CN102533762B - 一种获得脱致敏转基因大豆新材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学与生物技术领域，涉及一种获得脱致敏转基因大豆新材料的方法。该方法是将大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi通过农杆菌介导的方法导入大豆；所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi是将序列为SEQ ID NO.2的Gly m Bd 30K基因的发卡结构插入到载体pCAMBIA3301的PmI I和BstEII位点得到。本发明获得的脱致敏转基因大豆籽粒中过敏蛋白Gly m Bd 30K基因的表达量明显降低，同时转化株具有除草剂抗性。

Description

一种获得脱致敏转基因大豆新材料的方法

技术领域

本发明属于分子生物学与生物技术领域，涉及一种获得脱致敏转基因大豆新材料的方法。

背景技术

大豆是重要的植物蛋白来源之一，同时也是8类主要致过敏食物之一(Metcalfe D.Thenature and mechanisms of food allergies and related diseases.Food technology，1992，5(5)：136-140)。Ogawa等(1991)通过免疫印迹技术在大豆中检测到15种过敏蛋白质，并对有食物过敏史的人检测发现，14％的人对大豆过敏，仅次于对蛋清的反应(26.7％)。近年来包括中国在内的世界各国对大豆的消费迅速增长，增加了大豆蛋白引发过敏的几率。(Ogawa T，Bando N，Tsuji H，Okajima H，Nishikawa K，Sasaoka K.Investigation of theIgE-binding proteins in soybeans by immunoblotting with the sera of the soybeansensitive patients with atopic dermatitis.Journal of Nutritional Science andVitaminology，1991，37：555-565.)

Gly m Bd 30K、Gly m Bd 60K和Gly m Bd 28K是大豆中的3种主要过敏蛋白。Gly mBd 30K也称为P34，是半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族的一个边缘成员。与Ig E结合试验中表明，超过65％以上对大豆敏感的病人仅对Gly m Bd 30K蛋白过敏，因此Gly m Bd 30K蛋白被视为大豆蛋白中一个重要的免疫显性过敏原。目前还没有筛选到30K缺失或低含量的种质。在美国Yaklich等(1999)筛选美国农业部大豆核心种质，发现30K含量相似，且野生亲缘种也不缺失30K。(Yaklich RW，Helm RM，Cockrell G，Herman EM.Analysis of thedistribution of the major soybean seed allergens in a core collection of Glycine maxaccessions.Crop Science，1999，39：1444-1447.)日本用诱变方法在改造β-伴球蛋白起了很大的作用，但去除30K的努力并没取得成功。在我国关荣霞等(2004)筛选了175份多样性广的、具有代表性的中国大豆品种也没有检测到缺失30K过敏原的材料。(关荣霞，常汝镇，邱丽娟，刘章雄，郭顺堂.栽培大豆蛋白亚基11S/7S组成及过敏蛋白缺失分析.作物学报，2004，11：1076-1079.)这些结果表明，直接利用目前的种质资源培育低30K过敏原的大豆品种似乎是比较困难的。

RNAi是最近几年才发展起来的研究生物体基因表达、调控与功能的一项技术，是由小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象。其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合并引起降解，从而阻止mRNA的翻译。将小片段双链RNA(siRNA)导入细胞，siRNA结合一个核酶复合物，从而形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，激活的RISC通过碱基配对定位到mRNA转录本上，并在距离siRNA 3`端12个碱基的位置切割mRNA，引起mRNA的降解，从而特异性抑制靶基因的表达，是基因敲除(knockdown or knockout)的强大工具，在功能基因组研究和基因治疗中有很好的前景。(Lipardi C，Wei Q，Paterson BM.RNAi as random degradative PCR：siRNA primersconvert mRNA into dsRNAs that are degradedto generate new siRNAs.Cell，2001，107，297-307.)

