CN1784492A - 针对胞质雄性不育辣椒的特异性dna片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及针对胞质雄性不育辣椒的特异性DNA片段，包括SEQID No：1的多核苷酸，由SEQ ID No：1的第223到第678的核酸组成的与胞质雄性不育辣椒相关的候选多核苷酸(称为orf456)，以及SEQ IDNo：2的多核苷酸。包括SEQ ID No：1或2的多核苷酸的针对胞质雄性不育辣椒的特异性DNA片段可通过PCR方法用于识别辣椒的雄性不育和雄性可育胞质型。另外，杂种辣椒育种/种子公司可检测CMS系中掺杂的保持系，通过确保CMS系的纯度，可以除去大部分的杂种种子污染源，使育种行业和农民受益显著。

Description

针对胞质雄性不育辣椒的特异性DNA片段及其应用

技术领域

本发明涉及针对胞质雄性不育辣椒的特异性DNA片段，使用基于所述DNA的标记区分植物胞质基因型的方法，以及制备转基因胞质雄性不育植物的方法。

背景技术

两个自交系的杂交后代相对于任何一个亲本来说都具有较高的产量潜力，这种现象即为杂种优势。杂种与最好的非杂种品种相比，产量可提高10～30％，是提高产量的理想选择。

应用最为广泛的生产杂交辣椒的系统为三系系统：(a)被称为胞质雄性不育(CMS)系的雄性不育、雌性可育系，因为它在基因组的胞质部分中携带可致使雄性不育的突变；(b)保持系；(c)恢复系。保持系和恢复系的雄性和雌性均可育。实际上，CMS和保持系的基因组的核部分相同(通常称为同核系)，但基因组的胞质部分不同。CMS系的雄性不育为母性遗传，最有可能为线粒体DNA突变所导致。雌性可育的CMS系可通过保持系散发的花粉的受精而繁殖。由于基因组的胞质部分不通过花粉传递，这种杂交的后代只能从CMS系获得胞质，因此仍为雄性不育。尽管后代基因组的核部分有一半来自保持系，但它与CMS系仍完全相同，因为保持系和CMS系的基因组核部分并没有差别。

CMS系与另一自交亲本系(称为恢复系)杂交，可生产杂种种子，如上所述，所述恢复系为雄性和雌性可育。此杂交过程中，CMS系作为雌性亲本而恢复系作为雄性亲本。恢复系还在核基因组中携带Rf(育性恢复)基因，该基因可使细胞质来自CMS系的植物的雄性育性得到恢复。因此可生产杂种种子。选择适当的CMS和恢复系，以使杂种表现出足够强的杂种优势(或异配优势)，从而与自交品种相比具有较高的产量。

辣椒(Capsicum annuum L.)中的CMS首先由Peterson(Peterson PA(1958)″Cytoplasmically inherited male sterility in Capsicum.″Amer Nat.，92：111-119)在引自印度的PI 164835中发现并记载。从此在本领域中，商业种子公司利用此特性生产杂交F₁种子。Peterson系的雄性不育(S-)细胞质为生产杂交F₁辣椒种子的唯一共用CMS来源。

一个经过较好鉴定的CMS系统的例子发现自玉米。通过用不育和可育mtRNA筛选cms-T玉米的mtDNA文库，Dewey等(Dewey RE，Levings III CS，Timothy DH(1986)″Novel recombination in the maizemitochondrial genome produces a unique transcriptional unit in the Texasmale-sterile cytoplasm.″Cell 44：439-449)识别出了T细胞质特异区域。所述区域包含一个被称为T-urf13的特殊基因，据推测该基因编码一段13-kDa的多肽(URF13)。T-urf13位于orf25的上游，两者共转录。

另一个例子发现于矮牵牛属。在矮牵牛属中检测到S-pcf基因与CMS相关。该基因座由以下各部分构成：atp9基因的5′部分；coxII的外显子部分；以及未知开放阅读框urf-s(Young EG，Hanson MR(1987)″A fused mitochondrial gene associated with cytoplasmic male sterility isdevelopmentally regulated.″Cell 50：41-49)。

与CMS有关的特异基因在以下植物中也有所报道：豆类(Johns C，Lu M，Lyznik A，Mackenzie S(1992)″A mitochondrial DNA sequence isassociated with abnormal pollen development in cytoplasmic male sterilebean plants.″The Plant Cell 4：435-449)，芸苔(Grelon M，Budar F，Bonhomme S，Pelletier G (1994)″Ogura cytoplasmic male-sterility(CMS)-associated orf138 is translated into a mitochondrial membranepolypeptide in male-sterile Brassica cybrids.″Mol Gen Genet 243：540-547)，萝卜(Makaroff CA，Apel IJ，Palmer JD(1990)″Characterizationof radish mitochondrial atpA-associated sequences and relationship withmale sterility.″Plant Mol Biol 15：735-746)，向日葵(Moneger R，Smart CJ，Leaver CJ(1994)″Nuclear restoration of cytoplasmic male sterility insunflower is associated with the tissue-specific regulation of a novelmitochondrial gene.″The EMBO J.13(1)：8-17)，水稻(Akagi H(1995)″Genetic diagnosis of cytoplasmic male sterile cybrid plants of rice.″Theor.Appl.Genet.90：948-951)，胡萝卜(Kanzaki H，Takeda M，Kameya T(1991)″Sequence analysis of a mitochondrial DNA fragment isolated fromcultured cells of carrot cytoplasmic male-sterile strain.″Japanese J Genet66：719-724)，以及高粱(Tang HV(1996)″Transcript processing internalto a mitochondrial open reading frame is correlated with fertilityrestoration in male-sterile Sorghum.″Plant J.10：123-133)。

尽管这些CMS相关基因通常由mtDNA的内部重排产生(HansonMR(1991)″Plant mitochondrial mutations and male sterility.″Annu RevGenet 25：461-486)，但开放阅读框没有明显的序列同源性。直到现在仍不清楚这些基因在CMS植物中如何作用并产生线粒体功能异常和无功能的花粉。

