CN109929850A

CN109929850A - 抗线虫棉花转化事件ghp10

Info

Publication number: CN109929850A
Application number: CN201711350788.9A
Authority: CN
Inventors: 杜雪琼; 王维鹏; 滕晓露; 杨晓凤; 陈凯; 李银龙; 周正剑; 邱龙; 马崇烈; 章旺根
Original assignee: Sub-Group Co ltd Of China Seed
Current assignee: Sub-Group Co ltd Of China Seed
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: CN109929850B

Abstract

本申请提供了抗线虫棉花转化事件GHP10，并提供了相关的创制方法、检测方法和应用，属于植物生物技术领域。具体地，本申请以棉花品种材料Coker312为受体经过转基因，得到在特定基因组序列之间插入外源基因插入物的棉花植株，其中外源基因插入物包含抗线虫基因。本申请所获得转化事件GHP10，所插入的外源基因位于棉花基因组的非功能位点，不影响植物自身其他基因的表达，在使转基因棉花植物获得抗虫特性的同时，保持了其良好的农艺性状。

Description

抗线虫棉花转化事件GHP10

技术领域

本申请涉及植物生物技术领域，具体涉及一种抗线虫棉花转化事件的创制方法、检测方法和应用。

背景技术

棉花作为一种特殊的经济作物，在种植过程中很容易受到外界因素的影响。除了温度、湿度、施肥等因素的影响外，棉花种植过程中容易受到病虫害的影响，如果不及时采取必要的病虫害预防措施，将会影响棉花的整体产量，同时给棉花种植带来不利影响。

棉花病害分为侵染性病害和非侵染性病害两大类。其中侵染性病害是由病原生物，例如真菌、细菌、线虫、病毒等引起的。虽然可以采用喷洒农药杀虫剂的方法来预防棉花虫害，但杀虫剂残留对于棉花产品的安全性存在一定的隐患，因而开发抗病虫的棉花品种是从根部上防治虫害爆发的根本。

转基因技术可以应用于棉花品种的开发，使棉花具备抗虫害体质，是目前流行的防治虫害的强有力手段。用于棉花的抗虫基因主要是针对鳞翅目害虫和同翅目昆虫，如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的内毒素蛋白基因、豇豆胰蛋白酶抑制基因(Cowpea Trypsin Inhibitor，CpTI)和植物凝集素基因(1ectin)。对于土壤中危害棉花的线虫，尚有待于开发有效的转基因抗性品种。

发明内容

一方面，本申请提供了核酸分子，其为：i)包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸和/或第4501-5156位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；ii)包含SEQ IDNO:1的第201-812位核苷酸和第3900-4571位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；iii)包含SEQ ID NO:1的第3900-4571位核苷酸和第4501-5156位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；或者iv)包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸，第3900-4571位核苷酸和第4501-5156位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

在一实施方案中，本申请提供的核酸分子包含SEQ ID NO:1所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

在另一实施方案中，本申请提供的核酸分子包含表达抗线虫基因的表达盒，如SEQID NO:1的第3043-4840位核苷酸所示序列。

在又一实施方案中，本申请提供的核酸分子，其通过将如SEQ ID NO:1的第3043-4840位核苷酸所示的表达抗线虫基因的表达盒导入棉花的基因组中获得。

在另一实施方案中，本申请提供的核酸分子，其存在于棉花植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分中。

另一方面，本申请提供了用于检测棉花转化事件的探针，其包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸或第4501-5156位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

又一方面，本申请提供了用于检测棉花转化事件的引物对，其能够特异性扩增产生包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸或第4501-5156位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

在一实施方案中，本申请提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸所示序列的引物对；ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第4501-5156位核苷酸所示序列的引物对；iii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3900-4571位核苷酸所示序列的反向引物；或者iv)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3900-4571位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第4501-5156位核苷酸所示序列的反向引物。

在另一实施方案中，本申请提供的引物对为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11所示的核苷酸序列或其互补序列；或者SEQ ID No:12和SEQ ID No:13所示的核苷酸序列或其互补序列。

此外，本申请还提供了用于检测棉花转化事件的试剂盒或微阵列，其包含上述的探针和/或上述的引物对。

还一方面，本申请提供了检测棉花转化事件的方法，其包括利用以下来检测待测样品中是否存在所述转化事件：上述的探针；上述的引物对；上述的探针和上述的引物对；或者上述的试剂盒或微阵列。

本申请还提供了对棉花进行育种的方法，所述方法包括以下步骤：1)获得包含上述的核酸分子的棉花；2)将步骤1)所获得的棉花通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到后代植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地，3)对步骤2)所获得的后代植物进行抗线虫鉴定，并利用上述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。

进一步地，本申请还提供了由上述的方法获得的棉花植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分等，以及由这些棉花植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分等制成的制品，包括工业原料等。

附图说明

图1是转化载体pZZ00068的结构示意图，其中的英文及各缩写含义列举如下：

PDI：优化的PDI基因序列

polyA：多聚腺苷酸序列

NOS Terminator：胭脂碱合成酶终止子

T-BORDER(right)：T-DNA右边界序列

Phpl：氢过氧化物裂解酶启动子

NPTII：新霉素磷酸转移酶基因

CaMV35S polyA：黄瓜花叶病毒35S多聚腺苷酸序列，终止子

T-BORDER(left)： T-DNA左边界序列

Bp：碱基对

kanamasin(R)：卡那霉素抗性序列

pBR322ori： pBR322起始区序列

pBR322born： pBR322骨架区序列

pVS1rep： pVS1复制子

pVS1sta： pVS1转录起始区

图2是棉花转化事件GHP10基因组DNA的Southern印迹检测结果图，其中：泳道1为转化事件GHP10；泳道2为阴性对照Coker312；泳道3为阳性质粒对照；泳道4为分子量标记。

