CN101921804A

CN101921804A - 大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30 K的RNAi植物表达载体

Info

Publication number: CN101921804A
Application number: CN2010101984457A
Authority: CN
Inventors: 朱月林; 盖钧镒; 刘思辰; 杨立飞
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2010-06-11
Filing date: 2010-06-11
Publication date: 2010-12-22

Abstract

本发明涉及大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30 K的RNAi植物表达载体的构建，属于分子生物学领域。分别设计引物扩增Gly m Bd 30 K干扰片段和内含子片段连接pMD19-T载体，转化TOP10。在两端引入酶切位点，将三个片段[30k-antisense(A)、intron(I)和30k-sense(S)]连接起来，将A-I-S结构连入pCAMBIA1301形成干扰载体pCAScil-1301。该RNAi植物表达载体转化大豆将会对过敏蛋白质基因进行基因沉默，为确保过敏人群安全食用大豆奠定坚实基础。对提高我国大豆分子育种的技术水平具有重要理论和实践意义。

Description

大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30 K的RNAi植物表达载体

一、技术领域

本发明涉及了一个大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体的构建，属于分子生物学和生物技术领域。

二、背景技术

RNA干扰(RNA interference，简称RNAi)，又称为转录后基因沉默，是一种快速关闭基因的新方法。也是研究生物体基因表达、调控与功能的一项新技术，其实质是小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默。其作用机理是siRNA与对应的mRNA特异结合并引起降解，从而阻止mRNA的翻译，特异性抑制靶基因的表达，因此成为基因敲除(gene knockout)的强大工具。目前，随着研究的不断深入，RNAi的机制正被逐步阐明，同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。

大豆[Glycine max(L.)Merr.]食物过敏是一个全世界密切关注的公共健康问题。大豆蛋白在食品加工业的广泛应用，给大豆过敏人群带来了一定的食物安全问题。调查发现，全世界约2％的成年人和6％～8％的儿童患有食物过敏症，大豆过敏症多发于5岁以下的幼儿，主要表现为胃部不适或过敏性皮炎，主要的症状是口周红斑、唇肿、起疹子、皮肤发痒、腹泻等，严重时可危及生命。如何降低大豆过敏原含量，保证大豆食品安全，已经成为一个世界范围内的重大课题。

最安全有效防止大豆食品过敏的措施就是培育脱致敏的大豆新品种。尽管传统育种技术已经成功地改善了大豆的营养价值，然而，这种过程不仅耗时，而且利用空间有限，也很难同时改变大豆多个品质性状，毕竟，大豆可改良的遗传资源是有限的，并且对于大豆性状的改良只限于已经得到的突变体材料。而RNA干扰技术，能够扩大可操作基因的范围和突变的种类，且对目的基因的表达有了可控性，同时RNAi所具有的特异性、稳定性、高效、快速以及不改变其它基因的表达等特性，为RNAi在植物功能基因组学研究以及植物的遗传改良等方面提供了一个强有力的手段。RNAi技术在作物品质改良上具有广阔的应用前景。

三、发明内容

技术问题：本发明涉及大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体的构建，属于分子生物学领域。构建的RNAi植物表达载体可导入大豆及其它含有过敏蛋白质的植物，消除过敏蛋白质对过敏人群的危害，可用于植物品种改良。

技术方案：

1)Gly m Bd 30K干扰片段的克隆：

选用‘南农32’作为材料，取幼嫩籽粒，按照TakaRa公司的Total RNA提取试剂盒说明书提取豆粒总RNA，取2μg总RNA合成cDNA，用RNase消化cDNA产物。设计引物扩增Gly m Bd 30K干扰片段：

Ps：CCTTGTGTTGCTTCTTTTCTCC，

Pa：GATGGTCACAAGAATATTGTTC，

Gly m Bd 30K干扰片段长395bp，进行常规聚合酶链式(PCR)反应，以提取的cDNA为模板，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，51.8℃复性30sec，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min，将PCR产物连接到pMD19-T载体上，转化TOP10细胞，进行序列测定后续实验中备用。

2)内含子片段的克隆：

设计引物扩增内含子片段：

Is：GTAAATTTCTAGTTTTTCTCCT，

Ia：CTGTAACTATCATCATCATCAT，

内含子片段长190bp，进行常规PCR反应，pCAMBIA1301质粒为模板，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，45.3℃复性30sec，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min，将PCR产物连接到pMD19-T载体上，转化TOP10细胞，进行序列测定后续实验中备用。