CMS特性在商业上生产杂交F₁种子中非常有用和重要。因此，几个研究小组一直尝试培育转基因雄性不育植物。例如，Mariani等(Mariani C，Beuckeleer J，Truettner J，Leemans J，Goldberg RB(1990)″Induction of male sterility in plants by a chimeric ribonucleasegene.″Nature 347：737-741)通过使用绒毡层特异性启动子和barnase(芽胞杆菌RNA酶)基因培育了雄性不育烟草，其中所述barnase基因是植物中的核糖核酸酶基因。还有几次实验试图将这些CMS相关基因转化进入可育植物中。使用菜豆中CMS相关的线粒体DNA序列orf239(Abad AR，Mehrtens BJ，Mackenzie SA(1995)″Specific expression inreproductive tissues and fate of a mitochondrial sterility-associated proteinin cytoplasmic male sterile beans.″Plant Cell 7：271-285)转化具有或不具有线粒体靶向序列的烟草。转化的烟草显示出半不育或雄性不育表现型，尽管该蛋白并没有成功引导至线粒体中(He S，Abad AR，Gelvin SB，Mackenzie SA (1996)″A cytoplasmic male sterility-associatedmitochondrial protein causes pollen disruption in transgenic tobacco.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11763-11768)。另一CMS相关基因，即矮牵牛属中编码25kDa蛋白的pcf基因的urf-s序列，已经用线粒体靶向序列构建体转化进入矮牵牛花和烟草植物中。尽管在转基因矮牵牛花和烟草植物的线粒体中检测到PCF蛋白的表达，这些植物的育性却不受影响(Wintz H，Chen HC，Sutton CA，Conley CA，Cobb A，Ruth D，HansonMR(1995)″Expression of the CMS-associated urf-s sequence intransgenic petunia and tobacco.″Plant Mol Biol 28：83-92)。

另外，在育种系统中，正确识别包括粮食作物在内的植物的雄性可育(N-)胞质和雄性不育(S-)胞质极为重要。常规通过发芽试验(GOT)来估算杂交种子纯度和胞质基因型，该项试验依赖于评估生长成熟的代表性取样植物的形态特征和花的特征(可区分出杂种)。例如，辣椒需要生长数月才能成熟，在获得结果之前，种子因为不能上市而必须在适宜的条件下贮存。另外，较长的延迟可导致生产杂交种子后的第一种植季节被GOT试验占据，该季节也是种植杂种的最好季节。此种情况下，种子不得不贮存长达一年时间，即直到下一个种植季节才能上市。对于种子公司来说，在等待GOT结果的过程中，大量资金以贮藏杂交种子的形式长时间积压。GOT试验的另一个缺点是形态特征的表达易受环境的影响。而且，不利气候条件(如暴风或暴雨、高温、干旱)还有可能损伤或毁坏作物，从而难以收集数据。为了解决上述问题，开发了使用CMS相关的序列作为DNA标记的技术，以便容易地检测雄性不育胞质型。本技术使用通过聚合酶链反应(PCR)检测的DNA标记，由于此技术比诸如限制片段长度多态性(RFLP)等基于杂交的方法能够更加高效地处理大量样品，所以是实现本发明目的的理想方法。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明的一个方面提供与辣椒胞质雄性不育相关的DNA片段。

本发明的另一目的是提供用于获得转基因雄性不育植物的构建体，所述构建体使用由下面两部分组成的多核苷酸：SEQ ID NO：1的第223到第678的核酸，以及能够将所述编码区表达的蛋白定位于线粒体内的DNA序列。

本发明的另一目的是提供一种生产转基因雄性不育植物的方法。

本发明的另一目的是提供一种在转基因植物中抑制花粉生成的方法。

本发明的另一目的是提供针对CMS辣椒的特异性核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供一种通过PCR方法识别雄性不育辣椒的方法。

本发明的另一目的是提供用于识别雄性不育辣椒的PCR成套引物。

为了实现本发明的目的，本发明提供针对胞质雄性不育辣椒的特异性DNA片段，包括SEQ ID NO：1的多核苷酸或者由SEQ ID NO：1的第223到第678的核酸组成的多核苷酸。

另外，本发明提供一种转基因雄性不育植物，所述植物包括由SEQID NO：1的第223到第678的核酸组成的多核苷酸序列。

另外，本发明提供一种用于获得转基因雄性不育植物的构建体，包括：

a)由SEQ ID NO：1的第223到第678的核酸组成的多核苷酸序列(称为orf456)，

b)在植物中具有活性的启动子，并且有效连接于所述多核苷酸以实现其表达；和

c)能够将a)中所述多核苷酸表达的蛋白转移至线粒体的DNA序列。

另外，本发明提供一种生产转基因雄性不育植物的方法，包括：

a)制备构建体，包括

i)由SEQ ID NO：1的第223到第678的核酸组成的多核苷酸序列(称为orf456)。

ii)在植物中具有活性的启动子，并且有效连接于所述多核苷酸以实现其表达，和

iii)能够将a)中所述多核苷酸表达的蛋白转移至线粒体的DNA序列；

以及

b)将构建体转化进入植物或植物细胞。

另外，本发明提供一种在植物中抑制花粉生成的方法，包括：

a)制备构建体，包括

i)由SEQ ID NO：1的第223到第678的核酸组成的多核苷酸序列(称为orf456)，

ii)在植物中具有活性的启动子，并且有效连接于所述多核苷酸以实现其表达，和

iii)能够将a)中所述多核苷酸表达的蛋白转移至线粒体的DNA序列；

以及

b)将构建体转化进入植物或植物细胞。

另外，本发明提供位于辣椒coxII的3’侧翼区的CMS特异性DNA片段(SEQ ID NO：1，1596bp)，以便通过PCR识别雄性不育辣椒，包括：

a)对植物DNA或植物线粒体DNA，使用能够使coxII基因组基因的一部分或SEQ ID NO：1的核苷酸序列的一部分退火的正向引物和能够使SEQ ID NO：1的核苷酸序列的一部分退火的反向引物，进行聚合酶链反应(PCR)；和

b)观察DNA片段是否扩增，

其中，存在扩增片段表明该植物为雄性不育系，不存在则表明该植物为雄性可育系。

另外，本发明提供一种在植物中识别雄性不育的方法，包括：

a)对植物DNA或植物线粒体DNA，使用能够使atp6基因组基因的一部分或SEQ ID NO：2的核苷酸序列的一部分退火的正向引物和能够使SEQ ID NO：2的核苷酸序列的一部分退火的反向引物，进行聚合酶链反应(PCR)；和

b)观察DNA片段是否扩增，

其中，存在扩增片段表明该植物为雄性不育系，不存在则表明该植物为雄性可育系。

另外，本发明提供一种在植物中识别雄性不育的PCR成套引物，包括：

a)能够使coxII基因组基因的一部分或SEQ ID NO：1的核苷酸序列的一部分退火的正向引物；和

b)对植物DNA或植物线粒体DNA，能够使SEQ ID NO：1的核苷酸序列的一部分退火的反向引物，

其中，扩增的DNA片段的大小为从50bp到2kbp以上。

另外，本发明提供位于辣椒atp6的3’侧翼区的CMS特异性DNA片段(SEQ ID NO：2，251bp)，以便通过PCR识别雄性不育辣椒，包括：

a)能够使apt6基因组基因的一部分或SEQ ID NO：2的核苷酸序列的一部分退火的正向引物；和

b)对植物DNA或植物线粒体DNA，能够使SEQ ID NO：2的核苷酸序列的一部分退火的反向引物，

其中，扩增的DNA片段的大小为从50bp到1kb kbp以上。

附图说明

图1显示通过使用EcoRI、HindIII和BamHI消化，与八种线粒体探针(coxI、coxII、coxIII、atpA、atp6、atp9、cob、nad9基因)杂交，进行mtDNA的DNA印迹分析，以比较辣椒的雄性可育(F)和雄性不育(S)系。

