CN102864156A - 水稻植酸相关基因zju-lpa1及培育低植酸水稻的方法 - Google Patents

水稻植酸相关基因zju-lpa1及培育低植酸水稻的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水稻植酸相关基因ZJU-LPA1及培育低植酸水稻的方法，该基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还公开了培育低植酸水稻的方法，包括：构建包含水稻ZJU-LPA1基因的发夹结构单元；将所述发夹结构单元连入原始载体，构建植物表达载体；将所述植物表达载体通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织；将水稻愈伤组织转移到选择性培养基上继续培养，待分化成苗，移栽大田，筛选获得低植酸水稻植株。该基因编码含有Sulfate Transporter和STAS两个结构域的表达蛋白，不仅丰富了植酸代谢的网络途径，也为利用该基因进行水稻LPA育种和分子设计育种提供新的基因资源和理论指导。

Description

水稻植酸相关基因ZJU-LPA1及培育低植酸水稻的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体的说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆的水稻植酸相关基因ZJU-LPA1以及利用该基因培育低植酸水稻的方法。
背景技术
植酸是作物种子中最丰富的磷的贮存形式，占种子中全磷量的65～85％。植酸可与Zn2+、Fe3+、Ca2+等金属阳离子螯合成植酸盐，难以被人和非反刍动物(猪、鸡、鱼等)消化利用，降低了磷元素以及与之结合的微量元素、蛋白和淀粉的生物有效性，被认为是一种抗营养因子；此外，植酸还对生态环境具有负面效应，可引起湖泊等水系的富营养化。因此，降低植酸的含量成为育种学家、营养学家和环境学家关注的焦点之一。运用理化诱变和转基因技术，获得种子中植酸含量下降的低植酸(LPA)作物，可从源头上解决上述问题。
迄今，国内外已在水稻、大豆、玉米、大麦、小麦等作物中获得了一批LPA突变体，这些突变体不仅为LPA作物品种的选育及应用奠定了基础，也为进行LPA突变基因的定位、克隆研究提供了理想材料。利用正向(图位克隆)或反向遗传学(RNAi，T-DNA插入突变)技术，已克隆了若干LPA基因，揭示了LPA突变发生的分子机制。
植物体内的植酸代谢较为复杂，迄今还未明确。其合成代谢的大致途径如下：葡萄糖-6-磷酸在肌醇-3-磷酸合成酶(MIPS)的催化下生成肌醇-3-磷酸[Ins(3)P1]，接着在肌醇单磷酸酶的作用下生成肌醇和无机磷；后期为肌醇磷酸化/焦磷酸肌醇-磷酸化阶段，即肌醇和磷通过脂依赖和/或非脂依赖途径生成三磷酸肌醇，三磷酸肌醇经连续的磷酸化最终生成植酸。因此，植酸代谢或运输途径中任一基因突变或沉默均会导致降低植酸含量。如：大豆和水稻中MIPS基因的沉默；水稻和玉米中肌醇激酶(MIK)的突变；玉米、拟南芥和大豆中肌醇单磷酸激酶(IPK)的突变；玉米、大豆和水稻中植酸运输相关基因(MPR)基因的突变；水稻中与拟南芥中2-膦酸甘油酸激酶(2-PGK)同源基因的突变。
我国是稻米生产和消费的大国，也是铁缺乏和缺铁性贫血发生较严重的国家之一，培育具有营养与环保双重功能的LPA水稻在我国尤为重要。而获得具有自主知识产权的LPA相关新基因，则为通过传统育种手段或现代反向遗传学技术培育LPA水稻新品种提供了必要的前提，也为阐明植酸合成代谢途径奠定基础，具有重要的理论与实践意义。
发明内容
本发明提供了一种水稻植酸相关基因ZJU-LPA1，通过人工突变该基因或RNAi抑制该基因表达，可以有效降低水稻种子中的植酸含量。
一种水稻植酸相关基因ZJU-LPA1，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
一种所述水稻植酸相关基因ZJU-LPA1编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种培育低植酸水稻的方法，包括：
利用射线对水稻种子进行射线诱变处理，种植若干代后，筛选水稻ZJU-LPA1基因表达框被破坏的纯合型突变体；
所述水稻ZJU-LPA1基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
所述水稻种子的品种为三系晚籼恢复系“明恢86”和三系籼稻恢复系“中9B”。
所述射线为137Cs-γ射线。
所述射线诱变剂量为300Gy。
本发明提供了另一种培育低植酸水稻的方法，包括：
