CN102533762B - 一种获得脱致敏转基因大豆新材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学与生物技术领域,涉及一种获得脱致敏转基因大豆新材料的方法。该方法是将大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi通过农杆菌介导的方法导入大豆;所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi是将序列为SEQ ID NO.2的Gly m Bd 30K基因的发卡结构插入到载体pCAMBIA3301的PmI I和BstEII位点得到。本发明获得的脱致敏转基因大豆籽粒中过敏蛋白Gly m Bd 30K基因的表达量明显降低,同时转化株具有除草剂抗性。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学与生物技术领域,涉及一种获得脱致敏转基因大豆新材料的方法。
背景技术
大豆是重要的植物蛋白来源之一,同时也是8类主要致过敏食物之一(Metcalfe D.Thenature and mechanisms of food allergies and related diseases.Food technology,1992,5(5):136-140)。Ogawa等(1991)通过免疫印迹技术在大豆中检测到15种过敏蛋白质,并对有食物过敏史的人检测发现,14%的人对大豆过敏,仅次于对蛋清的反应(26.7%)。近年来包括中国在内的世界各国对大豆的消费迅速增长,增加了大豆蛋白引发过敏的几率。(Ogawa T,Bando N,Tsuji H,Okajima H,Nishikawa K,Sasaoka K.Investigation of theIgE-binding proteins in soybeans by immunoblotting with the sera of the soybeansensitive patients with atopic dermatitis.Journal of Nutritional Science andVitaminology,1991,37:555-565.)
Gly m Bd 30K、Gly m Bd 60K和Gly m Bd 28K是大豆中的3种主要过敏蛋白。Gly mBd 30K也称为P34,是半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族的一个边缘成员。与Ig E结合试验中表明,超过65%以上对大豆敏感的病人仅对Gly m Bd 30K蛋白过敏,因此Gly m Bd 30K蛋白被视为大豆蛋白中一个重要的免疫显性过敏原。目前还没有筛选到30K缺失或低含量的种质。在美国Yaklich等(1999)筛选美国农业部大豆核心种质,发现30K含量相似,且野生亲缘种也不缺失30K。(Yaklich RW,Helm RM,Cockrell G,Herman EM.Analysis of thedistribution of the major soybean seed allergens in a core collection of Glycine maxaccessions.Crop Science,1999,39:1444-1447.)日本用诱变方法在改造β-伴球蛋白起了很大的作用,但去除30K的努力并没取得成功。在我国关荣霞等(2004)筛选了175份多样性广的、具有代表性的中国大豆品种也没有检测到缺失30K过敏原的材料。(关荣霞,常汝镇,邱丽娟,刘章雄,郭顺堂.栽培大豆蛋白亚基11S/7S组成及过敏蛋白缺失分析.作物学报,2004,11:1076-1079.)这些结果表明,直接利用目前的种质资源培育低30K过敏原的大豆品种似乎是比较困难的。
RNAi是最近几年才发展起来的研究生物体基因表达、调控与功能的一项技术,是由小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象。其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合并引起降解,从而阻止mRNA的翻译。将小片段双链RNA(siRNA)导入细胞,siRNA结合一个核酶复合物,从而形成RNA诱导沉默复合物(RISC),激活的RISC通过碱基配对定位到mRNA转录本上,并在距离siRNA 3`端12个碱基的位置切割mRNA,引起mRNA的降解,从而特异性抑制靶基因的表达,是基因敲除(knockdown or knockout)的强大工具,在功能基因组研究和基因治疗中有很好的前景。(Lipardi C,Wei Q,Paterson BM.RNAi as random degradative PCR:siRNA primersconvert mRNA into dsRNAs that are degradedto generate new siRNAs.Cell,2001,107,297-307.)