在植物中持久表达RNA沉默通常是先构建表达载体，然后通过PEG介导、电穿孔介导、农杆菌侵染等方法使设计的序列整合到植物基因组中并稳定表达。由于农杆菌侵染法技术的成熟，在持久性的RNA沉默研究中得到了广泛应用。构建hpRNA高效表达载体用于特定基因沉默是研究的热点之一。Wesley等(2001)系统研究了不同结构的RNA对沉默效率的影响，发现相比于单链正义或反义RNA，双链RNA尤其是发夹式结构的RNA(hpRNA)对RNA沉默的效率有非常显著的提高。(Wesley SV，Helliwell CA，Smith NA，Wang MB，Rouse DT，Liu Q，Gooding PS，Singh SP，Abbott D，Stoufjesdijk PA，Robinson SP，Gleave AP，Green AG，Waterhouse PM.Construct design for efficient，effective andhigh-throughput gene silencing in plants.Plant Journal，2001，27：581-590.)如果在发夹结构的反向重复序列间加入一段非编码序列如内含子，在植物体内转录形成含内含子的发卡结构(intronsplicinghpRNA，ihpRNA)，则沉默效果与hpRNA相比可从58％提高到90％。Stoutjesdijk等(2002)采用FAD2基因的5′UTR片段也有效地沉默了该基因。(Stoutjesdijk P，Singh SP，Liu Q，Hurlstone C，Waterhouse P，Green A.hpRNA-mediated targeting ofthe Arabidopsis FAD2gene gives highly efficient and stable silencing.PlantPhysiology，2002，129：1723-1731.)

目前，构建植物干扰表达载体通过遗传转化的方法来降低大豆Gly m Bd 30K致敏性的研究报道在国内很少。Herman等(2003)通过遗传修饰去除大豆主要的过敏原30K已获得成功，遗传修饰后在30K多肽含量受抑制，但多肽结构上没有显著的变化，进一步观察发现30K沉默性状可在子代中稳定遗传，且它们的生长性、蛋白含量、含油率等农艺学性状与未遗传改造的对照株没有显著的差异，更说明通过遗传修饰得到的30K沉默植株确能有效地去除过敏原。(Herman EM，Helm RM，J ung R，Kinney AJ.Genetic modification removes animmunodominant allergen from soybean.Plant Physiology，2003，132：36-43.)这也为遗传改良去除大豆中过敏蛋白基因提供了可能。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种获得脱致敏转基因大豆新材料的方法。

一种转基因脱致敏大豆新材料的制备方法，将大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi通过农杆菌介导的方法导入大豆；所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi是将序列为SEQ ID NO.2的Gly m Bd 30K基因的发卡结构插入到载体pCAMBIA3301的PmI I和BstE II位点得到。

所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体的构建方法，包括如下步骤：

1)大豆过敏蛋白基因Gly m Bd30K干扰片段序列SEQ ID NO.1的获得：以大豆‘NY1001’籽粒为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以大豆cDNA为模板，设计上游引物Ps：SEQ ID NO.3，下游引物Pa：SEQ ID NO.4，扩增得到大豆过敏蛋白基因Gly m Bd30K的干扰片段，PCR产物连接到pMD19-T载体，测序验证；

2)内含子序列的获得

以质粒pCAMBIA3301为模板，设计上游引物Is：SEQ ID NO.5，下游引物Ia：SEQ ID NO.6扩增得到内含子序列，PCR产物连接到pMD19-T载体，测序验证；

3)发卡结构序列的获得

通过融合PCR的方法，设计四条引物P₁：SEQ ID No.7、P₂：SEQ ID No.8、P₃：SEQ ID No.9，P₄：SEQ ID No.10进行3轮PCR，将30K干扰片段与内含子序列以大豆过敏蛋白基因Glym Bd30K的干扰片段反向序列-内含子-大豆过敏蛋白基因Gly m Bd30K的干扰片段正向序列的形式连接，形成发卡结构，并导入酶切位点PmI I和BstE II，PCR产物连接到pMD 19-T载体，测序验证；

4)30K干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建

PmI I/BstEII双酶切发卡结构的PCR产物，插入到pCAMBIA3301载体PmI I和BstE II位点，酶切验证，干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi构建成功。

转染所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的细胞。

所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi在转基因大豆脱致敏新材料、新品种培育中的应用。

有益效果：

本发明构建了一个沉默大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 30K基因的RNAi发卡结构，并导入到含有除草剂抗性基因(bar)的表达载体pCAMBIA3301中，获得植株干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi。bar基因既可作为筛选标记基因，也可以作为抗除草剂的功能基因。转基因大豆籽粒中过敏蛋白Gly m Bd 30K基因的表达量明显降低，同时转化株具有除草剂抗性。

附图说明

图1干扰载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建流程

图2植物表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的鉴定

A：30K干扰片段琼脂糖凝胶电泳分析

M：DNA Marker(2Kb/1Kb/0.75Kb/0.5Kb/0.25Kb/0.1Kb)，1：30K干扰片段；

B：内含子片段琼脂糖凝胶电泳分析

M：DNA Marker(1.5Kb/1Kb/0.9Kb/0.8Kb/0.7Kb/0.6Kb/0.5Kb/0.4Kb/0.3Kb/0.2Kb/0.1Kb)，1：内含子；