图2显示使用三种线粒体探针(atpA，atp6，coxII)进行mtRNA的RNA印迹分析。atp6和coxII基因显示RNA转录物的多态性条带图(以箭头表示)。

图3显示对辣椒(Capsicum annuumL.)的atp6和coxII基因进行RFLP和反向PCR的结果。(A)：使用atp6(左)和coxII(右)探针对N细胞质和S细胞质进行DNA印迹分析的结果。(B)：反向PCR扩增以克隆辣椒CMS系特异性DNA序列。预测的PCR片段以星号(*)标出。

图4显示辣椒保持系(N细胞质)和CMS系(S细胞质)的coxII编码和侧翼区的示意图。

图5显示辣椒保持系(N细胞质)和CMS系(S细胞质)的atp6编码和侧翼区的对照示意图。(A)：辣椒(N)atp6-1和(S)atp6-1基因核苷酸序列的对照示意图。

(B)：(N)atp6-2和(S)ψatp6-2核苷酸序列的对照示意图。高度保守区以绿框表示。红框显示与(N)atp6-2的3’区无核苷酸序列同源性的截短区(truncated region)。箭头表示atp6的3’区进行反向PCR的引物对。每个atp6拷贝的EcoRI-EcoRI片段大小在右侧标明。

图6为可育系和不育系coxII基因核苷酸序列的对照示意图。箭头表示在coxII的3′区进行反向PCR、测序和RT-PCR实验的引物对。

图7显示对位于不育系coxII基因的3’区的orf456基因进行RT-PCR实验的结果。

图8显示使用orf456探针对可育系、不育系和恢复系的mtRNA进行RNA印迹分析的结果。大约15μg/道的RNA加载于1.2％的琼脂糖凝胶，并转移至N⁺尼龙膜。F：可育系，S：不育系，R：恢复系。

图9显示通过orf456基因的表达进行细菌生长抑制实验的结果。

图10显示用来转化的orf456和egfp-1转基因的构建。该图显示将各基因构建体克隆进入pCAMBIA2300植物转化载体的方案。

图11显示洋葱瞬时表达分析的GFP荧光图谱。

图12显示拟南芥属(Arabidopsis)转化体的GFP荧光图谱。

图13显示雄性不育(线粒体靶向，a)转化体和雄性可育(线粒体非靶向，b)转化体的花朵形态。

图14显示转基因拟南芥属线粒体靶向转化体在结种期的表型。

图15显示异源T₀转基因拟南芥属转化体，同时显示雄性不育和雄性可育表型。

图16显示使用CMS特异性SCAR引物对对20种辣椒栽培种或保藏物(accession)进行PCR扩增。

具体实施方式

在以下的详细叙述中，只对所选实施方式进行说明和描述，只是为了说明发明人认为的实施本发明的最佳方式。应该理解，本发明可在多个方面进行修改而不背离本发明。因此，附图和描述本质上应看作是示例性而非限制性。

本发明的针对胞质雄性不育辣椒的特异性DNA片段包括SEQ IDNO：1的多核苷酸，由SEQ ID NO：1的第223至第678的核酸组成的多核苷酸，或者SEQ ID NO：2的多核苷酸。SEQ ID NO：1的多核苷酸(1596bp)位于coxII基因的3’末端，并且包含位于核酸的第223至第678位的orf456区作为开放阅读框。SEQ ID NO：2的多核苷酸(251bp)位于3’截短型apt6基因的3’末端。

针对胞质雄性不育辣椒的特异性DNA片段可用于制备雄性不育植物或/和从辣椒保持系中区分雄性不育系。

本发明可用于所有种类的植物，优选包括茄科(solanaceae)如辣椒、茄子、烟草、西红柿和矮牵牛花；十字花科(Brassicaceae)如萝卜、花椰菜和甘蓝；花卉植物种类如百合和菊花；以及木本植物。

为了制备转基因雄性不育植物，可先制备带有与辣椒胞质雄性不育相关的DNA片段(orf456)的表达构建体，其中所述DNA片段有效连接于转录和翻译调节序列并受其调控。转录和翻译调节序列为可在特定生物体(如细菌、酵母、真菌、植物、昆虫、动物和人类)、细胞或组织中起作用以影响与之相连的外源基因的转录和翻译表达的序列，可根据宿主细胞选择使用。转录和翻译调节序列的例子包括启动子、增强子、靶向前序列和终止子，但不限于此。

启动子可来源于高水平表达的基因，以指导下游结构序列的转录。此类启动子可来源于公知质粒或载体，例子包括RA8启动子、TA29启动子等等。选择适当的启动子可由本领域普通技术人员较好地完成。

表达构建体可进一步包括多克隆位点、选择性标记、复制起点，以及能够将外源基因表达的蛋白转移至线粒体的DNA序列，例如，SEQID NO：3的酵母细胞色素c氧化酶亚基IV(coxIV)的前序列。表达构建体可为普通载体，例子有质粒或病毒载体，包括由CaMV 35S启动子和胭脂碱合酶(nos)基因终止子组成的pCAMBIA2300载体。然而，可以使用任何其他的质粒或载体，只要它可在宿主中复制和存活。

根据宿主细胞类型所采用的生成转化体的转化方法已为公知，如磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导转染，电穿孔(electrophoration)(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，1986)，热休克(heat-shock)，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的DNA转移，原生质体转化，微注射和生物射弹转染。

在本发明的一个实施方案中，带有orf456片段的重组pCAMBIA2300载体通过根癌土壤杆菌介导的DNA转移引入洋葱和拟南芥属植物中。洋葱瞬时表达实验表明SEQ ID NO：3的酵母细胞色素c氧化酶亚基IV(coxIV)的前序列能够将外源基因表达的蛋白转移至线粒体。使用带有orf456片段的重组pCAMBIA2300载体转化的拟南芥(Arabidopsis thaliana)显示没有花粉这一雄性不育表型。