图3是棉花转化事件GHP10的插入位点特异性PCR检测结果及DNA电泳照片，其中M为分子量标记；WT表示模板DNA来自野生型棉花植株；ddH₂O表示模板为水；L和R表示PCR模板DNA来自含转化事件GHP10的转基因植株，其中，R表示PCR引物在插入为点右侧结合；L表示PCR引物与插入为点左侧匹配。

图4是棉花转化事件GHP10以及野生型棉花抗线虫测试后根系生长情况对比图，测试组5个重复：1、2、3、4、5，种植于接有南方根结线虫的花盆；对照组：ck1、ck2，种植于未接线虫的花盆。根系为棉花生长30d后收取。

图5是转基因棉花和野生型棉花植株生长30天后的根系鲜重统计结果对比(单位：mg)。转基因植株5个重复种植于接有南方根结线虫的花盆；对照(ck1，ck2)种植于未接线虫的花盆。

图6是根结线虫对转基因和野生型棉花根系鲜重比值R(GE/WT)的影响分析。*：方差分析(P＜0.05)

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

本技术领域人员公知，外源基因在植物体内的表达具有位置效应，即受到插入染色体位置的影响，这种影响可能是由于染色体结构或整合位点附近的转录调节元件造成的。因此，通常需要生产数百个不同的转化事件，并从这些事件中筛选出外源基因表达水平及模式符合预期要求的优异转化事件，以达到商业化生产应用的目的。

优异的转化事件可通过常规育种方法即有性杂交的方式将外源基因转育到其它遗传背景的种质中，其后代保持了原始转化体的转基因表达特性。本申请涉及通过从诸多转化事件中筛选出的优异棉花转化事件GHP10。

在本申请中，“转化事件GHP10”是指以棉花品种材料YZ-1为受体经过转基因，得到在特定基因组序列之间插入外源基因插入物(T-DNA插入物)的棉花植株，其中外源基因插入物包含抗线虫基因。本申请所获得转化事件GHP10，所插入的外源基因位于棉花基因组的非功能位点，不影响植物自身其他基因的表达，在使转基因棉花植物获得抗虫特性的同时，保持了其良好的农艺性状。

在具体实例中，转基因后所得到的T-DNA插入物具有SEQ ID NO:1的第502-4862位核苷酸所示序列。转化事件GHP10可以指这一转基因过程，也可以指由这一过程所得到的基因组内的T-DNA插入物，或T-DNA插入物与侧翼序列的组合，或可以指由这一转基因过程得到的棉花植株。转化事件GHP10还可以指由上述植物进行无性繁殖、有性繁殖、减倍或加倍繁殖或以上的组合而得到的后代植物。

在其他实施方案中，该事件也适用于同样的外源基因(SEQ ID NO:1的第502-4862位核苷酸所示序列)转化其他植物受体品种，从而将T-DNA插入物插入到同样基因组位置而获得的植物。适用的植物包括双子叶植物，例如大豆、花生、向日葵等。

在本申请中，获得了以SEQ ID NO:1的第1-501位核苷酸为左侧侧翼序列和SEQ IDNO:1的第4863-5363位核苷酸为右侧侧翼序列的T-DNA插入物(SEQ ID NO:1的第502-4862位核苷酸)。侧翼序列并非仅限于SEQ ID NO:1的第1-501位核苷酸和第4863-5363位核苷酸，由于列出的侧翼序列仅是用于表示T-DNA插入物在基因组中的位置，即T-DNA插入物的插入位点位于棉花第2号染色体的8049411处，因此本申请的侧翼序列可以根据基因组序列而向两侧延伸。

由于转化事件GHP10产生向基因组中特定位点插入的T-DNA插入物，因此其插入位点是特异性的，可以用于检测生物样品中是否包含转化事件GHP10。在具体实施方案中，包含转化事件GHP10的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的任何序列，均可用于检测本申请的转化事件GHP10，包括但不限于包含上游插入位点(左侧翼序列与T-DNA插入物的接合位点)或下游插入位点(右侧翼序列与T-DNA插入物的接合位点)的以下序列或其片段或其变体或其互补序列中的一种或多种：i)包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸所示序列；ii)包含SEQ ID NO:1的第1-812位核苷酸所示序列；iii)包含SEQ ID NO:1的第3900-4517位核苷酸所示序列；iv)包含SEQ ID NO:1的第502-4862位核苷酸所示序列；v)包含SEQ ID NO:1的第4501-5156位核苷酸所示序列；vi)包含SEQ ID NO:1的第4501-5363位核苷酸所示序列；vii)包含SEQ ID NO:1的第201-5156位核苷酸所示序列；viii)包含SEQ ID NO:1所示的序列。

在具体实例中，可用于检测本申请的转化事件GHP10的序列为包含上游插入位点的序列或其片段或其变体或其互补序列，如包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸所示序列或包含SEQ ID NO:1的第1-812位核苷酸所示序列，或者为包含下游插入位点的序列，例如，包含SEQ ID NO:1的第4501-5156位核苷酸所示序列或包含SEQ ID NO:1的第4501-5363位核苷酸所示序列，或者为包含上游插入位点的序列与包含下游插入位点的序列的组合。

在另一实例中，可用于检测本申请的转化事件GHP10的序列为包含上游插入位点的序列或其片段或其变体或其互补序列与包含T-DNA插入物的序列或其片段或其变体或其互补序列的组合，例如，包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸所示序列或包含SEQ IDNO:1的第1-812位核苷酸所示序列，与包含SEQ ID NO:1的第3900-4517位核苷酸所示序列或包含SEQ ID NO:1的第502-4862位核苷酸所示序列的组合。

在另一实例中，可用于检测本申请的转化事件GHP10的序列为包含下游插入位点的序列或其片段或其变体或其互补序列与包含T-DNA插入物的序列或其片段或其变体或其互补序列的组合，例如，包含SEQ ID NO:1的第4501-5156位核苷酸所示序列或包含SEQ IDNO:1的第4501-5363位核苷酸所示序列，与包含SEQ ID NO:1的第3900-4517位核苷酸所示序列或包含SEQ ID NO:1的第502-4862位核苷酸所示序列的组合。

