CN101748126A - 一种利用rna干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法 - Google Patents
一种利用rna干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101748126A CN101748126A CN200910216417A CN200910216417A CN101748126A CN 101748126 A CN101748126 A CN 101748126A CN 200910216417 A CN200910216417 A CN 200910216417A CN 200910216417 A CN200910216417 A CN 200910216417A CN 101748126 A CN101748126 A CN 101748126A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr
- enzyme
- primer
- amplification
- ddh
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，以SEQ IDNO.1所述的核苷酸序列为抗玉米粗缩病的目的基因序列，通过四次PCR反应，获得目的基因序列，经限制性内切酶酶切、分离、回收、连接，构建植物表达载体；将植物表达载体利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈伤组织，通过除草剂筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。该方法利用RNA干扰技术，可培育出优良的抗粗缩病的玉米转基因植株，从根本上解决玉米粗缩病问题，显著提高玉米产量，提高其经济价值。
Description
技术领域
本发明属于转基因植物的培育技术领域，特别涉及一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法。
背景技术
玉米粗缩病是由玉米粗缩病毒(MRDV)所引起的一种病毒病。国内学者研究表明，此病是由灰飞虱传播的一种病毒性病害，其病原是一种具有双层衣壳的双链RNA球形病毒，主要由灰飞虱传播，只侵染单子叶植物。其寄主范围较广，有玉米、小麦、水稻、谷子和黑麦等。另外，还有一年生禾本科杂草，如狗尾、马塘、画眉、蟋蟀和白茅草等。田间冬小麦“绿矮型病株”及与丛矮病毒(WRSV)混生的矮缩病株，即是玉米粗缩病的初侵染源。研究资料表明，在玉米上传毒并造成危害的主要是灰飞虱第1代成虫，而灰飞虱则又是玉米粗缩病的主要传毒介体。研究结果表明，麦套夏玉米一般3～5片叶即可感病，而且感病越早，发病越重，经济产量损失也越大！
近年来，山东、山西、河北、北京、天津、陕西、云南等地都有发病严重甚至绝产的报道。玉米粗缩病已成为我国乃至世界玉米生产中的主要病害。发展到了不可忽视的地步。针对玉米粗缩病的发生与环境条件、播种日期、品种抗病性等因素有关，目前也采取了调整播期、加强田间管理、药物防治等措施来控制其发生，但是由于病毒繁殖快，易于变异，用传统的防治方法不能从根本上解决这一问题。
解决这一问题的有效策略是选育并推广抗病毒玉米品种。近年来逐渐兴起的RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)，为各种作物的抗病毒育种研究开辟了一条新的途径。利用基因工程的方法可以将病毒基因导入优良玉米品种，获得对病毒的抗性。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。
作为一种古老的生物体自我监督机制，RNAi是植物抵御外来核酸入侵，保持自身基因组结构完整性的一种有效策略。由双链RNA(dsRNA)介导的干扰现象作为细胞的一种防御机制可针对性地降解细胞内与之具有同源性的核酸(如病毒的核酸)，达到对病毒的抵抗，同时还调节细胞内编码基因的表达，为利用RNA介导的病毒抗性进行抗病毒基因工程的研究奠定了基础。
目前有分析玉米粗缩病基因序列以及寻找和筛选一些与玉米粗缩病抗性相关的分子标记的报道。如：Ba i等分离鉴定了引起中国禾本科作物矮化症状的水稻黑条纹矮化病毒(Identification of rice black streaked dwarf virusin different cereal crops with dwarfing symptoms in China.Acta Virol.2001；45(5-6)：335-9.)。Azuhata等研究表明水稻黑条纹矮化病毒与玉米粗缩病病毒基因同源性很高(Closes imilarity between genome structures ofrice black-streaked dwarf and maize rough dwarf viruses.J Gen Virol.1993，74(7)：1227-32.)。李常保等人利用RAPD标记方法寻找与玉米粗缩病(MRDV)基因紧密连锁的分子标记(李常保等，玉米抗粗缩病病毒(MRDV)基因的RAPD标记及其辅助选择效果研究，作物学报，2002年7月，28(4)：564～568)；何龙等人利用SSR标记方法，寻找与玉米粗缩病抗性基因连锁的SSR分子标记(何龙等，玉米粗缩病抗性基因SSR标记初步研究，广东农业科学，2008年，8：5～8)；陈艳萍等人利用SSR-BSA技术筛选玉米粗缩病抗性基因分子标记(陈艳萍等，利用SSR-BSA技术筛选玉米粗缩病抗性基因分子标记，江苏农业学报，2008，24(5)：590～594)。
通过上述方法找到了一些可能与玉米粗缩病抗性有关的分子标记，张举仁等也利用分子标记进行了抗粗缩病玉米选育(利用分子标记选育抗粗缩病的玉米，发明专利公开号：CN 101138313A)。但目前还未见利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米成功的报道。
发明内容
本发明的主要目的就是针对上述抗粗缩病玉米的研究现状，提供一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法：
以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，以SEQ ID NO.2所述的F0核苷酸序列作为初始模板，分别以下述四对引物f1/r1、f3/r3、f4/r4依次进行PCR扩增，下一对引物上下游的3’端分别与上一对引物上下游的5’端有部分碱基重叠，第一对引物以F0为模板，以后每一对引物以上一对引物的产物为模板，这样每次PCR之后都在5’和3’端将目的序列延伸，最终扩增得到目的基因序列；四对引物分别如下：
f1：TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，
r1：GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG；
f2：TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，
r2：AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG；
f3：GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，
r3：TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA；
f4：CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，
r4：AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT；
将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pSK-int，于0.8％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入pSK-int载体中，形成含正反向重复目的片段的中间载体，命名为pSK-int-FR303；
用不同的两种限制性内切酶分别酶切中间载体pSK-int-FR303和植物表达载体pJIM19(BARR)，将含正反向重复序列的目的片段连接到pJIM19(BARR)载体中，即为构建成功的植物表达载体；新构建的载体能转录出发夹结构RNA(hairpin RNA)，命名为pJIM19-MRDV303；
将植物表达载体pJIM19-MRDV303利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈伤组织，通过除草剂筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。
上述利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，更具体的可包括下述主要步骤：
(1)、玉米粗缩病病毒的RNAi载体的构建
A.重叠PCR法扩增获得如SEQ ID NO.1所述的目的基因序列
通过NCBI数据库的Blast序列比对，选择MRDV的保守序列共303bp作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，在本发明中命名为MRDV-303，其核苷酸序列从左至右从5’端至3’端碱基组成如SEQ ID NO.1所述。
具体步骤如下：
1)PCR扩增获得第一段序列：
首先合成目的基因片段的中间部分片段F0(123bp-179bp)，即具有如SEQID NO.2所述的核苷酸序列，再以F0为初始模板、以下述上游引物f1和下游引物r1进行PCR扩增：
f1：TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，
r1：GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG；
扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2μL，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1μL，
上游引物f1 0.5μL，