本发明还有一主题为从转基因雄性不育植物恢复为雄性可育植物的方法，根据本发明，其特征在于它包括以下步骤：

(a)使用包含所述序列的载体质粒，通过将如上限定的杂交DNA构建体的至少一个拷贝引入受体植物中以转化所选的高等植物，以获得转基因雄性不育植物(TMSP)；(b)使用包含反向orf456序列的质粒，通过引入反义杂交DNA构建体(包括orf456基因的反义编码区)的至少一个拷贝来转化与(a)中相同的高等植物，以获得转基因雄性可育植物(TMFP)；以及使(1)中获得的转基因雄性不育植物和(2)中获得的雄性可育植物杂交，以获得雄性育性恢复的、具有预选特性的优势杂种。本发明的主题还涉及包括与启动子和适当的终止子相连的、如上限定的反义杂交序列的质粒，其中所述启动子选自组成型启动子(constitutive promoter)和花药特异性启动子。

另外，本发明的胞质雄性不育辣椒特异性DNA片段可用于从保持系辣椒中识别雄性不育辣椒。识别雄性不育辣椒的方法包括：a)以植物DNA或植物线粒体DNA为模板，使用能够使coxII基因组基因或atp6基因组基因的一部分或SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列的一部分退火的正向引物和能够使SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列的一部分退火的反向引物，进行聚合酶链反应(PCR)，和b)观察DNA片段是否扩增，存在扩增片段表明该植物为雄性不育系，不存在则表明该植物为雄性可育系。扩增DNA片段的大小为从50bp到2kbp以上，正向引物和反向引物长度为从50bp到1kbp以上。

在观察步骤中，DNA片段是否扩增可以通过在琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行溴乙锭染色来检测。还可以采用放射标记、比色、化学发光或荧光等方法检测PCR产物。

在本发明的一个实施方案中，使用包含SEQ ID NO：15或17的核苷酸序列的引物作为正向引物，使用包含SEQ ID NO：16或18的核苷酸序列的引物作为反向引物。

提供以下实施例进一步阐述本发明，并非意图在权利要求书的限定之外限制本发明。

                     实施例

实施例1：雄性不育和可育辣椒的RFLP和RNA印迹分析

本研究中使用一种辣椒(Capsicum annuum cv.Milyang)的近等基因雄性可育系(N/rf/rf基因型)、雄性不育系(S/rf/rf)和恢复系(S/Rf/Rf)。这些均由Hungnong种子公司(Hungnong Seed Company)提供。

1-1.RELP分析

为了从保持系和CMS系植物中分离mtDNA，辣椒幼叶在黄化后采集并均质，均质过程每10g样品使用70ml均质缓冲液(0.1M Tris-HClpH7.2，0.5M甘露醇，0.001M乙二醇-双(β-氨乙基醚)N，N，N’，N’四乙酸(EGTA)，0.2％牛血清白蛋白(BSA)，0.05％半胱氨酸)。通过蔗糖梯度离心纯化线粒体，然后通过DNA酶I程序(Sparks RB，Dale RMK(1980)″Characterization of 3H-labelled supercoiled mitochondrial DNA fromtobacco suspension culture cells.″Mol Gen Genet 180：351-355)分离mtDNA。

雄性可育和CMS系的mtDNA(10μg)使用EcoRI(德国，BoehringerMannheim)消化后分别使用0.8％琼脂糖凝胶分离，然后转移至HybondN⁺尼龙膜(美国，新泽西，Amersham Pharmacia Biotech)。选择八种线粒体探针(coxI，coxII，coxIII，atpA，atp6，atp9，cob，nad9)进行RFLP分析。使用[α-32P]dCTP(美国，新泽西，Amersham Pharmacia Biotech)以随机引物法对线粒体DNA探针进行放射性标记。使用杂交缓冲液(0.75M NaCl，0.125M柠檬酸，0.05M磷酸钠，5×Denhardt′s溶液，3％葡聚糖硫酸酯，2.5mM EDTA，0.6％SDS，pH7.2，50％甲酰胺)在42℃下进行DNA印迹分析24h。使用2×SSC、0.1％SDS在65℃下冲洗印迹10min，1×SSC、0.05％SDS在65℃下冲洗20min。使用X射线胶卷(美国，Kodak)为印迹拍照。

图1显示通过使用EcoRI、HindIII和BamHI消化，与八种线粒体探针(coxI、coxII、coxIII、atpA、atp6、atp9、cob、nad9基因)杂交，进行mtDNA的DNA印迹分析，以比较辣椒的雄性可育(N)和雄性不育(S)系。三个基因(atpA，atp6，coxII)显示出可育和不育mtDNA之间的多态性。

1-2：RNA印迹分析

为了进行RNA印迹分析，将来自不育、可育和恢复花药的总RNA(20μg)分开置于标准甲醛凝胶(1.2％琼脂糖)上，并通过毛细管印迹(Sambrook等，1989)转移至Hybond N⁺尼龙膜(美国，AmershamPharmacia Biotech.)。对这三个基因(atpA，atp6，coxII)进行RNA印迹分析。印迹在60℃杂交16小时，最后使用0.5×SSC，0.1％SDS冲洗。

图2显示使用三种线粒体探针(atpA，atp6，coxII)进行mtRNA的RNA印迹分析的结果，其中这三种探针在DNA印迹分析中显示多态性条带。atp6和coxII基因显示转录产物RNA(以箭头表示)的多态性条带图。

实施例2：对coxII和atp6的侧翼区进行反向PCR和测序

2-1.对coxII基因的3’侧翼区进行反向PCR

进行反向PCR以克隆保持系和CMS系辣椒中的coxII基因的3’区。为进行反向PCR，将mtDNA(5μg)在含有10单位EcoRI(德国，Boehringer Mannheim)的100μl的反应混合物中在37℃下过夜消化。消化混合物使用苯酚/氯仿提取，使用乙醇沉淀DNA。使用3单位的T4 DNA连接酶(美国，BRL)，在200μl体系中37℃下重新连接mtDNA30分钟。随后，连接混合物置于65℃失活20分钟。苯酚/氯仿提取之后，DNA先使用乙醇沉淀，然后溶解于50μl TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH7.4)。

对大约500ng DNA在热循环仪(Perkin Elmer 9600)中进行PCR反应，PCR反应混合物的总体积为50μl，由以下几部分组成：每种引物(SEQ ID NO：5和6的成套引物)各25pmol，每种dNTP各200μM，_ExTaq DNA聚合酶(日本，TakaRa)2.5单位，以及10×_ExTaq DNA聚合酶缓冲液5μl。PCR扩增以94℃(1min)、60℃(1min)和72℃(2min)进行35个循环。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分离，使用溴乙锭染色，并在紫外光下观察。

