CN107354163A - 水稻RING finge家族E3泛素连接酶OsDHS基因、其编码蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

水稻RING finge家族E3泛素连接酶OsDHS基因、其编码蛋白及其应用，本发明的目的是提供水稻RING finger家族E3连接酶OsDHS基因、其编码蛋白及其应用。该OsDHS基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明将OsDHS基因在水稻中过量表达或敲除，通过一系列实验证明OsDHS基因过量表达转基因水稻对干旱超敏感，表皮蜡质严重缺失；相反，dhs突变体表现为耐旱能力增强。本发明OsDHS基因通过调控水稻表皮蜡质合成，进而调控植物对干旱胁迫的反应。

Description

水稻RING finge家族E3泛素连接酶OsDHS基因、其编码蛋白及 其应用

技术领域

本发明涉及一种OsDHS基因、其编码蛋白及其应用。

背景技术

水稻是世界一半以上人口的主要粮食作物。随着工业化发展和水污染的日益严重，干旱胁迫已成为制约水稻产量的主要因素。所幸，水稻自身形成多种抵御干旱胁迫的机制，其中表皮蜡质结构为防止水分通过非气孔途径蒸发提供了重要的屏障作用，增加蜡质含量可显著提高水稻的抗旱能力。近年来，研究人员克隆了许多蜡质合成途径的基因，这些基因能够调节蜡质数量或组成，改变表皮蜡质结构，从而调控植物对干旱胁迫的反应，然而对于调控蜡质合成的转录因子研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供水稻RING finger家族E3连接酶OsDHS基因、其编码蛋白及其应用。

本发明水稻RING finge家族E3泛素连接酶OsDHS基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本发明OsDHS基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明OsDHS基因在调控植物对干旱胁迫的反应中的应用。其中所述植物为水稻。

本发明OsDHS基因在调控水稻表皮蜡质合成中的应用。

本发明的有益效果：

本发明在分子水平上首次成功地克隆出水稻RING finger家族E3连接酶OsDHS基因。该基因编码一个a Really Interesting New Gene(RING)家族蛋白，能够调控水稻表皮蜡质合成。OsDHS过表达水稻表皮蜡质显著减少，而dhs突变体则耐旱能力显著增强。

本发明通过遗传转化手段，将OsDHS基因在水稻中过量表达或敲除，通过一系列实验证明OsDHS基因过量表达转基因水稻对干旱超敏感，表皮蜡质严重缺失；相反，dhs突变体表现为耐旱能力增强。

通过转基因技术将水稻OsDHS基因在水稻中过量表达，并获得了稳定遗传的高世代转基因材料。表型实验分析表明，转基因材料比非转基因的对干旱敏感，表皮蜡质严重缺失，所有蜡质组分含量显著下降；而利用CRISPR/CAS9介导的基因编辑技术，获得纯合的dhs突变体，耐旱能力显著增强，表皮蜡质各组份含量显著增加。水稻RING finger家族E3连接酶OsDHS的发现，将充实水稻表皮蜡质合成网络在水稻干旱胁迫反应中作用的理论依据，对提高水稻抵御干旱等逆境胁迫能力具有重要的应用价值，并对水稻产量的提高提供较大的实践空间，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为OsDHS过表达植株表达水平分析；

