CN104910264B - 一种毛竹油菜素内酯受体蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，提供了一种毛竹油菜素内酯受体蛋白及其编码基因，本发明提供的蛋白选自如下a）或b）：a）由如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的由a）衍生的蛋白质。所述蛋白的编码基因、以及含有所述基因的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系均属于本发明的保护范围。所述蛋白、所述基因、所述重组载体、所述重组菌、所述表达盒或所述转基因细胞系均可应用于植物速生育种，在禾本科植物育种中具有广泛的应用前景。

Description

一种毛竹油菜素内酯受体蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种毛竹油菜素内酯受体蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

油菜素内酯是一种重要的天然植物激素，作用机理类似于生长素，它能充分激发植物内在潜能，促进作物生长和增加作物产量。植物细胞的伸长速率决定着植物的生长速度，研究表明油菜素类固醇物质（brassinosteroids，BRs）在棉花纤维发育中具有重要作用，大田施用油菜素内酯（brassinolide，BL），一种生物活性最高的BRs，可以使纤维长度提高6.1%，纤维强度提高9.5%。BRs发挥活性主要是通过与细胞膜上的受体结合来实现其功能的，因此对细胞膜上BRs受体蛋白进行研究，有助于揭示BRs的作用机制。

竹子作为我国重要的森林资源，生长速度快，竹笋出土到长成新竹仅需40-50天，4年生达到材性最佳；繁殖能力强，一次造林，青山常在，永续利用（每年砍伐竹林中的1/5-1/4）；较耐瘠薄，适宜山地造林，尤其是我国造林宜林地日趋减少的情况下，竹林优势更为明显。因此竹资源开发利用已成为解决我国林农民生问题的重要途径。毛竹(Phyllostachysedulis)是我国重要的笋材两用竹种之一，速生的特点一直倍受关注，以毛竹为材料进行油菜素内酯受体蛋白基因的研究，对于解析毛竹速生机制、更好地开发利用毛竹基因资源具有重要的现实意义。

然而，竹子油菜素类固醇物质及其受体蛋白的研究尚属空白。因此，本发明从毛竹中克隆得到的油菜素内酯受体蛋白基因具有广阔的应用前景。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种毛竹油菜素内酯受体蛋白及其编码基因。

本发明提供的毛竹油菜素内酯受体蛋白，来源于毛竹(Phyllostachys edulis)，选自如下a）或b）：

a）由如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的由a）衍生的蛋白质。

该蛋白的等电点为8.337，分子量为64.915KDa。第55-200位为黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide，FAD）结合区保守域，多结构域分析显示该蛋白具有FAD内酯氧化酶(FAD Lactone oxidase)的性质。

本领域技术人员可根据本发明公开的油菜素内酯受体蛋白氨基酸序列（SEQ IDNo.1），在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明油菜素内酯受体蛋白还包括SEQ ID No.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有与毛竹油菜素内酯受体蛋白同等功能的由毛竹油菜素内酯受体蛋白衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。

本发明提供的编码基因为如下1）或2）的基因：

1）其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

2）其核苷酸序列是SEQ ID NO.2的自5′末端第172-1857位核苷酸所示。

SEQ ID NO.2所示的基因全长为2093bp，分析表明，该序列包含一个完整的编码区1686bp，5′非翻译区（UTR）171bp，3′非翻译区212bp和polyA尾巴24bp，编码561个氨基酸组成的蛋白，如SEQ ID NO.1所示。实验表明，该基因在水稻矮化突变体Fn189中过量表达，转基因水稻的株高恢复如野生型水稻，与Fn189相比，纤维细胞显著增长。由此表明该基因具有促进植物细胞生长的功能。

此外，本发明所述编码基因还包括由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到编码毛竹油菜素内酯受体蛋白的核苷酸序列。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒均属于本发明的保护范围。