2-2.对atp6基因的5’和3’侧翼区进行反向PCR

对大约500ng DNA在热循环仪(Perkin Elmer 9600)中进行PCR反应。PCR反应混合物的总体积为50μl，由以下几部分组成：每种引物(SEQ ID NO：7和8的成套引物)各25pmol，每种dNTP各200μM，_ExTaq DNA聚合酶(日本，TakaRa)2.5单位，以及10×_ExTaq DNA聚合酶缓冲液5μl。PCR扩增以94℃(1min)、60℃(1min)和72℃(2min)进行35个循环。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分离，使用溴乙锭染色，并在紫外光下观察。

图3显示辣椒(Capsicum annuum L.)的atp6和coxII基因的RFLP和反向PCR的结果。“A”为使用atp6(左)和coxII(右)探针对N细胞质和S细胞质进行DNA印迹分析的结果。保持(N细胞质)系和CMS(S细胞质)系的mtDNA(10μg)使用EcoRI酶消化后在0.8％琼脂糖凝胶上分离。“B”为进行反向PCR扩增以克隆CMS系辣椒特异性DNA序列的结果，“M1”和“M2”分别表示分子量标准λ/HindIII和1kb DNA puls梯度(美国，Promega公司)。预测的PCR片段以星号(*)标出。

2-3.测定CMS系辣椒特异性核苷酸

实验2-1和2-2的扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶上分离，使用Gelextraction kits(德国，Qiagen)纯化，克隆进入pGEM-T easy载体(美国，Promega)，使用Perkin Elmer 9600 PCR仪和ABI377自动测序仪(美国，Applied Biosystems)测序。

图4显示辣椒保持系(N细胞质)和CMS系(S细胞质)的coxII编码和侧翼区的对照示意图。箭头表示coxII的3’区进行反向PCR的引物对。各coxII的EcoRI-EcoRI片段大小在右侧标出。coxII的3’侧翼区的CMS特异性序列显示有1596个碱基(SEQ ID NO.1)。

图5显示辣椒保持系(N细胞质)和CMS系(S细胞质)的atp6编码和侧翼区的对照示意图。“A”为辣椒的(N)atp6-1和(S)atp6-1基因的结构对照示意图，“B”为(N)atp6-2和(S)ψ atp6-2的结构对照示意图。高度保守区以绿框表示。红框显示与(N)atp6-2的3’区无核苷酸序列同源性的截短区。箭头表示atp6的3’区进行反向PCR的引物对。每个atp6拷贝的EcoRI-EcoRI片段大小在右侧标明。atp6基因的3’侧翼区的CMS特异性序列显示有251个碱基(SEQ IDNO.2)。

4-4.识别与辣椒CMS相关的候选开放阅读框

在NCBI主页，通过程序ORF查找器(ORF Finder)发现了一个新的开放阅读框。通过反向PCR和测序结果，绘制出可育和不育辣椒coxII基因结构差异，并且检测到在不育系coxII基因的3’区存在一个新的开放阅读框(称为orf456)(图6)。至于atp6基因，没有在atp6编码和侧翼区检测到新的开放阅读框或嵌合基因。

实施例3：克隆coxII基因3’区

3-1.反转录酶PCR实验

为了测定ORF查找器程序确定的开放阅读框是否可在CMS植物中真正转录，使用特异性引物对(SEQ ID NO：6，9和10)进行RT-PCR。使用总共三微克花药RNA，在10μl第一链cDNA合成反应体系中，使用M-MLV反转录酶(美国，Gibco BRL)驱动，根据厂商提供的方法进行。在热循环仪(Perkin Elmer 9600)中对1μl cDNA进行PCR，使用每种引物10pmol，每种dNTP 100μM，1.5单位_ExTaq DNA聚合酶(日本，TaKaRa)，以及2.5μl 10×_ExTaq DNA聚合酶缓冲液，共25μl。PCR扩增以94℃(1min)、50℃(1min)和72℃(2min)进行30个循环。RT-PCR产物克隆进入pGEM-T easy载体(美国，Promega)，使用T7和SP6引物(SEQ ID NO：11～14)测序。

图7显示对位于不育系coxII基因的3’区的orf456基因进行RT-PCR实验的结果。使用引物对(SEQ ID NO：9和10)进行RT-PCR以验证新生成的orf456在不育系中确实并且唯一地转录。使用成套引物(SEQID NO：6和10)进行RT-PCR以检测orf456是否与位于上游区的coxII共转录。图8显示使用orf456探针对可育系、不育系和恢复系的mtRNA进行RNA印迹分析的结果。大约15μg/道的RNA加载于1.2％的琼脂糖凝胶，并转移至N⁺尼龙膜。F：可育系，S：不育系，R：恢复系。图3显示使用orf456探针对可育系、不育系和恢复系的mtRNA进行RNA印迹分析的结果。在携带有S细胞质的不育系和恢复系中，orf456开放阅读框确实并且唯一地转录。

实施例4：细菌生长抑制试验

为了查明orf456如何影响植物线粒体并且导致线粒体功能异常和雄性不育，采用异源系统即细菌细胞。检测orf456基因对细菌细胞的可能毒性。

orf456基因克隆进入pTrcHis2-TOPO表达载体，并转染进入大肠杆菌(E.coli)株Top 10细胞(美国Invitrogen)。在相同条件下培养带有pTrcHis2-TOPO+LacZ基因的细胞，并使用1mM IPTG诱导，作为对照。根据制造商提供的方法进行克隆和转化。含有LacZ基因(对照)和orf456基因的Top10细胞在37℃下置于含50μg/ml氨苄西林的3ml LB培养基中预培养16小时。50μl原代培养物转移至20ml该培养基中，37℃下培养2～3小时。当O.D.₆₀₀＝0.6时，加入1mM IPTG，每小时测定吸光度以监测各转化体的生长速度。orf456诱导表达之后，大肠杆菌细胞的生长速度立即显著减缓。图9显示通过orf456基因的表达进行细菌生长抑制试验的结果。带有含orf456的构建体并使用1mMIPTG诱导的大肠杆菌的生长速度，与带有其他构建体的菌株相比，显著减缓。