C：30K片段反向连接到内含子的5`端琼脂糖凝胶电泳分析

M：DNA Marker(2Kb/1Kb/0.75Kb/0.5Kb/0.25Kb/0.1Kb)，1：30K反向-内含子；

D：30K片段正向连接到内含子的3`端琼脂糖凝胶电泳分析

M：DNA Marker(2Kb/1Kb/0.75Kb/0.5Kb/0.25Kb/0.1Kb)，1：发卡结构；

E：植物干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi质粒双酶切检测琼脂糖凝胶电泳分析

M：DNA Marker(10Kb/9Kb/8Kb/7Kb/6Kb/5Kb/4Kb/3Kb/2Kb/1Kb)，

1：pCAMBIA3301-30K-RNAi双酶切(PmI I/BstE II)；

图3植物干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi图谱

图4转基因大豆的再生

A：无菌苗；B：子叶节外植体；C：农杆菌菌液；D：不定芽的形成；E：芽伸长；F：再生植株生根；F：移植成苗

图5转基因大豆T₁代植株PCR鉴定

A：bar基因的PCR扩增；B：GUS基因的扩增

M：DNA Marker(2Kb/1Kb/0.75Kb/0.5Kb/0.25Kb/0.1Kb)；P：阳性对照(质粒)；WT：阴性对照(野生型植株)；1，2，3，4，6，7，8，9，10，13，14，15：转化植株；11，12：分离植株

图6转基因大豆叶片Basta涂抹鉴定

A：转基因大豆叶片；B：野生型大豆叶片

图7转基因大豆花和种子GUS染色鉴定

A：花GUS染色；B：种子GUS染色

图8转基因大豆30K基因相对表达量的测定

提取转基因大豆籽粒总RNA，反转录成cDNA后用于荧光定量PCR。大豆环孢素A受体基因(CYP2)作为内参基因。通过公式2^-ΔΔCT计算出T₁代12棵转化株相对于对照株中30K基因的相对表达量。

具体实施方式

下述实施方法若无特殊说明均为常规方法。

下述实施方法中所用的试剂、材料，如无特殊说明均可通过商业途径得到。

实施例1植物双价表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建

本发明所构建植物表达载体以pCAMBIA3301载体为基础载体，构建的策略如图1所示，具体实施方式如下：

1.30K干扰片段的克隆：

选用结荚期大豆‘NY1001’的嫩荚作为材料，参照TaKaRa公司总RNA提取试剂盒(目录号：D9108A)说明书方法，提取籽粒总RNA并反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，参照大豆Gly m Bd 30K (以下简称30K)基因序列信息(NCBI登录号：EU883600)，设计引物扩增序列为SEQ ID NO.1所示的30K干扰片段；

上游引物Ps：5′-CCTTGTGTTGCTTCTTTTCTCC-3′(SEQ ID NO.3)

下游引物Pa：5′-GATGGTCACAAGAATATTGTTC-3′(SEQ ID NO.4)

以上述籽粒cDNA为模板，进行PCR反应，凝胶电泳检测(如图2-A所示)50μL反应体系包含：10×PCR Buffer 5.0μL，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L^-1)，MgCl₂ 3μL(25mmol·L^-1)，Ps、Pa引物各1.0μL(20μmol·L^-1)，Taq DNA Polymerase 0.2μL，cDNA模板1.0μL，ddH₂O补至50μL；反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30sec，51.8℃复性30sec，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN，目录号：AP-GX-50)回收纯化，用T₄DNA连接酶(TaKaRa，目录号：D2011A)连接到pMD19-T载体(TaKaRa，目录号：D102A)，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定；

2.内含子序列的克隆：

以质粒pCAMBIA3301为模板，参照GUS基因(NCBI登录号：AF485783)中内含子序列信息设计引物扩增内含子片段；

上游引物Is：5′-GTAAATTTCTAGTTTTTCTCCT-3′(SEQ ID NO.5)

下游引物Ia：5′-CTGTAACTATCATCATCATCAT-3′(SEQ ID NO.6)

以质粒pCAMBIA3301为模板，进行PCR反应，凝胶电泳检测(如图2-B所示)。50μL反应体系包含：10×PCR Buffer 5.0μL，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L^-1)，MgCl₂ 3μL(25mmol·L^-1)，Is、Ia引物各1.0μL(20μmol·L^-1)，Taq DNA Polymerase 0.2μL，cDNA模板1μL，ddH₂O补至50μL；反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30sec，45.3℃复性30sec，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化，用T₄DNA连接酶连接到pMD19-T载体，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定；

