CN102586270B - 水稻抗逆性相关的OsHMGB3基因及编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从水稻DNA片断中分离克隆与水稻抗逆性相关的OsHMGB3基因。该基因含有HMG基因家族保守结构域，为该基因家族HMGB类型成员。OsHMGB3基因受(聚乙二醇)PEG、高盐、低温、高温以及脱落酸(ABA)诱导表达，超表达OsHMGB3可提高水稻苗期抵抗渗透胁迫的能力，与水稻抗逆性相关。本发明的水稻基因对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性。

Description

水稻抗逆性相关的OsHMGB3基因及编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及一种新的水稻抗逆相关基因OsHMGB3及其编码蛋白与应用，利用此基因可培育抗旱能力增强的转基因植物。

背景技术

干旱缺水是影响农作物产量的主要因素之一，而水稻作为主要的粮食作物之一，其生产消耗水量非常大，这与近年来全球范围内日益严重的水资源短缺形成了尖锐的矛盾。利用基因工程技术，将抗逆基因转入到当前广泛应用的优良作物品种中，培育既抗逆又高产优质的农作物新品种是应对水资源短缺、保障粮食安全的有效途径之一。深入发掘并研究植物节水抗旱基因，是解析植物抗旱机制的基础工作，为培育节水抗旱作物提供理论依据和基因资源。

细胞核中，基因组DNA由组蛋白以及其它一些蛋白共同组成了核蛋白复合物，也就是常说的染色质。染色质的结构是高度动态的，并且能够被与其相关的一些蛋白所调控。在这些蛋白中，高迁移率族蛋白(HMG-high mobility group)蛋白是仅次于组蛋白的第二大含量丰富的蛋白(Reeves，1982；Bustin et al.，1996；Thomas et al.，2001)。HMG蛋白分为三个家族，第一家族是HMGB，第二家族是HMGN，第三家族是HMGA。至今已从各种植物中克隆出编码HMGB蛋白的基因，包括水稻(Wu et al.，2003)，玉米(Grasser et al.，1991)，大豆(Laux et al.，1991)，刀豆(Yamamoto et al.，1998)，蚕豆(Grasser et al.，1993)，豌豆(Webster etal.，1997)，牵牛花(Zheng et al.，1993)。高等植物中的各种高迁移率族蛋白(HMGB)的不同之处在于染色质结合位点(Lichota et al.，2001)、DNA相互作用(Stemmer et al.，2002)以及表达模式的不同(Stemmer et al.，1999)。植物中存在各种各样的高迁移率族蛋白(HMGB)，预示着它们将在细胞核中执行多种功能。

水稻中已有高迁移率族蛋白1(HMGB1)和高迁移率族蛋白2(HMGB2)的研究报道，高迁移率族蛋白1(HMGB1)能够识别特定的DNA结构，如它更容易结合一些小环状的DNA，而不易结合线状DNA(Wu et al.，2003)；高迁移率族蛋白2(HMGB2)能够调节细胞的增殖(Yoshida et al.，2006)。但有关水稻高迁移率族蛋白(HMGB)蛋白和抗逆性的关系至今未见报道。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明目的在于提供一种新的水稻抗逆相关OsHMGB3基因，是从水稻中分离克隆的一段完整编码区段的DNA片段，对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明，它具有植物特有HMGB家族的保守结构域，因此命名为OsHMGB3。具有该家族典型的结构域，属高迁移率族蛋白(HMGB)类型，可响应逆境胁迫。

本发明的另一目的是提供利用水稻基因OsHMGB3培育抗逆能力增强的转基因植物的方法及其应用。分离和应用一种包含OsHMGB3基因的DNA片段，该基因能响应高温、低温、盐、外源ABA和PEG胁迫处理，发生表达变化。

本发明的技术方案是，所述OsHMGB3基因DNA序列为序列表SEQ ID NO：1所示，或者与SEQ ID NO：1至少90％同源的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。

较佳的是，所述的OsHMGB3基因为SEQ ID NO：2中所示的DNA序列，或与SEQID NO：2同源性达90％的DNA序列。

本发明的另一种技术方案是，所述OsHMGB3基因编码的蛋白为下列之一：

其氨基酸序列为序列表SEQ ID NO：3所示；或与SEQ ID NO：3序列的同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体或诱导突变体；或是在高或低的严谨条件下能与权利要求1或2所述的OsHMGB3基因的DNA杂交的DNA所编码的蛋白。