所述重组载体为如下Ⅰ）或Ⅱ）的重组质粒：

Ⅰ）将权利要求2或3所述基因插入pCAMBIA1301载体多克隆位点得到的重组质粒；

Ⅱ）将权利要求2或3所述基因插入pET30a载体多克隆位点得到的重组质粒。

在本发明实例中，所述毛竹油菜素内酯受体蛋白基因命名PeCE，通过如下方法克隆获得：从毛竹根系EST文库中得到一个片段，分析发现该片段为包含5′端cDNA序列，编码的片段属于油菜素内酯受体蛋白（部分片段）。根据油菜素内酯受体蛋白基因家族的保守区设计引物，以毛竹根系的cDNA为模板，通过RT-PCR的方法先克隆到T-easy载体上，并对筛选出的阳性克隆子进行测序克隆分析，发现插入片段与油菜素内酯受体蛋白基因家族的保守区有着较高的相似性。根据已获得保守区片断的序列设计引物，进行3′-RACE扩增，将PCR产物回收、连接后转化，在得到的大量克隆中，选取阳性克隆进行测序。通过测序并与保守区序列、5′端序列拼接，去掉重叠部分，得到全长基因序列2093bp。

将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明基因的过量表达载体，进一步将该表达载体导入恰当的宿主细胞中，获得表达本发明PeCE基因的工程菌。

在本发明实例中，根据PeCE编码区序列设计包含酶切位点的引物，通过RT-PCR的方法先克隆到T-easy载体上，测序正确后将PeCE克隆到植物表达载体pCAMBIA1301的多克隆位点，转化农杆菌EHA105，侵染水稻突变体Fn189的愈伤组织，获得转基因植株。

本发明的另一目的是提供的基因在促进植物茎秆生长中的应用。

本发明的有益效果：提供了一种新的油菜素内酯受体蛋白基因，能够实现水稻矮化突变体Fn189的株高恢复到野生型的正常表型，为植物速生育种提供了新的基因资源，将在竹子等禾本科植物育种中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为保守区扩增产物电泳图；

图2为3′-RACE扩增产物电泳图；

图3为植物表达载体PeCE sense的质粒载体图；

图4为单克隆菌落PCR电泳结果，其中，1-4：单克隆菌落；5：重组表达载体质粒；6：水；M：DNA分子量标记；

图5为转PeCE基因植株RT-PCR检测，其中，1-2：转基因植株；3：野生型；4：矮化突变体；5：水；M：DNA分子量标记；

图6为水稻株高表型，其中，a：矮化突变体Fn189；b：野生型水稻；c：以矮化突变体Fn189为受体转化PeCE基因的转基因植株；

图7为水稻株高统计，其中，MT：矮化突变体；line-1和line-2：转基因株系；WT：野生型；

图8为水稻纤维细胞长度统计，其中，1：水稻转PeCE基因植株；2：水稻矮化突变体；3：野生型水稻；

图9为重组表达载体pET30a-PeCE的质粒载体图；

图10为重组蛋白纯化的SDS-PAGE检测图，其中，1：pET30a对照；2：诱导表达pET30a-PeCE融合蛋白；3：未诱导pET30a-PeCE表达的融合蛋白；4：纯化的pET30a-PeCE融合蛋白；M：蛋白分子量标记。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1毛竹油菜素内酯受体蛋白基因PeCE序列的获得

以毛竹(Phyllostachys edulis)根系为材料，提取RNA，并反转录成cDNA作为模板。从本实验室建立的毛竹根系cDNA文库EST序列中获得油菜素内酯受体蛋白基因的5′端cDNA序列723bp，根据该序列以及水稻同源序列3′端序列设计引物，PCR扩增编码区序列。

上游引物：5′-ATGCCGGATCTTCAGGAACCCCT-3′；

下游引物：5′-CGCCTCATCAGCGTAGGCTGGC-3′。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，约1.6kb处有一条亮带，切下目的条带纯化回收，将回收的DNA片段连接到pGEM-T easy载体上，转化大肠杆菌（Esherichia coli）DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析后，再将单克隆测序，插入片段为1679bp。应用Blast在线软件，将测序的序列与已报道的基因进行同源比较，发现插入片段与油菜素内酯受体蛋白基因家族的保守区有着较高的一致性。