图2为OsDHS过表达植株与野生型相比植株形态上的差异；

图3为OsDHS过表达植株与野生型相比叶片形态上的差异；

图4为OsDHS过表达植株与野生型相比株高与叶片长度统计；

图5为OsDHS过量表达植株刚刚从培养瓶中转入营养钵中的形态比较；

图6为OsDHS过量表达植株转入营养钵暴露于空气中1h后的形态比较；

图7为OsDHS过表达植株叶片失水速率测定结果；

图8为OsDHS过表达植株叶片浸水实验结果；

图9为OsDHS过表达植株叶绿素浸提速率测定结果；

图10为OsDHS过表达植株气孔密度统计结果；

图11为扫描电镜观察OsDHS过表达植株表皮蜡质结构图；

图12为透射电镜观察OsDHS过表达植株角质层结构图；

图13为OsDHS过表达植株表皮蜡质组分含量测定结果；

图14为dhs突变体打靶位点示意图；

图15为打靶效果检测结果；

图16为扫描电镜观察dhs突变体表皮蜡质结构图；

图17为dhs突变体叶绿素浸提速率测定结果；

图18为dhs突变体蜡质组分含量测定结果；

图19为正常浇灌下dhs突变体与对照的植株形态比较；

图20为失水3d的dhs突变体与对照的植株形态比较；

图21为干旱处理7d，复水3d的dhs突变体与对照的植株形态比较；

图22为dhs突变体干旱处理后复水成活率统计结果；

图23为dhs突变体叶片失水率测定结果；

图24为OsDHS的泛素连接酶活性检测结果；

图25为OsDHS蛋白RING结构域定点突变示意图；

图26为OsDHS^C95S过表达植株表型；

图27为OsDHS^C95S过表达植株叶片失水率测定结果；

图28为OsDHS^C95S过表达植株叶绿素浸提速率测定结果；

图29为OsDHS^C95S过表达植株蜡质组分含量测定结果。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式水稻RING finge家族E3泛素连接酶OsDHS基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

具体实施方式二：本实施方式OsDHS基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

具体实施方式三：本实施方式OsDHS基因在调控植物对干旱胁迫的反应中的应用。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：所述植物为水稻。其它与具体实施方式三相同。

具体实施方式五：本实施方式OsDHS基因在调控水稻表皮蜡质合成中的应用。

以下实施例中如无特别说明均为常规方法。

实施例(1)水稻E3泛素连接酶OsDHS基因的克隆：

一、以水稻品种日本晴为材料，用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取叶片总RNA；

二、采用DNaseⅠ处理步骤一提取的总RNA；

三、取1μg步骤二处理后的总RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照购买自BDBiosciences Clontech公司的BD SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒的使用手册进行，获得cDNA；

四、以获得的cDNA为模板通过正向引物F1与反向引物R1扩增OsDHS基因，PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸35S，共38循环，再72℃延伸10min，将PCR产物在ABI3130测序仪(ABI公司)上进行测序；测序结果表明水稻RINGfinger家族E3泛素连接酶OsDHS基因由495个碱基组成，其核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO：1所示。

正向引物F1：5’-CACC GGATCC ATGGGGTTCCCTCTGGTGT-3’

反向引物R1：5’-CAG ACTAGT TCACCAAACGACGCCCGT-3’

实施例(2)水稻E3泛素连接酶OsDHS过量表达植物表达水稻的获得

一、过量表达载体构建：将获得的OsDHS基因的cDNA，装入植物表达载体pCAMBIA1300中，形成一个CaMV 35S启动子驱动的OsDHS融合体质粒；

二、目的载体转化农杆菌EHA105，农杆菌介导法转入黑龙江水稻品种龙粳11中，针对OsDHS基因，鉴定20株以上单拷贝插入的纯合过量表达转基因水稻。

实施例(3)OsDHS基因过表达转基因水稻分子鉴定：

一、以待鉴定OsDHS基因过表达转基因水稻和其对照为材料，用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取叶片总RNA；

二、采用DNaseⅠ处理步骤一提取的总RNA；

三、取1μg步骤二处理后的总RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照购买自BDBiosciences Clontech公司的BD SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒的使用手册进行，获得cDNA；

四、以获得的cDNA为模板通过正向引物F2与反向引物R2，水稻内参Actin正向引物F3与反向引物R3，以及SYBR Green PCR master mix(TransStart)进行Quantitativereal-time PCR。数据从Bio-Rad chromo 4real-time PCR detector上获得；用2^-△△CT方法分析倍数变化。

正向引物F2：5'-GTCGGGATCTGCCACCACC-3'

反向引物R2：5'-CAGCCATGACAGCCGTGCT-3'

正向引物F3：5'-AGACCTTCAACACCCCTGCTATG-3'

反向引物R3：5'-TCACGCCCAGCAAGGTCG-3'

OsDHS基因过表达转基因水稻分子鉴定结果如图1(以3株具有代表性的能稳定遗传的OsDHS基因过表达转基因水稻为例)。OsDHS基因在对照Control中的表达水平设为1；OsDHS基因过量表达转基因水稻的3个株系中，OsDHS-OE1表达量是Control的49倍，OsDHS-OE2表达量是Control的27倍，OsDHS-OE3表达量是Control的34倍。以上结果证明本实验所采用的实验材料确实是OsDHS基因过量表达的。