3.发卡结构的构建

通过融合PCR的方法将三个片段(反向A-内含子I-正向S)连接起来。设计四条引物，P₁、P₂、P₃、P₄，在两端引入酶切位点PmII和BstEII。以下用PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase(TaKaRa目录号：DR010A)

引物序列：

30k反向序列上游引物P₁：5`-ACCACGTGGATGGTCACAAGAAT-3`(SEQ ID No.7)

30k反向序列下游引物P₂：5`-ACTAGAAATTTACCCTTGTGTTG-3`(SEQ ID No.8，P₂各有A和I的部分序列)

内含子的下游引物P₃：5`-GAAGCAACACAAGGCTGTAACTATCA-3`(SEQ ID No.9，P₃各有I和S的部分序列)

30k正向序列的下游引物P₄：5`-TATGGTGACCGATGGTCACAAGAAT-3`(SEQ IDNo.10)

(1)第一轮PCR：以Gly m Bd 30K干扰片段为模板，P₁、P₂为引物进行扩增：

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5.0μL，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L^-1)，引物P₁和P₂各1.0μL(20μmol·L^-1)，P rimeSTAR^TM HS DNA Polymerase 0.4μL，cDNA模板1μL，ddH₂O补至50μL；反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30sec，52℃复性1min，72℃延伸45s，30个循环后，72℃总延伸10min，获得部分融合的A。

加A反应：5μL 10x A-Tailing Buffer，4μL dNTP Mixture，0.5μL A-Tailing Enzyme(TaKaRa，D404)，4μg DNA，ddH₂O补至50μL。72℃反应20min，冰置1-2min。PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化，用T₄DNA连接酶连接到pMD19-T载体，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定；

(2)第二轮PCR：以融合片段A和I为模板，P₁、P₃为引物进行扩增：

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5.0μL，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L^-1)，A片段和I片段各1.0μL(20μmol·L^-1)作模板，引物P₁、P₃各1.0μL，PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase 0.4μL，ddH₂O补至50μL；反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30sec，54.7℃复性30sec，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min，获得部分融合的A-I(如图3-C所示)。

加A反应：5μL 10×A-Tailing Buffer，4μL dNTP Mixture，0.5μL A-Tailing Enzyme，4μg DNA最后补水至50μL。72℃反应20min，冰置1-2min。PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化，用T₄DNA连接酶连接到pMD19-T载体，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定；(3)第三轮PCR：以融合片段A-I和Gly m Bd 30K干扰片段为模板，P₁、P₄为引物进行PCR扩增：

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5.0μL，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L^-1)，融合片段A-I和Gly m Bd 30K干扰片段各1.0μL作模板，P₁、P₄1.0μL，PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase0.4μL，ddH₂O补至50μL；反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min，获得发卡结构A-I-S(如图2-D所示)。

加A反应：5μL 10x A-Tailing Buffer，4μL dNTP Mixture，0.5μL A-Tailing Enzyme，4μg DNA最后补水至50μL。72℃反应20min，冰置1-2min。PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化，用T₄DNA连接酶连接到pMD19-T载体，转化TOP10感受态细胞，进行序列测定，获得的发卡结构A-I-S序列如SEQ ID NO.2所示；

4.植物干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建

(1)PmII和BstEII双酶切：分别取pCAMBIA3301载体和第3步所得到发卡结构的PCR产物各15μL用PmI I和BstE II双酶切，双酶切体系(50μL)：10×Buffer 15μL(NEB)，BSA0.5μL，DNA 15μL，BstEII1.0μL，PmII 1.0μL，ddH₂O补至50μL；37℃反应3h；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，回收质粒pCAMBIA3301大片段和发卡结构小片段；

(2)上述回收的大片段和小片段，按照1∶4的比例，用T₄DNA连接酶连接，连接反应体系：10×T₄ligase Buffer 2.5μL，pCAMBIA3301大片段2μL，发卡结构小片段8μL，T₄DNA连接酶1μL，ddH₂O补至25μL；16℃反应过夜，取10μL连接产物转化TOP10感受态细胞。37℃过夜培养，挑取单克隆扩大培养，提取质粒，进行双酶切验证(如图2-E所示)，植物表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建成功(如图3所示)。