为验证3′端，获得全长cDNA序列，根据已获得保守区片段的序列设计3′-RACE引物：

PeCE3-1：5′-GCCACCCAGGGGGAATCTATCAGGAAC-3′；

PeCE3-2：5′-TGAGCACCACCACAGGCAAGGCGACAC-3′。

引物PeCE3-1和通用引物UPM的产物电泳呈现弥散状态，没有特异性条带，将PCR产物稀释50倍作为模板，用引物PeCE3-2与通用引物NUP配对进行扩增，电泳结果显示约在0.6kb有一条亮带，如图2所示。将PCR产物回收、连接后转化，在得到的大量克隆中，选取阳性克隆进行测序获得序列603bp。通过测序并于保守区序列拼接，去掉重叠部分，得到脱氧核糖核苷酸序列全长为2093bp，该基因命名为PeCE，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，包含一个完整的编码区1686bp，5′非翻译区（UTR）171bp，3′非翻译区212bp和polyA尾巴24bp。

通过blast软件在线比较分析，发现PeCE编码的氨基酸序列与其它单子叶植物的油菜素内酯受体蛋白具有较高的一致性，尤其与同是来自禾本科的水稻（Oryza sativa）、谷子（Setaria italica）、玉米（Zea mays）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、大麦（Hordeum vulgare subsp.vulgare）和节节麦（Aegilops tauschii）的同源蛋白一致性都在90%以上，其中与水稻的细胞伸长蛋白Dwarf1（AAM01136）的一致性最高，达95.4%，由此可见，克隆出的PeCE基因为毛竹中的一全新的油菜素内酯受体蛋白基因。

实施例2携带毛竹油菜素内酯受体蛋白基因的植物表达载体构建

以毛竹cDNA为模板，根据序列表中序列2设计引物，PCR扩增毛竹油菜素内酯受体蛋白基因编码区的脱氧核糖核苷酸序列。植物表达引物两端分别引入XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点，引物序列如下：

植物表达上游引物：5′-tctagaATGCCGGATCTTCAGGAACCCCT-3′，引入XbaⅠ酶切位点；

植物表达下游引物：5′-ggatccCGCCTCATCAGCGTAGGCCG-3′，引入BamHⅠ酶切位点。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带纯化回收，将回收的DNA片段连接到pGEM-T easy载体上，转化大肠杆菌（Esherichia coli）DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析后，再将单克隆测序，得到含有XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点及编码毛竹油菜素内酯受体蛋白的脱氧核糖核苷酸序列的质粒pT-PeCE。

将质粒pT-PeCE和表达载体pCAMBIA1301质粒在37℃条件下分别用双酶切6hr，酶切产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带，用T₄DNA连接酶4℃连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取卡那霉素抗性（50mg·L^-1）平板上长出的单克隆，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切图谱鉴定。将获得的重组表达载体命名为PeCE sense，重组表达载体PeCE sense如图3所示。

实施例3重组表达载体转化宿主、阳性克隆鉴定

将实施例2中构建的表达载体PeCE sense通过电击的方法转入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105感受态细胞中，挑取卡那霉素抗性（50mg·L^-1）平板上长出的单菌落进行PCR鉴定。以PeCE基因重组表达载体转化后形成的单克隆菌落为模板，用实施例2中引物进行PCR检测，同时以重组质粒和水为对照。菌落PCR产物的电泳结果表明，单克隆菌落含有目的基因片段，如图4所示，可用于侵染转化实验。

实施例4毛竹PeCE基因转化水稻矮化突变体与转基因水稻植株表型分析

将水稻矮化突变体Fn189的成熟种子脱壳灭菌，接种到诱导愈伤的培养基中。培养3周后，从盾片处生长出愈伤组织，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤，用作转化的受体。用含有双元质粒载体PeCE sense的农杆菌EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗处25℃培养3天后，在含有潮霉素（50mg·L^-1）的选择培养基上筛选抗性愈伤和转基因植株。将潮霉素抗性植株在阴凉处炼苗，7天后移栽到水田。获得了2个转基因株系，如图5中泳道1、2所示，经过RT-PCR分析表明，PeCE已在转基因植株中表达。

经过连续筛选，分别获得株系line-1和株系line-2的转基因株系T3代植株23和28株，两个株系的株高性状分离为正常株高和矮化两种表型，而且基本符合3:1的分离比例，且转基因植株正常株高与野生型接近，明显高于矮化突变体，如图6和图7所示。

