CN1570111A - 与玉米株高相关基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米株高基因的序列及其编码的蛋白质与应用，其目的是提供一种与玉米株高相关的基因及其编码蛋白并提供一种利用该基因培育矮化玉米的方法。本发明的与玉米株高相关基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID No：1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的与玉米株高相关基因将在玉米的遗传改良中发挥重要作用。

Description

与玉米株高相关基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域中一个与玉米株高相关基因及其编码蛋白的应用，特别涉及一个与玉米株高相关基因ZmDWF1及其编码蛋白与该基因在培育矮化玉米中的应用。

背景技术

在玉米的遗传改良中，株高是十分重要的性状，它与玉米株型、种植密度关系密切，快速选育玉米的理想株高是育种家长期以来刻意追求的目标。长期以来，国内外玉米育种中应用的都是多基因决定的矮生性状。为了达到理想的株高，往往要经过多代选择，从而严重地影响了玉米的育种效率。虽然在玉米中也发现了不少单基因矮生突变体，到目前为止，人们至少对28个矮生基因进行过比较细致的遗传研究，其中26个已被定位(Lin等，1995)。但绝大多数矮生基因或者由于与其它不良基因紧密连锁，或者由于一因多效，凡是带有这些基因的个体往往表现植株矮小畸形，不便于繁殖利用。因此人们一直认为单基因矮生性在玉米育种上没有利用价值。

虽然对植物的矮生性状已进行了大量的研究，但长久以来，人们对植物控制株高的机理还了解不多。近年来，人们用T-DNA标签法等现代分子生物学技术在拟南芥中克隆了几个矮化基因(dwf1/dim/cbb1、dwf2/bri1/cbb2、dwf3/cbb3/cpd、dwf4、det2等)，并研究了其致矮的分子机理。研究发现，这些基因的突变影响了油菜素内酯的生物合成或信号转导。

油菜素内酯是一种植物类固醇激素，它在植物体内有广泛的生理效应，其作用包括：细胞伸长、细胞分裂、维管束分化、花粉管伸长、受精、衰老和环境胁迫反应等。除拟南芥外，人们已克隆了控制油菜素内脂合成的两个豌豆基因-lkb(dwf1的同源基因)和lk(det2的同源基因)和两个水稻基因OsDIM(dwf1的同源基因)及brd1基因。在玉米中虽然也有大量的矮生突变体，但到目前为止尚未见到与油菜素内酯生物合成或信号传导相关基因的克隆。

目前，仅在豌豆、棉花等少数几种作物中克隆了DWF1/DIM基因的同源基因。L.Tao和N.Kameya等已经从水稻中克隆得到了这种同源基因，但是仅在GeneBank中提交了氨基酸序列。此外，最近Isabell Greevel等人从人类中克隆得到DWF1/DIM基因的同源基因Seladin-1，并且这个基因编码的产物能够抵抗Alzheimer痴呆症引起的神经原退化以及氧化压力胁迫。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种与玉米株高相关基因及其编码蛋白。

本发明所提供的一种与玉米株高相关基因，名称为ZmDWF1，来源于玉米属玉米(Zea mays L.)，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的开放阅读框；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列1中的cDNA序列由2005个碱基组成，该基因的开放阅读框架为自5’端第127到第1815位碱基。

所述与玉米株高相关基因，是以玉米的总RNA的反转录cDNA为模板，通过5′RACE和3′RACE以及全基因cDNA的扩增得到的，所述5′RACE所用的引物为精简的通用扩增引物AAP(Abridged Anchor Primer：5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GIIGGG IIG-3’)、序列表中的SEQ ID №：3和序列表中的序列4；所述3′RACE所用的引物为AP(Adapter primer：5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACT TTT TTT TTT TTTTTT T-3’)、序列表中的SEQ ID №：5和序列表中的序列6；所述全长玉米株高相关基因cDNA的扩增的引物为序列表中的SEQ ID №：7和序列表中的序列8。

一种与玉米株高相关基因编码蛋白，名称为ZmDWF1，来源于玉米属玉米(Zea maysL.)，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID№：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

序列表中序列2的氨基酸残基序列是由562个氨基酸残基组成的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体及细胞系，如重组载体pT-MD，p3301F和含有该基因的大肠杆菌(E.coli)(DH5α)均属于本发明的保护范围。

扩增ZmDWF1中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的第二个目的是提供一种培育矮化玉米的方法。

本发明所提供的培育矮化玉米的方法，是沉默玉米中的与株高相关基因，抑制该基因的表达，得到矮化的玉米。

沉默玉米中的ZmDWF1基因可通过多种方法实现，如双链RNA干扰技术(Double-stranded RNA interference，RNAi)沉默基因的方法，反义RNA沉默基因的方法，植物病毒载体介导基因沉默的方法，T-DNA插入突变，本发明沉默基因的方法并不限于上述几种方法，只要能沉默ZmDWF1均可，优选为RNAi沉默基因的方法，如可将与玉米株高相关基因以双链RNAi的形式克隆到转化载体上得到重组载体，如p3301RNAi，通过农杆菌渗透法转化玉米，得到得到矮化的玉米。