下游引物r1 0.5μL，
rTaq酶 0.2μL，
ddH2O 13.0μL；
扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，59℃，30s，72℃，30s(30个循环)；
72℃，5min；10℃保温；
扩增得到第一段序列。
2)PCR扩增获得第二段序列：
以步骤1)的产物(第一段序列)为模板，以下述上游引物f2和下游引物r2进行PCR扩增：
f2：TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，
r2：AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG；
扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2μL，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1μL，
上游引物f2 0.5μL，
下游引物r2 0.5μL，
rTaq酶 0.2μL，
ddH2O 13.0μL；
扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s(30个循环)；
72℃，5min；10℃保温；
扩增得到第二段序列。
3)PCR扩增获得第三段序列：
以步骤2)的产物(第二段序列)为模板，以下述上游引物f3和下游引物r3进行PCR扩增：
f3：GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，
r3：TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA；
扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2.0μL，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1μL，
上游引物f3 0.5μL，
下游引物r3 0.5μL，
rTaq酶 0.2μ L，
ddH2O 13.0μL。
扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s(30个循环)；
72℃，5min；10℃保温；
扩增得到第三段序列。
4)PCR扩增获得目的基因序列：
以步骤3)的产物(第三段序列)为模板，以下述上游引物f4和下游引物r4进行PCR扩增：
f4：CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，
r4：AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT；
扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2.0μL，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1μL，
上游引物f4 0.5μL，
下游引物r4 0.5μL，
rTaq酶 0.2μL，
ddH2O 13.0μL。
扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，59℃，30s，72℃，30s(30个循环)；
72℃，5min；10℃保温。
扩增得到目的基因序列。
将扩增产物目的基因序列在1％琼脂糖凝胶上分离、回收和纯化，得到纯化的回收产物。
5)连接和转化：
①回收产物连接到pMD-18T
反应体系如下：pMD-18T载体1μL(约50ng)，10×连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收PCR产物加至终反应体积10μL。
16℃连接12h，得到连接产物。
②转化大肠杆菌DH5α
感受态细胞的制备：
a.取在无抗生素平板上生长良好的单个DH5α菌落，接种于1mL LB液体培养基中，37℃振荡培养(225r/min)过夜；
b.取500μL活化过夜的菌液于50mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4；
c.将菌液倒入50mL离心管中，冰浴10min；
d.在预冷至4℃的离心机中，4000r/min离心10min后去掉上清液，收集菌体；
e.加入20mL冰冷的0.1mol/L CaCl2于离心管中，均匀悬浮菌体后，冰浴中30min；
f.4℃下，4000r/min离心10min后去掉上清液，收集菌体，加入2mL冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液均匀悬浮菌体后，放入冰中待用。
转化步骤如下：
a.将连接产物加入200μL感受态细胞中，充分混匀置于冰上30min；
b.42℃热击1min 30s，冰浴2min后加入预热至37℃的LB液体培养基600μL；
c.37℃低速(100r/min)振荡培养50min；
d.在每个含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB固体培养基平板上加100μL菌液，均匀涂于平板上；
e.37℃培养箱中培养16小时。
6)阳性克隆的筛选：
以前述步骤A4)的目的基因序列为模板，以下述引物f5和r5扩增全长目的基因序列：
f5：CCTGCTCAAATGGGAATA
r5：AACGAATGACGCTACTGC
①挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12小时。
②以菌液为模板进行PCR扩增，反应体系如下：
扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2.0μL，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1μL，
上游引物f5 0.5μL，
下游引物r5 0.5μL，
rTaq酶 0.2μL，
ddH2O 13.0μL；
③PCR反应扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s(30个循环)；
72℃，5min；10℃保温；
将得到的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离。
④测序：通过测序确定扩增得到的序列与目的基因序列是否一致。
B.构建含正向序列的中间载体pSK-int-F303
1)PCR扩增获得正向片段：
以上述步骤A6)得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物F1和R1，其5’端分别引入限制性内切酶位点XhoI和HindIII，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全。引物序列如下：
F1：5’ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3’(XhoI)，
R1：5’CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3’(Hi nd III)；
PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1-10ng，dNTPs 100μmol/L，上游引物F1 5pmol，下游引物R1 5pmol，TaqDNA聚合酶1U，Mg2+ 1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL；
PCR反应程序为：先94℃4min；再94℃30s，58℃30s，72℃30s，循环30次；最后72℃延伸5min；
将扩增得到的产物在1％琼脂糖凝胶上分离，得到正向片段PCR产物。
2)PCR产物与中间载体的酶切、回收和纯化：
①PCR产物30μL酶切体系为：10×H缓冲液3.0μL，正向片段PCR产物10.0μL(约2μg)，XhoI 5U，Hi ndIII 5U，ddH2O加至终体积30μL
②中间载体20μL酶切体系为：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int中间载体5.0μL(约1μg)，XhoI 5U，HindIII 5U，ddH2O加至终体积20μL。
37℃温育4小时，将得到的酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶上分离，再回收和纯化，得到纯化的回收产物。
3)正向片段连入中间载体：
①回收产物连接到中间载体pSK-int
10μL反应体系为：pSK-int中间载体2μL(约300ng)，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收正向片段酶切产物5μL(约800ng)，ddH2O加至终反应体积10μL；
16℃连接10小时；
②连接产物转化大肠杆菌DH5α，方法同上述步骤A5)；
4)正向片段阳性克隆的筛选：
①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12小时。
②取培养后的菌液进行PCR扩增，反应体系如下：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1.0μL菌液，dNTPs100μmol/L，引物F15pmol，引物R15pmol，TaqDNA聚合酶1U，Mg2+1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL。
PCR扩增程序同上述步骤B1)。
③对PCR呈阳性的克隆，取500μL菌液进行测序，完全正确的样品用于下一步载体构建，命名为pSK-int-F303。
C.构建含反向重复序列的中间载体pSK-int-FR303
1)PCR扩增获得反向片段：
以上述步骤A6)得到的目的基因序列为模板，设计引物上下游引物F2和R2，其5’端分别引入限制性内切酶位点SpeI和PstI，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全。引物序列如下：
F2：5’AAAACTAGTCCTGCTCAAATGGGAAT 3’(SpeI)