实施例(4)水稻RING finger家族E3泛素连接酶OsDHS基因过量表达转基因植株形态分析：

OsDHS基因过量表达转基因再生植株与野生型相比生长缓慢，颜色深绿，再生植株生长30d后，观察植株形态，图2和图3为OsDHS基因过表达转基因水稻及其对照植株形态比较，其中图2为水稻植株整体比较，图3为叶片比较。图4为OsDHS基因过表达植株株高和叶片长度数据统计，由图可见，OsDHS基因过表达植株与对照相比显著矮小，叶片显著变短。

实施例(5)水稻OsDHS过量表达转基因水稻对干旱敏感性分析：

一、将OsDHS过量表达转基因再生植株从培养瓶中取出，移栽到营养钵中，观察表型。

二、取OsDHS过量表达植株和非转基因对照植株叶片，各称量0.5g，置于玻璃平皿上，然后将带有叶片的玻璃平皿置于室温、无通风环境下，每隔30min称量一次，最后计算失水率。

图5为OsDHS过量表达植株刚刚从培养瓶中转入营养钵中，OsDHS过量表达植株与对照相比，植株矮小，颜色深绿；图6为转入营养钵暴露于空气中1h，OsDHS过量表达植株暴露于空气中后叶片迅速卷曲、萎蔫，3d后叶片变黄、萎蔫，多数OsDHS基因过量表达植株在移栽1个月后死亡。图7为OsDHS基因过量表达植株叶片失水率测定结果(图7中曲线a表示WT，曲线b表示OsDHS-OE1，曲线c表示OsDHS-OE2，曲线d表示OsDHS-OE3)，由图可见，OsDHS基因过量表达植株叶片失水率显著快于对照。以上结果表明，OsDHS基因过量表达植株对干旱超敏感。

实施例(6)OsDHS基因过量表达植株叶片渗透性分析：

一、将OsDHS基因过量表达植株和非转基因对照浸入水中，取出后，观察叶片水珠情况；

二、取OsDHS基因过量表达植株和非转基因对照植株相同部位叶片，剪成2cm小段，于室温中用30ml 80％的乙醇浸泡，避光，每隔10min取0.5ml浸提液检测OD664和OD647波长下的吸光值，连续检测1h后，继续浸泡24h，取0.5ml浸提液检测上述吸光值，根据公式(7.93×A664+19.53×A647)计算各时间点叶绿素含量，除以总叶绿素含量，计算叶绿素渗出速率。

从图8中可以看出，OsDHS基因过量表达植株浸水后，叶片挂上大量水珠，而非转基对照叶片几乎没有挂水珠。图9为叶绿素浸提速率分析(图9中曲线a表示WT，曲线b表示OsDHS-OE1，曲线c表示OsDHS-OE2，曲线d表示OsDHS-OE3)，可见OsDHS基因过量表达植株叶片的叶绿素浸提速率显著较野生型快。以上结果可见OsDHS基因过量表达植株叶片表皮结构有可能被破坏，叶片渗透性显著增加。

实施例(7)OsDHS基因过量表达植株表皮结构观察。

一、扫描电镜低倍数下(300倍)观察OsDHS基因过量表达植株和非转基因对照植株叶片的气孔结构和密度。

二、扫描电镜高倍数下(1000倍)观察OsDHS基因过量表达植株和野生型植株叶片表皮蜡质结构。

三、透射电镜观察OsDHS基因过量表达植株和野生型与叶片表皮角质层结构。

通过低倍数扫描电镜观察OsDHS基因过量表达植株叶片表面的气孔结构与野生相比没有显著变化，对气孔密度进行统计结果见图10，也没有显著变化，由此排除由于气孔结构变化导致叶片失水速率和渗透性增加的可能；通过高倍数扫描电镜观察发现，OsDHS基因过量表达植株叶片表皮蜡质晶体结构与对照相比显著稀少(图11)；通过透射电镜观察发现，野生型叶片表皮角质层结构清晰、连续，而OsDHS基因过量表达植株的角质层结构不清晰，且出现断裂(图12)。以上结果说明OsDHS基因过量表达植株对干旱超敏感是由于其表皮蜡质结构破坏造成的。

实施例(8)OsDHS基因过量表达植株表皮蜡质组分含量测定。

一、取OsDHS基因过量表达植株和野生型叶片，测量叶面积，然后浸入30ml正己烷中，67℃，30s，迅速取出叶片。

二、向提取液中加入50μg 24烷作为内标，液氮吹干。

三、加入100μl of bis-N,N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA,Sigma,USA)和100μl吡啶，70℃衍生化60min。