本发明人用拟南芥的dwf1基因为目标序列，得到一个玉米的EST片段(471个核苷酸)，它与拟南芥dwf1/dim基因具有77％的同源性。用RACE技术(Rapidamplification cDNA ends，cDNA末端快速扩增技术)得到玉米这一cDNA的3’端和5’端片段，并克隆得到了玉米ZmDWF1基因全长cDNA，由于ZmDWF1与拟南芥一个与油菜素内酯生物合成相关基因DWF1推导的蛋白氨基酸序列具有很高的同源性(86％)，因此推测本发明的ZmDWF1也与玉米中油菜素内酯生物合成相关。同时本发明也初步分析了其在玉米不同组织不同发育时期的表达特性，并进一步用RNAi基因研究玉米ZmDWF1的表达受到抑制后的表型，成功的利用这一基因的构建体使玉米的株高得到了矮化，这表明本发明中玉米ZmDWF1双链RNAi构建体的转录产物很可能对玉米中内源的ZmDWF1进行干扰，影响玉米油菜素内酯合成，从而导致其株高的矮化。本发明的与玉米株高相关基因将在玉米的遗传改良中发挥重要作用。

附图说明

图1A为ZmDWF1的5′RACE的PCR扩增产物电泳图谱

图1B为ZmDWF1的3′RACE的PCR扩增产物电泳图谱

图1C为ZmDWF1的全长cDNA的PCR扩增产物电泳图谱

图2为ZmDWF1基因在玉米基因组中的Southern blot分析图谱

图3A为检测ZmDWF1基因在玉米不同发育时期的各个组织中表达情况的Northernblot图谱

图3B为ZmDWF1基因在玉米不同发育时期的各个组织中表达量的柱状图

图4植物表达载体p3301RNAi的图谱示意图

图5为转基因玉米植株矮化株型的表型观察

图6A为转基因玉米植株T₀代的bar基因PCR扩增片段电泳图谱

图6B为转基因玉米植株T₁代的bar基因PCR扩增片段电泳图谱

图7A为转化植株的目的基因T₁代的Southern blot分析结果图

图7B为转化植株的目的基因T₂代的Southern blot分析结果图

图8A为转基因玉米植株T₁代早期(1个月)的蛋白考马斯亮蓝染色电泳图谱

图8B为与图8A中等量的蛋白的Western blot图谱

图8C为转基因玉米植株T₁代晚期(2个半月)的蛋白考马斯亮蓝染色电泳图谱

图8D为与图8C中等量的蛋白的Western blot图谱

具体实施方式

材料

1.菌株、植物病毒与质粒

大肠杆菌(E.coli)(DH5α)和农杆菌LBA4404购自博大公司。p3301载体购自澳大利亚CAMBIA。

2.工具酶及生化试剂

各种限制性内切酶、T-Easy载体试剂盒和随机引物试剂盒购自Promega公司；dNTP混合物购自Takara公司；T₄ DNA连接酶购自BioLabs；T₄ DNA聚合酶购自Takara公司、萘乙酸、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Km)、链霉素(Sm)和噻孢霉素(Cef)购自欣经科公司；除草剂Bastar购自日本明治公司；同位素α-³²P dCTP购自北京亚辉生物公司；尼龙膜购自Amersham公司。

3.仪器HITACHI分光光度计、培养箱、真空泵、组培室、培养箱、PCR扩增仪(GeneAmp PCR System 9700)、511型酶标分析仪，PCR扩增仪(GeneAmp PCR System9700)；

4.培养基

有关内容见申请号为“02158758.2”，发明名称为“一种对玉米进行基因转化的方法”的中国专利申请，其中筛选培养基仅用了其中的除草剂Bastar。

5.PCR引物

M1：5’-AAG CAG CAC GAC GAG AA-3’

M2：5’-ATG CCA TAG AAA AGG TCA GA-3’

M3：5’-GAC CCA TGT TGA CAA GGG GCT CG-3’(SEQ ID №：3)

M4：5’-GGG GCT CGA CCT TGG CAA CC-3’(SEQ ID №：4)

M5：5’-GCA GAT GGC CGG GTC GTC AGA G-3’(SEQ ID №：5)

M6：5’-GGG TCG TCA GAG CCA CCA AGG ACA A-3’(SEQ ID №：6)

M7：5’-CAT CTA GAT CAG AGC CGT AGC AAC CAC CA-3’(SEQ ID №：7)

M8：5’-GTT GAT CAA CAA CGC TGG ACA TCA ACG ACA A-3’(SEQ ID №：8)

M9：5’-CTC ACG TGG AAA GAA ACC GCT GCT GCT AA-3’

M10：5’-GTA GAT CTC ATC AAC GAC AAT GAC TGA CCG-3’

M11：5’-CGC TCT CCC TTA TGC GAC TCC-3’

M12：5’-CTG GAC ATC AAC GAC AAT GAC TGA C-3’

M13：5’-GGC GGT CTG CAC CAT CGT CA-3’

M14：5’-GTA CCG GCAGGC TGA AGT CCA-3’

M15：5’-TTG GAT CCC CGA GGG ACG GTG ACC-3’

M16：5’-TTT CTC GAG AAT GGG CTA AGC AAA ACG-3’