R2：5’AAACTGCAGAACGAATGACGCTACTGC 3’(PstI)
PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1-10ng，dNTPs100μmol/L，引物F25pmol，引物R25pmol，TaqDNA聚合1U，Mg2+1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL。
PCR扩增程序同上述步骤B1)；
2)反向片段PCR产物与载体pSK-int-F303的酶切：
①PCR产物30μL酶切体系：10×H缓冲液3.0μL，反向片段PCR产物10.0μL(约2μg)，SpeI 5U，PstI 5U，ddH2O加至终体积30μL。
②中间载体20μL酶切体系：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int-F303中间载体5.0μL(约1μg)，SpeI 5U，PstI 5U，ddH2O加至终体积20μL。
37℃温育2小时。
③酶切产物的回收、纯化、连接和转化等操作与正向片段的相同。
10μl连接体系为：pSK-int-F 303中间载体2μL(约300ng)，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收反向片段酶切产物5μL(约800ng)，ddH2O加至终反应体积10μL。
16℃连接12小时。
3)反向片段阳性克隆的筛选：
①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12h。
②取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系如下：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1.0μL菌液，dNTPs100μmo l/L，引物F25pmol，引物R25pmol，Taq DNA聚合1U，Mg2+1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL。
PCR扩增程序同上述步骤B1)；
③对PCR呈阳性的克隆，取500μL菌液进行测序，完全正确的即为含反向重复目的片段的中间载体，命名为pSK-int-FR303。
D.构建含反向重复序列的表达载体pJIM19-MRDV303
1)Xho I和Spe I双酶切含反向重复目的片段的中间载体pSK-int-FR 303
30μL酶切体系为：10×K缓冲液1.5μL(终浓度0.5K)，pSK-int-FR30315.0μL(约3μg)，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH2O加至终体积30μL。
37℃温育30分钟。
2)XhoI和SpeI双酶切植物表达载体pJIM19
30μL酶切体系如下：10×K缓冲液3.0μL，pJ IM1910.0μL(约2μg)，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH2O加至终体积30μL。
37℃温育2小时。
3)酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后分别回收反向重复序列和植物表达载体的大片段，所有操作按说明书进行。T4DNA连接酶连接。
10μL连接体系为：10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，正反向重复序列5μL(约1μg)，植物表达载体的大片段2μL(约200ng)，T4DNA连接酶350U，ddH2O加至终反应体积10μL。16℃连接10小时。
4)阳性克隆的筛选
①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12小时。
②取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系为：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1.0μL菌液，dNTPs100μmol/L，引物F25pmol，引物R25pmol，Taq DNA聚合酶1U，Mg2+1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL。
PCR反应体系及扩增程序同上述步骤B1)。
③PCR呈阳性的克隆在20mL含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中扩大培养，提取质粒；XhoI和SpeI双酶切鉴定，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的条带，即为构建好的植物表达载体，在本发明中命名为pJIM19-MRDV303。
(2).农杆菌介导法转化优良玉米的胚性愈伤组织及植株的再生
A.植物表达载体pJIM19-MRDV303转化农杆菌：
①农杆菌感受态细胞的制备
取-70℃保存的EHA105于含有50μg/mL利福霉素平板划线，28℃培养2天。挑取单菌落接种于5mL YEP液体培养基中，225r/min，28℃振荡培养12小时左右。将5mL菌液转接于100mL YEP液体培养基中，28℃，225r/min，振荡培养至OD600＝0.5；转入无菌50mL的离心管，5000g离心5min，去上清液。加入1mL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，4℃下，5000g离心5min，去上清。加入200μL预冷的含15％甘油的0.1mo l/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-70℃，备用。
②表达载体pJIM19-MRDV303转化农杆菌
取0.5μg左右的pJIM19-MRDV303质粒DNA加入到200μl EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；液氮中速冻1min；取出后37℃水浴5min；冰浴2min；加入800μLYEP液体培养基，28℃，150r/min振荡培养4h；然后取200μL涂布在含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福霉素的YEP平板上，28℃培养到形成单菌落。
③阳性克隆的鉴定
挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福霉素的YEP液体培养基中，28℃，225r/min振荡培养12h，直接用菌液做PCR。PCR反应体系及扩增程序同上述步骤(1)D4)。
B.农杆菌浸染：
将含有目标载体pJIM19-MRDV303的农杆菌接种到含50mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的YEP培养基，于28℃培养2天；挑取单个菌落于含相应抗生素的1mL YEP培养基中，28℃、225r/min振荡培养12h，再将其加入含相应抗生素的50mL培养基扩大培养至OD600＝0.5；4℃、4000r/min离心5min收集菌体，用等体积的液体浸染培养基悬浮。将待转化优良玉米自交系的愈伤组织分别浸入含AS的浸染培养基，浸染5-10min。
C.共培养：
浸染了农杆菌的愈伤组织置于灭菌纸上，吸干多余水分后接种到共培养基。用保鲜膜封好平板，22℃暗培养3d。
D.清洗及恢复培养：
共培养3天后的愈伤组织用5mL含250mg/L噻孢霉素钠的灭菌蒸馏水清洗3次，置于灭菌滤纸上吸干多余水分后，接种到恢复培养基上。用保鲜膜封好平板，25℃暗培养5d。
E.筛选转化子：
恢复培养后的愈伤组织转接到含1.5mg/L除草剂草丁膦的选择培养基上。每两周后将抗性愈伤组织转接到新鲜的选择培养基上；连续筛选3代，草丁膦浓度按1.5mg/L、3.0mg/L、5.0mg/L递增；每次转接都淘汰褐色的愈伤组织。
F.转基因植株的再生：
选取抗性愈伤组织，转接到分化培养基(N6盐和维生素+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+水解酪蛋白100mg/L+KT 1mg/L，pH 5.8)上，25℃光照培养16小时/d；2-3周后，将分化出的幼苗转接到生根壮苗培养基(MS盐和维生素+肌醇100mg/L+生根粉ABT 0.25g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8)上，25℃光照培养16小时/d，即得到T0转基因植株。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明方法利用RNA干扰技术，可培育出具有优良抗粗缩病的玉米转基因植株，从根本上解决玉米粗缩病问题，显著提高玉米产量，提高其经济价值。
附图说明
图1为中间载体pBluescript SK+，构建正反向重复序列的中载体pSK-int在pBluescript SK+的MCS区插入了一段内含子；
图2为植物表达载体pJIM19(BARR)。MCS为多克隆位点区，酶切位点依次为XbaI，XhoI，StuI，SpeI，SacI；
图3为重叠PCR扩增目的基因电泳检测结果图；
图4为含正向序列中间载体pSK-int-F 303用Xho I/HindIII双酶切鉴定电泳检测结果图；
图5为含反向重复序列中间载体pSK-int-FR303用XhoI/SpeI双酶切鉴定电泳检测结果图；
图6为转基因昌7-2再生植株；
图7为再生植株目的基因PCR检测电泳结果图；
图8为田间接种病毒15天后的18-599红植株。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
实施例1
本实施例利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，包括下述主要步骤：
(1)、玉米粗缩病病毒的RNAi载体的构建
A.重叠PCR法扩增获得如SEQ ID NO.1所述的目的基因序列
通过NCBI数据库的Blast序列比对，选择MRDV的保守序列共303bp作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，在本发明中命名为MRDV-303，其核苷酸序列从左至右从5’端至3’端碱基组成如SEQ ID NO.1所述。