在另一实例中，可用于检测本申请的转化事件GHP10的序列为包含SEQ ID NO:1的第201-5156位核苷酸所示序列或其片段或其变体或其互补序列，或者为包含SEQ ID NO:1所示的序列或其片段或其变体或其互补序列。

因此，能够特异性检测转化事件GHP10的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的引物对、探针、以及引物对和探针的组合均可用于检测本申请的转化事件GHP10。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向从左向右书写。

在一些实施方案中，本申请还涉及核酸序列的片段，其是指完整部分中的不完整的更小片段的部分。例如，SEQ ID NO：1的片段包括SEQ ID NO：1的完整序列的至少约10个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、或至少约50个核苷酸的序列或更多。

在一些实施方案中，可以对本申请的核酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。在某些实施方案中，可以依照双子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用双子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请还涉及核酸序列的变体。一般来讲，特定核酸片段的变体将与该特定核苷酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互补序列。这样的变体序列包括一个或多个核酸残基的添加、缺失或替换，从而可以导致相应的氨基酸残基的添加、移除或替换。通过本领域内已知的序列比对程序包括杂交技术确定序列同一性。实施方案的核苷酸序列变体与本申请的序列的差异可以少至1-15个核苷酸、少至1-10个(例如6-10个)，少至5个，少至4、3、2或甚至1个核苷酸。

如本文所用，“探针”是附加了常规可检测的标记或报告分子例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶的分离的多核苷酸，其与靶多核苷酸的链是互补的。

在具体实施方案中，本申请所提供的用于检测转化事件GHP10的DNA探针，包括包含SEQ ID NO：1的足够长度的连续核苷酸的序列或其完全互补序列，该DNA探针在严格杂交条件下与包含上游插入位点或下游插入位点的核苷酸序列杂交并且在严格杂交条件下不与不含上游插入位点或下游插入位点的核苷酸序列杂交。

在具体实例中，本申请所提供的探针包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸或第4501-5156位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

如本文所用，“引物”是分离的多核苷酸，其通过核酸杂交形成引物和靶DNA链之间的杂交体而与互补靶DNA链退火，然后凭借例如DNA聚合酶沿着靶DNA链伸展。引物对涉及其靶多核苷酸扩增用途，例如通过聚合酶链反应(PCR)或其他常规核酸扩增方法。

在具体实施方案中，本申请所提供的用于检测转化事件GHP10的引物对包括第一DNA分子以及不同于第一DNA分子的第二DNA分子，其中所述第一DNA分子和第二DNA分子各自包含SEQ ID NO：1的足够长度的连续核苷酸的核苷酸序列或其完全互补序列，且其中所述第一DNA分子存在于SEQ ID NO：1的T-DNA插入物中和所述第二DNA分子存在于SEQ IDNO：1的侧翼序列中，当与来自转化事件GHP10的DNA在扩增反应中共同使用时，该DNA引物产生用于检测样品中转化事件GHP10DNA的扩增子，且其中所述扩增子包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸或第4501-5156位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

在具体实施方案中，本申请所提供的引物对为特异性识别包含SEQ ID NO:1的第201-812位或第1-812位核苷酸所示序列的引物对。

在具体实施方案中，本申请所提供的引物对为特异性识别包含SEQ ID NO:1的第4501-5156位或第4501-5363位核苷酸所示序列的引物对。

在具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第201-812位或第1-812位核苷酸所示序列的引物对；和ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第4501-5156位或第4501-5363位核苷酸所示序列的引物对；或者，所述引物对包含：特异性识别包含SEQ ID NO:1的第201-812位或第1-812位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第4501-5156位或第4501-5363位核苷酸所示序列的反向引物。

在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ IDNO:1的第201-812位或第1-812位核苷酸所示序列的引物对；和ii)特异性识别包含SEQ IDNO:1的第3900-4517位或第502-4862位核苷酸所示序列的引物对；或者，所述引物对包含：特异性识别包含SEQ ID NO:1的第201-812位或第1-812位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3900-4517位或第502-4862位核苷酸所示序列的反向引物。

在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ IDNO:1的第3900-4517位或第502-4862位核苷酸所示序列的引物对；和ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第4501-5156位或第4501-5363位核苷酸所示序列的引物对；或者，所述引物对包含：特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3900-4517位或第502-4862位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第4501-5156位或第4501-5363位核苷酸所示序列的反向引物。

在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为：i)特异性识别包含SEQ IDNO:1的第201-812位或第1-812位核苷酸所示序列的引物对，ii)特异性识别包含SEQ IDNO:1的第3900-4517位或第502-4862位核苷酸所示序列的引物对，和iii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第4501-5156位或第4501-5363位核苷酸所示序列的引物对。

在另一具体实施方案中，本申请所提供的引物对为特异性识别包含SEQ ID NO:1所示序列的引物对。

在具体实例中，所述引物对为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11所示的核苷酸序列或其互补序列；或者SEQ ID No:12和SEQ ID No:13所示的核苷酸序列或其互补序列。

设计和使用引物和探针的方法是本领域熟知的，例如在Joseph Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press(2001)和Current Protocols in Molecular Biology，Wiley-Blackwell中描述。

如本文所用，“试剂盒”或“微阵列”是指用于生物样品中棉花转化事件GHP10的鉴定和/或检测目的的试剂组或芯片。为质量控制(例如种子批次的纯度)、植物材料中或包含植物材料或来源于植物材料的材料例如但不限于食品或饲料产品中事件GHP10的检测的目的，可以使用试剂盒或芯片，并且其组分可以具体地调整。

在具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒或探针包括本申请所提供的任一种探针或任一种引物对。在另一具体实施方案中，本申请所提供的试剂盒或探针包括本申请所提供的任一种探针或任一种引物对的组合。