由上海生工合成。

实施例1、与玉米株高相关基因ZmDWF1的克隆

A.EST序列的获得及证实

用拟南芥的dwarf1/dim基因全长在GeneBank的other_ests库中比对，找到了一个玉米芯片cDNA 471bp的EST，与拟南芥的相似性为77％。这个片段很有可能就是dwarf1/dim在玉米中同源基因的一部分。所以在这个EST两端分别设计引物(M1，M2)，按常规方法提取玉米胚根和胚芽的总RNA反转录后，用RT-PCR方法进行PCR扩增，反应混合物如下：

H₂O               10.15μl

10×PCR缓冲液      2.0μl

反转录的cDNA       2.0μl

M1(2μM)           2.0μl

M2(2μM)           2.0μl

dNTPmix(250μM)    1.6μl

Taq酶(4U/μl)      0.25μl

总计               20.0μl

反应条件：94℃，5min； 72℃，7min；

4℃，保存。

参照T-Easy载体试剂盒说明书将PCR产物克隆到T-Easy载体上。经测序，与库中玉米芯片cDNA 471bp的EST序列相似性为99％，从而证实了该EST是dwarf1/dim在玉米中同源基因的一部分。

B.5’RACE的扩增

在该EST序列5’端设计嵌套引物M3，M4，为保证引物的特异性，选择退火温度为66℃，这样也使得它们与5’RACE试剂盒(GIBCOBRL NO.18374-058，购自北京原平皓生物公司)提供的引物AUAP的退火温度基本接近，它们分别与AUAP组成一对引物进行PCR扩增。第一轮产物稀释500倍后用于第二轮模板，第一轮反应混合物如下：

H₂O               10.15μl

10×PCR缓冲液      2.0μl

反转录的cDNA       2.0μl

AUAP(10μM)        2.0μl

M4(10μM)          2.0μl

dNTPmix(250μM)    1.6μl

Taq酶(4U/μl)      0.25μl

总计               20.0μl

反应条件：94℃，5min；

72℃，7min；

4℃，保存。

第二轮反应混合物如下：

H₂O                          33.5μl

10×PCR buffer                5.0μl

10mM dNTP mix                 1.0μl

25mM MgCl₂                   3.0μl

M3(10μM)                     2.0μl

AUAP Primer(10μM)            2.0μl

稀释100倍的第一轮PCR产物      5.0μl

Taq酶(5U/μl)                 0.5μl

Total                         50μl

PCR反应程序与第一轮一致，退火温度为68℃。

扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳结果如图1A所示，表明得到一个约520bp和一个约480bp的片段，其中520bp的片段与推测的序列大小一致。图1A中，M1为GeneRuler^TM 1kb bp DNA ladder(MBI-SM0313)；1为5′RACE产物。回收该片段，按照常规方法将其克隆至pGEM^T-Easy Vector(购自Promega公司)中并测序，与dwarf1/dim相似性为82％，基本上可以确定所得序列就是目的序列。

C.3’RACE的扩增

为获得ZmDWF1的3’端的序列，在EST序列的3’端设计引物(M5，M6)，同样为了提高引物的特异性以及与3′RACE试剂盒(GIBCOBRL NO.18373-019，购自北京原平皓生物公司)中提供的AP引物退火温度一致，采用68℃较高的退火温度，并分别与AP组成一对引物进行PCR扩增。第一轮产物稀释1000倍后用于第二轮模板，第一轮反应混合物如下：

H₂O                10.15μl

10×PCR缓冲溶液     2.0μl

反转录的cDNA        2.0μl

AP(10μM)           2.0μl

M6(10μM)           2.0μl

dNTPmix(250μM)     1.6μl

Taq酶(4U/μl)       0.25μl

总计                20.0μl

反应条件：94℃，5min； 72℃，7min；

4℃，保存。

第二轮反应混合物如下：

H₂O                         10.15μl

10×PCR缓冲溶液              2.0μl

稀释1000倍的第一轮PCR产物    2.0μl

AP(10μM)                    2.0μl

M5(10μM)                    2.0μl

dNTPmix(250μM)              1.6μl

Taq酶(4U/μl)                0.25μl

总计                         20.0μl

PCR扩增程序与第一轮基本一致，只是将退火温度降至66℃。

扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图1B所示，表明得到一个约1.3kb的片段和一个约750bp的片段，其中1.3kb的片段与推测的序列大小一致。图1B中，M2为GeneRuler^TM 100bp ladder plus(MBI-SM0241)；2为3′RACE产物。回收该片段，按照常规方法将其克隆至pGEM^T-Easy Vector(购自Promega公司)中并测序，与dwarf1/dim相似性为72％，基本上可以确定所得序列就是目的序列。

D.全长MzDWF1 cDNA的扩增

尽管MzDWF1的全部序列已经基本清楚，然而它们毕竟是三段不同的序列。为了获得MzDWF1 cDNA的全长，在已知序列的两端分别设计引物(M7，M8)，按常规方法提取玉米胚根和胚芽的总RNA反转录后，用RT-PCR方法进行PCR扩增，反应混合物如下：

