连接酶350 U，回收正向片段酶切产物5μL，ddH₂O加至终反应体积10μL；

16 ℃连接10 h；

转化大肠杆菌DH5α，方法同前述步骤A 5）;

4）正向片段阳性克隆的筛选：

挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、225 r/min振荡培养12 h；

取培养后的菌液进行PCR扩增，反应体系如下：10×PCR缓冲液        2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₁ 5 pmol，引物R₁ 5 pmol，Taq DNA聚合酶1 U，Mg²⁺ 1.5 mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR扩增程序同上述步骤B 1）;

对PCR呈阳性的克隆，取500μL菌液进行测序，完全正确的样品用于下一步载体构建，命名为pSK-int-F303；

反向重复序列的中间载体pSK-int-FR303通过如下步骤构建，

1）PCR扩增获得反向片段：

以上述步骤A 6）得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物F₂和R₂，其5’端分别引入限制性内切酶位点SpeI和PstI，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全;引物序列如下：

F₂：5’AAAACTAGTCCTGCTCAAATGGGAAT 3’，

R₂：5’AAACTGCAGAACGAATGACGCTACTGC 3’；

PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1-10 ng， dNTPs 100μmol/L，引物F₂ 5 pmol，引物R₂ 5 pmol，Taq DNA聚合1U，Mg²⁺ 1.5 mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR扩增程序同上述步骤B 1）;

2）反向片段PCR产物与载体pSK-int-F303的酶切：

PCR产物30μL酶切体系：10×H缓冲液3.0μL，反向片段PCR产物10.0μL，SpeI 5 U，PstI 5 U，ddH₂O加至终体积30μL；

中间载体20μL酶切体系：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int-F303中间载体5.0μL，SpeI 5 U，PstI 5 U，ddH₂O加至终体积20μL；

37℃温育4小时；

酶切产物的回收、纯化、连接和转化等操作与正向片段的相同；

10μL连接体系为：pSK-int-F303中间载体2μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4 DNA连接酶350 U，回收反向片段酶切产物5μL，ddH₂O加至终反应体积10μL；

16 ℃连接12 h；

3）反向片段阳性克隆的筛选：

挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、225 r/min振荡培养12 h；

取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系如下：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₂ 5 pmol，引物R₂ 5 pmol，Taq DNA聚合1U，Mg²⁺ 1.5 mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR扩增程序同上述步骤B 1）;

对PCR呈阳性的克隆，取500μL菌液进行测序，完全正确的即为含反向重复目的片段的中间载体，命名为pSK-int-FR303；

表达载体pJIM19-MRDV303通过如下步骤构建，

1）XhoI和SpeI双酶切含反向重复目的片段的中间载体pSK-int-FR303

30μL酶切体系为：10×K缓冲液1.5μL，pSK-int-FR303 15.0μL，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH₂O加至终体积30μL；

37℃温育30分钟；

2）XhoI和SpeI双酶切植物表达载体pJIM19

30μL酶切体系如下：10×K缓冲液3.0μL，pJIM1910.0μL，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH₂O加至终体积30μL；

37℃温育2小时；

3）酶切产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳后分别回收反向重复序列和植物表达载体的大片段，所有操作按说明书进行;T4 DNA 连接酶连接；

10μL连接体系为：10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，正反向重复序列                      5μL，植物表达载体的大片段2μL，T4 DNA连接酶 350 U，ddH₂O加至终反应体积10 μL；16℃连接10 h；

4）阳性克隆的筛选

挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有卡那霉素的LB液体培养基中37℃、225 r/min振荡培养12小时；

取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系为：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₂ 5 pmol，引物R₂ 5 pmol，Taq DNA聚合酶1 U，Mg²⁺ 1.5 mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR扩增程序同上述步骤B 1）;

PCR呈阳性的克隆在20 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养，提取质粒；XhoI和SpeI双酶切鉴定，0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的条带，即为构建好的植物表达载体，在本发明中命名为pJIM19-MRDV303。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于,包括下述主要步骤：

（1）、玉米粗缩病病毒的RNAi载体的构建

A.重叠PCR法扩增获得如SEQ ID NO.1所述的目的基因序列

以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，以SEQ ID NO.2所述的F0核苷酸序列作为初始模板，分别以四对引物f1/r1、f2/r2、f3/r3、f4/r4依次进行PCR扩增：