此外，本申请还提供了转基因棉花植物、后代、种子、植物细胞或植物部分及其制品，包括但不限于工业原料。这些植物、后代、种子、植物细胞、植物部分及其制品中均包含可检测的本申请所提供的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的核酸分子序列。

进一步地，本申请还提供了对棉花进行育种的方法，包括以下步骤：1)获得包含本申请所提供的T-DNA插入物与侧翼序列的接合位点的核酸分子序列的棉花；2)将步骤1)所获得的棉花通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到后代植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地步骤3)，对步骤2)所获得的棉花植物进行抗线虫鉴定，并利用本申请所提供的探针、引物对、试剂盒或阵列来检测其中是否存在转化事件GHP10。

此外，本申请提供了在田间控制或杀死线虫的方法。

在具体实施方案中，本申请所提供的控制或杀死线虫的方法，包括向所述线虫喂食有效量的转化事件GHP10的棉花植物。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。

若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例所涉及的棉花品种材料为商业化品种Coker312，经中国种子集团自行繁种，应用于棉花遗传转化。

实施例

实施例1棉花转化事件GHP10的获得及分子检测

1、基因克隆

从马铃薯(Symphytum tuberosum)中克隆得到丝氨酸蛋白酶抑制剂(serineproteinase inhibitor)基因(LOC102604256)。对基因编码序列进行分析发现，该序列GC含量约为39％，没有明显的密码子偏好性，可直接用于棉花的遗传转化。将该DNA序列稍微调整并命名为PDI，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:1第3900-4571位核苷酸所示。

2、载体构建

PCR扩增PDI基因，上游引物为5’端带有XbaI位点，下游引物为3’端带有SacI位点，同时在ATG上游添加Kozak序列。

使用限制性内切酶XbaI和SacI分别处理PDI片段和表达载体pBI121(Genbank登录号:AF485783)。将处理过的PDI片段插入表达载体pBI121的XbaI和SacI位点之间，与载体上原有的CaMV 35s启动子和NOS终止子组成表达盒PCaMV35s-PDI-Tnos其序列如SEQ ID NO:1第3043-4840位核苷酸所示。

使用限制性内切酶HindIII和EcoRII切下pBI121上的PCaMV35s-PDI-Tnos表达盒并插入pBluescript(Stratagene,La Jolla,CA,USA)质粒的多克隆位点，该质粒命名为pZZ01303。

在pCambia3300基础上构建骨架载体，其带有Phpl-NPTII-T35spolyA元件，以及HindIII和PmeI单酶切位点。

以pORE_O2(Genbank登录号：AY562540)质粒为模板，PCR扩增氢过氧化物裂解酶启动子hpl(At4g15440promoter)，上游引物为5’端带有HindIII位点()，下游引物3’端带有FseI位点()，HindIII+FseI处理hpl片段和pCambia3300载体。将hpl启动子连入处理过的pCambia3300载体切口处，得到含Phpl-NPTII-T35spolyA元件的载体。

EcoRI单酶切pZZ01303，T4-DNA聚合酶补平酶切产生的粘末端，纯化回收；接着用HindIII处理回收的线性质粒片段，获得PCaMV35s-PDI-Tnos片段。

HindIII+PmeI处理带有Phpl-NPTII-T35spolyA元件的质粒，切口处连入处理后的PCaMV35s-PDI-Tnos片段，获得含有Phpl-NPTII-T35spolyA和PCaMV35s-PDI-Tnos两个表达元件的转化载体，命名为pZZ00068，该载体为本发明首次成功构建的，其结构示意图如图1所示。

3、遗传转化

将转化载体pZZ00068通过电击法转入农杆菌EHA105中，并利用农杆菌介导棉花遗传转化，具体操作如下。

1)无菌苗的种植：

棉花种子去壳后用75％的酒精灭菌30秒，然后用20％的漂白水溶液表面灭菌30分钟，然后用无菌水漂洗4-5次播种于菌苗培养基(1/2MS+1.5％葡萄糖+0.3％phytagel，PH值调至5.9)中，在28℃培养7天(或光照或黑暗或黑暗与光照交替)。

2)农杆菌的准备：

将转化需要用的载体菌株先用LB板(LB培养基：10g/L NaCl+10g/L胰化蛋白胨+5g/L酵母)划单克隆板，然后挑取单克隆在对应的LB平板上扩繁用于下步的转化。

3)农杆菌菌液的活化：

将扩繁的载体菌株用含有100μm AS的MGL液体培养基(5g胰化蛋白胨+5gNaCl+0.1MgSO₄.7H₂O+0.25gKH₂PO₄+5g甘露醇+1.16g甘氨酸钠，PH值调至5.9)活化，OD₆₀₀＝0.3，活化好的菌液将用于下胚轴的侵染。

4)农杆菌菌液的侵染：

将去掉叶子和根部的棉花下胚轴切成0.5cm的小段，用活化好的农杆菌菌液浸染15分钟，吸干菌液后放入共培养基(共培养基：MS+B5+3％葡萄糖+0.3％phytagel胶+1mg/lIBA+0.5mg/l kinetin+1g/LMgCl₂，PH值调至5.9)中于21℃暗培养2-3天。

5)胚性愈伤的诱导及筛选：

将共培养后的下胚轴转移到加有卡那霉素的筛选培养基(MS+B5+3％葡萄糖+0.3％phytagel胶+1mg/l IBA+0.5mg/l kinetin+1g/LMgCl₂+(75/50mg/L)卡那霉素+400mg/LCef，PH值调至5.9)中诱导胚性愈伤，于28℃光照培养筛选4-6个月，每2-4周更换培养基一次。

6)分化与生根

当出现胚性愈伤之后，将其转移到分化培养基(MS(无NH₄NO₃，KNO₃加倍)+B5+3％葡萄糖+0.3％phytagel胶+0.5mg/l IBA+0.15mg/l kinetin+2.0g/l glutamine+1.0g/lasparagines，PH值调至5.9)中诱导胚性愈伤成苗，将成苗的植株转移到生根培养基(1/2MS+B5+1.5％葡萄糖+0.3％phytagel胶，PH值调至5.9)中，光照培养进行生根。