H₂O               10.15μl

10×PCR缓冲液      2.0μl

反转录的cDNA       2.0μl

M7(2μM)           2.0μl

M8(2μM)           2.0μl

dNTPmix(250μM)    1.6μl

Taq酶(4U/μl)      0.25μl

总计               20.0μl

反应条件：94℃，5min； 72℃，7min；

4℃，保存。

扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳结果如图1C所示，表明通过RT-PCR得到了包含整个编码区的ZmDWF1的cDNA克隆，全长约1850bp。图1C中，M2为GeneRuler^TM100bp ladder plus(MBI-SM0241)；3为ZmDWF1全长cDNA产物。回收该片段，按照常规方法将其克隆至pGEM^T-Easy Vector(购自Promega公司)中，将这个载体命名为pT-MD。经北京赛百胜生物公司测序表明，ZmDWF1的核苷酸序列如序列表中的序列1所示，其编码具有序列表中序列2所示的氨基酸序列的蛋白质。

实施例2、Southern blot分析ZmDWF1在玉米基因组中的拷贝数

按照CTAB法提取玉米基因组DNA，分别取15μg玉米基因组DNA，经过BamHI，HindIII，XbaI，DraI，EcoRI和EcoRV过夜酶切，将酶切产物电泳后转移至Southern印迹膜，以ZmDWF1全长为探针进行杂交。结果如图2所示，表明在EcoRV(R)，HindIII(S)酶切产物中有一条清晰的杂交条带，而这两种酶在ZmDWF1基因中都没有切点。此外，在EcoRI(R)(S)和BamHI(R)(S)的酶切产物中含有两条清晰的杂交条带或者少于两条带，而这两种酶在ZmDWF1基因中都只有一个切点。在其余酶尽管在基因中没有或仅有一个酶切位点(EcoRV，HindIII)，但酶切条带中都有2-3条带甚至更多。出现这种情况的可能原因是在这一基因的内含子中有酶的切点，把基因分成了几段。因此，推测在玉米基因组中只有ZmDWF1基因的一个拷贝。同时，该杂交结果也表明：ZmDWF1基因在玉米抗病品种(p138)和感病品种(5003)中具有多态性。图2中，R为玉米抗病品种P138，S为玉米感病品种5003。

实施例3、ZmDWF1在玉米不同发育时期不同组织的表达情况

按常规方法提取玉米不同发育时期各个组织中总RNA，富集mRNA后准确定量，以5μg mRNA转Northern印迹膜，然后以ZmDWF1全长为探针进行杂交。其中胚芽(ES)和胚根(ER)在种子萌发48hr后采集；幼叶(YL)、幼茎(YS)、幼根(YR)在种植一个月后采集，幼根为冠状根；成熟叶片(ML)、成熟茎(MS)、成熟根(MR)、成熟雄穗(PT)、雌穗(PE)、花丝(PS)在授粉期采集；根尖1、2、3、4(T1、T2、T3、T4)在种子萌发48hr后从主胚根上采集，依次是0-0.5cm、0.5-1.0cm、1.0-2.0cm、2.0-3.0cm；幼嫩雄穗(YT)在雄穗尚未露出叶片前采集。杂交结果如图3A和图3B所示，图3A表明ZmDWF1基因在玉米发育不同时期各个组织中基本上都有一条约2.0kb的杂交带，这与实施例1通过拼接得到的ZmDWF1 cDNA的大小一致。图3B表明尽管ZmDWF1基因在各个时期都表达，但表达量明显具有发育时期和组织的特异性：除了胚芽外，与别的器官相比，ZmDWF1在根中表达较强，而在大约相当于幼根根尖(0-0.5cm)(包含根冠和根尖分生组织)以及成熟区位置表达最强，在靠近根尖的相临区域ZmDWF1的表达却非常弱。而在生殖器官中ZmDWF1的表达都比较弱。由于ZmDWF1与拟南芥一个与油菜素内酯生物合成相关基因具有很高的同源性，这些发现可能提示玉米中油菜素内酯主要在根里合成，尤其是幼嫩且生长发育旺盛的根组织。

实施例4、培育株高矮化的玉米

1、玉米转化载体的构建

根据酶切位点分析，用NcoI和NotI酶切处理pT-MD，将得到的大片段插入质粒pET30a(+)(购买自Novagen)的NcoI和NotI之间，形成一个新的质粒pET70D，可用于原核表达。然后以pET70D为模板，用引物(M9，M10)将含有全长目的基因(ZmDWF1)的片段扩增出来。将这个片段和和植物转化载体p3301(购买自澳大利亚CAMBIA公司)同时用PmlI和BglII双切并分别回收，其产物用T₄DNA连接酶过夜连接(16℃)。用连接产物通过热激法转化大肠杆菌(E.coli)(DH5α)，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上筛选出阳性克隆。按常规碱裂解方法提取阳性克隆的质粒DNA，以M9，M10为引物进行PCR鉴定。结果在以阳性克隆为模板的扩增反应中均出现了负对照没有的2.0kb大小的目的基因片段。连接后的质粒命名为p3301F。