四、用Agilent 7000C气相色谱质谱联机(GC-MS/MS)检测分析表皮蜡质组分和含量。

OsDHS基因过量表达植株表皮蜡质组分和含量分析结果如图13(图13中C16、C18等C后面的数字是指相应蜡质组分碳链的碳原子数)。OsDHS基因过量表达植株表皮蜡质几乎所有组分都比野生型显著降低，通过统计分析，可见OsDHS基因过量表达植株表皮蜡质中几个主要组分(烷、初级醇、醛)总含量比野生型显著降低，总蜡质含量显著降低(表1所示)。由此进一步说明OsDHS基因过表达导致转基因植株表皮蜡质结构破坏，蜡质各组分含量显著降低，从而导致过表达植株通过非气孔途径水分流失增加，对干旱超敏感。

表1

实施例(9)dhs突变体的获得

一、载体构建：设计两段OsDHS的打靶sgRNAs，顺序连入CRISPR/Cas9双元载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H中，连接U3启动子的打靶引物F4和R4，以及连接U6a启动子的打靶引物F5和R5的核苷酸序列如下：

正向引物F4：5'-GGCACCATGCAGTAGCACACCAGA-3'

反向引物R4：5'-AAACTCTGGTGTGCTACTGCATGG-3'

正向引物F5：5'-GCCGAGCTTGGCCAAGGCGATGAG-3'

反向引物R5：5'-AAACCTCATCGCCTTGGCCAAGCT-3'

二、目的载体转化农杆菌EHA105，农杆菌介导法转入黑龙江水稻品种龙粳11中，针对OsDHS基因，鉴定3株以上OsDHS基因敲除纯合的突变体。

实施例(10)dhs突变体水稻分子鉴定：

提取转基因植物DNA，在打靶sgRNAs两端设计引物，做PCR扩展包含打靶区域的片段，测序分析打靶效果。打靶效果检测引物F6和R6序列如下:

正向引物F6：5'-AGTATTGCCAACTGTGCGTAGC-3'

反向引物R6：5'-CGACGACGAAGAGCATCAGC-3'

dhs突变体打靶位点示意图如图14，打靶效果检测结果见图15，dhs均为大片段缺失突变体，选择三个不同缺失类型的dhs突变体用于下一步研究。

实施例(11)dhs突变体叶片表皮结构扫描电镜观察。

取不同突变类型dhs突变体叶片与野生叶片，用1000倍扫描电镜观察叶片表皮蜡质结构。

图16为扫描电镜观察dhs突变体表皮蜡质结构结果。可见dhs突变体与野生型相比，表皮蜡质结构更加致密。

实施例(12)dhs突变体叶绿素浸提速率分析。

取4周龄dhs突变体和野生型幼苗相同部位叶片，剪成2cm小段，于室温中用30ml80％的乙醇浸泡，避光，每隔10min取0.5ml浸提液检测OD664和OD647波长下的吸光值，连续检测1h后，继续浸泡24h，取0.5ml浸提液检测上述吸光值，根据公式(7.93×A664+19.53×A647)计算各时间点叶绿素含量，除以总叶绿素含量，计算叶绿素渗出速率。

图17为dhs突变体叶绿素浸提速率分析结果(图17中曲线a表示WT，曲线b表示OsDHS-OE1，曲线c表示OsDHS-OE2，曲线d表示OsDHS-OE3)，由图可见，dhs突变体叶绿素浸提速率显著低于野生型，说明dhs突变体叶片表皮渗透性低于野生型。

实施例(13)dhs突变体表皮蜡质组分和含量分析。

一、取dhs突变体和野生型叶片，测量叶面积，然后浸入30ml正己烷中，67℃，30s，迅速取出叶片。

二、向提取液中加入50μg 24烷作为内标，液氮吹干。

三、加入100μl of bis-N,N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA,Sigma,USA)和100μl吡啶，70℃衍生化60min。

四、用Agilent 7000C气相色谱质谱联机(GC-MS/MS)检测分析表皮蜡质组分和含量。

图18为dhs突变体表皮蜡质组分和含量分析结果，可见dhs突变体表皮蜡质多数组分含量显著高于野生型；由表2统计结果看出，dhs突变体表皮蜡质总含量显著高于野生型。