3)Gly m Bd 30K干扰载体的构建：

通过融合PCR的方法将三个片段[30k-antisense(A)、intron(I)和30k-sense(S)]连接起来。设计四条引物，P1、P2、P3、P4，在两端引入酶切位点BstE II和PmI I。

引物序列：

P1：acCACGTGGATGGTCACAAGAATATTGTTCCTTC

P2：ACTAGAAATTTACCCTTGTGTTG(P2各有A和I的一部分)

P3：GAAGCAACACAAGGCTGTAACTATCA(P3各有I和S的一部分)

P4：tatGGTGACCGATGGTCACAAGAATATTGTTC

载体PMD-A-I-S和pCAMBIA1301双酶切Bst EII/PmI I，将A-I-S结构连入pCAMBIA1301形成干扰载体pCAScil-1301。Bst EII/PmI I双酶切反应：5μL Buffer 1，0.5μL BSA，15μL质粒，1μL PmI I补水至50μL，37℃反应2h；酶切结束后，再加入1μL Bst E II，60℃反反应1h。转入TOP10后进行PCR和酶切验证，构建成功。

有益效果：

1.本发明构建的Gly m Bd 30K RNAi载体pCAscil-1301为大豆中首次报道，可导入大豆及其它过敏作物中，消除过敏蛋白质对过敏人群的危害，可进行植物品种改良。

2.国内外研究表明利用RNAi技术，能快速有效地关闭相应基因，使得生物体产生相应的功能缺表型，从而可确定对应基因的功能，且具有特异性、高效性和广泛性的优势。

3.RNAi比反义RNA技术更有效，能在低于反义核酸几个数量级的浓度下，使目标基因表达降到极低水平甚至完全“剔除”，从而产生缺失突变体表型，因此更容易产生功能丧失。

4.与T-DNA技术造成的功能永久性缺失相比，RNAi技术通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用，其抑制基因表达的时间可以随意控制。

四、附图说明

图1干扰载体的双酶切鉴定

1：pCAscil-1301质粒

2：pCAMBIA1301/BstE Ⅱ/Pml Ⅰ

3：pCAscil-1301/BstE Ⅱ/Pml Ⅰ

4：DNA Marker

图2 Gly m Bd 30K发卡结构示意图

图3 Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体质粒图谱

五、具体实施方式

构建策略：

1>内含子的选择—选用常用表达载体PCAMBIA1301中GUS基因的内含子序列，来做干扰载体的中间片段；

2>Gly m Bd 30K干扰片段的选择—利用BLAST数据库比对，取位于Gly m Bd 30K编码区内，与大豆基因组其它基因同源性较低的片段；

3>发卡结构插入位点的选择—将发卡结构引入PCAMBIA1301载体GUS基因的His-tag终止子TGA后。

4>发卡结构的模式为：反义片段+内含子+正义片段

Gly m Bd 30K RNAi载体pCAscil-1301的构建过程：

1.Gly m Bd 30K干扰片段的克隆：

选用‘南农32’(审定品种，审定编号：国审豆2008025，市场购买)作为材料，取幼嫩籽粒，按照TakaRa公司的Total RNA提取试剂盒说明书提取豆粒总RNA，取2μg总RNA合成cDNA，用RNase消化cDNA产物。设计引物扩增Gly m Bd 30K干扰片段：

Ps：CCTTGTGTTGCTTCTTTTCTCC，

Pa：GATGGTCACAAGAATATTGTTC，

Gly m Bd 30K干扰片段序列：

CCTTGTGTTGCTTCTTTTCTCCCTCTTAGGTCTCTCTTCTAGTTCCAGCATATCAACTC

ATCGTTCCATATTGGACCTTGACCTAACCAAGTTTACCACACAGAAACAGGTGTCTT

CACTGTTCCAACTATGGAAGAGTGAGCATGGACGTGTCTACCATAACCACGAAGAA

GAGGCAAAGAGACTTGAGATTTTCAAGAATAACTTGAACTATATCAGGGACATGAA

TGCAAACAGAAAATCACCCCATTCTCATCGTTTAGGATTGAACAAGTTTGCTGACAT

CACTCCTCAAGAGTTCAGCAAAAAGTACTTGCAAGCTCCCAAGGATGTGTCGCAGC

AAATCAAAATGGCCAACAAGAAAATGAAGAAGGAACAATATTCTTGTGACCATC

2.内含子片段的克隆：

设计引物扩增内含子片段：

Is：GTAAATTTCTAGTTTTTCTCCT，

Ia：CTGTAACTATCATCATCATCAT，

内含子序列：

TAAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCTTGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTT

TTGAGCTTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAA

TATTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATG

ATAGTTACAG

3.正义、反义基因及内含子三个片段的融合：

引物序列：

P1：acCACGTGGATGGTCACAAGAATATTGTTCCTTC

P2：ACTAGAAATTTACCCTTGTGTTG(P2各有A和I的一部分)

P3：GAAGCAACACAAGGCTGTAACTATCA(P3各有I和S的一部分)

P4：tatGGTGACCGATGGTCACAAGAATATTGTTC

(1)第一轮PCR：以Gly m Bd 30K干扰片段为模板，P1、P2为引物进行扩增：

PCR反应体系：5μL 5x Pfu Buffer，2.5μL dNTPs，1μL Gly m Bd 30K干扰片段作模板，引物P1、P2各1μL，0.25μL Pfu酶，最后灭菌水至25μL；PCR反应程序：二温法，94℃预变性3min，94℃复性30sec，68℃延伸45sec，共30个循环，最后68℃延伸10min。获得部分融合的A。

加A反应：5μL 10x A-Tailing Buffer，4μL dNTP Mixture，0.5μL A-Tailing Enzyme，4μgDNA最后补水至50μL。72℃反应20min，冰置1～2min。最后连入T载体测序。

(2)第二轮PCR：以A和I为模板，P1、P3为引物进行扩增：

PCR反应体系：5μL 5x Pfu Buffer，2.5μL dNTPs，A片段和I片段各1μL作模板，引物P1、P3各1μL，0.25μL Pfu酶，最后灭菌水至25μL；PCR反应程序：二温法，94℃预变性3min，94℃复性30sec，68℃延伸45sec，共30个循环，最后68℃延伸10min。获得部分融合的A-I。

加A反应：5μL 10x A-Tailing Buffer，4μL dNTP Mixture，0.5μL A-Tailing Enzyme，4μgDNA最后补水至50μL。72℃反应20min，冰置1～2min。最后连入T载体测序，得PMD-A-I。

(3)第三轮PCR：以融合片段A-I和Gly m Bd 30K干扰片段为模板，A-I的PCR反应液、P4为引物进行megaprimer PCR扩增：

PCR反应体系：2.5μL 10x E Buffer，2μL dNTPs，2μL MgCl₂，融合片段A-I和Glym Bd 30K干扰片段各1μL作模板，引物200ng megaprimer、P4 1μL，0.25μL Pfu酶，最后灭菌水至25μL；PCR反应程序：二温法，94℃预变性3min，94℃复性30sec，68℃延伸45sec，共30个循环，最后68℃延伸10min。获得发卡结构A-I-S。直接连入T载体，得PMD-A-I-S亚克隆测序。

4.RNAi植物载体的完成：

载体PMD-A-I-S和pCAMBIA1301双酶切Bst EII/PmI I，将A-I-S结构连入pCAMBIA1301形成干扰载体pCAScil-1301。

Bst EII/PmI I双酶切反应：5μL Buffer 1，0.5μL BSA，15μL质粒，1μL PmI I补水至50μL，37℃反应2h；酶切结束后，再加入1μL Bst E II，60℃反反应1h。转入TOP10后进行PCR和酶切验证，构建成功。

综上所述，本发明构建的Gly m Bd 30K RNAi载体pCAscil-1301为大豆中首次报道，可进行植物品质改良。国内外研究表明利用RNAi技术，能快速有效地关闭相应基因。

序列表

<110>南京农业大学

<120>大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30 K的RNAi植物表达载体

<130>说明书

<140>00

<141>2010-06-01

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>395

<212>DNA

<213>大豆[Glycine max(L.)Merr.]