以pET70D为模板，用引物(M11，M12)将含有全长目的基因(ZmDWF1)以及pET70D启动子后含多克隆位点的500bp左右的整个片段(约2.4kb)扩增出来。扩增片段回收后用Klenow(DNA聚合酶I大片段)在37℃处理30分钟后，75℃灭活10分钟，同时用PmlI酶切p3301F并分别回收，将回收的产物用T₄DNA连接酶过夜连接(16℃)。用得到的连接产物通过热激法转化大肠杆菌(E.coli)(DH5α)，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB培养基上筛选出阳性克隆。按常规方法提取阳性克隆的质粒DNA，利用四种不同的内切酶分别单切(NcoI，EcoRI，PstI和KpnI)进行酶切鉴定，结果所切片段大小都正确。连接后的质粒命名为p3301RNAi(其图谱如图4)

上述PCR扩增的反应体系和反应条件均和实施例1中的D相同。酶切及连接反应均参照《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克编，冷泉港实验室，2001年，第三版)和所用试剂的说明书进行。

2、转基因玉米的培育

按常规方法大量提取p3301RNAi的质粒DNA，取1ug转化农杆菌LBA4404感受态细胞，28℃、YEB培养基(含Km 50mg/L，Sm 125mg/L)上培养两天。挑选六个克隆M9，M10引物，做菌液的PCR鉴定，均扩增出大小约为2000bp的目标条带。

将含有表达载体p3301RNAi的农杆菌接种于YEB培养基(含Km 50mg/L，Sm 125mg/L)，以250rpm进行振荡培养，在28℃培养至OD600为0.6-0.8，将菌液置于离心管中，在5000rpm下离心5min并收集菌体，将收集的菌体用添加100μM乙酰丁香酮的D-inf液体培养基进行洗涤，以去除残余的YEB培养基，最后将农杆菌悬浮于添加100μM乙酰丁香酮的D-inf中，OD值约为0.3-0.4，备用。(或用AB固体培养基培养2-3天，收集菌体，将收集的菌体用添加100μM AS的D-inf液体培养基进行洗涤，最后将农杆菌悬浮于添加100μM AS的D-inf中，OD值约0.3-0.4，放置半小时可用于转化。)

将玉米幼胚和愈伤组织放到D-inf溶液中一个小时后，用D-inf洗一次，再浸入添加100μM的D-inf农杆菌菌液中，用振荡器振荡30秒，并放置5分种，取出用灭菌滤纸吸干，放到D-AS培养基上，在25℃黑暗共培养3天，并设对照。

把共培养3天后的幼胚和愈伤组织移入含有250mg/L的噻孢霉素的无菌水中，洗涤1-3次，最后一次在含有250mg/L的噻孢霉素的无菌水中浸泡30分钟。取出植物材料，用无菌滤纸吸干，放至含250mg/L的噻孢霉素的愈伤诱导培养基DN6上一周后进行以下处理：

1)低压选择将转化受体移入加有相应抗生素(噻孢霉素250mg/L)的筛选培养基LSD1.5上，先在含Bastar 5mg/L低选择压下培养2周。

2)高压选择  再经过2-3轮Bastar 10mg/L高压选择，每轮3周。每次继代注意淘汰呈褐色和水渍化的愈伤组织，并把生长正常的愈伤组织用镊子夹碎，分开选择培养。

3)胚状体的诱导  然后将选择到的抗性愈伤组织转到诱导胚状体培养基D1.5DM上，3周即可出现胚状体。

4)再生将形成的胚状体再转入到分化培养基RM上进行分化，培养条件为28℃，每日光照3000Lx光强光照16小时，很快就会有小苗再生出来。

5)幼苗锻炼再生的小植株长到3片叶时，可将幼苗分移植到罐头瓶中，并在室内培养。

6)再生苗第一次移栽待小苗长出新叶及根后，将幼苗从罐头瓶中取出，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(1∶3)的小花盆中，最初3-5天，幼苗应遮上塑料薄膜，以保持湿度

7)再生苗的第二次移栽当玉米苗又长出2-3片新叶时，将其移入大田中正常生长，至开花前套袋，人工授粉，正常培育至种子收获，结果如图5和表1所示，表明与在相同条件下培养的未转基因的对照植株相比，T₁代和T₂代玉米的平均株高分别矮于对照54.94cm，54.93cm(图5)。图5中，A，B表示转基因植株(T₁代)表现出不同程度的矮化(50天)；C表示正常的植株(50天)。

表1.T₁代和T₂代玉米的平均株高

样本  平均株高(cm)  样本数 最小值 最大值

CK    214.2±4.1    18     190    248

T₁   159.06±3.4   110    70     200

T₂   159.07±4.0   76     61     245

实施例5、转基因玉米的分子检测

1、PCR检测标记基因bar

由于目的基因在玉米中本身存在，所以进行bar基因的检测以确定目的构建体的整合情况。具体方法如下：

DNA微量提取：在一装有400ul冰冷的CTAB提取缓冲液(不含β-巯基乙醇)的Eppendoff管中用圆玻璃棒磨碎约1-2cm²的新鲜T₀和T₁代转基因玉米植株或未转基因玉米植株幼嫩叶片。加入500ul 65℃预热的CTAB提取缓冲液(含β-巯基乙醇)混匀，65℃保温90min，不时颠倒混匀。待冷至室温后加入450ul氯仿/异戊醇，颠倒混匀至溶液呈乳浊状---但不要振荡。离心2min分层。将液相转移至一干净的Eppendoff管中，加入3ul RNase A，室温下保温30min。加入600ul异丙醇，颠倒混匀。微量离心机中离心10min沉淀DNA，去上清。依次用800ul 76％乙醇，0.2mol/L乙酸钠和100ul70％乙醇洗涤沉淀。离心沉淀5min，然后吸去残留的乙醇。抽真空泵干燥DNA，最后把DNA溶解于50ul TE缓冲液中，4℃保存。