7)移栽

当生根培养基中的转基因植株生长到一定大小后移栽至小盆中生长，同时取样用于分子检测。

4、分子鉴定

T0代转化苗的分子检测包括阳性、拷贝数和骨架检测。

采用天根生化科技(北京)有限公司DNAsecure Plant Kit(Cat.#DP320)对棉花基因组DNA进行抽提。实时PCR反应的各引物序列如下：

PCR反应在ABI 7900上进行，反应程序如下：95℃预变性10min；95℃变性10s；60℃复性与延伸55s，30个循环。

实时PCR反应完成后，根据仪器生成的内参基因和目标基因的平均Ct(扩增循环数)值，根据公式RQ＝2^-ΔCt，计算对应样本的RQ值。

因为内参基因SAD1为棉花单拷贝基因，所以可以推断，理论上当转化事件的RQ值为0.5左右时，该事件为单拷贝杂合；当RQ值接近1.0时，该事件为双拷贝纯合。因此我们可以根据RQ值，来推断出目的基因的拷贝数。对高世代的转化事件进行基因分型的方法同上。

因为无骨架样品在整个扩增区间中无扩增曲线，即Ct值为35cycles，所以可以根据骨架元件ori的平均Ct值，来筛选无骨架插入的转基因样品。

分子检测结果显示，在127个转化事件中，有8个转入了含有PDI基因的外源片段。其中，转化事件GHP10的T₀代转化苗外源基因PDI的RQ值为0.29，而野生型对照样品的RQ值为0，骨架元件Ori扩增的Ct值为35，因此该转化苗为阳性，低拷贝，无骨架的优质转化事件。

5、Southern印迹检测

Southern杂交探针标记及杂交与显影采用Roche公司的DIG High Primer DNALabeling and Detection Starter Kit I。具体实验方法如下：

步骤1.CTAB法抽提转化植株总基因组DNA。

取叶片0.5-1g，放入预冷的研钵中，加入液氮快速将叶片研磨成粉末，倒入2mL离心管中。加入700uL预热至65℃的1.5％CTAB提取液并摇匀，65℃水浴保温30-60min，期间摇动几次；室温冷却后，加入700uL氯仿，摇匀后，颠倒轻摇10min，室温下8000rpm离心10min；移上清至另一离心管，加入等体积的沉淀液(异丙醇)，-20℃下沉淀30分钟，室温下8000rpm离心10min；用700μL 75％乙醇漂洗2-3次，风干后溶于50μL TE中-20℃保存备用。

步骤2.基因组DNA的酶切。

选用限制性内切酶Hind III酶切总基因组DNA，酶切反应体系如下表，混匀后37℃酶切24h左右，酶切后先取少量进行预电泳检测酶切效果，然后用酶切好的总DNA在1％的琼脂糖凝胶中进行低电压(30-40V)电泳过夜，使DNA充分分开。

步骤3.转膜。

将凝胶修整后切去右下角作为标记，浸泡在0.25mol/L HCl至溴酚蓝变黄，蒸馏水洗两次；碱变性液[1.5M NaCl，0.5M NaOH]中变性45min，去离子水漂洗；中和液[1M Tris-HCl(PH7.4)，1.5M NaCl]中漂洗30min，更换中和液漂洗15min；置于搭好的转膜台上，用10×SSC溶液作为转膜液，Hybond-N+尼龙膜漂洗于去离子水液面，直至完全湿润，浸入转移缓冲液中；用10×SSC溶液进行毛细管法转移16-20h，将胶上的DNA转移到尼龙膜上。转移结束后，将尼龙膜用2×SSC溶液简单漂洗后，紫外交联仪上交联1min后，室温晾干，用保鲜膜将膜包好，4℃下保存备用。

步骤4.探针扩增与标记。

探针扩增：以PDI基因设计探针，引物序列如SEQ ID No:8(csp-586,GTTATGTTTGTGTTTGCTTCCC)和SEQ ID No:9(csp-587,GGGAGTAATAGGGCAATACAAT)，所示，探针长度为514bp，探针序列如SEQ ID No:1第3917-4430为核苷酸所示。

探针标记：取1μg或者(10ng-3μg)回收的探针DNA，加灭菌ddH2O至16μl；PCR仪95℃，10分钟，迅速放冰上；加入4μl DIG-High Prime短暂离心；37℃PCR仪或水浴1h或者过夜；65℃，10分钟或者加入2μl 0.2mol/L EDTA(PH 8.0)以终止反应。

步骤5.杂交。

加热杂交液DIG Easy Hyb(10ml/100cm2)，在杂交炉中42℃下预杂交30分钟；95℃下变性探针(25ng/ml)，5分钟后置于冰上；将变性探针加入到预先加热的DIG Easy Hyb中(3.5ml/100cm²)，混匀；倒掉预杂交液，加入含有变性探针的杂交液；杂交炉中42℃下杂交14小时。

步骤6.洗膜与显色。

倒掉杂交液，然后用2×SSC，0.1％SDS室温下洗涤两次，每次5分钟；最后用0.5×SSC，0.1％SDS，65℃下洗涤两次，每次15分钟。显色方法同探针效率检测操作。

Southern杂交结果显示，杂交条带为单一条带，如图2所示。理论上，Hind III酶切杂交获得的条带应该大于2.5Kb，实际获得的杂交条带大小约为4Kb左右，符合预期，因此可以确认该转化事件为单位点单拷贝插入。由此，获得棉花转化事件GHP10。

实施例2棉花转化事件GHP10的繁育及田间表现

1、转化事件田间繁育

如实施例1所述，本实施例转化事件的受体材料为棉花品系Coker312，在获得T₀代的转化事件(单拷贝插入且无载体骨架污染)后，以该转化事件为母本，连续自交3个世代获得纯合的转基因株系种子。期间，根据T₀代qRT-PCR结果，选择RQ值接近0.5且无骨架(Ct值≥35)的株系。将种子发芽，得到T₁代植株，取样提取T₁代植株基因组DNA，进行qRT-PCR检测并选取T₁代植株中RQ值接近1的株系，继续自交，直到性状不再分离；之后，将纯合种子种植，在苗期鉴定对棉花线虫的抗性，选取抗虫性好的株系继续繁种。