实施例5：引导外源基因进入线粒体以及制备转化体

5-1.制备用于转化拟南芥属的构建体

从pEGFP-1载体(美国，帕洛阿尔托，Clontech)扩增egfp-1片段(SEQ ID NO：4，购自Clontech的GFP变体)。使用T4 DNA连接酶(美国，Promega)连接扩增的coxIV靶序列(SEQ ID NO：3，酵母中细胞色素c氧化酶亚基IV前体的DNA片段)和egfp-1基因，然后克隆进入pCAMBIA2300载体(MJC)。另外制备如图9所示的coxIV-orf456构建体和非靶向性orf456构建体，并连接于pCAMBIA2300载体。

在图10中，将胭脂碱合酶(nos)基因终止子序列融合于orf456和egfp-1序列的3’末端。在第一个构建体(称为coxIV-orf456)中，orf456序列融合于酵母菌株Y187(美国，Stratagene)核coxIV基因前序列的转运肽序列。第二个构建体(称为非靶向性orf456)没有线粒体靶向肽序列。第三个构建体(称为coxIV-egfp-1)使用coxIV前序列和来自pEGFP-1载体(美国，Clontech)的egfp-1制备。

5-2.洋葱瞬时表达实验

pCAMBIA2300载体中的融合构建体(coxIV前序列融合于egfp-1基因)转染后在洋葱表皮细胞中瞬时表达。将洋葱内表皮(2×2cm)置于包含1×MS盐、30g/L蔗糖和2％琼脂，pH5.7的琼脂板上。表皮移至琼脂板上1小时内进行轰击。如Scott等(1999)所述的方法进行粒子轰击。光下培养20～22小时后，在国家环境管理设备中心(NICEM，韩国，Suweon)，使用辐射2000多光子成像系统(Radiance2000 Multi-Photon Imaging System，加州，Hercules，Bio-Rad)，通过共焦激光扫描显微镜技术检测线粒体定位情况。

图11显示洋葱瞬时表达分析的GFP荧光图谱。左图显示coxIV+egfp-1构建体转化的洋葱中的GFP荧光。使用Mitotraker CMSRox染色(美国Molecular Probe公司)进行线粒体检测(右图)。GFP图谱和Mitotraker染色图谱完全匹配

5-3.拟南芥植株转化

转化试验使用拟南芥野生型哥伦比亚植株进行。载体构建中使用了一个强CaMV 35S启动子和nos终止子。所使用的线粒体靶序列来自酵母coxIV前序列，构建中所使用的orf456和egfp-1序列通过PCR扩增以易于克隆。插入物经酶消化及测序确认。插入物用一种适宜的限制酶消化后克隆到植株转化载体pCAMBIA2300中。在卡那霉素LB培养基上筛选带有正确插入物的克隆。使用热休克法(Sambrook等，1989)转化进入根癌土壤杆菌LBA4404中。使用携带有coxIV(靶向)-orf456和非靶向orf456构建体的根癌土壤杆菌转化拟南芥植株。通过一种改进的花浸泡法(Clough和Bent，1998)进行以根癌土壤杆菌为媒介的转化作用。转基因植株用一种含有卡那霉素硫酸盐(50μg·ml^-1)的培养基筛选。抗生素处理后依然存活的绿色植株留作进一步分析。

图12显示拟南芥根中表达的GFP荧光图谱。

转化体的营养生长是一致的并与未转化的对照植株或非靶向转化体相似。开花后，51株用线粒体靶向信号转染的拟南芥转化株中的31株在T₁代显示雄性不育表型。这是根据花朵形态和结种情况来分类的。在50株使用非靶向构建体转染的拟南芥转化株中，有3株表现雄性不育表型。这是在非靶向实验情况下的非常意外的结果。然而据推测，细胞质中此orf456产物不会对植物细胞有任何有害影响，此结果也为细菌生长抑制实验所证实，即使它不在线粒体中表达。

图13显示雄性不育(线粒体靶向，a)转化体和雄性可育(线粒体非靶向，b)转化体的花朵形态。“a”为带有线粒体靶向orf456的雄性不育转化体的花朵图片，“b”为带有线粒体非靶向orf456的雄性可育转化体的花朵图片。

图14显示拟南芥线粒体靶向转化体(a)和线粒体非靶向转化体(b)在结种期的表型。

图15显示雄性不育和雄性可育表型生长于同一主干的拟南芥转化株，来自于真空渗透转化法。箭形符号表示正常授粉产生的正常长角果，箭头符号表示没有授粉不能正常结种的花朵。

5-4.确认转基因植株

提取供PCR和DNA印迹分析用的叶总DNA(Kim等，2001)。使用热循环仪PTC-200(美国，MJ Research)对100ng总DNA进行PCR扩增，以94℃下30秒、55℃下45秒、72℃下90秒进行三十个循环。总DNA使用限制酶消化，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，然后转移至尼龙膜上，与[α-³²P]dCTP(美国，新泽西州，Amersham Pharmacia Biotech)标记的探针杂交。

表2显示根据花粉产生情况，对确定含有orf456转基因的转基因T₁拟南芥株进行雄性育性评定情况。

(表2)

植株类型	植株数	分类
				可育	不育
		非靶向靶向	5051			4720	331

实施例6：通过基因型定型测定雄性可育或不育

6-1.引物

设计特异性寡核苷酸引物以用于区分辣椒(Capsicum annuum L.)保持(N细胞质)和CMS(S细胞质)系的PCR分析。

coxII SCAR PCR引物

正向引物(SEQ ID NO：15)——coxII基因编码区的一部分

反向引物(SEQ ID NO：16)——CMS系特有序列的一部分

apt6 SCAR PCR引物

正向引物(SEQ ID NO：17)——atp6基因编码区的一部分

反向引物(SEQ ID NO：18)——CMS系特有序列的一部分

coxII阳性对照

正向引物：SEQ ID NO：19

反向引物：SEQ ID NO：20

6-2.区分辣椒CMS和保持系的PCR分析

使用所述成套引物，按如下所述进行PCR。

总DNA(200ng)混合于200μmol dNTP，每种引物20pM，5μl10×反应缓冲液，2.5单位Taq聚合酶(日本，Takara)，反应体系共50μl。对atp6 SCAR标记进行PCR扩增，以94℃(1min)、52℃(1min)、72℃(2min)进行35个循环。扩增的DNA进行0.8％琼脂糖凝胶电泳。在使用coxII SCAR标记的情况下，退火温度为56℃。

图16显示20个辣椒栽培种的PCR结果，其中“N”表示可育表型，“S”表示不育表型，“M”表示λ/HindIII DNA分子量标准。

使用coxII SCAR引物对，在CMS系中有708bp的DNA片段扩增物，而在保持系中没有观察到PCR扩增物。使用atp6 SCAR引物对，在CMS系中有607bp的DNA片段扩增物，而在保持系中没有观察到PCR扩增物。为了检验PCR反应是否正常进行，使用跨coxII基因编码区的PCR引物对作为对照。PCR扩增片段大小约为1.5kb。该PCR实验所用的辣椒列于表1中。