PCR扩增的反应体系(PCR扩增引物还是M13和M14)均和实施例1中的相同，而

反应条件为：94℃，5min； 72℃，7min；4℃，保存。

取PCR产物10ul进行电泳检测。以质粒p3301RNAi为正对照，未转基因植株为负对照，结果如图6A和图6B所示，表明在T₁，T₂代大部分样品中都有大小为500bp的目的基因条带，而负对照则没有。图6A和图6B中，+表示正对照，质粒p3301RNAi；M为1 kb Ladder；-表示负对照，未转基因的玉米；图6A和图6B中的1-7分别为T₁，T₂代转基因玉米植株。

2、Southern杂交检测目的基因(ZmDWF1)的RNAi构建体的整合

SDS法大量提取步骤1中检测到标记基因bar的转基因玉米植株或未转基因玉米植株的总DNA，在1.5ml Eppendorf管中进行酶解：

加入以下组分：

基因组DNA             15-30ug

10×Buffer            10ul

HindIII内切酶         10ul

ddH₂O                补充水到100ul

37℃酶解12小时，取1ul电泳检测是否酶解完全，如不完全，则补加酶和Buffer；酶切完成后，电泳、转尼龙膜。4℃保存或直接用于杂交。

标记探针：

以ZmDWF1的全长cDNA为模板，以M15，M16为引物，反应体系均和实施例1中的相同，反应条件为94℃，5min；

72℃，7min；4℃，保存。

进行PCR，得到约960bp的目的基因特异的片段30ng，用无菌水补至32ul，沸水中变性5min，冰浴5min。按Promega公司的Prime-a-Gene Labelling System Kit说明，依次加入：

5×标记缓冲液            10ul

dA.T.G(0.5mM每种)        2ul

BSA(10mg/ml)             2ul

Klenow片段(5units/ul)    1ul

α-³²P dCTP(10uCi/ul)   3ul

总体积                   50ul

37℃保温三个小时，沸水中变性10min，冰浴10min，备用。

预杂交和杂交：

5×SSC预湿的杂交膜放入杂交管，带有DNA的一面向里，加入10ml预热到65℃的Church缓冲液(含1％BSA，1mM EDTA，0.25M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH7.2)，7％SDS)预杂5hr，加入变性好的探针，于65℃杂交16h以上。杂交结束后，依次用2×SSC+0.5％SDS，1×SSC+0.5％SDS，0.5×SSC+0.5％SDS，0.1×SSC+0.1％SDS在65℃洗膜，每次15min，洗完后，滤纸吸干膜表面的水分，保鲜膜包好，放入暗盒，-70℃放射自显影，自显影的时间根据信号强弱而定。该Southern杂交结果如图7A和图7B所示，表明步骤1中检测到标记基因bar的转基因玉米植株中出现了负对照中不一样的条带，出现了新的条带，说明目的基因的RNAi构建体已经整合到玉米基因组中。图7A中，+表示正对照，960bp的目的基因PCR回收片段；-表示负对照，未转基因玉米植株；1-8为步骤1中检测到标记基因bar的转基因玉米植株。图7B中，+表示正对照，960bp的目的基因PCR回收片段；-表示负对照，未转基因玉米植株；1-7为转基因植株。

3、Western blot方法检测目的蛋白(ZmDWF1编码的蛋白)的表达

用磷酸盐缓冲液[200mM NaCl，50mM NaH₂PO₄(pH7.0)，10mM MgCl₂，10％甘油，5mM β-巯基乙醇，0.5mM PMSF]加上2％SDS来提取转基因玉米植株(包括步骤1中检测到标记基因bar的转基因玉米植株)T₁代、T₂代和未转基因玉米植株总蛋白。每点样孔上样40μg总蛋白[蛋白定量参照Bradford方法(Bradford，1976)]，用Bio-Rad装置进行SDS-PAGE电泳，按照Bio-Rad操作说明书转膜并显色。其中，转基因玉米植株T₁代进行8％的SDS-PAGE电泳，转基因玉米植株T₂代进行12％的SDS-PAGE电泳。结果如图8A、图8B、图8C和图8D所示，表明矮化植株中的目的蛋白的表达受到了抑制甚至检测不到目的蛋白，目的蛋白大小约65KD。图8A和图8B中，1为矮化严重的转基因植株，2为中等矮化的转基因植株，3，4为正常的同龄植株(高)；图8C和图8D中，PreM 为prestaining marker；1为正常植株(高)；2为矮化严重的转基因植株(与图8A和图8B中的1分别对应)；3为中等矮化的转基因植株(与图8A和图8B中的2分别对应)。

序列表

<160>8

<210>1

<211>2005

<212>DNA

<213>玉米属玉米(Zea mays L.)