具体步骤如下：
1)PCR扩增获得第一段序列：
首先合成目的基因片段的中间部分片段F0(123bp-179bp)，即具有如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列，再以F0为初始模板、以下述上游引物f1和下游引物r1进行PCR扩增：
f1：TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，
r1：GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG；
扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2.0μL，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1μL，
上游引物f1 0.5μL，
下游引物r1 0.5μL，
rTaq酶 0.2μL，
ddH2O 13.0μL；
扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，59℃，30s，72℃，30s(30个循环)；
72℃，5min；10℃保温；
扩增得到第一段序列。
2)PCR扩增获得第二段序列：
以步骤1)的产物(第一段序列)为模板，设计上游引物f2和下游引物r2，分别与步骤1)产物的5’和3’端部分碱基重叠，进行PCR扩增：
f2：TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，
r2：AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG；
扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2.0μL，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1μL，
上游引物f2 0.5μL，
下游引物r2 0.5μL，
rTaq酶 0.2μL，
ddH2O 13.0μL；
扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s(30个循环)；
72℃，5min；10℃保温；
扩增得到第二段序列。
3)PCR扩增获得第三段序列：
以步骤2)的产物(第二段序列)为模板，设计上游引物f 3和下游引物r3，分别与步骤2)产物的5’和3’端部分碱基重叠，进行PCR扩增：
f3：GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，
r3：TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA；
扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2.0μL，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1.0μL，
上游引物f3 0.5μL，
下游引物r3 0.5μL，
rTaq酶 0.2μL，
ddH2O 13.0μL。
扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s(30个循环)；
72℃，5min；10℃保温；
扩增得到第三段序列。
4)PCR扩增获得目的序列：
以步骤3)的产物(第三段序列)为模板，设计上游引物f4和下游引物r4，分别与步骤3)产物的5’和3’端部分碱基重叠，进行PCR扩增：
f4：CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，
r4：AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT；
扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2.0μL，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1.0μL，
上游引物f4 0.5μL，
下游引物r4 0.5μL，
rTaq酶 0.2μL，
ddH2O 13.0μL。
扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，59℃，30s，72℃，30s(30个循环)；
72℃，5min；10℃保温。
PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行，扩增产物即为目的基因序列。
将扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，80V恒定电压电泳45min。
在步骤4)引物扩增电泳分离后，使用TI ANGEN公司琼脂糖凝胶回收和纯化试剂盒，所有操作均按说明书进行，得到纯化的回收产物。
5)连接和转化：
①回收产物连接到pMD-18T
反应体系如下：pMD-18T载体1μL(约50ng)，10×连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收PCR产物加至终反应体积10μL。
16℃连接12h。
②转化大肠杆菌DH5α
感受态细胞的制备：
a.取在无抗生素平板上生长良好的单个DH5α菌落，接种于1mL LB液体培养基中，37℃振荡培养(225r/min)过夜；
b.取500μL活化过夜的菌液于50mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4；
c.将菌液倒入50mL离心管中，冰浴10min；
d.在预冷至4℃的离心机中，4000r/min离心10min后去掉上清液，收集菌体；
e.加入20mL冰冷的0.1mol/L CaCl2于离心管中，均匀悬浮菌体后，冰浴中30min；
f.4℃下，4000r/min离心10min后去掉上清液，收集菌体，加入2mL冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液均匀悬浮菌体后，放入冰中待用。
转化步骤如下：
a.将连接产物加入200μL感受态细胞中，充分混匀置于冰上30min；
b.42℃热击1min 30s，冰浴2min后加入预热至37℃的LB液体培养基600μL；
c.37℃低速(100r/min)振荡培养50min；
d.在每个含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB固体培养基平板上加100μL菌液，均匀涂于平板上；
e.37℃培养箱中培养16h。
6)阳性克隆的筛选：
以前述步骤A4)的目的基因序列为模板，以下述引物f5和r5扩增全长目的基因序列：
f5：CCTGCTCAAATGGGAATA
r5：AACGAATGACGCTACTGC
①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12h。
②以菌液为模板进行PCR扩增，反应体系如下：DNA1μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物f45pmol，引物r45pmol，Taq DNA聚合酶1U，10×PCR缓冲液2.0μL，Mg2+1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL。
扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2.0μ L，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1.0μL，
上游引物f5 0.5μL，
下游引物r5 0.5μL，
rTaq酶 0.2μL，
ddH2O 13.0μL；
③PCR反应扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s(30个循环)；
72℃，5min；10℃保温；
将得到的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，80V恒定电压电泳45min，检测有无目的片段。
④测序：将目的片段送Invitrogen公司测序，测序结果表明扩增序列与设计的目的片段完全一致。
B.构建含正向序列的中间载体pSK-int-F303
1)PCR扩增获得正向片段：
以上述步骤A6)得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物F1和R1，其5’端分别引入限制性内切酶位点XhoI和HindIII，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全。引物序列如下：
F1：5’ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3’(XhoI)，
R1：5’CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3’(HindIII)；
PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1-10ng，dNTPs 100μmol/L，上游引物F15pmol，下游引物R15pmol，Taq DNA聚合酶1U，Mg2+1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL；
PCR反应程序为：先94℃4min；再94℃30s，58℃30s，72℃30s，循环30次；最后72℃延伸5min；
PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，80V恒定电压电泳45min，得到正向片段PCR产物。
2)PCR产物与中间载体的酶切、回收和纯化：
①PCR产物30μL酶切体系为：10×H缓冲液3.0μL，正向片段PCR产物10.0μL(约2μg)，XhoI 5U，HindIII 5U，ddH2O加至终体积30μL。