在植物中持久表达RNA沉默通常是先构建表达载体,然后通过PEG介导、电穿孔介导、农杆菌侵染等方法使设计的序列整合到植物基因组中并稳定表达。由于农杆菌侵染法技术的成熟,在持久性的RNA沉默研究中得到了广泛应用。构建hpRNA高效表达载体用于特定基因沉默是研究的热点之一。Wesley等(2001)系统研究了不同结构的RNA对沉默效率的影响,发现相比于单链正义或反义RNA,双链RNA尤其是发夹式结构的RNA(hpRNA)对RNA沉默的效率有非常显著的提高。(Wesley SV,Helliwell CA,Smith NA,Wang MB,Rouse DT,Liu Q,Gooding PS,Singh SP,Abbott D,Stoufjesdijk PA,Robinson SP,Gleave AP,Green AG,Waterhouse PM.Construct design for efficient,effective andhigh-throughput gene silencing in plants.Plant Journal,2001,27:581-590.)如果在发夹结构的反向重复序列间加入一段非编码序列如内含子,在植物体内转录形成含内含子的发卡结构(intronsplicinghpRNA,ihpRNA),则沉默效果与hpRNA相比可从58%提高到90%。Stoutjesdijk等(2002)采用FAD2基因的5′UTR片段也有效地沉默了该基因。(Stoutjesdijk P,Singh SP,Liu Q,Hurlstone C,Waterhouse P,Green A.hpRNA-mediated targeting ofthe Arabidopsis FAD2gene gives highly efficient and stable silencing.PlantPhysiology,2002,129:1723-1731.)
目前,构建植物干扰表达载体通过遗传转化的方法来降低大豆Gly m Bd 30K致敏性的研究报道在国内很少。Herman等(2003)通过遗传修饰去除大豆主要的过敏原30K已获得成功,遗传修饰后在30K多肽含量受抑制,但多肽结构上没有显著的变化,进一步观察发现30K沉默性状可在子代中稳定遗传,且它们的生长性、蛋白含量、含油率等农艺学性状与未遗传改造的对照株没有显著的差异,更说明通过遗传修饰得到的30K沉默植株确能有效地去除过敏原。(Herman EM,Helm RM,J ung R,Kinney AJ.Genetic modification removes animmunodominant allergen from soybean.Plant Physiology,2003,132:36-43.)这也为遗传改良去除大豆中过敏蛋白基因提供了可能。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足,提供一种获得脱致敏转基因大豆新材料的方法。
一种转基因脱致敏大豆新材料的制备方法,将大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi通过农杆菌介导的方法导入大豆;所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi是将序列为SEQ ID NO.2的Gly m Bd 30K基因的发卡结构插入到载体pCAMBIA3301的PmI I和BstE II位点得到。
所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体的构建方法,包括如下步骤:
1)大豆过敏蛋白基因Gly m Bd30K干扰片段序列SEQ ID NO.1的获得:以大豆‘NY1001’籽粒为材料,提取总RNA,反转录为cDNA,以大豆cDNA为模板,设计上游引物Ps:SEQ ID NO.3,下游引物Pa:SEQ ID NO.4,扩增得到大豆过敏蛋白基因Gly m Bd30K的干扰片段,PCR产物连接到pMD19-T载体,测序验证;
2)内含子序列的获得
以质粒pCAMBIA3301为模板,设计上游引物Is:SEQ ID NO.5,下游引物Ia:SEQ ID NO.6扩增得到内含子序列,PCR产物连接到pMD19-T载体,测序验证;
3)发卡结构序列的获得
通过融合PCR的方法,设计四条引物P1:SEQ ID No.7、P2:SEQ ID No.8、P3:SEQ ID No.9,P4:SEQ ID No.10进行3轮PCR,将30K干扰片段与内含子序列以大豆过敏蛋白基因Glym Bd30K的干扰片段反向序列-内含子-大豆过敏蛋白基因Gly m Bd30K的干扰片段正向序列的形式连接,形成发卡结构,并导入酶切位点PmI I和BstE II,PCR产物连接到pMD 19-T载体,测序验证;