<220>

<221>Gly m Bd 30 K干扰片段

<222>(1)..(395)

<223>

<400>1

ccttgtgttg cttcttttct ccctcttagg tctctcttct agttccagca tatcaactca 60

tcgttccata ttggaccttg acctaaccaa gtttaccaca cagaaacagg tgtcttcact 120

gttccaacta tggaagagtg agcatggacg tgtctaccat aaccacgaag aagaggcaaa 180

gagacttgag attttcaaga ataacttgaa ctatatcagg gacatgaatg caaacagaaa 240

atcaccccat tctcatcgtt taggattgaa caagtttgct gacatcactc ctcaagagtt 300

cagcaaaaag tacttgcaag ctcccaagga tgtgtcgcag caaatcaaaa tggccaacaa 360

gaaaatgaag aaggaacaat attcttgtga ccatc 395

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>Ps

<222>(1)..(22)

<223>

<400>2

ccttgtgttg cttcttttct cc 22

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>Pa

<222>(1)..(22)

<223>

<400>3

gatggtcaca agaatattgt tc 22

<210>4

<211>190

<212>DNA

<213>pCAMBIA1301

<220>

<221>内含子片段

<222>(1)..(190)

<223>

<400>4

gtaaatttcta gtttttctcc ttcattttct tggttaggac ccttttctct ttttattttt 60

ttgagctttg atctttcttt aaactgatct attttttaat tgattggtta tggtgtaaat 120

attacatagc tttaactgat aatctgatta ctttatttcg tgtgtctatg atgatgatga 180

tagttacag 190

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>Is

<222>(1)..(22)

<223>

<400>5

gtaaatttct agtttttctc ct 22

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>Ia

<222>(1)..(22)

<223>

<400>6

ctgtaactat catcatcatc at 22

<210>7

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P1

<222>(1)..(34)

<223>

<400>7

accacgtgga tggtcacaag aatattgttc cttc 34

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P2

<222>(1)..(23)

<223>

<400>8

actagaaatt tacccttgtg ttg 23

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P3

<222>(1)..(26)

<223>

<400>9

gaagcaacac aaggctgtaa ctatca 26

<210>10

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>P4

<222>(1)..(32)

<223>

<400>10

tatggtgacc gatggtcaca agaatattgt tc 32

Claims

1.大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体的构建。

1)Gly m Bd 30K干扰片段的克隆：

选用‘南农32’作为材料，取幼嫩籽粒，按照TakaRa公司的Total RNA提取试剂盒说明书提取豆粒总RNA，取2μg总RNA合成cDNA，用RNase消化cDNA产物，设计引物：

Ps：CCTTGTGTTGCTTCTTTTCTCC，

Pa：GATGGTCACAAGAATATTGTTC，

扩增Gly m Bd 30K干扰片段，Gly m Bd 30K干扰片段长395bp，进行常规聚合酶链式PCR反应，以提取的cDNA为模板，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，51.8℃复性30sec，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min，将PCR产物连接到pMD19-T载体上，转化TOP10细胞，进行序列测定后续实验中备用；

2)内含子片段的克隆：

设计引物：

Is：GTAAATTTCTAGTTTTTCTCCT，

Ia：CTGTAACTATCATCATCATCAT，

扩增内含子片段，内含子片段长190bp，进行常规PCR反应，pCAMBIA1301质粒为模板，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，45.3℃复性30sec，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min，将PCR产物连接到pMD19-T载体上，转化TOP10细胞，进行序列测定后续实验中备用；

3)Gly m Bd 30K干扰载体的构建：

通过融合PCR的方法将三个片段正义基因A、内含子I及反义基因S三个片段的融合连接起来，设计四条引物：

P1：acCACGTGGATGGTCACAAGAATATTGTTCCTTC

P2：ACTAGAAATTTACCCTTGTGTTG

P3：GAAGCAACACAAGGCTGTAACTATCA

P4：tatGGTGACCGATGGTCACAAGAATATTGTTC

两端引入酶切位点BstE II和PmI I，载体PMD-A-I-S和pCAMBIA1301双酶切Bst EII/PmI I，将A-I-S结构连入pCAMBIA1301形成干扰载体pCAScil-1301，Bst EII/PmI I双酶切反应：5μL Buffer 1，0.5μL BSA，15μL质粒，1μL PmI I补水至50μL，37℃反应2h；酶切结束后，再加入1μL Bst E II，60℃反反应1h；转入TOP10后进行PCR和酶切验证，构建成功大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体。

2.权利要求1所述过敏蛋白质基因Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体的应用。