(1)构建ZJU-LPA1基因RNAi的发夹结构单元；
(2)将所述发夹结构单元连入中间载体，构建植物表达载体；
(3)将所述植物表达载体通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织；
(4)将水稻愈伤组织转移到选择性培养基上继续培养，待分化成苗，移栽大田，筛选获得低植酸水稻植株。
所述发夹结构单元包括中间的内含子及两端的目的基因片段和目的基因片段的反向互补片段，所述目的基因片段为ZJU-LPA1基因CDS序列的部分序列，ZJU-LPA1基因CDS碱基序列如SEQ ID No.3所示，内含子在本发明中没有特异性的要求，它可以是来自pSSK-IN载体，碱基序列如SEQ ID NO.24所示。
扩增所述目的基因片段的引物为：
RiF：5’-CAGTTGGTAGGACATTTGCTTCA-3’；
RiR：5’-TGCCTTTGATGTTCCCTTGA-3’。
优选的，所述原始载体为pCAMBIA 1301-35SN。
优选的，将所述低植酸水稻植株种植若干代，获得性状稳定的株系。
本发明利用水稻低植酸突变体，通过图位克隆方法在水稻中克隆到了水稻ZJU-LPA1基因，并通过互补实验对基因功能进行了验证。该基因编码含有Sulfate Transporter和STAS两个结构域的表达蛋白，利用RNAi技术降低该基因的表达，可以获得水稻低植酸材料。该基因的克隆不仅丰富了植酸代谢的网络途径，也为利用该基因进行水稻LPA育种和分子设计育种提供新的基因资源和理论指导。
附图说明
图1是水稻低植酸突变体、野生型及功能互补实验T1代转基因种子的无机磷比色。1：由上至下依次为5个标准P对照，含量依次为0.00μg、0.15μg、0.46μg、0.93μg、1.39μg；2：野生型明恢86；3：lpa1；4：功能互补实验T1种子；5：RNAi T2代纯合LPA植株种子
图2是ZJU-LPA1基因在水稻第4号染色体上的初步定位图；
图3是ZJU-LPA1候选基因的克隆；
图4是转基因表达载体图谱，A：pCAMBIA1301+ZJU-LPA1互补载体；B：pCAMBIA1301-35SN+RNAi表达载体。
具体实施方式
实施例1、ZJU-LPA1基因的分离和克隆
1、水稻低植酸突变体zju-lpa1的获得
水稻(Oryza sativa L.)低植酸突变体zju-lpa1，由三系晚籼恢复系明恢86(MH86)通过300Gy的137Cs-γ射线诱变获得。选育途径如下：2002年夏，辐照MH86水稻干种子，杭州种植混收M1:2种子；2003年夏，单株种植收获M2:3种子，检测无机磷(Pi)含量，筛选含高无机磷(HIP)籽粒植株7个；2004年冬海南陵水南繁基地加代获得4个纯合HIP株系，2个纯合HIP植株，另1个材料仍在分离；2005年杭州夏继续种植获得2份纯合HIP株系，1份纯合HIP植株；上述材料扩大种植形成7个HIP株系，依次命名为zju-lpa1-1～zju-lpa1-7。等位性测验表明zju-lpa1-1～zju-lpa1-7之间相互等位，但与本实验室获得的另外3个低植酸材料互不等位，为1个新低植酸突变材料，该基因命名ZJU-LPA1。
其等位突变体Z9-lpa为籼稻品种“中9B”通过300Gy137Cs-γ射线采用上述相似方法诱变筛选获得。相比野生型，zju-lpa1-1突变体植酸含量下降44％，无机磷含量升高3.4倍，总磷含量基本不变(图1)。Z9-lpa突变体植酸含量下降40％，无机磷含量升高1.5倍，总磷含量基本不变(Liu，Q.L.，Xu，X.H.，Ren，X.L.，Fu，H.W.，Wu，D.X.，and Shu，Q.Y.2007.Generation andcharacterization of low phytic acid germplasm in rice(Oryza sativa L.).Theoretical and Applied Genetics 114(5)：803-814)。
2、遗传分析和定位群体构建
纯合的zju-lpa1-1突变体分别和正常表型粳稻品种日本晴和DH1进行杂交，F1代自交，得到F2群体，在分蘖盛期每个单株标记并取1克左右的嫩叶，然后单株收获F2:3种子，钼酸铵比色法检测水稻种子的无机磷含量，每株检测8粒。从中选出一共1181株LPA突变表型的个体为定位群体，找出对应的编号叶片，用来提取总DNA。
3、ZJU-LPA1基因的定位
采用水稻微量DNA提取法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA。具体如下：取约0.2克水稻叶片放入1.5ml离心管中并使用组织磨样器将样品磨碎，CTAB法提取总DNA，溶解在200μl灭菌超纯水中作为DNA样品，每个PCR反应使用1.5μl样品。