4)30K干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建
PmI I/BstEII双酶切发卡结构的PCR产物,插入到pCAMBIA3301载体PmI I和BstE II位点,酶切验证,干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi构建成功。
转染所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的细胞。
所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi在转基因大豆脱致敏新材料、新品种培育中的应用。
有益效果:
本发明构建了一个沉默大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 30K基因的RNAi发卡结构,并导入到含有除草剂抗性基因(bar)的表达载体pCAMBIA3301中,获得植株干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi。bar基因既可作为筛选标记基因,也可以作为抗除草剂的功能基因。转基因大豆籽粒中过敏蛋白Gly m Bd 30K基因的表达量明显降低,同时转化株具有除草剂抗性。
附图说明
图1干扰载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建流程
图2植物表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的鉴定
A:30K干扰片段琼脂糖凝胶电泳分析
M:DNA Marker(2Kb/1Kb/0.75Kb/0.5Kb/0.25Kb/0.1Kb),1:30K干扰片段;
B:内含子片段琼脂糖凝胶电泳分析
M:DNA Marker(1.5Kb/1Kb/0.9Kb/0.8Kb/0.7Kb/0.6Kb/0.5Kb/0.4Kb/0.3Kb/0.2Kb/0.1Kb),1:内含子;
C:30K片段反向连接到内含子的5`端琼脂糖凝胶电泳分析
M:DNA Marker(2Kb/1Kb/0.75Kb/0.5Kb/0.25Kb/0.1Kb),1:30K反向-内含子;
D:30K片段正向连接到内含子的3`端琼脂糖凝胶电泳分析
M:DNA Marker(2Kb/1Kb/0.75Kb/0.5Kb/0.25Kb/0.1Kb),1:发卡结构;
E:植物干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi质粒双酶切检测琼脂糖凝胶电泳分析
M:DNA Marker(10Kb/9Kb/8Kb/7Kb/6Kb/5Kb/4Kb/3Kb/2Kb/1Kb),
1:pCAMBIA3301-30K-RNAi双酶切(PmI I/BstE II);
图3植物干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi图谱
图4转基因大豆的再生
A:无菌苗;B:子叶节外植体;C:农杆菌菌液;D:不定芽的形成;E:芽伸长;F:再生植株生根;F:移植成苗
图5转基因大豆T1代植株PCR鉴定
A:bar基因的PCR扩增;B:GUS基因的扩增
M:DNA Marker(2Kb/1Kb/0.75Kb/0.5Kb/0.25Kb/0.1Kb);P:阳性对照(质粒);WT:阴性对照(野生型植株);1,2,3,4,6,7,8,9,10,13,14,15:转化植株;11,12:分离植株
图6转基因大豆叶片Basta涂抹鉴定
A:转基因大豆叶片;B:野生型大豆叶片
图7转基因大豆花和种子GUS染色鉴定
A:花GUS染色;B:种子GUS染色
图8转基因大豆30K基因相对表达量的测定
提取转基因大豆籽粒总RNA,反转录成cDNA后用于荧光定量PCR。大豆环孢素A受体基因(CYP2)作为内参基因。通过公式2-ΔΔCT计算出T1代12棵转化株相对于对照株中30K基因的相对表达量。
具体实施方式
下述实施方法若无特殊说明均为常规方法。
下述实施方法中所用的试剂、材料,如无特殊说明均可通过商业途径得到。
实施例1植物双价表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建
本发明所构建植物表达载体以pCAMBIA3301载体为基础载体,构建的策略如图1所示,具体实施方式如下:
1.30K干扰片段的克隆:
选用结荚期大豆‘NY1001’的嫩荚作为材料,参照TaKaRa公司总RNA提取试剂盒(目录号:D9108A)说明书方法,提取籽粒总RNA并反转录成cDNA,用RNase消化cDNA产物,参照大豆Gly m Bd 30K (以下简称30K)基因序列信息(NCBI登录号:EU883600),设计引物扩增序列为SEQ ID NO.1所示的30K干扰片段;
上游引物Ps:5′-CCTTGTGTTGCTTCTTTTCTCC-3′(SEQ ID NO.3)
下游引物Pa:5′-GATGGTCACAAGAATATTGTTC-3′(SEQ ID NO.4)
以上述籽粒cDNA为模板,进行PCR反应,凝胶电泳检测(如图2-A所示)50μL反应体系包含:10×PCR Buffer 5.0μL,dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L-1),MgCl2 3μL(25mmol·L-1),Ps、Pa引物各1.0μL(20μmol·L-1),Taq DNA Polymerase 0.2μL,cDNA模板1.0μL,ddH2O补至50μL;反应程序:94℃预变性5min,94℃变性30sec,51.8℃复性30sec,72℃延伸1min,30个循环后,72℃总延伸10min;PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN,目录号:AP-GX-50)回收纯化,用T4DNA连接酶(TaKaRa,目录号:D2011A)连接到pMD19-T载体(TaKaRa,目录号:D102A),转化TOP10感受态细胞,进行序列测定;
2.内含子序列的克隆:
以质粒pCAMBIA3301为模板,参照GUS基因(NCBI登录号:AF485783)中内含子序列信息设计引物扩增内含子片段;
上游引物Is:5′-GTAAATTTCTAGTTTTTCTCCT-3′(SEQ ID NO.5)
下游引物Ia:5′-CTGTAACTATCATCATCATCAT-3′(SEQ ID NO.6)
以质粒pCAMBIA3301为模板,进行PCR反应,凝胶电泳检测(如图2-B所示)。50μL反应体系包含:10×PCR Buffer 5.0μL,dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L-1),MgCl2 3μL(25mmol·L-1),Is、Ia引物各1.0μL(20μmol·L-1),Taq DNA Polymerase 0.2μL,cDNA模板1μL,ddH2O补至50μL;反应程序:94℃预变性5min,94℃变性30sec,45.3℃复性30sec,72℃延伸1min,30个循环后,72℃总延伸10min;PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化,用T4DNA连接酶连接到pMD19-T载体,转化TOP10感受态细胞,进行序列测定;
3.发卡结构的构建
通过融合PCR的方法将三个片段(反向A-内含子I-正向S)连接起来。设计四条引物,P1、P2、P3、P4,在两端引入酶切位点PmII和BstEII。以下用PrimeSTARTM HS DNA Polymerase(TaKaRa目录号:DR010A)
引物序列:
30k反向序列上游引物P1:5`-ACCACGTGGATGGTCACAAGAAT-3`(SEQ ID No.7)
30k反向序列下游引物P2:5`-ACTAGAAATTTACCCTTGTGTTG-3`(SEQ ID No.8,P2各有A和I的部分序列)
内含子的下游引物P3:5`-GAAGCAACACAAGGCTGTAACTATCA-3`(SEQ ID No.9,P3各有I和S的部分序列)
30k正向序列的下游引物P4:5`-TATGGTGACCGATGGTCACAAGAAT-3`(SEQ IDNo.10)
(1)第一轮PCR:以Gly m Bd 30K干扰片段为模板,P1、P2为引物进行扩增:
PCR反应体系:10×PCR Buffer 5.0μL,dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L-1),引物P1和P2各1.0μL(20μmol·L-1),P rimeSTARTM HS DNA Polymerase 0.4μL,cDNA模板1μL,ddH2O补至50μL;反应程序:94℃预变性5min,94℃变性30sec,52℃复性1min,72℃延伸45s,30个循环后,72℃总延伸10min,获得部分融合的A。