本发明的另一种技术方案是，提供了包含OsHMGB3基因的重组载体。所述重组载体所选用的载体可为引导外源基因在植物中表达的载体。

优选的技术方案是，重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。

本发明的另一种技术方案是，一种具有所述OsHMGB3基因编码的转化体，所述转化体的宿主为植物，所述植物为括水稻在内的多种植物。

优选的技术方案是，将所述基因导入植物细胞、组织或器官，再将所述植物细胞、组织或器官培育成植株，得到抗逆性增强的转基因植物，所述基因导入植物细胞]组织或器官的步骤为：

(1)、水稻OsHMGB3基因的克隆；

(2)水稻OsHMGB3蛋白的序列信息与同源性分析；

(3)观察水稻基因OsHMGB3在各组织器官的表达分析；

(4)对比水稻基因OsHMGB3在逆境胁迫下的表达分析；

(5)水稻基因OSGRAS1超量表达转化为水稻；

(6)转基因水稻的苗期甘露醇处理。

较佳的是，本发明通过对水稻基因分离克隆及其对逆境胁迫的响应分析，提供了一种包含大小为399bp的OsHMGB3基因的水稻DNA片断。OsHMGB3基因含有HMG基因家族保守结构域，为该基因家族HMGB类型成员。该基因受干旱、盐及外源ABA诱导表达，与水稻抗逆性相关。

实现上述技术方案的操作办法是：

可以采用已克隆的OsHMGB3基因为探针，从cDNA文库和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组，mRNA和cDNA中扩增得到本发明的OsHMGB3基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含OsHMGB3基因序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得抗逆能力提高的转基因植株。

携带本发明OsHMGB3基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。

本发明的技术效果是：

本发明的水稻基因对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性。

本发明OsHMGB3基因克隆自水稻第4染色体的抗旱QTL区段，与该家族的其它成员比对结果表明，该基因具有该家族典型的结构域，属高迁移率族蛋白(HMGB)类型。在干旱、盐、高温、低温、外源ABA处理下的基因表达谱分析表明，该基因可响应逆境胁迫表达。而且，超表达该基因的转基因水稻表现出显著增强的抵抗渗透胁迫的能力。

本发明的技术效果是对于培育抗逆性增强的植物新品种具有重要的意义和应用价值。

附图说明

图1为本发明的OsHMGB3基因在各组织器官的表达；

图2为本发明的OsHMGB3基因在苗期冷、热、盐、PEG和外源ABA处理下的表达水平；

图3为本发明利用ClustalW2软件将OsHMGB3基因预测的蛋白序列与同源蛋白序列进行比对的结果；

图4为本发明的OsHMGB3基因超表达载体转化水稻植株的Southern blot检测；

图5为本发明的OsHMGB3基因超表达载体转化水稻植株的表达水平检测；

图6为本发明的OsHMGB3基因的超表达转基因水稻的苗期甘露醇处理分析。

具体实施方式

下述实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如萨姆布鲁克(Sambrook)等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

水稻OsHMGB3基因的克隆

1.幼苗培育

将水稻置于30℃萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。

2.RNA提取与第一链cDNA合成

RNA的提取：所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1ml TRNzol-A⁺试剂的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加0.2ml氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置3min；后于4℃，12000rpm离心10min后，上清液移至新的2mL EP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加100μl RNase-free ddH₂O溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

反转录之前需用DNaseI消化所提取样品，反应体系如下：

37℃反应15min后，加入0.25μl0.1M EDTA(保证终浓度＞2mM)，70℃温育10min终止反应，短暂离心后置于冰上备用。

第一链cDNA的合成参照Promega反转录系统A3500操作手册，具体步骤如下：

(1)DNaseI消化过的样品中依次加入下列各试剂配制20μl的反应体系：

(2)将上反应体系于42℃温育15min

(3)然后95℃加热5min，使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合；

(4)4℃或冰上放置5min。

制备好的cDNA可以立即使用或存放于-20℃备用。

3.基因的克隆

从水稻第4染色体的抗旱QTL区段内定位到候选基因LOC_Os04g47690，对水稻基因组及全长基因数据库进行BLAST搜索，获得其对应的全长cDNA(AK120614)。根据预测信息设计上下游引物Gf1：5’-ATGGGCAAGGCCGACGCC-3’和Gr1：5’-CTACTCGTCCTCGCCACTGCCAT-3’，从cDNA中直接克隆获得了OsHMGB3基因ORF(399bp)，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用T7或SP6作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI3730测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果经BLAST比对确认。