实施例2质粒pCAMBIA3301-30K-RNAi转染农杆菌EHA105

(1)质取2μg(10μl)纯化的质粒pCAMBIA3301-30K-RNAi，加入200μL农杆菌EHA105感受态，混匀；

(2)冰浴5min，转入液氮冷冻1min；

(3)加入800μL YEB液体培养基，250rpm，28℃，4-5h；

(4)用移液器将菌液移至YEB固体选择培养基(含相应抗生素)均匀涂布；

(5)28℃培养1-2d，挑取单菌落，提质粒，酶切检测。

实施例3农杆菌介导30K干扰表达载体转化大豆

1.外植体的制备及侵染

取成熟饱满的大豆‘NY1001’种子，表面消毒后接种于萌发培养基(B5+3％蔗糖+0.8％琼脂，pH 5.8)，25℃条件下，光照(16/8h，90μmol m^-2s^-1)培养5-6天获得无菌苗(如图4-A所示)。保留子叶下方2-3cm的下胚轴，垂直沿下轴胚将子叶分开，水平划5-7次腋芽原基区，得到子叶节外植体(如图4-B所示)。

将农杆菌EHA105(含pCAMBIA3301-30K-RNAi)划线于平板，28℃培养24h，挑取单克隆液体培养24h，然后取2ml菌液加入200ml YEP液体培养基中，扩大培养至OD₆₅₀为0.6-0.8，菌液离心后，用液体共培养培养基(1/10B5，1.67mg·L^-16-苄基氨基嘌呤，0.25mg·L^-1赤霉素，200μmol·L^-1乙酰丁香酮，3％蔗糖和0.7％琼脂，pH 5.4)重悬，调节OD₆₅₀值为1(如图3-C所示)。

外植体放入到50ml重悬菌液中，侵染30min。侵染结束后，吸干多余菌液，将外植体近轴面向下接种于铺有一层滤纸的共培养基(添加3mmol·L^-1L-半胱氨酸，1mmol·L^-1硫代硫酸钠和二硫苏糖醇)，25℃暗培养4天。

2.大豆的再生

共培养结束后的外植体，用液体芽诱导培养基(B5，1.67mg·L^-16-苄基氨基嘌呤，500mg·L^-1羧苄青霉素，3％(w/v)蔗糖，3mmol·L^-1MES，pH 5.6)摇动洗涤4-5次，近轴面向上接种于固体芽诱导培养基(液体芽诱导培养基+0.8％琼脂)。25℃光照(16/8h，90μmolm^-2s^-1)培养10天。10天后，外植体接种于芽诱导筛选培养基(芽诱导培养基+4mg·L^-1双丙氨磷)，筛选培养4周，每2周继代一次。

筛选后含有丛生芽的外植体(如图4-D所示)，接种到芽伸长培养基(MS，1mg·L^-1玉米素，0.5mg·L^-1赤霉素，0.1mg·L^-1吲哚乙酸，100mg·L^-1焦谷氨酸，50mg·L^-1 L-天冬酰胺，300mg·L^-1羧苄青霉素，2mg·L^-1双丙氨磷，3％蔗糖，3mmol·L^-1MES和0.8％的琼脂，pH 5.6)，芽伸长6-8周，每隔两周继代1次。

待芽伸长至3-4cm时(如图4-E所示)，用手术刀从基部切下，转入生根培养基(1/2B5，0.5mg·L^-1 IBA，3％蔗糖，0.8％琼脂，pH 5.6)，根长至1-2cm长时(如图4-F所示)，驯化移入温室，常规管理，直至成熟收获(如图4-G所示)。

实施例3转基因大豆的鉴定

1.转基因大豆植株PCR鉴定

取转基因大豆幼嫩籽粒，SDS法，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别设计GUS和bar基因的引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检测(如图5所示)。通过对转化植株中外源基因GUS和bar的PCR检测，初步证实植株的转基因特性。

上游引物GUS 1：5`-TGGTGACGCATGTCGCGCAAGAC-3`(SEQ ID No.11)

下游引物GUS2：5`-GGTGATGATAATCGCCTGATGCAG-3`(SEQ ID No.12)

上游引物bar1：5`-GCACCATCGTCAACCACTAC-3`(SEQ ID No.13)

下游引物bar2：5`-TGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3`(SEQ ID No.14)

GUS基因的PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性45sec，55℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min，bar基因的PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性45sec，58℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min。

2.转基因大豆Basta涂抹鉴定

选取健康生长的转基因大豆和野生型大豆叶片，用棉棒蘸取0.05％Basta涂抹于半张叶片，五天之后观察叶片表现，拍照记录(如图6所示)。图6所示，非转基因植株涂抹Basta的半张叶片表现出失绿，而转基因植株的叶片正常，显示出Basta的抗性。