<400>1

ccgcaggcag catctgcatc tctcgcccac ctccgctccg cctactgctg ctggtggtag  60

ggaggcggag aaggaggccc ttgcgcccgc ccgccggccg gatcagagcc gtagcaacca  120

ccacccatgg cggacgtgca cgaacctttg gtgcgccgta agaggaagaa ggttttggtg  180

gactacttgg tgaagttccg atggatcctc gtgatcttcg tggtccttcc tatttcaact  240

ctgatctact tcaacatctt cctgggcgac atgtggtccg ccatgaagtc ggagaagaag  300

cgccagaagc agcacgacga gaacgtgcag aaggtcgtga agcggctcaa gcagaggaac  360

ccgaagaagg acggtcttgt ttgcacggcc aggaagccct ggatcgctgt tggcatgcgc  420

aacgtggact acaagcgtgc gaggcatttc gaggtcgacc tttcttcctt caggaacatc  480

cttgagatcg acaaagagag gatggttgcc aaggtcgagc cccttgtcaa catgggtcag  540

ataaccagag ctacctgccc aatgaacctt gcccttgcgg tcgtcgccga gctcgacgac  600

ctcactgttg gtgggctgat caacggttac ggcatcgagg ggagctctca cctctatggc  660

cttttctccg acacggttgt cgcgatggag gttgttctcg cagatggccg ggtcgtcaga  720

gccaccaagg acaacgagta ctctgacctt ttctatggaa ttccctggtc ccagggaaca  780

ctggggttcc ttgtctctgc agagatcaag ctgatcccca tcaaggagta catgaagctc  840

acctacactc cagtcaaggg gggtctaaag gagatcgcgc aggcctacgc ggattctttc  900

gctccgaggg acggtgaccc ggcaaaggtc cctgactttg ttgaagggat ggtgtacaca  960

gagagcgagg gtgtcatgat gacgggcgtg tacgcttcga aagaagaggc gaagaagaag  1020

ggcaacaaga tcaactgcgt ggggtggtgg tttaagccct ggttctacca gcacgctcag  1080

acggcgctga ataggggcga gtttgtggag tacatcccga cgagggagta ctaccaccgg  1140

cacacccggt gcctgtactg ggaggggaag ctgatcctgc ccttcggcga ccagttctgg  1200

ttcaggttcc tgctgggctg gctgatgcca ccgaaggtgt ccctgctgaa ggcgacccag  1260

ggcgaggcta tcaggaacta ctaccacgac aaccatgtga tccaggacat gctggtgccg  1320

ctgtacaagg ttggggatgc gctggagttc gtgcaccgcg agatggaggt gtatcctctg  1380

tggctgtgcc ctcaccggct gtacaagctg ccggtgaaga cgatggtgta cccggagcct  1440

gggttcgagc accagcacag gcagggcgac gcgagctacg cacagatgtt cacggacgtg  1500

ggcgtgtact acgcccccgg ggcggtgctg aggggggagg agttcaacgg cgcggaggct  1560

gtgcacaggc tggagcagtg gctgatcgag aaccacagct accagccgca gtacgcggtg  1620

tcggagctga acgagaagga ctcctggcgc atgttcgacg cgtcgcacta cgagcactgc  1680

cgccaaaagt acggggcggt gggcacgttc atgagcgtgt actacaagtc caagaagggg  1740

cgcaagacgg agaaggaggt gcaggaggcg gaggcggcca tactggagcc ggcctacgcg  1800

gacgaggagg cctaaagctc gtggtcgttt tgcttagccc attttaatta gaacttgatg  1860

gatgtagtgt gtgtctgtct gaagtcattt taattagaac tcttaaagct cgtggtcggt  1920

cggtcagtca gtcagtcatt gtcgttgatg tccagcgttg tgtttttttt atattctcta  1980

atggaatctc tcagattgat tcggg                                        2005

<210>2

<211>562

<212>PRT

<213>玉米属玉米(Zea mays L.)