实施例2

水稻OsHMGB3蛋白的序列信息与同源性分析

本发明新的水稻OsHMGB3全长cDNA的ORF长度为399bp，详细序列见SEQ ID NO：3。根据全长ORF推导出水稻OsHMGB3的氨基酸序列，共132个氨基酸残基，分子量为14002.37道尔顿，等电点(pI)为7.80。详细序列见SEQ ID NO：3。通过与BLASTP程序比对得出，OsHGMB3编码蛋白具有HMGB-UBF_HMG-box结构域，属于HMGB家族。

通过对水稻、拟南芥、玉米、小麦、大麦、大豆、陆地棉、小立碗藓的HMGB编码蛋白进行多序列比对(图3)，我们发现，除了该蛋白的核心区域HMG-box在不同物种间高度保守，其酸性C-末端也相对保守。

实施例3

水稻基因OsHMGB3在各组织器官的表达分析

1.选取材料

苗期：选取饱满的IRAT109种子，蒸馏水清洗，3％NaClO消毒10min后清洗干净，30℃催芽，种子露白后转放到发芽盒内水培生长，三叶期后施加营养液。在28℃，16h/8h的光照培养室中培养，至四叶期时取新叶及根部位的材料进行分析；

成株期：IRAT109种植于水田，孕穗期取植株的剑叶、叶鞘和穗进行分析。

2.RNA提取与第一链cDNA合成

同实施例1。

3.定量PCR分析

基因表达的定量分析使用Takara公司的Premix Ex Taq^TM(Perfect Real Time)试剂盒，和美国ABI7000定量PCR仪进行。根据OsHMGB3全长eDNA序列设计定量引物。以水稻持家基因actin(GenBank accession No.AY212324)为参照基因，根据其cDNA序列设计引物。所用基因定量前引物为Gf2：5’-CCGTTCTTCGCCTTCCTG-3’，基因定量后引物Gr2：5’-CGCCACTGCCATCATTCTC-3’，Actin F：5’-CTTCCTCATGCCATCCTGC-3’，Actin R：5’-GCAAGCTTCTCCTTGATGTCC-3’。20μl反应体系的配制。

反应条件为：95℃30s，然后在95℃5s，60℃31s，循环40次，并增设Dissociation Stage。设定在每个循环中60℃31s时收集数据，其它具体操作按仪器使用说明书进行。计算目的基因与参照基因的平均CT值以及ΔCT值，利用2^-ΔΔCT法进行结果分析，最后将数据导入GraphPad Prism5.0做出目的基因的相对表达量柱状图。

定量分析结果显示(图1)，该基因在植株的各组织中均有一定量表达，茎中表达量稍低，推测该基因不具有组织表达特异性。

实施例4

水稻基因OsHMGB3在逆境胁迫下的表达分析

1.逆境胁迫处理

选取饱满的IRAT109种子，蒸馏水清洗，3％NaClO消毒10min后清洗干净，30℃催芽，种子露白后转放到发芽盒内水培生长，三叶期后施加营养液(国际水稻所标准营养液)。在28℃，16h/8h的光照培养室中培养，至四叶期时进行各种逆境和激素处理：20％PEG6000、200mM NaCl、4℃、42℃和100μM脱落酸(ABA)。分别在胁迫前、胁迫后3h、6h、12h、24h对逆境处理材料进行取样。在处理前、处理后0.5h、3h、6h、12h、24h对ABA处理样品取样。所有处理和取样过程都是在持续光照的条件下进行。

2.RNA提取与第一链cDNA合成

同实施例1。

3.定量PCR分析

同实施例1。

定量分析结果显示(图2)，OsHMGB3对PEG和ABA处理较敏感，处理后短时间内被诱导表达，表达量明显上升，对冷处理则呈现缓慢响应的特点，而对盐和热处理的反应相对滞后。具体表现为：PEG模拟干旱处理3h后，该基因被迅速诱导表达，表达量为处理前的4.6倍，随着处理时间的推移逐渐减少，在处理24h时恢复到处理前的水平(图2-A)；高盐胁迫处理12h该基因才有明显的积累，并在24h时达到最高，为处理前的4.9倍(图2-B)；冷处理3h时该基因被少量诱导表达，其表达量随处理时间延长缓慢上升(图2-C)；热处理24h后才得到明显的诱导，为处理前的3.6倍(图2-D)；ABA处理0.5h后该基因就得到了诱导表达，为处理前的3.5倍，并维持在此表达水平，至处理12h后表达量回复到处理前水平(图2-E)。上述结果表明，该基因能够受到PEG、高盐、低温、高温以及ABA的诱导表达，因而该基因在逆境应答反应中可能起着重要的作用。