分别取水稻上部3节每节的中间部位（约2cm），将样品按轴向劈成几片，装入试管中，倒入提前配制好的离析液（30%过氧化氢:冰醋酸=1:1），盖上试管塞，装好样品和离析液的试管放入到烘箱中，60℃烘36h。样品发白后将样品取出洗净（先用纯净水洗6-7次，期间每隔2h换一次水），直至样品没有酸味。用玻璃棒轻轻将纤维捣成单根的纤维，用吸管吸取适量的纤维置于载玻片上，气干，每个样品设置3个重复。使用三目显微镜测量（型号：LEICADM LB2），将气干的载玻片放在显微镜下，每个样品记录30根纤维的长度，进行统计分析。结果表明，转PeCE基因植株的第一节、第二节的纤维长度介于突变体和野生型水稻之间，而第三节的纤维长度几乎与野生型相接近，纤维长度都明显长于突变体，如图8所示。这充分证实了毛竹PeCE基因是控制水稻株高的同源基因，能够通过促进纤维细胞伸长来实现植株的高生长。

实施例5PeCE基因在大肠杆菌中的表达

以毛竹cDNA为模板，根据序列表中序列2设计引物，PCR扩增毛竹油菜素内酯受体蛋白基因编码区的脱氧核糖核苷酸序列。原核表达引物两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，引物序列如下：

原核表达上游引物：5′-catatgATGCCGGATCTTCAGGAACCCCT-3′，引入NdeⅠ酶切位点；

原核表达下游引物：5′-ctcgagCGCCTCATCAGCGTAGGCCG-3′，引入XhoⅠ酶切位点。

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带纯化回收，将回收的DNA片段连接到pGEM-T easy载体上，转化大肠杆菌（Esherichia coli）DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选，提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析后，再将单克隆测序，得到含有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点及编码毛竹油菜素内酯受体蛋白的脱氧核糖核苷酸序列的质粒pT-PeCE1。

将质粒pT-PeCE1和质粒pET30a在37℃条件下分别用双酶切6hr，酶切产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，回收，用T₄DNA连接酶4℃连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取卡那霉素抗性（50mg·L^-1）平板上长出的单克隆进行酶切鉴定和测序，测序结果表明，单克隆菌落含有目的基因片段，将获得的重组表达载体命名为pET30a-PeCE，重组表达载体pET30a-PeCE如图9所示。

用pET30a-PeCE质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取卡那霉素抗性（50mg·L^-1）平板上长出的单菌落进行菌落PCR鉴定，证明单克隆菌落含有目的基因片段，可用于蛋白的诱导表达实验。将鉴定正确的克隆培养过夜，再将细菌100倍稀释于含卡那霉素抗性（100mg·L^-1）的LB培养基中培养，待菌液生长至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入IPTG（终浓度为0.4mmol·L^-1）进行诱导培养。取诱导过的菌液250ml，5000rpm离心10min，收集细胞；加入9ml的BugBuster溶液、9μl的Benzonase核酸酶、9μl的Lysozyme，重悬细胞，室温下将细胞液在摇板上孵育15min；轻轻涡旋震荡，裂解细胞；4℃下1200g离心20min，取上清入另一个新管中，按照IDA HisBind树脂纯化方法准备树脂柱（MERCK）；将制备好的抽提物小心加到树脂柱的上方；分别用10倍体积的1×结合缓冲液、6倍体积的1×漂洗缓冲液、6倍体积的1×洗脱缓冲液洗脱蛋白，获得纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析。蛋白电泳结果表明，表达蛋白的分子量约为65kDa，如图10所示，与预测的分子量大小相符。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种促进植株增高的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该蛋白来源于毛竹(Phyllostachys edulis)。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因为如下1)或2)的基因：

1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

2)其核苷酸序列是SEQ ID NO.2的自5′末端第172-1857位核苷酸所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为如下Ⅰ)或Ⅱ)的重组质粒：

Ⅰ)将权利要求2或3所述基因插入pCAMBIA1301载体多克隆位点得到的重组质粒；

Ⅱ)将权利要求2或3所述基因插入pET30a载体多克隆位点得到的重组质粒。

6.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

7.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

8.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

9.权利要求2或3所述的基因在促进植物茎秆生长中的应用。