(表1)

	栽培种或保藏物	细胞质基因型*	表型		栽培种或保藏物	细胞质基因型	表型
								1	80-2	S	不育	11	Subicho-1	N	可育
2	80-5	S	不育	12	Milyang-B	N	可育
								3	KC268-1-1	S	不育	13	FC-2(来自中国CMS)	S	不育
4	KC268-1-3	S	不育	14	FC-3(来自欧洲CMS)	S	不育
								5	KC268-2-1	S	不育	15	FC-4	S	不育
6	CMS-A	S	不育	16	4570	S	不育
								7	Chilsungcho-A	S	不育	17	4578	S	不育
8	Milyang-A	S	不育	18	TF68	N	可育
								9	CMS-B	N	可育	19	Ancho	N	可育
10	Chilsungcho-1	N	可育	20	CM334	N	可育

^*N：N细胞质，S：S细胞质

                         序列表

<110>财团法人Seoul大学校 产学协力财团(SEOUL NATIONAL UNIVERSITYINDUSTRY FOUNDATION)

<120>针对胞质雄性不育辣椒的特异性DNA片段及其应用

<130>opp20040905kr

<150>PCT/KR03/00904

<151>2003-05-07

<150>KR 10-2003-0029269

<151>2003-05-09

<160>20

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>1590

<212>DNA

<213>辣椒(Capsicum annuum)

<220>

<221>变体

<222>(1)..(1590)

<223>与胞质雄性不育型相关的coxII基因的3′区

<220>

<221>基因

<222>(223)..(678)

<223>orf456

<400>1

agcgcggaag cttaagcgga aatgaaagag gaggttgagg ttatgaagtc acttagccgt     60

atactataca aagggaaagg cgtcggtacg gagtcacgtc agctgtggat atagactagg    120

ctataaggaa cggagtctta aactatggac cgagacagat atatagaaag tgtgcagtga    180

gggtgcttgt aaatcactag gtagcctagc tcgacccaag caatgcccaa aagtcccatg    240

tatttctggt taaacaaacc agcaatttcc gacaagtctt tcttcattgg aagagcaaga        300

agcggaacta caacatttac atgcaatttc accatgaatt ttattgatta tggcacattg        360

tttacttttt ctttttatct cggtatttca atcggcattt ttgcgggccg gttttttgag        420

cgaagtgaag ttttacagga attggagaac ttccagctag aaaaaataaa actgaaaacg        480

gaagcagaac tgcaatttct ttgtagagag cacttgagaa tgaatgaaga attacaatta        540

cctgttccag atggaacgag tatgcacatc tccgactttt tagggaaagc ctttttggtc        600

gacgagactg tgagggaacg aatattaggg ctgactcaaa tttatatgga tctaaaaaac        660

aatggagcaa ccgagtaact tttttctttt atttttagac tattatagca atttgtttag        720

cgctttttaa tatattcgtc tgtcgccgtt gcagctaaaa taacggagga tggaggcggg        780

gaggggaggg ggacatcaaa tggattcaag tttgaacaaa acaggaagag gttcgattcc        840

tctttgatgt tgttaagcca agagcgccaa gcgcatgcgc gaaatgagag cgtcaggaat        900

ggaaaggcaa aacctactat gcaccaagtc caggaacccg agtccgagta cagtgaatca        960

aggaagagac tgcagcttca tcagctcaat gcaaggtccg tcgaaatctt ccggaggggt       1020

ctagcatccc gtaggtcagt tactccagcg ccacagttcg acagctcggg aaatacctct       1080

cacgcccacg gtcgtctttt gaccacgcaa tgaccttccc agaatgggtt gcagaaagca       1140

gaatctcaaa gggggaaccc catccagggg atatgcagat agagcgccca agacttggca       1200

gggaacggga ccgtgattct gaagaggaac agacaagagg aaagcaaggc caagaagcct       1260

ccgggataga ctcctccctc tatacgtggg agcaacatag acagttcctc ttccctgaag       1320

ccgaggccaa actaacatat cctgtttctc ccgaaacaac ggattcctca ccctcaggag       1380

ccccaagtaa cgaatccgaa tgcctatctc ccgtttaata agacttattg gaatggaaga       1440

aggagagtag tcctctggtc atcagttagt agttcaataa tcccagtagt tgtcctcttg       1500

cctaaaaaaa ggagtcagcc caacatggac aatgataggc agaccaaaga tttacgcagt       1560

ccttgcgtgc ttgctttgcg caccgaattc                                     1590

<210>2

<211>251

<212>DNA

<213>辣椒(Capsicum annuum)

<220>

<221>变体

<222>(1)..(251)

<223>与胞质雄性不育型相关的atp6基因的3’区

<400>2

tgaaaagtgg ttaatagcga gatccattaa ccgtgcttgc tgctctgcgt tgaactcctt      60

tagtggcttc gctcgctcgc tctaacgctc gtttagtaga cagcgagtgg agtgcataag     120

cccctttaga gataggggtg agtactacac gagctcgtaa gtaaagtacg gaacgagcct     180

tgtctacgaa gcagagcgac ctcatcttgc ttgcttctgg cgaagcttct agctctaaat     240

aataggaatt c                                                          251

<210>3

<211>162

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221>基因

<222>(1)..(162)

<223>酵母细胞色素c氧化酶亚基IV前体DNA片段

<400>3

atgctttcac tacgtcaatc tataagattt ttcaagccag ccacaagaac tttgtgtagc     60

tctagatatc tgcttcagca aaaacccgtg gtgaaaactg cccaaaactt agcagaagtt    120

aatggtccag aaactttgat tggtcctggt gctaaagagg gt                       162

<210>4

<211>720

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>绿色荧光蛋白变体

<400>4

atgtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg         60

gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg        120

gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc        180

tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc        240

agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct        300

tcaaggacga cggcaactac gaagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg        360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac        420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac        480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc        540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac        600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc        660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa        720

                                                                         720

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对coxII基因的3’侧翼区进行反向PCR使用的正向引物

<400>5

cttggctggt agaaccactc tattg                                                   25

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对coxII基因的3’侧翼区进行反向PCR使用的反向引物

<400>6

gaaggagttt actatggtca gtgcag                                                  26

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对apt6基因的5’和3’侧翼区进行反向PCR使用的正向引物

<400>7

aggattgcca agcatttggt actgagtttc ctcct                                        35

<210>8

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对apt6基因的5’和3’侧翼区进行反向PCR使用的反向引物