<400>2

Met Ala Asp Val His Glu Pro Leu Val Arg Arg Lys Arg Lys Lys Val

1               5                   10                  15

Leu Val Asp Tyr Leu Val Lys Phe Arg Trp Ile Leu Val Ile Phe Val

            20                  25                  30

Val Leu Pro Ile Ser Thr Leu Ile Tyr Phe Asn Ile Phe Leu Gly Asp

        35                  40                  45

Met Trp Ser Ala Met Lys Ser Glu Lys Lys Arg Gln Lys Gln His Asp

    50                  55                  60

Glu Asn Val Gln Lys Val Val Lys Arg Leu Lys Gln Arg Asn Pro Lys

65                  70                  75                  80

Lys Asp Gly Leu Val Cys Thr Ala Arg Lys Pro Trp Ile Ala Val Gly

                85                  90                  95

Met Arg Asn Val Asp Tyr Lys Arg Ala Arg His Phe Glu Val Asp Leu

            100                 105                 110

Ser Ser Phe Arg Asn Ile Leu Glu Ile Asp Lys Glu Arg Met Val Ala

        115                 120                 125

Lys Val Glu Pro Leu Val Asn Met Gly Gln Ile Thr Arg Ala Thr Cys

    130                 135                 140

Pro Met Asn Leu Ala Leu Ala Val Val Ala Glu Leu Asp Asp Leu Thr

145                 150                 155                 160

Val Gly Gly Leu Ile Asn Gly Tyr Gly Ile Glu Gly Ser Ser His Leu

                165                 170                 175

Tyr Gly Leu Phe Ser Asp Thr Val Val Ala Met Glu Val Val Leu Ala

            180                 185                 190

Asp Gly Arg Val Val Arg Ala Thr Lys Asp Asn Glu Tyr Ser Asp Leu

        195                 200                 205

Phe Tyr Gly Ile Pro Trp Ser Gln Gly Thr Leu Gly Phe Leu Val Ser

    210                 215                 220

Ala Glu Ile Lys Leu Ile Pro Ile Lys Glu Tyr Met Lys Leu Thr Tyr

225                 230                 235                 240

Thr Pro Val Lys Gly Gly Leu Lys Glu Ile Ala Gln Ala Tyr Ala Asp

                245                 250                 255

Ser Phe Ala Pro Arg Asp Gly Asp Pro Ala Lys Val Pro Asp Phe Val

            260                 265                 270

Glu Gly Met Val Tyr Thr Glu Ser Glu Gly Val Met Met Thr Gly Val

        275                 280                 285

Tyr Ala Ser Lys Glu Glu Ala Lys Lys Lys Gly Asn Lys Ile Asn Cys

    290                 295                 300

Val Gly Trp Trp Phe Lys Pro Trp Phe Tyr Gln His Ala Gln Thr Ala

305                 310                 315                 320

Leu Asn Arg Gly Glu Phe Val Glu Tyr Ile Pro Thr Arg Glu Tyr Tyr

                325                 330                 335

His Arg His Thr Arg Cys Leu Tyr Trp Glu Gly Lys Leu Ile Leu Pro

            340                 345                 350

Phe Gly Asp Gln Phe Trp Phe Arg Phe LeuLeu Gly Trp Leu Met Pro

        355                 360                 365

Pro Lys Val Ser Leu Leu Lys Ala Thr Gln Gly Glu Ala Ile Arg Asn

    370                 375                 380

Tyr Tyr His Asp Asn His Val Ile Gln Asp Met Leu Val Pro Leu Tyr

385                 390                 395                 400

Lys Val Gly Asp Ala Leu Glu Phe Val His Arg Glu Met Glu Val Tyr

                405                 410                 415

Pro Leu Trp Leu Cys Pro His Arg Leu Tyr Lys Leu Pro Val Lys Thr

            420                 425                 430

Met Val Tyr Pro Glu Pro Gly Phe Glu His Gln His Arg Gln Gly Asp

        435                 440                 445

Ala Ser Tyr Ala Gln Met Phe Thr Asp Val Gly Val Tyr Tyr Ala Pro

    450                 455                 460

Gly Ala Val Leu Arg Gly Glu Glu Phe Asn Gly Ala Glu Ala Val His

465                 470                 475                 480

Arg Leu Glu Gln Trp Leu Ile Glu Asn His Ser Tyr Gln Pro Gln Tyr

                485                 490                 495

Ala Val Ser Glu Leu Asn Glu Lys Asp Ser Trp Arg Met Phe Asp Ala

            500                 505                 510

Ser His Tyr Glu His Cys Arg Gln Lys Tyr Gly Ala Val Gly Thr Phe

        515                 520                 525

Met Ser Val Tyr Tyr Lys Ser Lys Lys Gly Arg Lys Thr Glu Lys Glu

    530                 535                 540

Val Gln Glu Ala Glu Ala Ala Ile Leu Glu Pro Ala Tyr Ala Asp Glu

545                 550                 555                 560

Glu Ala

    562

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gacccatgtt gacaaggggc tcg                                            23

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

ggggctcgac cttggcaacc                                                20

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gcagatggcc gggtcgtcag ag                                             22

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gggtcgtcag agccaccaag gacaa                                          25

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

catctagatc agagccgtag caaccacca                                      29

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

gttgatcaac aacgctggac atcaacgaca a                                   31

Claims (10)

1、一种与玉米株高相关基因编码蛋白，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQID №：2衍生的蛋白质。

2、根据权利要求1述的蛋白质，其特征在于：所述与玉米株高相关基因编码蛋白是序列表中的SEQ ID №：2。

3、一种与玉米株高相关基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

4、根据权利要求3述的基因，其特征在于：所述与玉米株高相关基因是序列表中的SEQ ID №：1。

5、根据权利要求4所述的基因，其特征在于：所述与玉米株高相关基因，是以玉米的总RNA的反转录cDNA为模板，通过5′RACE和3′RACE以及全长玉米株高相关基因cDNA的扩增得到的；所述5′RACE的引物为AAP、序列表中的SEQ ID №：3和序列表中的序列4；所述3′RACE的引物为AP、序列表中的SEQ ID№：5和序列表中的序列6；所述全长玉米株高相关基因cDNA的扩增的引物为序列表中的SEQ ID №：7和序列表中的序列8。

6、含有权利要求3述基因的表达载体。

7、含有权利要求3述基因的细胞系。

8、扩增权利要求3述基因任一片段的引物对。

9、一种培育矮化玉米的方法，是沉默玉米中的与玉米株高相关基因，抑制该基因的表达，得到矮化的玉米。

10、权利要求3所述基因在玉米的遗传改良中的应用。

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