加A反应:5μL 10x A-Tailing Buffer,4μL dNTP Mixture,0.5μL A-Tailing Enzyme(TaKaRa,D404),4μg DNA,ddH2O补至50μL。72℃反应20min,冰置1-2min。PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化,用T4DNA连接酶连接到pMD19-T载体,转化TOP10感受态细胞,进行序列测定;
(2)第二轮PCR:以融合片段A和I为模板,P1、P3为引物进行扩增:
PCR反应体系:10×PCR Buffer 5.0μL,dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L-1),A片段和I片段各1.0μL(20μmol·L-1)作模板,引物P1、P3各1.0μL,PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 0.4μL,ddH2O补至50μL;反应程序:94℃预变性5min,94℃变性30sec,54.7℃复性30sec,72℃延伸1min,30个循环后,72℃总延伸10min,获得部分融合的A-I(如图3-C所示)。
加A反应:5μL 10×A-Tailing Buffer,4μL dNTP Mixture,0.5μL A-Tailing Enzyme,4μg DNA最后补水至50μL。72℃反应20min,冰置1-2min。PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化,用T4DNA连接酶连接到pMD19-T载体,转化TOP10感受态细胞,进行序列测定;(3)第三轮PCR:以融合片段A-I和Gly m Bd 30K干扰片段为模板,P1、P4为引物进行PCR扩增:
PCR反应体系:10×PCR Buffer 5.0μL,dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L-1),融合片段A-I和Gly m Bd 30K干扰片段各1.0μL作模板,P1、P41.0μL,PrimeSTARTM HS DNA Polymerase0.4μL,ddH2O补至50μL;反应程序:94℃预变性5min,94℃变性30sec,55℃复性1min,72℃延伸1min,30个循环后,72℃总延伸10min,获得发卡结构A-I-S(如图2-D所示)。
加A反应:5μL 10x A-Tailing Buffer,4μL dNTP Mixture,0.5μL A-Tailing Enzyme,4μg DNA最后补水至50μL。72℃反应20min,冰置1-2min。PCR产物用凝胶回收试剂盒回收纯化,用T4DNA连接酶连接到pMD19-T载体,转化TOP10感受态细胞,进行序列测定,获得的发卡结构A-I-S序列如SEQ ID NO.2所示;
4.植物干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建
(1)PmII和BstEII双酶切:分别取pCAMBIA3301载体和第3步所得到发卡结构的PCR产物各15μL用PmI I和BstE II双酶切,双酶切体系(50μL):10×Buffer 15μL(NEB),BSA0.5μL,DNA 15μL,BstEII1.0μL,PmII 1.0μL,ddH2O补至50μL;37℃反应3h;双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,回收质粒pCAMBIA3301大片段和发卡结构小片段;
(2)上述回收的大片段和小片段,按照1∶4的比例,用T4DNA连接酶连接,连接反应体系:10×T4ligase Buffer 2.5μL,pCAMBIA3301大片段2μL,发卡结构小片段8μL,T4DNA连接酶1μL,ddH2O补至25μL;16℃反应过夜,取10μL连接产物转化TOP10感受态细胞。37℃过夜培养,挑取单克隆扩大培养,提取质粒,进行双酶切验证(如图2-E所示),植物表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建成功(如图3所示)。
实施例2质粒pCAMBIA3301-30K-RNAi转染农杆菌EHA105
(1)质取2μg(10μl)纯化的质粒pCAMBIA3301-30K-RNAi,加入200μL农杆菌EHA105感受态,混匀;
(2)冰浴5min,转入液氮冷冻1min;
(3)加入800μL YEB液体培养基,250rpm,28℃,4-5h;
(4)用移液器将菌液移至YEB固体选择培养基(含相应抗生素)均匀涂布;
(5)28℃培养1-2d,挑取单菌落,提质粒,酶切检测。
实施例3农杆菌介导30K干扰表达载体转化大豆