ZJU-LPA1基因的初步定位：通过钼酸铵无机磷比色法检测上述定位群体的F2:3种子，首先选取197个隐性样本，组成小群体，结合基因池法，进行SSR多态性分析。根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取平均分布在各染色体上的SSR引物，根据已知的反应条件进行PCR扩增，PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液2.0μl(含Mg2+)，上、下游引物(浓度分别为10μM)各0.4μl，10mM的dNTP 0.4μl，DNA模板1.5μl；0.2μl的5U/Tag DNA聚合酶，补灭菌水至20μl。PCR程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸7min。经8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，检测PCR产物的多态性，将ZJU-LPA1基因初步定位在水稻第4号染色体长臂上的RM5478和RM17567分子标记之间(图2)。
ZJU-LPA1基因的精细定位：从上述定位群体中，扩大定位单株至1181株，在初步定位的基础上继续设计SSR、InDel、CAPS标记，最终将ZJU-LPA1基因精确定位于BAC号为AL606690区段上112kb的范围之内，两边的分子标记分别为CAPS3和ID26，并且与分子标记CAPS2和ID19共分离(图3)。
表1、基因定位主要引物及其序列
Figure BDA00002198971200051
4、候选基因预测和比较分析
根据水稻数据库TIGR(http://rice.plantbiology.msu.edu/)的注释，在定位区域的112kb中共有14个基因，其中6个为转座/反转座相关蛋白，与植酸代谢途径相关性不大。对其余8个基因我们分别设计测序引物，在突变体和野生型中分别逐一扩增测序比对分析，发现仅在其中一个基因(LOC-Os04g55800)的第12个外显子中，zju-lpa1-1相比野生型MH86有一个碱基差异，进一步对zju-lpa1-2～zju-lpa1-7这6个等位基因材料测序发现为同一碱基位点突变。同时，我们对另一个不同背景来源的等位突变材料Z9-1pa测序分析发现，相比野生型Z9B，Z9-lpa在ZJU-LPA1基因的第一个外显子上有一个6bp的缺失(图3)。该基因的测序引物见表2。
表2.ZJU-LPA1基因测序引物
根据TIGR数据库的基因注释和NCBI数据库同源比对搜索，预测该基因编码含有Sulfate transporter和STAS两个结构功能域的表达蛋白。ZJU-LPA1基因的基因组碱基序列如SEQ ID No：1所示，该基因编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，编码该蛋白质的CDS碱基序列为SEQ ID No：3所示。
实施例2、基因功能互补实验
将水稻基因组BAC克隆AL606690用限制性内切酶Kpn I和EcoR I完全酶切，电泳分离后，纯化回收约12kb的DNA片段并连接到表达载体pCAMBIA 1301中，该克隆覆盖了这个ORF的基因组区域，包括起始密码子ATG上游3.96kb启动子序列和终止密码子TGA下游的2.6kb的调控序列(还包含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列)，从而构建成双元质粒载体pCAMBIA 1301+promoter+LPA1+nos。
将该质粒通过热击的方法转入农杆菌EHA105中转化水稻zju-lpa1。大致流程如下：利用zju-lpa1成熟胚诱导的愈伤组织，经过诱导培养基继代2-3代，挑选生长旺盛、颜色鲜黄、质地紧密的胚性愈伤组织颗粒做转化的受体，用含有上述双元质粒载体的农杆菌EHA105菌株浸染水稻愈伤，25℃暗培养3天后，在含有30mg/L Hygromycin的筛选培养基上培养14天，重复筛选培养1次，然后将筛选出的愈伤组织转至含有50mg/LHygromycin的筛选培养基上继续筛选14天，将继续分裂生长的抗性愈伤转与分化培养基上光照培养，约7天后愈伤开始转绿，21天后开始长出幼芽，然后移至生根培养基上生长14天，经炼苗后转入大田。
对突变体成熟胚转基因后的再生植株进行分子鉴定。对收获的T1代种子进行钼酸铵无机磷比色法鉴定，发现转基因互补试验的水稻种子中植酸含量恢复至野生型水平(图1，表3)，证实该LPA候选基因为ZJU-LPA1基因。
表3.不同来源水稻种子中的植酸含量