具体步骤如下：

  1）PCR扩增获得第一段序列：

首先合成目的基因片段的中间部分片段F0，即具有如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列，再以F0为初始模板、以上游引物f1和下游引物r1进行PCR扩增；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer     2.0μL，

dNTPs            1.6μL，

Mg²⁺              1.2μL，

DNA模板          1.0μL，

上游引物f1       0.5μL，

下游引物r1       0.5μL，

rTaq酶           0.2μL，

ddH₂O               13.0μL；

扩增程序为：

94℃，5 min；

94℃，30 s，59℃，30 s，72℃， 30 s；30个循环；

72℃，5 min；10℃保温；

扩增得到第一段序列；

2）PCR扩增获得第二段序列：

以步骤1）的产物为模板，以上游引物f2和下游引物 r2进行PCR扩增；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer     2.0μL，

dNTPs            1.6μL，

Mg²⁺              1.2μL，

DNA模板          1.0μL，

上游引物f2       0.5μL，

下游引物r2       0.5μL，

rTaq酶           0.2μL，

ddH₂O               13.0μL；

扩增程序为：

94℃，5 min；

94℃，30 s，58 ℃，30 s，72℃， 30 s；30个循环；

72℃，5 min；10 ℃保温；

扩增得到第二段序列；

3）PCR扩增获得第三段序列：

以步骤2）的产物为模板，以上游引物f3和下游引物 r3进行PCR扩增；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer     2.0 μL，

dNTPs            1.6 μL，

Mg²⁺              1.2 μL，

DNA模板          1.0 μL，

上游引物f3       0.5μL，

下游引物r3       0.5μL，

rTaq酶           0.2μL，

ddH₂O              13.0μL；

扩增程序为：

94℃，5 min；

94℃，30 s，58℃，30 s，72℃， 30 s；30个循环；

72℃，5 min；10℃保温；

扩增得到第三段序列；

4）PCR扩增获得目的基因序列：

以步骤3）的产物为模板，以上游引物f4和下游引物 r4进行PCR扩增；

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer     2.0 μL，

dNTPs            1.6 μL，

Mg²⁺              1.2 μL，

DNA模板          1.0 μL，

上游引物f4       0.5 μL，

下游引物r4       0.5 μL，

rTaq酶           0.2 μL，

ddH₂O              13.0 μL；

扩增程序为：

94℃，5 min；

94℃，30 s，59℃，30 s，72℃，30 s；30个循环；

72℃，5 min；10℃保温；

扩增得到目的基因序列；

将扩增产物目的基因序列在1% 琼脂糖凝胶上分离、回收和纯化，得到纯化的回收产物；

5）连接和转化：

①回收产物连接到pMD-18T

反应体系如下：pMD-18T载体 1μL，10×连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350 U，回收PCR产物加至终反应体积10μL；

16℃连接12小时，得到连接产物；

转化大肠杆菌DH5α

感受态细胞的制备：

.取在无抗生素平板上生长良好的单个DH5α菌落，接种于1ml LB液体培养基中，37℃、225 r/min振荡培养过夜；

.取500μL活化过夜的菌液于50 mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.4；

.将菌液倒入50 mL离心管中，冰浴10 min；

.在预冷至4℃的离心机中，4000 r/min离心10 min后去掉上清液，收集菌体；

.加入20 mL冰冷的0.1 mol/L CaCl₂于离心管中，均匀悬浮菌体后，冰浴中30 min；

. 4℃下，4000 r/min离心10 min后去掉上清液，收集菌体，加入2 mL冰冷的0.1mol/L CaCl₂溶液均匀悬浮菌体后，放入冰中待用；

转化步骤如下：

.将连接产物加入200μL感受态细胞中，充分混匀置于冰上30 min；

.42℃热击1 min 30 s，冰浴2 min后加入预热至37℃的LB液体培养基600 μL；

.37℃、100 r/min低速振荡培养50 min；

.在每个含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上加100μL菌液，均匀涂于平板上；

.37℃培养箱中培养16小时；

6)阳性克隆的筛选：

以前述步骤4）得到的目的基因序列为模板，以下述引物f5和r5扩增全长目的基因序列：

f5：CCTGCTCAAATGGGAATA,

r5：AACGAATGACGCTACTGC;

挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、225 r/min振荡培养12小时；

以菌液为模板进行PCR扩增，反应体系如下：

扩增体系为，每20μL中含有：

10×PCR buffer     2.0 μL，

dNTPs            1.6 μL，

Mg²⁺              1.2 μL，

DNA模板          1.0 μL，

上游引物f5       0.5 μL，

下游引物r5       0.5 μL，

rTaq酶           0.2 μL，

ddH₂O              13.0 μL；

③PCR反应扩增程序为：

94℃，5 min；

94℃，30 s，58℃，30 s，72℃，30 s；30个循环；

72℃，5 min；10℃保温；

将得到的扩增产物在1% 琼脂糖凝胶上电泳分离；

④测序：通过测序确定扩增得到的序列与目的基因序列是否一致；

B.构建含正向序列的中间载体pSK-int-F303

1）PCR扩增获得正向片段：

以上述步骤A 6）得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物F₁和R₁，其5’端分别引入限制性内切酶位点XhoI和HindIII，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全；引物序列如下：