将棉花转化事件GHP10在温室大棚中连续繁育3代，针对每一世代都通过RT-PCT检测来确定棉花植株外源基因PDI、棉花内参基因SAD1以及载体骨架片段存在与否，同时计算外源插入基因与棉花内参基因SAD1的RQ值，从而确定外源插入基因阳性且无骨架残留的转基因株系，并选择RQ值接近1的纯合株系。考察结果显示，转化事件GHP10连续3个世代的外源插入基因PCR结果均呈阳性，骨架片段PCR结果均呈阴性，且从T₁代开始RQ值分别为0.67、0.68、0.72，比较稳定且均介于0.5和1之间。

可见，棉花转化事件GHP10为单拷贝且遗传稳定的优质事件。

2、转化事件田间表现

步骤1.分离比考察。以棉花SAD1基因为内参，qRT-PCR检测外源基因PDI。根据仪器生成的内参基因和目标基因的平均Ct(扩增循环数)值，根据公式RQ＝2^-ΔCt，计算对应样本的RQ值。根据RQ值，可以计算出目的基因的相对拷贝数。

步骤2.棉花线虫抗性鉴定。

1)测试材料：珂字棉312，棉花转化事件GHP10纯合株系。

2)南方根结线虫培养：将两周大番茄移栽到大花盆中，继续培养2周，接种南方根结线虫二龄幼虫600条/株；接种后，在温室中继续培养一个月，温度为27±2℃，光照条件为L:D＝16:8，湿度约为50％-60％。

3)棉花培养及测试。将棉花置于穴盘中萌发；待长出2-4片真叶后，取长势一致的转基因苗和野生型幼苗各一株，同时种植于一个花盆中。对照花盆中未接任何线虫；测试花盆中接种600条南方根结线虫二龄幼虫。每隔10-15天观察棉花长势；一个月后回收棉花根系。测量根系鲜重，计算每盆中转基因植株(GE)根系鲜重和野生型(WT)植株根系鲜重比值R。

棉花线虫活体接虫试验显示，棉花转化事件GHP10的对南方根结线虫的抗性比野生型对照更高。实验中将转基因和野生型棉花种植于同一花盆中：当没有线虫影响时，二者长势基本一致；当花盆中接种线虫后，转基因棉花和野生型棉花的生长都受到一定影响，但转基因棉花的长势要明显优于野生型棉花(见图4和图5)。

统计结果表明，接种线虫后转基因棉花根系和野生型棉花根系比值(R1＝5.77)要明显大于未接线虫时的值(R2＝1.10),说明转基因棉花根系对南方根结线虫的抗性要优于野生型植株(图6)。

实施例3棉花转化事件GHP10的左(5’)和右(3’)侧翼序列的分离

一般而言，检测转基因植物的DNA引物序列和方法简单并且一致，这些检测方法通常集中在频繁使用的基因表达元件，如启动子、终止子和标记基因，因为对于许多转化载体而言，编码序列区是可互换的。因此，这些方法并不能用于区分仅编码序列不同的构建体，也不能用于区分不同的转化事件，特别是那些使用相同的转化载体产生的事件，除非与插入的异源DNA相邻的染色体DNA即“侧翼DNA”的序列已知。为此，本实施例通过“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology)对棉花转化事件GHP10进行了全基因组重测序，进而精确定位到外源插入序列及其侧翼序列。

测序委托苏州金唯智公司完成，测序深度为30X。参考基因组来源为：NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝cotton)。将测序数据与参考基因组比对后，获得了棉花转化事件GHP10的5’和3’侧翼序列以及部分转化载体序列，共计5363bp，如SEQ ID NO:1所示。其中，1-501bp为5’侧翼序列(序列长501bp)；4863-5363bp为3’侧翼序列(序列长501bp)；中间第502-4862bp序列为外源插入T-DNA序列，长3505bp；与表达载体pZZ00068中T-DNA(SEQ ID NO:20)相比，插入的T-DNA序列左右两侧碱基分别缺失了55bp和44bp。

NCBI数据库分析显示，该插入位点位于棉花第2号染色体的8049411处(chr2:8049411-8049488；evalue＝3e-22)。进一步分析显示，插入位点位于功能基因LOC107887563(chr9:90501682-90504407)下游5440bp处和功能基因LOC107904519(chr9:90490829-90492429)上游19755bp处，推断对棉花功能基因无影响。

实施例4棉花转化事件GHP10侧翼序列的应用

利用棉花转化事的侧翼基因组序列和外源片段中的NPTII和PDI序列设计3-5对引物，建立该转化事件及其衍生产品的定性PCR鉴定方法。

依据转化事件GHP10外源片段整合位点5’端棉花基因组设计的引物为5’-GTAGGACCCACACCTTTAGAGTT-3’(SEQ ID No:10，CSP-6390)，依据NPTII序列设计的引物为5’-TCGTGCTTTACGGTATCGCC-3’(SEQ ID No:11，CSP-6391)。棉花基因组DNA采用CATB法提取。PCR反应程序为94℃5min，(94℃30s，55℃30s，72℃1min)35个循环，72℃，7min。

依据转化事件GHP10外源片段整合位点3’端棉花基因组设计的引物为5’-GGATCCACCTTTGGAGGAGTA-3’(SEQ ID No:12，csp-6393)，依据PDI基因序列设计的引物为5’-AAAGGCGTTTGGCTCTTGTC-3’(SEQ ID No:13，csp-6392)。棉花基因组DNA采用CATB法提取。PCR反应程序为95℃5min，(94℃30s，60℃30s，72℃1min)35个循环，72℃，7min。