<400>8

ggtatgatac cttatagctt acacgttaca agtca                                       35

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>coxII RT 5’引物

<400>9

atgcccaaaa gtcccatgta t                                                      21

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>coxII RT 3’引物

<400>10

ttactcggtt gctccattgt                                                        20

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>测序引物

<400>11

tgcttgtaaa tcactaggta gcc                                                    23

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>测序引物

<400>12

ccagcaattt ccgacaagtc tt                                                         22

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>测序引物

<400>13

aacgagtatg cacatctccg actt                                                       24

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>测序引物

<400>14

ttaggcaaga ggacaactac tgg                                                        23

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>coxII SCAR PCR引物

<400>15

gtcgggagaa ctacctaact a                                                           21

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>coxII SCAR PCR引物

<400>16

ggctacctag tgatttacaa gca                                                         23

<210>17

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>apt6I SCAR PCR引物

<400>17

agtccacttg aacaatttga aataatc                                                     27

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>apt6I SCAR PCR引物

<400>18

gttccgtact ttacttacga gc                                                          22

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>coxII阳性对照引物

<400>19

cttggctggt agaaccactc tattg                                                      25

<210>20

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>coxII阳性对照引物

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Claims (27)

1.针对胞质雄性不育辣椒的特异性DNA片段，包括SEQ ID NO：1的第223到第678的核酸的多核苷酸。

2.根据权利要求1的DNA片段，其中所述DNA片段包括SEQ IDNO：1的多核苷酸。

3.根据权利要求1或2的DNA片段，其中所述多核苷酸位于coxII基因的3’末端。

4.针对胞质雄性不育辣椒的特异性DNA片段，包括SEQ ID NO：2的多核苷酸。

5.根据权利要求4的DNA片段，其中所述多核苷酸位于3’截短的atp6基因的3’末端。

6.一种转基因雄性不育植物，包括SEQ ID NO：1的第223到第678的核酸的多核苷酸。

7.一种用于获得转基因雄性不育植物的构建体，包括

a)由SEQ ID NO：1的第223到第678的核酸组成的核苷酸序列构成的多核苷酸，

b)在植物中具有活性的启动子，并且有效连接于所述多核苷酸以实现其表达；和

c)能够将a)中所述多核苷酸表达的蛋白转移至线粒体的DNA序列。

8.根据权利要求7的构建体，其中c)中所述DNA序列包括SEQ IDNO：3的核苷酸序列。

9.根据权利要求7的构建体，其中所述植物选自一种或多种以下植物：茄科如辣椒、茄子、烟草、西红柿和矮牵牛花；十字花科如萝卜、花椰菜和甘蓝；花卉植物种类如百合和菊花；以及木本植物。

10.一种制备雄性不育转基因植物的方法，包括将权利要求7的构建体转化进入植物或植物细胞中。

11.根据权利要求10的方法，其中所述植物选自一种或多种以下植物：茄科如辣椒、茄子、烟草、西红柿和矮牵牛花；十字花科如萝卜、花椰菜和甘蓝；花卉植物种类如百合和菊花；以及木本植物。

12.一种抑制植物花粉生成的方法，包括将权利要求7的构建体转化进入植物或植物细胞中。

13.根据权利要求12的方法，其中所述植物选自一种或多种以下植物：茄科如辣椒、茄子、烟草、西红柿和矮牵牛花；十字花科如萝卜、花椰菜和甘蓝；花卉植物种类如百合和菊花；以及木本植物。

14.一种识别胞质雄性不育辣椒的方法，包括：

a)对植物基因组DNA或植物线粒体DNA，使用能够使coxII基因组DNA的一部分或SEQ ID NO：1的核苷酸序列的一部分退火的正向引物和能够使SEQ ID NO：1的核苷酸序列的一部分退火的反向引物，进行聚合酶链反应(PCR)；和

b)观察DNA片段是否扩增，

其中，存在扩增片段表明该植物为雄性不育系，不存在则表明该植物为雄性可育系。

15.根据权利要求14的方法，其中扩增的DNA片段的大小为50bp～2kbp。

16.根据权利要求14的方法，其中PCR的正向引物和反向引物分别包括约15个核酸至35个核酸。

17.根据权利要求14的方法，其中正向引物包括SEQ ID NO：15的核苷酸序列，反向引物包括SEQ ID NO：16的核苷酸序列。

18.根据权利要求14的方法，其中观察DNA片段是否扩增步骤包括进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行溴乙锭染色。

19.根据权利要求14的方法，其中观察DNA片段是否扩增步骤通过放射性标记法、比色法、化学发光法或荧光法进行。

20.一种在植物中识别雄性不育的方法，包括：

a)对植物基因组DNA或植物线粒体DNA，使用能够使apt6基因组DNA的一部分或SEQ ID NO：2的核苷酸序列的一部分退火的正向引物和能够使SEQ ID NO：2的核苷酸序列的一部分退火的反向引物，进行聚合酶链反应(PCR)；和

b)观察DNA片段是否扩增，

其中，存在扩增片段表明该植物为雄性不育系，不存在则表明该植物为雄性可育系。

21.根据权利要求20的方法，其中扩增的DNA片段的大小为50bp～1kbp。

22.根据权利要求20的方法，其中PCR的正向引物和反向引物分别包括约15个核酸至35个核酸。

23.根据权利要求20的方法，其中正向引物包括SEQ ID NO：17的核苷酸序列，反向引物包括SEQ ID NO：18的核苷酸序列。

24.一种在植物中识别雄性不育的PCR成套引物，包括：

a)能够使coxII基因组基因的一部分或SEQ ID NO：1的核苷酸序列的一部分退火的正向引物；和

b)对植物DNA或植物线粒体DNA，能够使SEQ ID NO：1的核苷酸序列的一部分退火的反向引物，以及

其中，扩增的DNA片段的大小为从50bp到2kbp以上。

25.根据权利要求24的PCR成套引物，其中正向引物包括SEQ IDNO：15的核苷酸序列，反向引物包括SEQ ID NO：16的核苷酸序列。

26.一种在植物中识别雄性不育的PCR成套引物，包括：

a)能够使apt6基因组基因的一部分或SEQ ID NO：2的核苷酸序列的一部分退火的正向引物；和

b)对植物DNA或植物线粒体DNA，能够使SEQ ID NO：2的核苷酸序列的一部分退火的反向引物，以及

其中，扩增的DNA片段的大小为从50bp到1kbp以上。

27.根据权利要求26的PCR成套引物，其中正向引物包括SEQ IDNO：17的核苷酸序列，反向引物包括SEQ ID NO：18的核苷酸序列。

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