F₁：5’ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3’，

R₁：5’CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3’；

PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1-10ng，dNTPs 100μmol/L，上游引物F1 5 pmol，下游引物R1 5 pmol，Taq DNA聚合酶1U，Mg²⁺ 1.5mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR反应程序为：先94℃ 4 min；再94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，循环30次；最后72℃延伸5 min；

将扩增得到的产物在1% 琼脂糖凝胶上电泳分离，得到正向片段PCR产物；

2）PCR产物与中间载体的酶切、回收和纯化：

PCR产物30μL酶切体系为：10×H缓冲液3.0μL，正向片段PCR产物    10.0μL，XhoI 5 U，HindⅢ 5 U，ddH₂O加至终体积30μL；

中间载体20μL酶切体系为：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int中间载体5.0μL，XhoI 5 U，HindⅢ 5 U，ddH₂O加至终体积20μL；

37℃温育4小时，将得到的酶切产物在1.0%琼脂糖凝胶上分离，再回收和纯化，得到纯化的回收产物；

3）正向片段连入中间载体：

回收产物连接到中间载体pSK-int

10μL反应体系为：pSK-int中间载体2μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4 DNA连接酶350 U，回收正向片段酶切产物5μL，ddH₂O加至终反应体积10μL；

16 ℃连接10 h；

转化大肠杆菌DH5α，方法同前述步骤A 5）;

4）正向片段阳性克隆的筛选：

挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、225 r/min振荡培养12 h；

取培养后的菌液进行PCR扩增，反应体系如下：10×PCR缓冲液        2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₁ 5 pmol，引物R₁ 5 pmol，Taq DNA聚合酶1 U，Mg²⁺ 1.5 mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR扩增程序同上述步骤B 1）;

对PCR呈阳性的克隆，取500μL菌液进行测序，完全正确的样品用于下一步载体构建，命名为pSK-int-F303；

C.构建含反向重复序列的中间载体pSK-int-FR303

1）PCR扩增获得反向片段：

以上述步骤A 6）得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物F₂和R₂，其5’端分别引入限制性内切酶位点SpeI和PstI，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全;引物序列如下：

F₂：5’AAAACTAGTCCTGCTCAAATGGGAAT 3’，

R₂：5’AAACTGCAGAACGAATGACGCTACTGC 3’；

PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1-10 ng， dNTPs 100μmol/L，引物F₂ 5 pmol，引物R₂ 5 pmol，Taq DNA聚合1U，Mg²⁺ 1.5 mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR扩增程序同上述步骤B 1）;

2）反向片段PCR产物与载体pSK-int-F303的酶切：

PCR产物30μL酶切体系：10×H缓冲液3.0μL，反向片段PCR产物10.0μL，SpeI 5 U，PstI 5 U，ddH₂O加至终体积30μL；

中间载体20μL酶切体系：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int-F303中间载体5.0μL，SpeI 5 U，PstI 5 U，ddH₂O加至终体积20μL；

37℃温育4小时；

酶切产物的回收、纯化、连接和转化等操作与正向片段的相同；

10μL连接体系为：pSK-int-F303中间载体2μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4 DNA连接酶350 U，回收反向片段酶切产物5μL，ddH₂O加至终反应体积10μL；

16 ℃连接12 h；

3）反向片段阳性克隆的筛选：

挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、225 r/min振荡培养12 h；

取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系如下：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₂ 5 pmol，引物R₂ 5 pmol，Taq DNA聚合1U，Mg²⁺ 1.5 mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR扩增程序同上述步骤B 1）;

对PCR呈阳性的克隆，取500μL菌液进行测序，完全正确的即为含反向重复目的片段的中间载体，命名为pSK-int-FR303；

D.构建含反向重复序列的表达载体pJIM19-MRDV303

1）XhoI和SpeI双酶切含反向重复目的片段的中间载体pSK-int-FR303

30μL酶切体系为：10×K缓冲液1.5μL，pSK-int-FR303 15.0μL，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH₂O加至终体积30μL；

37℃温育30分钟；

2）XhoI和SpeI双酶切植物表达载体pJIM19

30μL酶切体系如下：10×K缓冲液3.0μL，pJIM1910.0μL，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH₂O加至终体积30μL；