②中间载体20μL酶切体系为：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int中间载体5.0μL(约1μg)，XhoI 5U，HindIII 5U，ddH2O加至终体积20μL。
37℃温育2小时，酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶上分离，80V恒定电压电泳50分钟。
③使用TIANGEN公司琼脂糖凝胶回收和纯化试剂盒，所有操作均按说明书进行，得到纯化的回收产物。
3)正向片段连入中间载体：
①回收产物连接到中间载体pSK-int的10μL反应体系为：酶切的pSK-int中间载体2μL(约300ng)，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收正向片段酶切产物5μL(约800ng)，ddH2O加至终反应体积10μL。
16℃连接10小时。
②转化大肠杆菌DH5α，方法同上述步骤A5)。
4)正向片段阳性克隆的筛选：
①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12h。
②取培养后的菌液进行PCR扩增，反应体系如下：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F15pmol，引物R15pmol，Taq DNA聚合酶1U，Mg2+1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL。
PCR扩增程序同上述步骤B1)；
③PCR呈阳性的克隆取500μL菌液送Invitrogen公司测序，完全正确的样品用于下一步载体构建，命名为pSK-int-F303。
C.构建含反向重复序列的中间载体pSK-int-FR303
1)PCR扩增获得反向片段：
以上述步骤A6)得到的目的基因序列为模板，上下游引物F2和R2，其5’端分别引入限制性内切酶位点SpeI和PstI(下划线)，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全。引物序列如下：
F2：5’AAAACTAGTCCTGCTCAAATGGGAAT 3’(SpeI)
R2：5’AAACTGCAGAACGAATGACGCTACTGC 3’(PstI)
PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1-10ng，dNTPs 100μmol/L，引物F25pmol，引物R25pmol，Taq DNA聚合1U，Mg2+1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL。
PCR扩增程序同上述步骤B1)；
2)反向片段PCR产物与载体pSK-int-F303的酶切：
①PCR产物30μL酶切体系：10×H缓冲液3.0μL，反向片段PCR产物10.0μL(约2μg)，SpeI 5U，PstI 5U，ddH2O加至终体积30μL。
②中间载体20μL酶切体系：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int-F303中间载体5.0μL(约1μg)，SpeI 5U，PstI 5U，ddH2O加至终体积20μL。
37℃温育2h。
③酶切产物的回收、纯化、连接和转化等操作与正向片段的相同。
10μL连接体系为：pSK-int-F303中间载体2μL(约300ng)，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收反向片段酶切产物5μL(约800ng)，ddH2O加至终反应体积10μL。
16℃连接12h。
3)反向片段阳性克隆的筛选：
①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12h。
②取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系如下：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1.0μL菌液，dNTPs 100μmo l/L，引物F25pmol，引物R25pmol，TaqDNA聚合酶1U，Mg2+1.5mmol/L，ddH 2O加至终体积20μL。
PCR扩增程序同上述步骤B1)；
③PCR呈阳性的克隆取500μL菌液送Invitrogen公司测序，完全正确的即为含反向重复目的片段的中间载体，命名为pSK-int-FR303。
D.构建含反向重复序列的表达载体pJIM19-MRDV303
1)XhoI和SpeI双酶切含反向重复目的片段的中间载体pSK-int-FR303
30μ L酶切体系为：10×K缓冲液1.5μL(终浓度0.5K)，pSK-int-FR30315.0μL(约3μg)，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH2O加至终体积30μL。
37℃温育30min。
2)XhoI和SpeI双酶切植物表达载体pJIM19
30μL酶切体系如下：10×K缓冲液3.0μL，pJIM1910.0μL(约2μg)，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH2O加至终体积30μL。
37℃温育2h。
3)酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后分别回收反向重复序列和植物表达载体的大片段，所有操作按说明书进行。T4DNA连接酶连接。
10μL连接体系为：10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，正反向重复序列5μL(约1μg)，植物表达载体的大片段2μL(约200ng)，T4DNA连接酶350U，ddH2O加至终反应体积10μL。16℃连接10h。
4)阳性克隆的筛选
①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12h。
②取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系为：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F25pmol，引物R25pmol，Taq DNA聚合1U，Mg2+1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL。
PCR扩增程序同上述步骤B1)；
③PCR呈阳性的克隆在20ml含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中扩大培养，提取质粒，使用TIANGEN公司的质粒小提试剂盒，所有操作按说明书进行。XhoI和SpeI双酶切鉴定，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的条带，即为构建好的植物表达载体，命名为pJI M19-MRDV303。
(2).农杆菌介导法转化优良玉米自交系的胚性愈伤组织及植株的再生
1)植物表达载体pJIM19-MRDV303转化农杆菌：
①农杆菌感受态细胞的制备
取-70℃保存的EHA105于含有50μg/mL利福霉素平板划线，28℃培养2天。挑取单菌落接种于5mL YEP液体培养基中，225r/min，28℃振荡培养12小时左右。将5mL菌液转接于100mL YEP液体培养基中，28℃，225r/min，振荡培养至OD600＝0.5；转入无菌50mL的离心管，5000g离心5min，去上清液。加入1mL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，4℃下，5000g离心5min，去上清。加入200μL预冷的含15％甘油的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-70℃。
②表达载体p JIM19-MRDV303转化农杆菌
取0.5μg左右的pJIM19-MRDV303质粒DNA加入到200μLEHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；液氮中速冻1min；取出后37℃水浴5min；冰浴2min；加入800μLYEP液体培养基，28℃，150r/min振荡培养4h；取200μL菌液涂布在含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福霉素的YEP平板上，28℃培养形成单菌落。
③阳性克隆的鉴定
挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL利福霉素的YEP液体培养基中，28℃，225r/min振荡培养12h，直接用菌液做PCR。
PCR反应体系及扩增程序同上述步骤(1)D4)。
2)农杆菌浸染：
将含有目标载体pJIM19-MRDV303的农杆菌接种到含50mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的YEP培养基，于28℃培养2天。挑取单个菌落于含相应抗生素的1mL YEP培养基中，28℃、225r/min振荡培养12h，再将其加入含相应抗生素的50mL培养基扩大培养至OD600＝0.5；4℃、4000r/min离心5min收集菌体，用等体积的液体浸染培养基(含100μmol/L乙酰丁香酮即AS)悬浮。将昌7-2、18-599红、18-599白的愈伤组织分别浸入含AS的浸染培养基，浸侵染5-10min。
3)共培养：
浸染了农杆菌的愈伤组织置于灭菌纸上，吸干多余水分后接种到共培养基。用保鲜膜封好平板，22℃暗培养3d。
4)清洗及恢复培养：
共培养3天后的愈伤组织用5mL含250mg/L噻孢霉素钠的灭菌蒸馏水清洗3次，置于灭菌滤纸上吸干多余水分后，接种到恢复培养基上。用保鲜膜封好平板，25℃暗培养5d。
5)筛选转化子：
恢复培养后的愈伤组织转接到含1.5mg/L除草剂草丁膦的选择培养基上。每两周后将愈伤组织转接到新鲜的选择培养基上；连续筛选3代，草丁膦浓度按1.5mg/L、3mg/L、5mg/L递增；每次转接都淘汰褐色的愈伤组织。
6)转基因植株的再生：