采用CTAB法提取转化事件GHP10的DNA样品，以水、非转基因植株DNA样品作为阴性对照，使用上述引物进行扩增。结果显示，阴性对照均无扩增条带，转化事件GHP10的DNA样品均有特异性目标片段扩增(如图3所示)。转化事件GHP10的DNA扩增序列分别有612bp和656bp的特异性目的条带。

本实施例表明，利用转化事件GHP10的5’和/或3’侧翼序列进行PCR检测，可以特异性地检测该转化事件的亲本、杂种F₁和后代及其制品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国种子集团有限公司

<120> 抗线虫棉花转化事件GHP10

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5363

<212> DNA

<213> 棉花(Gossypium spp)

<220>

<221> gene

<222> (502)..(4862)

<223> T-DNA插入物

<400> 1

gattgaattt ccgctttcca attataaatt cagttatatt tgaatcacta ttttccttat 60

aggttaaacg gtgctagctt ctttttttgt ggcccaactg gagactttca gctggattgt 120

tgagcccatc agcctttaaa ttagttttaa aagtatctat agtactatac caattaattt 180

cagccttttc catctctgtt gtaggaccca cacctttaga gtttgttttt agattatctg 240

ctggattgca ccagtttttg tttgactctt caaccccttt cctagccgaa acttgaagca 300

aaatattcac ctcattactt tcagattttt cctacttttc ctccactacc tgtctaacag 360

agctcttttt caaaacaaac tccttctcgg ttggagaagg caagttcgac tttttcggta 420

ggagagcatc atcatttatc accacctcct cccctgtata caaacattgc ttcattgatt 480

ttttccttat tgatccaaat attgcggacg tttttaatgt actgaattaa cgccgaatta 540

attgggggat ctggatttta gtactggatt ttggttttag gaattagaaa ttttattgat 600

agaagtattt tacaaataca aatacatact aagggtttct tatatgctca acacatgagc 660

gaaaccctat aggaacccta attcccttat ctgggaacta ctcacacatt attatggaga 720

aactcgaaat tcgagctctc agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg 780

cgaatcggga gcggcgatac cgtaaagcac gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag 840

ctcttcagca atatcacggg tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag 900

ccggccacag tcgatgaatc cagaaaagcg gccattttcc accatgatat tcggcaagca 960

ggcatcgcca tgagtcacga cgagatcctc gccgtcgggc atgcgcgcct tgagcctggc 1020

gaacagttcg gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag 1080

accggcttcc atccgagtac gtgctcgctc gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg 1140

gcaggtagcc ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga tggatacttt 1200

ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag 1260

ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt 1320

ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc ttgaagttca ttcagggcac cggacaggtc 1380

ggtcttgaca aaaagaaccg gcctcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga 1440

gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg 1500

agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat catggccggc ccttttgagc ttagaggttt 1560

ttcttgtttt tggaaattat ctcttcgcct tctatttcta tgcggttata gatatatctt 1620

ggtaaggtat aaataaataa ataaagagaa cattaattat acatgcagta tttgtagact 1680

tttcgtaaac aattaatttt attttatttt ttatgtactt atattgttaa gtattatcat 1740

atgagtgaag ttcatcgcta aacgaaacat catttatata tatacttata tttttatgaa 1800

tcctggttta attgatcgaa atatgttttt tacaatttcc tcctttttta tacatctctt 1860

ccatctaagt attctgtaaa aagacttaat tatggtataa aatgtaacat ttgatttaaa 1920

aaatgtaaat aaatcgtttt gaggaaggag aggcattgtc gtcaaccaaa atcactgtgt 1980

gtggttttag aaccgtggtt aggttttttg gggctataga cgaggtaaaa agtttgtagc 2040

attttatgtc agatttaaag aataaagatt ggtagctaca caataaataa cataatactc 2100

gaccactaca tgatattttt ttttcttaac tcatttgttt tgttttcttt gaaacaccac 2160

ctttattaag acttttcaga ttctccaaag aatctacatg gacagttgtg acttcaatgg 2220

ttggattcca gcatgtctat gttactcaat aatggccttt atcttggact caaaagacac 2280

acgagggtta gacagaccgt atagggatat tcgaagttcg cgaatctgta aaacatgaag 2340

actgttaaag aaaaggtgtt ctccatcaca catcgcctac ttagagctta tatcacttag 2400

cagattttat ttcccgtctt tctaattcag accatatagt caaagctcta aatagcattc 2460

tccagagaaa aaatatactt ttggggtcgt gtgtaatttc catattccat ttttaagatg 2520

aggatctctc tcgtggagcg gtagctaaac aaatttaaat aaaactgatc aatatgggta 2580

gattatagat aaaataacct tttaaataac aatgatcaaa aattaaccag aattttttta 2640

gttctcattt tatccattgt ccaatgctcc cgatactcat gtcactatat caaagataaa 2700

agttgggaca cccaatttaa tttttttgtg aaaggaagtt gggaccccaa tagatgtggc 2760

caatgccgcc atatccttat tttcccgact gatgtcagag caaccacata tttgatgttg 2820

tagcgttact atgaagacct tttttctttt gtttgataga aagatcacga tagatggatc 2880

tttcttaaaa ttgtttgtga cgggaataga aaaaagtgag aaacacgtgt ttttttaaat 2940

gtgtgacaaa gtaaccaccg cttccgtcca aaagaaaata aaggaaaagc caagtaacca 3000

ctgccaagta tccacgttaa gcttgcatgc ctgcaggtcc ccagattagc cttttcaatt 3060

tcagaaagaa tgctaaccca cagatggtta gagaggctta cgcagcaggt ctcatcaaga 3120

cgatctaccc gagcaataat ctccaggaaa tcaaatacct tcccaagaag gttaaagatg 3180

cagtcaaaag attcaggact aactgcatca agaacacaga gaaagatata tttctcaaga 3240

tcagaagtac tattccagta tggacgattc aaggcttgct tcacaaacca aggcaagtaa 3300

tagagattgg agtctctaaa aaggtagttc ccactgaatc aaaggccatg gagtcaaaga 3360

ttcaaataga ggacctaaca gaactcgccg taaagactgg cgaacagttc atacagagtc 3420

tcttacgact caatgacaag aagaaaatct tcgtcaacat ggtggagcac gacacacttg 3480

tctactccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggcaatt gagacttttc 3540

aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta 3600

ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa 3660

aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga 3720

ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg 3780

atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct 3840

ctatataagg aagttcattt catttggaga gaacacgggg gactctagaa ttatacaaaa 3900

tgaagtgttt atttttgtta tgtttgtgtt tgcttcccat tgtggtgttt tcatcaactt 3960

tcacttccca aaatctcatt gacctaccca gtgaatctcc tctacctaag ccggtacttg 4020

acacaaatgg taaagaactc aatcctaatt cgagttatcg gattatttcc attggtaggg 4080

gtgcgttagg tggtgatgta tacctaggaa agtccccaaa ttcagatgcc ccttgtccag 4140

atggcgtatt ccgttacaat tccgatgttg gacctagcgg tacacccgtt agattcattc 4200

ctttatctgg aggtatattt gaagatcaac tactcaacat acaattcaat attgcaacag 4260

tgaagttgtg tgttagttat acaatttgga aagtcggaaa tctaaatgca tattttagga 4320

cgatgttgtt ggagacggga ggaaccatag ggcaagcaga tagcagctat ttcaagattg 4380

ttaaattatc aaattttggt tacaacttat tgtattgccc tattactccc ccttttcttt 4440

gtccattttg tcgtgatgat aacttctgtg caaaggtggg tgtagttatt caaaatggaa 4500

aaaggcgttt ggctcttgtc aacgaaaatc ctcttgatgt cttattccag gaagttaagg 4560

atgaattgta ggagctcgaa tttccccgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta 4620

agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt 4680

aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt 4740

agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag 4800

gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc gggaattaaa ctatcagtgt 4860

ttccgaacaa attgacatcg ggaattaagc gctaacgagt aaggatgctc atcgtctgct 4920

ttagtaggat cttcacattg tatttccgaa cactccttga ccccatggcc tattcttcca 4980

cagccaaaac agaaagttgg gaggttctcg tatttaaaag gtagccataa tttccctttt 5040

ccacttggag aaacaaaaac ttcccttctt agttgttttt caatatctaa gttaactctg 5100

atacgacaaa attccccttt tatctcagat ctgattactc ctccaaaggt ggatccaacc 5160

gcgtgcatca agtccttctt atcatattca ggtggccacg gacaaacctt tatctagaac 5220

ggagaggata ccagttggat cttatttcgc tcaatgggtt tcgatagcct atcaaagatg 5280

attaattgtt ttcgaaagag ccatggtcgt ccttccaata cctgttctaa gtcttcttta 5340

tcttcgaacg agatcgtgaa cag 5363

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgatgagaaa tgaggagcca agg 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgaagccca atacacaacc c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgaagccca atacacaacc c 21

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaattgtaa cggaatacgc catc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aacaagacga actccaattc actg 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgttgattgt aacgatgaca gagc 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gttatgtttg tgtttgcttc cc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gggagtaata gggcaataca at 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtaggaccca cacctttaga gtt 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcgtgcttta cggtatcgcc 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggatccacct ttggaggagt a 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaaggcgttt ggctcttgtc 20

Claims

1.核酸分子，其为：

i)包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸和/或第4501-5156位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；

ii)包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸和第3900-4571位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；

iii)包含SEQ ID NO:1的第3900-4571位核苷酸和第4501-5156位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；或者

iv)包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸，第3900-4571位核苷酸和第4501-5156位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

2.如权利要求1所述的核酸分子，其包含SEQ ID NO:1所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

3.如权利要求1或2所述的核酸分子，其包含表达抗线虫基因的表达盒，如SEQ ID NO:1的第3043-4840位核苷酸所示序列。

4.如权利要求1或2所述的核酸分子，其通过将如SEQ ID NO:1的第3043-4840位核苷酸所示的表达抗线虫基因的表达盒导入棉花的基因组中获得。

5.如权利要求1或2所述的核酸分子，其存在于棉花植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分中。

6.用于检测棉花转化事件的探针，其包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸或第4501-5156位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列。

7.用于检测棉花转化事件的引物对，其能够特异性扩增产生包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸或第4501-5156位核苷酸所示序列，或其片段或其变体或其互补序列；

任选地，所述引物对为：

i)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸所示序列的引物对；

ii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第4501-5156位核苷酸所示序列的引物对；

iii)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第201-812位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3900-4571位核苷酸所示序列的反向引物；或者

iv)特异性识别包含SEQ ID NO:1的第3900-4571位核苷酸所示序列的正向引物，和特异性识别包含SEQ ID NO:1的第4501-5156位核苷酸所示序列的反向引物；

任选地，所述引物对为SEQ ID No:10和SEQ ID No:11所示的核苷酸序列或其互补序列；或者SEQ ID No:12和SEQ ID No:13所示的核苷酸序列或其互补序列。

8.用于检测棉花转化事件的试剂盒或微阵列，其包含权利要求6所述的探针和/或权利要求7所述的引物对。

9.检测棉花转化事件的方法，其包括利用以下来检测待测样品中是否存在所述转化事件：

-权利要求6所述的探针；

-权利要求7所述的引物对；

-权利要求6所述的探针和权利要求6所述的引物对；或者

-权利要求8所述的试剂盒或微阵列。

10.对棉花进行育种的方法，所述方法包括以下步骤：

1)获得包含权利要求1或2所述的核酸分子的棉花；

2)将步骤1)所获得的棉花通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到后代植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地，

3)对步骤2)所获得的后代植物进行抗线虫鉴定，并利用权利要求8所述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。