3.转基因大豆花和种子的GUS鉴定

取转基因大豆和野生型大豆花和种子，分别置于GUS染色液[50mmol·L^-1磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，1％(v/v)Triton×100，20％(v/v)甲醇，50mmol·L^-1六氰合亚铁酸钾，50mmol·L^-1六氰合铁酸钾，1mM×-gluc(GOLDBIO，货号：G1281C)]中，37℃染色12h。70％乙醇脱色后，拍照观察(如图7所示)。与对照组相比转化植株的花和种子都有GUS表达，进一步证明植株的转基因特性。

4.转基因大豆中Gly m Bd 30K基因相对表达量的测定

实时荧光定量PCR反应在安捷伦荧光PCR系统M3005P上进行，大豆环孢素A受体基因(CYP2)作为内参基因。分别设计CYP2和30K基因的RT-PCR引物：

上游引物FCYP：5′-CGGGACCAGTGTGCTTCTTCA-3′(SEQ ID No.15)

下游引物RCYP：5′-CCCCTCCACTACAAAGGCTCG-3′(SEQ ID No.16)

上游引物FK：5`-GGTTCAGCGGATGGTGTAGATTA-3`(SEQ ID No.17)

下游引物RK：5`-TGGTTGGGTATGAAGCGAAATAA-3`(SEQ ID No.18)

为检测大豆种子中30K基因的表达情况，取成熟期大豆种子，提取总RNA(参照TaKaRaTrizol Reagent说明书)，按照反转录试剂盒(TaKaRa，货号：DRR047A)的方法将RNA反转录为cDNA，进行荧光定量PCR反应。反应体系参照TaKaRaPremix Ex Taq^TM说明书，25μL体系包括：Premix Ex Taq^TM 2μL，上游引物和下游引物(CYP2和30K基因)各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH₂O 9.5μL。反应程序：95℃预变性30sec后，95℃变性5s，60℃退火20s，40个循环。

30K基因的相对表达量＝2^-ΔΔCT，ΔΔCT＝(C_T，30K-C_T，cyp2)_{转基因株系}-(C_T，30K-C_T，cyp2)_{野生型植株}，其中C_T，30K：30K基因的Ct值，C_T，cyp2：环孢素A受体基因的Ct值。

对T₁代12棵转化株的籽粒进行相对定量(如图8所示)，将对照组中的30K基因的表达量定为1，由图8可观察到，所有转化株籽粒中的30K基因的表达量均远低于对照组。表明干扰载体pCAMBIA3301-30K-RNAi明显地降低了转基因植株中Gly mBd 30K基因在籽粒中的表达量。

Claims (3)

1.大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi，其特征在于构建RNAi的发卡结构，其序列为SEQ ID NO. 2，并将Gly m Bd 30K 基因的发卡结构插入到载体pCAMBIA3301的PmⅡ和BstEⅡ位点得到。

2.权利要求1所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1）大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 30K干扰片段序列SEQ ID NO. 1的获得：

以大豆籽粒为材料，提取总RNA，反转录为cDNA，以大豆cDNA为模板，设计上游引物Ps ：SEQ ID NO. 3，下游引物Pa：SEQ ID NO. 4，扩增得到大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 30K 的干扰片段，PCR产物连接到pMD19-T载体，测序验证；

2）内含子序列的获得

 以质粒pCAMBIA3301为模板，设计上游引物Is： SEQ ID NO. 5，下游引物Ia: SEQ ID NO. 6扩增得到内含子序列，PCR产物连接到pMD19-T载体，测序验证；

3）发卡结构序列的获得

通过融合PCR的方法，设计四条引物P1：SEQ ID No.7、P2：SEQ ID No.8、P3：SEQ ID No.9，P4：SEQ ID No.10进行3轮PCR，将30K干扰片段与内含子序列以大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 30K 的干扰片段反向序列－内含子－大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 30K 的干扰片段正向序列的形式连接，形成发卡结构，并导入酶切位点PmⅡ和BstEⅡ，PCR产物连接到pMD19-T载体，测序验证；

4）30K干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建

PmⅡ/BstEⅡ双酶切发卡结构的PCR产物，插入到pCAMBIA3301载体PmⅡ和BstEⅡ位点，酶切验证，干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi构建成功。

3.权利要求1所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi在培育脱致敏转基因大豆中的应用。