选取抗性愈伤组织，转接到分化培养基(N6盐和维生素+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+水解酪蛋白100mg/L+KT 1mg/L，pH 5.8)上，25℃光照培养16小时/d；2-3周后，将分化出的幼苗转接到生根壮苗培养基(MS盐和维生素+肌醇100mg/L+生根粉ABT 0.25g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8)上，25℃光照培养16小时/d，即得到T0转基因植株。
经分子检测和田间接种鉴定，确定将MRDV基因转入到玉米自交系昌7-2、18-599红、18-599白中。
该阳性植株经过自交繁育、分子检测、接毒鉴定等，表明该株系是一种对玉米粗缩病具有较好抗病性的转基因作物。
序列表
<110>四川农业大学
<120>一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法
<160>2
<210>1
<211>303
<212>DNA
<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因的核苷酸序列
<400>1
cctgctcaaa tgggaatact tactgatgaa gttagactgt taatgcgaac tggtaaatta 60
agaattgacg gtggttatga tttcaattgt cccgcaagta ctacagacgt tactcactac 120
ggtggatatg atcaattttc acgtcaaatg tttgaacgtt tgaatctctt ttacaatatt 180
agtcttagca taatacccgt ttcagcttta aaaaccgttc atctatttga aaaggaatta 240
agtgttttgg atgcagacaa atctttgctt gaacaaactt ggagcgcagt agcgtcattc 300
gtt 303
<210>2
<211>57
<212>DNA
<213>抗玉米粗缩病的MRDV-303基因中间片段F0的核苷酸序列
<400>2
tggatatgat caattttcac gtcaaatgtt tgaacgtttg aatctctttt acaatat 57
Claims (2)
1.一种利用RNA干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法，其特征在于：
以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，以SEQ ID NO.2所述的F0核苷酸序列作为初始模板，分别以下述四对引物f1/r1、f3/r3、f4/r4依次进行PCR扩增，下一对引物上下游的3’端分别与上一对引物上下游的5’端有部分碱基重叠，第一对引物以F0为模板，以后每一对引物以上一对引物的产物为模板，这样每次PCR之后都在5’和3’端将目的序列延伸，最终扩增得到目的基因序列；四对引物分别如下：
f1：TCCCGCAAGTACTACAGACGTTACTCACTACGGTGGATATGATCAATTTTCAC，
r1：GCTGAAACGGGTATTATGCTAAGACTAATATTGTAAAAGAGATTCAAACG；
f2：TTAAGAATTGACGGTGGTTATGATTTCAATTGTCCCGCAAGTACTACAGAC，
r2：AACACTTAATTCCTTTTCAAATAGATGAACGGTTTTTAAAGCTGAAACGGGTATTATG；
f3：GTTAGACTGTTAATGCGAACTGGTAAATTAAGAATTGACGGTGGTT，
r3：TTGTTCAAGCAAAGATTTGTCTGCATCCAAAACACTTAATTCCTTTTCAA；
f4：CCTGCTCAAATGGGAATACTTACTGATGAAGTTAGACTGTTAATGCGAACT，
r4：AACGAATGACGCTACTGCGCTCCAAGTTTGTTCAAGCAAAGATTTGT；
将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体pSK-int，于1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入pSK-int载体中，形成含正反向重复目的片段的中间载体pSK-int-FR303；
用不同的两种限制性内切酶分别酶切中间载体pSK-int-FR 303和植物表达载体pJIM19，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到pJIM19载体中，即为构建成功的植物表达载体pJIM19-MRDV303；
将植物表达载体pJIM19-MRDV303利用农杆菌介导法分别转入优良玉米的胚性愈伤组织，通过除草剂筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：包括下述主要步骤：
(1)、玉米粗缩病病毒的RNAi载体的构建
A.重叠PCR法扩增获得如SEQ ID NO.1所述的目的基因序列
以SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列作为抗玉米粗缩病的目的基因序列，以SEQ ID NO.2所述的F0核苷酸序列作为初始模板，分别以四对引物f1/r1、f3/r3、f4/r4依次进行PCR扩增：
具体步骤如下：
1)PCR扩增获得第一段序列：
首先合成目的基因片段的中间部分片段F0，即具有如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列，再以F0为初始模板、以上游引物f1和下游引物r1进行PCR扩增；
扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2.0μL，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1.0μL，
上游引物f1 0.5μL，
下游引物r1 0.5μL，
rTaq酶 0.2μL，
ddH2O 13.0μL；
扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，59℃，30s，72℃，30s；30个循环；
72℃，5min；10℃保温；
扩增得到第一段序列；
2)PCR扩增获得第二段序列：
以步骤1)的产物为模板，以上游引物f2和下游引物r2进行PCR扩增；
扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2.0μL，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1.0μL，
上游引物f2 0.5μL，
下游引物r 20.5μL，
rTaq酶 0.2μL，
ddH2O 13.0μL；
扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s；30个循环；
72℃，5min；10℃保温；
扩增得到第二段序列；
3)PCR扩增获得第三段序列：
以步骤2)的产物为模板，以上游引物f3和下游引物r3进行PCR扩增；扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2.0μL，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1.0μL，
上游引物f3 0.5μL，
下游引物r3 0.5μL，
rTaq酶 0.2μL，
ddH2O 13.0μL；
扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s；30个循环；
72℃，5min；10℃保温；
扩增得到第三段序列；
4)PCR扩增获得目的基因序列：
以步骤3)的产物为模板，以上游引物f4和下游引物r4进行PCR扩增；扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2.0μL，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1.0μL，
上游引物f4 0.5μL，
下游引物r4 0.5μL，
rTaq酶 0.2μL，
ddH2O 13.0μL；
扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，59℃，30s，72℃，30s；30个循环；
72℃，5min；10℃保温；
扩增得到目的基因序列；
将扩增产物目的基因序列在1％琼脂糖凝胶上分离、回收和纯化，得到纯化的回收产物；
5)连接和转化：
①回收产物连接到pMD-18T
反应体系如下：pMD-18T载体1μL，10×连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收PCR产物加至终反应体积10μL；
16℃连接12小时，得到连接产物；
②转化大肠杆菌DH5α
感受态细胞的制备：
a.取在无抗生素平板上生长良好的单个DH5α菌落，接种于1ml LB液体培养基中，37℃、225r/min振荡培养过夜；
b.取500μL活化过夜的菌液于50mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.4；
c.将菌液倒入50mL离心管中，冰浴10min；
d.在预冷至4℃的离心机中，4000r/min离心10min后去掉上清液，收集菌体；
e.加入20mL冰冷的0.1mol/L CaCl2于离心管中，均匀悬浮菌体后，冰浴中30min；
f.4℃下，4000r/min离心10min后去掉上清液，收集菌体，加入2mL冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液均匀悬浮菌体后，放入冰中待用；
转化步骤如下：
a.将连接产物加入200μL感受态细胞中，充分混匀置于冰上30min；
b.42℃热击1min 30s，冰浴2min后加入预热至37℃的LB液体培养基600μL；
c.37℃、100r/min低速振荡培养50min；
d.在每个含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上加100μL菌液，均匀涂于平板上；