1.外植体的制备及侵染
取成熟饱满的大豆‘NY1001’种子,表面消毒后接种于萌发培养基(B5+3%蔗糖+0.8%琼脂,pH 5.8),25℃条件下,光照(16/8h,90μmol m-2s-1)培养5-6天获得无菌苗(如图4-A所示)。保留子叶下方2-3cm的下胚轴,垂直沿下轴胚将子叶分开,水平划5-7次腋芽原基区,得到子叶节外植体(如图4-B所示)。
将农杆菌EHA105(含pCAMBIA3301-30K-RNAi)划线于平板,28℃培养24h,挑取单克隆液体培养24h,然后取2ml菌液加入200ml YEP液体培养基中,扩大培养至OD650为0.6-0.8,菌液离心后,用液体共培养培养基(1/10B5,1.67mg·L-16-苄基氨基嘌呤,0.25mg·L-1赤霉素,200μmol·L-1乙酰丁香酮,3%蔗糖和0.7%琼脂,pH 5.4)重悬,调节OD650值为1(如图3-C所示)。
外植体放入到50ml重悬菌液中,侵染30min。侵染结束后,吸干多余菌液,将外植体近轴面向下接种于铺有一层滤纸的共培养基(添加3mmol·L-1L-半胱氨酸,1mmol·L-1硫代硫酸钠和二硫苏糖醇),25℃暗培养4天。
2.大豆的再生
共培养结束后的外植体,用液体芽诱导培养基(B5,1.67mg·L-16-苄基氨基嘌呤,500mg·L-1羧苄青霉素,3%(w/v)蔗糖,3mmol·L-1MES,pH 5.6)摇动洗涤4-5次,近轴面向上接种于固体芽诱导培养基(液体芽诱导培养基+0.8%琼脂)。25℃光照(16/8h,90μmolm-2s-1)培养10天。10天后,外植体接种于芽诱导筛选培养基(芽诱导培养基+4mg·L-1双丙氨磷),筛选培养4周,每2周继代一次。
筛选后含有丛生芽的外植体(如图4-D所示),接种到芽伸长培养基(MS,1mg·L-1玉米素,0.5mg·L-1赤霉素,0.1mg·L-1吲哚乙酸,100mg·L-1焦谷氨酸,50mg·L-1 L-天冬酰胺,300mg·L-1羧苄青霉素,2mg·L-1双丙氨磷,3%蔗糖,3mmol·L-1MES和0.8%的琼脂,pH 5.6),芽伸长6-8周,每隔两周继代1次。
待芽伸长至3-4cm时(如图4-E所示),用手术刀从基部切下,转入生根培养基(1/2B5,0.5mg·L-1 IBA,3%蔗糖,0.8%琼脂,pH 5.6),根长至1-2cm长时(如图4-F所示),驯化移入温室,常规管理,直至成熟收获(如图4-G所示)。
实施例3转基因大豆的鉴定
1.转基因大豆植株PCR鉴定
取转基因大豆幼嫩籽粒,SDS法,提取基因组DNA,以基因组DNA为模板,分别设计GUS和bar基因的引物进行PCR,琼脂糖凝胶电泳检测(如图5所示)。通过对转化植株中外源基因GUS和bar的PCR检测,初步证实植株的转基因特性。
上游引物GUS 1:5`-TGGTGACGCATGTCGCGCAAGAC-3`(SEQ ID No.11)
下游引物GUS2:5`-GGTGATGATAATCGCCTGATGCAG-3`(SEQ ID No.12)
上游引物bar1:5`-GCACCATCGTCAACCACTAC-3`(SEQ ID No.13)
下游引物bar2:5`-TGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3`(SEQ ID No.14)
GUS基因的PCR扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45sec,55℃复性1min,72℃延伸1min,30个循环后,72℃总延伸10min,bar基因的PCR扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45sec,58℃复性1min,72℃延伸1min,30个循环后,72℃总延伸10min。
2.转基因大豆Basta涂抹鉴定
选取健康生长的转基因大豆和野生型大豆叶片,用棉棒蘸取0.05%Basta涂抹于半张叶片,五天之后观察叶片表现,拍照记录(如图6所示)。图6所示,非转基因植株涂抹Basta的半张叶片表现出失绿,而转基因植株的叶片正常,显示出Basta的抗性。
3.转基因大豆花和种子的GUS鉴定
取转基因大豆和野生型大豆花和种子,分别置于GUS染色液[50mmol·L-1磷酸钠缓冲液(pH 7.0),1%(v/v)Triton×100,20%(v/v)甲醇,50mmol·L-1六氰合亚铁酸钾,50mmol·L-1六氰合铁酸钾,1mM×-gluc(GOLDBIO,货号:G1281C)]中,37℃染色12h。70%乙醇脱色后,拍照观察(如图7所示)。与对照组相比转化植株的花和种子都有GUS表达,进一步证明植株的转基因特性。