  材料名称   植酸含量(mg/g)   材料类型
  MH86   2.57±0.04   野生型
  zju-lpa1   1.44±0.02   LPA突变体
  Z9B   2.39±0.04   野生型
  Z9B-lpa   1.33±0.08   LPA突变体
  ZC01   2.47±0.03   互补实验阳性植株
  ZC03   1.52±0.05   转基因阴性对照植株
  ZR02   0.93±0.02   RNAi阳性植株
  ZR06   2.34±0.03   转基因阴性对照植株
实施例3、ZJU-LPA1基因沉默降低水稻种子植酸含量
提取水稻明恢86种子中的总RNA，反转录成cDNA，根据序列SEQID NO.3设计引物扩增ZJU-LPA1基因的部分片段，引物信息如下：
RiF：5’-CAGTTGGTAGGACATTTGCTTCA-3’；
RiR：5’-TGCCTTTGATGTTCCCTTGA-3’。
PCR扩增产物经克隆测序验证后，分别经过限制性内切酶NotI+BamHI和KpnI+XhoI酶切后连入同样处理的pSSK-IN RNAi中间载体形成“目的基因片段、内含子、目的基因片段(反向)”的RNAi发夹结构，最后，通过NotI+KpnI双酶切位点连入表达载体pCAMBIA 1301-35SN(由pCAMBIA 1301载体改造获得)。鉴定获得的阳性的克隆导入农杆菌EHA105中，转化水稻日本晴材料。转基因步骤参照实施例2。
在获得的12个转基因独立株系中，经GUS显色和RT-PCR分析后，获得8个阳性T1植株，进一步种植鉴定获得3个稳定的T2代转基因株系。无机磷比色和植酸含量测定表明，不同的株系之间植酸下降幅度不同，最高的植酸含量下降幅度达到60％左右(图1，表3)。
Figure IDA00002198972100011
Figure IDA00002198972100021
Figure IDA00002198972100031
Figure IDA00002198972100041
Figure IDA00002198972100051
Figure IDA00002198972100061
Figure IDA00002198972100071
Figure IDA00002198972100081
Figure IDA00002198972100101
Figure IDA00002198972100111
Figure IDA00002198972100121
Figure IDA00002198972100131
Figure IDA00002198972100141
Figure IDA00002198972100151

Claims (9)

1.一种水稻植酸相关基因ZJU-LPA1，其特征在于，碱基序列如SEQID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述水稻植酸相关基因ZJU-LPA1编码的蛋白质，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种培育低植酸水稻的方法，包括：
利用射线对水稻种子进行射线诱变处理，种植若干代后，筛选水稻ZJU-LPA1基因表达框被破坏的纯合型突变体；
所述水稻ZJU-LPA1基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻种子的品种为三系晚籼恢复系“明恢86”和三系籼稻恢复系“中9B”。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述射线为137Cs-γ射线。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述射线诱变剂量为300Gy。
7.一种培育低植酸水稻的方法，包括：
(1)构建ZJU-LPA1基因RNAi的发夹结构单元；
(2)将所述发夹结构单元连入原始载体，构建植物表达载体；
(3)将所述植物表达载体通过农杆菌介导转化水稻愈伤组织；
(4)将水稻愈伤组织转移到选择性培养基上继续培养，待分化成苗，移栽大田，筛选获得低植酸水稻植株。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述原始载体为pCAMBIA 1301-35SN。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述低植酸水稻植株种植若干代，获得性状稳定的株系。
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