37℃温育2小时；

3）酶切产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳后分别回收反向重复序列和植物表达载体的大片段，所有操作按说明书进行;T4 DNA 连接酶连接；

10μL连接体系为：10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，正反向重复序列                      5μL，植物表达载体的大片段2μL，T4 DNA连接酶 350 U，ddH₂O加至终反应体积10 μL；16℃连接10 h；

4）阳性克隆的筛选

挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有卡那霉素的LB液体培养基中37℃、225 r/min振荡培养12小时；

取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系为：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F₂ 5 pmol，引物R₂ 5 pmol，Taq DNA聚合酶1 U，Mg²⁺ 1.5 mmol/L，ddH₂O加至终体积20μL；

PCR扩增程序同上述步骤B 1）;

PCR呈阳性的克隆在20 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养，提取质粒；XhoI和SpeI双酶切鉴定，0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的条带，即为构建好的植物表达载体，在本发明中命名为pJIM19-MRDV303；

（2）.农杆菌介导法转化优良玉米的胚性愈伤组织及植株的再生

A.植物表达载体pJIM19-MRDV303转化农杆菌：

农杆菌感受态细胞的制备

取-70℃保存的EHA105于含有50 g/mL利福霉素平板划线，28℃培养2天；挑取单菌落接种于5mLYEP液体培养基中，225 r/min，28℃振荡培养12小时左右；将5mL菌液转接于100 mLYEP液体培养基中，28℃,225 r/min,振荡培养至OD₆₀₀=0.5;转入无菌50 mL的离心管，5000g离心5 min,去上清液；加入1 mL预冷的0.1 mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20 min，4℃下，5000 g离心5 min，去上清；加入200 μL预冷的含15% 甘油的0.1 mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮;混匀后立即冻存于-70℃，备用；

表达载体pJIM19-MRDV303转化农杆菌

取0.5g左右的pJIM19-MRDV303质粒DNA加入到200L EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30 min；液氮中速冻1 min；取出后37℃水浴5 min；冰浴2 min；加入800L YEP液体培养基,28℃，150 r/min振荡培养4 h,然后取200L菌液涂布在含50 g/mL 卡那霉素和50 g/mL利福霉素的YEP平板上，28℃ 培养到形成单菌落；

阳性克隆的鉴定

挑取转化后长出的农杆菌单菌落接种于含50 g/mL卡那霉素和50 g/mL利福霉素的YEP液体培养基中，28℃，225 r/min振荡培养12 h，用菌液作模板进行PCR检测;

PCR反应体系及扩增程序同上述步骤（1）D 4）;

B.农杆菌浸染：

将含有目标载体pJIM19-MRDV303的农杆菌接种到含50 mg/L利福霉素和50 mg/L卡那霉素的YEP培养基，于28℃培养2天;挑取单个菌落于含相应抗生素的1 mL YEP培养基中，28℃、225 r/min振荡培养12 h，再将其加入含相应抗生素的50 mL培养基扩大培养至OD600=0.5；4℃、4000 r/min离心5 min收集菌体，用等体积的液体浸染培养基悬浮；将待转化优良玉米自交系的愈伤组织分别浸入含AS的浸染培养基，浸染5-10 min；

C.共培养：

浸染了农杆菌的愈伤组织置于灭菌纸上，吸干多余水分后接种到共培养基;用保鲜膜封好平板，22℃暗培养3 d；

D.清洗及恢复培养：

共培养3 d后的愈伤组织用5 mL含250 mg/L噻孢霉素钠的灭菌蒸馏水清洗3次，置于灭菌滤纸上吸干多余水分后，接种到恢复培养基上;用保鲜膜封好平板，25℃暗培养5 d；

E.筛选转化子：

恢复培养后的愈伤组织转接到含1.5 mg/L除草剂草丁膦的选择培养基上;每两周后将抗性愈伤组织转接到新鲜的选择培养基上；连续筛选3代，草丁膦浓度按1.5 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L递增;每次转接都淘汰褐色的愈伤组织；

F.转基因植株的再生：

选取抗性愈伤组织，转接到分化培养基上，所述的分化培养基为：N6盐和维生素+蔗糖30 g／L+琼脂6 g／L+水解酪蛋白100 mg／L+KT 1 mg／L，pH 5.8；25℃光照培养16小时/d；2-3周后，将分化出的幼苗转接到生根壮苗培养基上，所述的生根壮苗培养基为：MS盐和维生素+肌醇100 mg/L +生根粉ABT 0.25 g/L+蔗糖30 g/L +琼脂6 g／L,pH 5.8；25℃光照培养16小时/d，即得到T0 转基因植株。

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