实施例5

水稻基因OsGRAS1超量表达转化水稻

1.利用GATEWAY重组克隆技术构建含OsHGMB3基因的超量表达载体：

以实施例3中已获得含有旱稻IRAT109的OsHGMB3基因的pGEMT-Easy载体为模板，用前引物Gf3：5’-AAAAAGCAGGCTATGGGCAAGGCCG-3’，后引物Gr3：5’-AGAAAGCTGGGTCTACTCGTCCTCGCC-3’进行第一轮PCR扩增。再利用通用引物attB1adapter：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’，attB2adapter：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’进行第二轮PCR扩增，扩增产物经回收纯化后，通过BP反应，将扩增产物片断克隆到入门载体pDONR207，筛选阳性克隆，通过LR反应，将目的基因重组克隆到GATEWAY超表达载体pCB4004(该载体是在中国科技大学向成斌研究员赠送的pCB2004基础上，将BASTA抗性基因(除草剂抗性基因)替换为潮霉素抗性基因改造而来，命名为pCB4004)。具体过程如下：

(1)第一轮PCR扩增

20μl反应体系：

各反应成分	用量(μl)
		ddH2O	13.8
10×buffer	2
		dNTPs	1
Prime F(10μM)	1
		Prime R(10μM)	1
质粒	1
		Taq	0.2

扩增程序：

步骤(Step)    时间(Time)  温度(Temperature)  周期(Cycles)  Initial变性

(Denaturation)    2min    98℃    1X

变性(Denaturation)    15s    98℃

复性过程(Annealing)    30s    60℃    10X

延长(Extension)    1min/kb    72℃

(2)第二轮PCR扩增

取上述PCR产物10ul作为模板，加入到下面PCR配置的40ul反应体系。

各反应成分	用量(μl)
		ddH2O	19.5
10×buffer	4
		dNTPs	2
Prime F(10μM)	2
		Prime R(10μM)	2
PCR产物	10
		Taq	0.5

紧接着严格按照下面的循环来进行PCR扩增：

步骤(Step)    时间(Time)  温度(Temperature)  周期(Cycles)

Initial Denaturation    1min    98℃    1X

Denaturation    15s    98℃

Annealing    30s    45℃    5X

Extension    1min/kb    72℃

然后设置下一步的PCR程序。

Step    Time  Temperature Cycles

Denaturation    15s    98℃

Annealing    30s  55℃  25X

Extension     1min/kb  72℃

最后取5ul电泳检测PCR质量。

(3)PCR产物的回收

采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行纯化回收。

(4)BP重组反应

BP反应的目的在于将含有attB接头的PCR产物重组到含有attP的供体载体上，以产生入门克隆。重组反应可在室温配制混匀，0.5ml的离心管中进行。反应体系如：

25℃温浴16h左右，随后将BP反应液转化大肠杆菌感受态细胞。重组大肠杆菌需在含庆大霉素平板上生长。接着挑取单菌落以进行PCR验证，最后抽提质粒。

(5)LR重组反应

重组反应可在室温配制，0.5ml的离心管中进行。反应体系如下：

Components        Sample

Entry clone(50-150ng)    3μL

Destination vector(150ng/μL)    1μL

5×LRClonase enzyme mix    1μL

25℃温浴16h左右，然后将反应液转化大肠杆菌感受态细胞。转化完成的大肠杆菌液涂布在含有卡那霉素的平板上生长。接着挑取单菌落，进行PCR验证，然后送测序，测序结果与该基因cDNA序列比对以确认序列正确与否，最后提取质粒，即可转化农杆菌EHA105。

2.农杆菌转化

根癌农杆菌(EHA105)感受态细胞的制备：

根癌农杆菌菌液于28℃培养至OD600＝0.5时，4℃离心收集菌体，用500ul、0.1mol/L冰浴CaCl₂重悬，冰浴30min后离心，去上清，用100ul，0.1mol/L冰CaCl₂重悬后，于4℃保存。