4.转基因大豆中Gly m Bd 30K基因相对表达量的测定
实时荧光定量PCR反应在安捷伦荧光PCR系统M3005P上进行,大豆环孢素A受体基因(CYP2)作为内参基因。分别设计CYP2和30K基因的RT-PCR引物:
上游引物FCYP:5′-CGGGACCAGTGTGCTTCTTCA-3′(SEQ ID No.15)
下游引物RCYP:5′-CCCCTCCACTACAAAGGCTCG-3′(SEQ ID No.16)
上游引物FK:5`-GGTTCAGCGGATGGTGTAGATTA-3`(SEQ ID No.17)
下游引物RK:5`-TGGTTGGGTATGAAGCGAAATAA-3`(SEQ ID No.18)
为检测大豆种子中30K基因的表达情况,取成熟期大豆种子,提取总RNA(参照TaKaRaTrizol Reagent说明书),按照反转录试剂盒(TaKaRa,货号:DRR047A)的方法将RNA反转录为cDNA,进行荧光定量PCR反应。反应体系参照TaKaRaPremix Ex TaqTM说明书,25μL体系包括:Premix Ex TaqTM 2μL,上游引物和下游引物(CYP2和30K基因)各0.5μL,cDNA模板2μL,ddH2O 9.5μL。反应程序:95℃预变性30sec后,95℃变性5s,60℃退火20s,40个循环。
30K基因的相对表达量=2-ΔΔCT,ΔΔCT=(CT,30K-CT,cyp2)转基因株系-(CT,30K-CT,cyp2)野生型植株,其中CT,30K:30K基因的Ct值,CT,cyp2:环孢素A受体基因的Ct值。
对T1代12棵转化株的籽粒进行相对定量(如图8所示),将对照组中的30K基因的表达量定为1,由图8可观察到,所有转化株籽粒中的30K基因的表达量均远低于对照组。表明干扰载体pCAMBIA3301-30K-RNAi明显地降低了转基因植株中Gly mBd 30K基因在籽粒中的表达量。
Claims (3)
1.大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi,其特征在于构建RNAi的发卡结构,其序列为SEQ ID NO. 2,并将Gly m Bd 30K 基因的发卡结构插入到载体pCAMBIA3301的PmⅡ和BstEⅡ位点得到。
2.权利要求1所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体的构建方法,其特征在于包括如下步骤:
1)大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 30K干扰片段序列SEQ ID NO. 1的获得:
以大豆籽粒为材料,提取总RNA,反转录为cDNA,以大豆cDNA为模板,设计上游引物Ps :SEQ ID NO. 3,下游引物Pa:SEQ ID NO. 4,扩增得到大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 30K 的干扰片段,PCR产物连接到pMD19-T载体,测序验证;
2)内含子序列的获得
以质粒pCAMBIA3301为模板,设计上游引物Is: SEQ ID NO. 5,下游引物Ia: SEQ ID NO. 6扩增得到内含子序列,PCR产物连接到pMD19-T载体,测序验证;
3)发卡结构序列的获得
通过融合PCR的方法,设计四条引物P1:SEQ ID No.7、P2:SEQ ID No.8、P3:SEQ ID No.9,P4:SEQ ID No.10进行3轮PCR,将30K干扰片段与内含子序列以大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 30K 的干扰片段反向序列-内含子-大豆过敏蛋白基因Gly m Bd 30K 的干扰片段正向序列的形式连接,形成发卡结构,并导入酶切位点PmⅡ和BstEⅡ,PCR产物连接到pMD19-T载体,测序验证;
4)30K干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi的构建
PmⅡ/BstEⅡ双酶切发卡结构的PCR产物,插入到pCAMBIA3301载体PmⅡ和BstEⅡ位点,酶切验证,干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi构建成功。
3.权利要求1所述的大豆Gly m Bd 30K基因RNA干扰表达载体pCAMBIA3301-30K-RNAi在培育脱致敏转基因大豆中的应用。
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