e.37℃培养箱中培养16小时；
6)阳性克隆的筛选：
以前述步骤4)得到的目的基因序列为模板，以下述引物f5和r 5扩增全长目的基因序列：
f5：CCTGCTCAAATGGGAATA，
r5：AACGAATGACGCTACTGC；
①挑取培养基平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12小时；
②以菌液为模板进行PCR扩增，反应体系如下：
扩增体系为，每20μL中含有：
10×PCR buffer 2.0μL，
dNTPs 1.6μL，
Mg2+ 1.2μL，
DNA模板 1.0μL，
上游引物f5 0.5μL，
下游引物r5 0.5μL，
rTaq酶 0.2μL，
ddH2O 13.0μL；
③PCR反应扩增程序为：
94℃，5min；
94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s；30个循环；
72℃，5min；10℃保温；
将得到的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离；
④测序：通过测序确定扩增得到的序列与目的基因序列是否一致；
B.构建含正向序列的中间载体pSK-int-F303
1)PCR扩增获得正向片段：
以上述步骤A 6)得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物F1和R1，其5’端分别引入限制性内切酶位点XhoI和HindIII，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全；引物序列如下：
F1：5’ATCCTCGAGCCTGCTCAAATGGGAAT 3’，
R1：5’CTCAAGCTTAACGAATGACGCTACTGC 3’；
PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA1-10ng，dNTPs 100μmol/L，上游引物F15pmol，下游引物R15pmo l，TaqDNA聚合酶1U，Mg2+1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL；
PCR反应程序为：先94℃4min；再94℃30s，58℃30s，72℃30s，循环30次；最后72℃延伸5min；
将扩增得到的产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，得到正向片段PCR产物；
2)PCR产物与中间载体的酶切、回收和纯化：
①PCR产物30μL酶切体系为：10×H缓冲液3.0μL，正向片段PCR产物10.0μL，XhoI 5U，HindIII 5U，ddH2O加至终体积30μL；
②中间载体20μL酶切体系为：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int中间载体5.0μL，XhoI 5U，HindIII 5U，ddH2O加至终体积20μL；
37℃温育4小时，将得到的酶切产物在1.0％琼脂糖凝胶上分离，再回收和纯化，得到纯化的回收产物；
3)正向片段连入中间载体：
①回收产物连接到中间载体pSK-int
10μL反应体系为：pSK-int中间载体2μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收正向片段酶切产物5μL，ddH2O加至终反应体积10μL；
16℃连接10h；
②转化大肠杆菌DH5α，方法同前述步骤A 5)；
4)正向片段阳性克隆的筛选：
①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12h；
②取培养后的菌液进行PCR扩增，反应体系如下：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F15pmol，引物R15pmol，Taq DNA聚合酶1U，Mg2+1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL；
PCR扩增程序同上述步骤B 1)；
③对PCR呈阳性的克隆，取500μL菌液进行测序，完全正确的样品用于下一步载体构建，命名为pSK-int-F303；
C.构建含反向重复序列的中间载体pSK-int-FR 303
1)PCR扩增获得反向片段：
以上述步骤A 6)得到的目的基因序列为模板，设计上下游引物F2和R2，其5’端分别引入限制性内切酶位点SpeI和PstI，酶切位点外侧添加三个保护碱基以保证酶切完全；引物序列如下：
F2：5’AAAACTAGTCCTGCTCAAATGGGAAT 3’，
R2：5’AAACTGCAGAACGAATGACGCTACTGC 3’；
PCR扩增体系为，每20μL中含有：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1-10ng，dNTPs 100μmol/L，引物F25pmol，引物R25pmol，TaqDNA聚合1U，Mg2+1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL；
PCR扩增程序同上述步骤B 1)；
2)反向片段PCR产物与载体pSK-int-F303的酶切：
①PCR产物30μL酶切体系：10×H缓冲液3.0μL，反向片段PCR产物10.0μL，SpeI 5U，PstI 5U，ddH2O加至终体积30μL；
②中间载体20μL酶切体系：10×H缓冲液2.0μL，pSK-int-F303中间载体5.0μL，SpeI 5U，PstI 5U，ddH2O加至终体积20μL；
37℃温育4小时；
③酶切产物的回收、纯化、连接和转化等操作与正向片段的相同；
10μL连接体系为：pSK-int-F 303中间载体2μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶350U，回收反向片段酶切产物5μL，ddH2O加至终反应体积10μL；
16℃连接12h；
3)反向片段阳性克隆的筛选：
①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12h；
②取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系如下：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F25pmol，引物R25pmol，Taq DNA聚合1U，Mg2+1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL；
PCR扩增程序同上述步骤B 1)；
③对PCR呈阳性的克隆，取500μL菌液进行测序，完全正确的即为含反向重复目的片段的中间载体，命名为pSK-int-FR303；
D.构建含反向重复序列的表达载体pJIM19-MRDV303
1)Xho I和Spe I双酶切含反向重复目的片段的中间载体pSK-int-FR303
30μL酶切体系为：10×K缓冲液1.5μL，pSK-int-FR30315.0μL，XhoI5U，SpeI 5U，ddH2O加至终体积30μL；
37℃温育30分钟；
2)XhoI和SpeI双酶切植物表达载体pJIM19
30μL酶切体系如下：10×K缓冲液3.0μL，pJ IM1910.0μL，XhoI 5U，SpeI 5U，ddH2O加至终体积30μL；
37℃温育2小时；
3)酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后分别回收反向重复序列和植物表达载体的大片段，所有操作按说明书进行；T4DNA连接酶连接；
10μL连接体系为：10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，正反向重复序列5μL，植物表达载体的大片段2μL，T4DNA连接酶350U，ddH2O加至终反应体积10μL；16℃连接10h；
4)阳性克隆的筛选
①挑取培养平板上生长良好的单菌落，在含有卡那霉素的LB液体培养基中37℃、225r/min振荡培养12小时；
②取培养后的菌液进行PCR扩增，20μL反应体系为：10×PCR缓冲液2.0μL，DNA 1.0μL菌液，dNTPs 100μmol/L，引物F25pmol，引物R25pmol，TaqDNA聚合酶1U，Mg2+1.5mmol/L，ddH2O加至终体积20μL；
PCR扩增程序同上述步骤B 1)；
③PCR呈阳性的克隆在20mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中扩大培养，提取质粒；XhoI和SpeI双酶切鉴定，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测含有目的片段大小的条带，即为构建好的植物表达载体，在本发明中命名为pJIM19-MRDV303；
(2).农杆菌介导法转化优良玉米的胚性愈伤组织及植株的再生
A.植物表达载体pJIM19-MRDV303转化农杆菌：
①农杆菌感受态细胞的制备
取-70℃保存的EHA105于含有50μg/mL利福霉素平板划线，28℃培养2天；挑取单菌落接种于5mLYEP液体培养基中，225r/min，28℃振荡培养12小时左右；将5mL菌液转接于100mLYEP液体培养基中，28℃，225r/min，振荡培养至OD600＝0.5；转入无菌50mL的离心管，5000g离心5min，去上清液；加入1mL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min，4℃下，5000g离心5min，去上清；加入200μL预冷的含15％甘油的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-70℃，备用；
②表达载体pJIM19-MRDV303转化农杆菌
取0.5μg左右的pJIM19-MRDV303质粒DNA加入到200μLEHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；液氮中速冻1min；取出后37℃水浴5min；冰浴2min；加入800μLYEP液体培养基，28℃，150r/min振荡培养4h，然后取200μL菌液涂布在含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福霉素的YEP平板上，28℃培养到形成单菌落；