农杆菌转化(冻融法)：

(1)向感受态农杆菌(100ul)中加入5ul植物表达载体质粒DNA，轻轻混匀，冰水浴30min后，于液氮中速冻冷激2min；

(2)取出，加入400～800ul YEP培养液(含卡那霉素，Kan)；28℃，200r/min振荡培养3-5h；

(3)室温离心(5000r/min，5min)，保留100ul上清重悬菌体，涂布于LB固体培养基(含Kan)上，28℃倒置培养2天直至长出合适大小的菌落。

(4)挑取单克隆进行PCR检测，得到阳性菌株。

3.愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20min，再用75％的乙醇消毒1min，然后用次氯酸钠(1.5％有效浓度)溶液振荡消毒20min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。

愈伤诱导培养基：采用表1的诱导培养基，加入0.3g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5ml 2，4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

4.继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。

继代培养基：采用表1的继代培养基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2ml 2，4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至5.9，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

5.农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌挑，取阳性单菌落，在1ml农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50ml农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养至OD600＝0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30min至OD600＝0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5d。

悬浮培养液：采用表1的悬浮培养液，加入0.08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0.2ml2，4-D(浓度1mg/ml)，配成100ml溶液，调pH至5.4，分成两瓶(每瓶50ml)，高温高压灭菌。使用之前加入1ml 50％的葡萄糖和100μl AS(100mM)。

共培养培养基：采用表1的共培养培养基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和3.0ml 2，4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至5.6，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入20ml50％的葡萄糖和1ml AS(100mM)。

6.筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。

筛选培养基：采用表2的筛选培养基，加入0.6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2.5ml2，4-D(浓度1mg/ml)，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。使用之前加入1ml Hn和1ml Cn(100ppm)。

7.分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16h/8h光暗培养诱导分化芽(4-6周)。

分化培养基：采用表2的分化培养基，加入2.0mg/L6-BA、2.0mg/L KT、0.2mg/LNAA、0.2mg/L IAA、1.0g水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成1L溶液，调pH至6.0，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

8.生根培养：待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16h/8h光暗培养，诱导生根。

生根培养基：采用表2的生根培养基，加入30g蔗糖，配成1L溶液，调pH值至5.8，加入7g琼脂粉，高温高压灭菌。

9.转化植株培养：待根系发达后，打开试管口，加入无菌水炼苗2-3d后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。

表1 基本培养基成分1

表2 基本培养基成分2

10.超量表达植株的阳性检测(采用GE healthcare公司的Southern blot试剂盒)

(1)基因组DNA提取(大样法)：液氮浸泡叶片，研磨成细粉，装入10ml离心管中，加4ml56℃预热的1.5×CTAB混匀；快速置于56℃的水浴30min，中间颠倒数次；加入氯仿/异戊醇(24∶1)4ml，轻摇30min；4000rpm离心20min，吸取上清3ml至新离心管中(10ml)，加300ul10％的CTAB(56℃水浴预热)，以及3.3ml的氯仿/异戊醇(24∶1)，颠倒数次；4000rpm离心20min，吸取上清2.7ml至新离心管中(10ml)，加5.4ml1％CTAB(56℃预热)，轻摇沉淀DNA，4000rpm离心20min，弃上清，加入2ml含1ul RNA酶的1M NaCl溶液，56℃水浴过夜溶解，加入2倍体积预冷(-20℃)的无水乙醇沉淀DNA，4000rpm离心5min，弃上清，75％乙醇清洗沉淀，晾干，加100ul灭菌水溶解DNA。

(2)基因组DNA酶切、电泳和凝胶预处理：

在2ml的离心管中加入以下组分：

DNA	20μL
		HindIII(TAKARA)	5μL
10×M buffer(TAKARA)	30μL
		ddH2O	Up to 300μl

混匀后37℃酶切过夜。酶切好的DNA样品在1％的琼脂糖凝胶中，低压(30V)电泳过夜。电泳结束后，将凝胶置于瓷盘中，切除加样孔及不含样品的多余部分，依次用下列溶液处理凝胶：0.25mol/L的HCl脱嘌呤处理10min，蒸馏水漂洗三次后，加入变性液(1.5MNaCl，0.5M NaOH)，振荡变性30min。蒸馏水漂洗三次，加入中和液(1.5M NaCl，0.5MTrizma base)中和30min，蒸馏水漂洗三次。