③阳性克隆的鉴定
挑取转化后长出的农杆菌单菌落接种于含50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福霉素的YEP液体培养基中，28℃，225r/min振荡培养12h，用菌液作模板进行PCR检测；
PCR反应体系及扩增程序同上述步骤(1)D 4)；
B.农杆菌浸染：
将含有目标载体pJIM19-MRDV303的农杆菌接种到含50mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的YEP培养基，于28℃培养2天；挑取单个菌落于含相应抗生素的1mL YEP培养基中，28℃、225r/min振荡培养12h，再将其加入含相应抗生素的50mL培养基扩大培养至OD600＝0.5；4℃、4000r/min离心5min收集菌体，用等体积的液体浸染培养基悬浮；将待转化优良玉米自交系的愈伤组织分别浸入含AS的浸染培养基，浸染5-10min；
C.共培养：
浸染了农杆菌的愈伤组织置于灭菌纸上，吸干多余水分后接种到共培养基；用保鲜膜封好平板，22℃暗培养3d；
D.清洗及恢复培养：
共培养3d后的愈伤组织用5mL含250mg/L噻孢霉素钠的灭菌蒸馏水清洗3次，置于灭菌滤纸上吸干多余水分后，接种到恢复培养基上；用保鲜膜封好平板，25℃暗培养5d；
E.筛选转化子：
恢复培养后的愈伤组织转接到含1.5mg/L除草剂草丁膦的选择培养基上；每两周后将抗性愈伤组织转接到新鲜的选择培养基上；连续筛选3代，草丁膦浓度按1.5mg/L、3.0mg/L、5.0mg/L递增；每次转接都淘汰褐色的愈伤组织；
F.转基因植株的再生：
选取抗性愈伤组织，转接到分化培养基上，所述的分化培养基为：N6盐和维生素+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+水解酪蛋白100mg/L+KT 1mg/L，pH 5.8；25℃光照培养16小时/d；2-3周后，将分化出的幼苗转接到生根壮苗培养基上，所述的生根壮苗培养基为：MS盐和维生素+肌醇100mg/L+生根粉ABT 0.25g/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8；25℃光照培养16小时/d，即得到T0转基因植株。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910216417A CN101748126A (zh) | 2009-11-27 | 2009-11-27 | 一种利用rna干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法 |
| CN2010105250518A CN101979562B (zh) | 2009-11-27 | 2010-10-29 | 一种利用rna干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910216417A CN101748126A (zh) | 2009-11-27 | 2009-11-27 | 一种利用rna干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101748126A true CN101748126A (zh) | 2010-06-23 |
Family
ID=42475739
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910216417A Pending CN101748126A (zh) | 2009-11-27 | 2009-11-27 | 一种利用rna干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法 |
| CN2010105250518A Expired - Fee Related CN101979562B (zh) | 2009-11-27 | 2010-10-29 | 一种利用rna干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010105250518A Expired - Fee Related CN101979562B (zh) | 2009-11-27 | 2010-10-29 | 一种利用rna干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN101748126A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102864156A (zh) * | 2012-09-26 | 2013-01-09 | 浙江大学 | 水稻植酸相关基因zju-lpa1及培育低植酸水稻的方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110283827B (zh) * | 2019-07-17 | 2021-06-08 | 山东农业大学 | 松材线虫mog-2基因及其在发育干扰中应用 |
| CN115011591B (zh) * | 2022-06-29 | 2023-12-19 | 中国农业科学院农业基因组研究所 | 一种用于抑制薇甘菊生长发育的RNAi分子制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101138313B (zh) * | 2007-07-20 | 2011-03-30 | 山东大学 | 利用分子标记选育抗粗缩病的玉米自交系 |
-
2009
- 2009-11-27 CN CN200910216417A patent/CN101748126A/zh active Pending
-
2010
- 2010-10-29 CN CN2010105250518A patent/CN101979562B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102864156A (zh) * | 2012-09-26 | 2013-01-09 | 浙江大学 | 水稻植酸相关基因zju-lpa1及培育低植酸水稻的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101979562B (zh) | 2012-10-24 |
| CN101979562A (zh) | 2011-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2022135246A1 (zh) | 一种控制大豆-根瘤菌匹配性的r基因及其蛋白质和应用 | |
| CN105567682A (zh) | 转基因大豆事件b4j8049外源插入片段旁侧序列及其应用 | |
| CN104450711B (zh) | OsmiR156f基因在增加水稻有效分蘖并提高水稻单株产量中的应用 | |
| WO2020221029A1 (zh) | 玉米类受体激酶基因ZmRLK7及其应用 | |
| CN102363782B (zh) | 一种水稻组蛋白脱乙酰化酶基因hdt701启动子及其应用 | |
| CN111424022A (zh) | 大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用 | |
| CN105087640B (zh) | 调节植物种子发育的基因及其应用 | |
| CN102676510B (zh) | 利用人工microRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法 | |
| CN103947461B (zh) | 一种使接穗品种获得病毒抗性的方法及RNA干扰载体pCAMBIA2300-CP与转基因方法 | |
| CN101748126A (zh) | 一种利用rna干扰技术培育抗粗缩病玉米的方法 | |
| CN103772495B (zh) | 一个棉花长纤维高表达基因（GhLFHE1）及其应用 | |
| CN109988761B (zh) | 一种核苷酸序列及其在增强植物抗有害生物能力中的应用 | |
| Li et al. | Differential transformation efficiency of Japonicarice varieties developed in northern China | |
| CN105274135A (zh) | 一种广泛用于多种植物基因沉默的RNAi载体及其应用 | |
| CN103740750A (zh) | 一种培育矮化、增加分蘖、提高抗旱性的转基因植物的方法 | |
| CN103667322A (zh) | 一种抗番茄黄化曲叶病毒的多基因嵌合体avctc及其制备方法和应用 | |
| CN105175519A (zh) | 蛋白srl2在培育叶卷曲水稻中的应用 | |
| CN105219784A (zh) | 一种杂交鹅掌楸LhRGL1基因及其应用 | |
| Puhan et al. | An efficient and universal Agrobacterium-mediated transformation protocol in rice | |
| CN110511932B (zh) | 棉花纤维长度相关microRNA477及其前体DNA和应用 | |
| CN116410282B (zh) | 来源欧洲芜菁ECD04的BraA03g008044E基因在根肿菌抗性改良中的应用 | |
| CN117904143B (zh) | 陆地棉GhDIR1基因、其编码蛋白及其表达载体和应用 | |
| CN110863006B (zh) | 一种提高水稻分蘖和再生的方法 | |
| CN102776179A (zh) | 小麦矮秆基因串联重复片段及其应用 | |
| CN102206261A (zh) | 一种与植物育性相关的蛋白及其编码基因与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20100623 |