(3)转膜

在瓷盘中加入适量转膜缓冲液20×SSC，将大小合适的滤纸用20×SSC浸透，并铺在玻璃板上搭成盐桥。将胶反面朝上置于滤纸上。胶周围用封口膜压边。

根据胶大小裁好硝酸纤维素膜，做好标记，正面向下，紧帖于胶上，防止气泡的产生。在膜上铺放浸过20×SSC，与膜同样大小的3层滤纸。然后铺放吸水纸，在吸水纸后压一块玻璃板，板上加1Kg左右的重物。转膜过夜。其间多次更换浸湿的吸水纸。转膜结束后，置于80℃中烘2h。

(4)探针制备

使用潮霉素基因引物(Hyg F：5’-CGTTATGTTTATCGGCACTTTG-3’，Hyg R：5’-TTGGCGACCTCGTATTGG-3’)扩增获得512bp的片段，并回收。将cross-linker按2∶8的比例稀释成工作液。使用前，将回收DNA用试剂盒中附带的蒸馏水稀释至10ng/ul，取10ul在沸水浴中变性5min，立即放入冰上冷却5min。依次加入10ul反应液，2ul标记试剂，并轻微混匀。再加入10ul cross-linker工作液，轻微混匀。离心机短暂离心，将液体收集至管底。37℃中反应30min。探针可以立即使用，或置于冰上2h内使用。

(5)杂交和检测

将杂交膜放入含30～40ml预杂交液的杂交管中，55℃预杂交30min，加入制备好的探针，混匀，杂交过夜。弃杂交液，加入55℃预热的洗液I，55℃洗脱10min。重复一次。加入洗液II，常温下漂洗10min。重复一次。将膜转移到干净的封口膜上，将CDP-STAR均匀地滴到杂交膜上，上面用封口膜封好，去除多余的气泡和CDP-STAR。暗室中将杂交膜及底片放入暗盒中，依据所用的DNA浓度，曝光6～12h。黑暗中依次将底片放入显影液，水，定影液中，即可见DNA谱带。显影时间以目的谱带清晰，而背景信号刚要出现时为宜(图4)。结果显示，OsHMGB3的转基因植株中以单拷贝插入为主，除2个假阳性植株外(6，10)，共检测出17个单拷贝植株，有2个二拷贝植株(20，21)。同时也说明，各转基因苗来自于不同的独立转化过程。

11.超量表达阳性植株中目的基因的表达水平检测

RNA提取及定量PCR方法见实施例1。

提取转基因T₀代植物叶片RNA，采用定量PCR法检测了OsHMGB3超量表达植株中目的基因的表达水平(图5)。在检测的15株转基因植株中，有5株表达量超过5倍，没有出现超过10倍的植株。

实施例6

转基因水稻的苗期甘露醇处理

将超量表达转基因家系种子去壳消毒(75％酒精处理1min，1.5％NaClO处理20min，无菌水清洗5次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽，野生型对照晚一天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上。待发芽2～3天后挑选发芽好且长势一致的种子，分别转移到含有0，150mmol/L甘露醇的1/2MS培养基上，在光照培养室生长7～10天后观察表型，并测量植株的株高以及鲜重。处理过程中观察表型并拍照。

实验结果可以看出，无甘露醇处理的正常生长条件下，转基因植株与野生型植株没有明显的差异；甘露醇渗透胁迫10天后，野生型植株生长明显受到抑制，转基因植株的生长也受到一定程度的抑制，但长势明显优于野生型植株(图6-A)。正常生长条件下，野生型植株和转基因植株的鲜重没有差异，甘露醇胁迫后3个转基因株系的植株鲜重极显著地高于野生型植株的鲜重(图6-B)；正常生长条件下，野生型植株和转基因植株在株高上没有差异，甘露醇胁迫后转基因植株的株高极显著地高于野生型植株株(图6-C)；该结果表明超表达OsHMGB3提高了水稻苗期对高渗胁迫的抗性。

综上所述，尽管已引证一些具体实例对对本发明作了详细的说明，但对本领域技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围，做各种变化或修正是显然的。

Claims (1)

1.一种水稻抗逆性相关的OsHMGB3基因的应用，其特征在于，所述水稻抗逆性相关的OsHMGB3基因选自SEQ ID NO:1中所示的DNA序列。