表2

实施例(14)dhs突变体干旱处理表型分析

一、每个实验材料挑选饱满一致的种子浸种2天，37℃催芽2天，露白后各选取生长一致的种子移栽到蛭石中，每天浇灌营养液，人工气候培养箱(型号：RXZ0450；light：14h，dark：10h)28℃进行培养。

二、培养4周后，停止浇灌，干旱处理3d后开始观察表型，干旱处理7d后，重新浇灌，复水3d后统计植株存活率。

图19-图21为dhs突变体干旱处理表型，图19为正常浇灌下植株形态，dhs突变体与对照相比在植株形态上没有显著差别；图20为失水3d的表型，可见野生型叶片明显卷曲，而dhs突变体叶片没有卷曲；图21为干旱处理7d，复水3d的表型，可见野生型植株存活率显著低于dhs突变体，从图22复水3d植株存活率的统计结果可以看出，野生型植株存活率为53％，而dhs突变体存活率为86％。由此可见dhs突变体耐旱性显著高于野生型。

实施例(15)dhs突变体叶片失水率

一、每个实验材料挑选饱满一致的种子浸种2天，37℃催芽2天，露白后各选取生长一致的种子移栽到蛭石中，每天浇灌营养液，人工气候培养箱(型号：RXZ0450；light：14h，dark：10h)28℃进行培养。

二、培养3周后每个株系及其对照挑选均匀一致的叶片用电子天平(型号：FA2004)各称量0.5g，置于玻璃平皿上，然后将带有叶片的玻璃平皿置于室温、无通风环境下，每隔30min称量一次，最后计算失水率。

dhs突变体叶片失水率测定结果如图23(图23中曲线a表示WT，曲线b表示dhs-1，曲线c表示dhs-2，曲线d表示dhs-3)。结果显示dhs突变体比对照失水速率明显慢。综合以上结果说明dhs突变体表皮蜡质结构更加致密，各种蜡质组分含量增加，使表皮渗透性降低，导致dhs突变体表皮通过非气孔途径的水分流失减少，从而增加了植株的耐旱能力。

实施例(16)OsDHS原核表达蛋白泛素化活性分析

一、载体构建：将OsDHS全长编码区序列插入融合MBP标签的原核表达载体pMal-c2x中，表示为MBP-OsDHS；同时将OsDHS蛋白RING结构域的保守氨基酸Cys95定点突变为Ser，表示为OsDHS^C95S，将OsDHS^C95S也插入原核表达载体pMal-c2x中。

二、泛素化活性体系为：小麦E1约100ng，拟南芥Ubc10(E2)约40ng，拟南芥UBQ14约1μg，MBP-OsDHS约500ng。以MBP-CIP8作为阳性对照，以MBP作为阴性对照。其中E1为泛素激活酶，Ubc10(E2)是泛素结合酶，UBQ14为泛素，MBP-CIP8是将CIP8基因(已知的E3泛素连接酶)序列插入融合MBP标签的原核表达载体pMal-c2x中获得的。

三、用5×SDS上样缓冲液结束反应，煮沸后通过SDS-PAGE分离，用His抗体检测。

图24为OsDHS蛋白泛素化活性分析结果，可见当泛素体系所有组分都存在的条件下，OsDHS具有弥散性的泛素化条带，与阳性对照MBP-CIP8类似，而当缺少任何一种组分时，都没有泛素化条带。图25为OsDHS^C95S定点突变示意图，定点突变的OsDHS^C95S蛋白不具有泛素化活性。说明OsDHS是有活性的E3泛素连接酶，RING结构域对于OsDHS的E3泛素连接酶活性是必需的。

(17)OsDHS^C95S点突变转基因水稻的表型分析

一、载体构建：将定点突变的OsDHS^C95S序列插入到植物表达载体1300-221-HA中，由35S启动子驱动。

二、目的载体转化农杆菌EHA105，农杆菌介导法转入黑龙江水稻品种龙粳11中，针对OsDHS^C95S基因，鉴定3株以上OsDHS^C95S过表达的突变体。

三、取T3代纯合的OsDHS^C95S过表达突变体植株，根据上述方法，观察OsDHS^C95S过表达突变体水稻的形态、分析失水速率、叶绿素浸提速率、蜡质组分含量等。

由图26可见，OsDHS^C95S过表达突变体植株形态与野生型无显著差别；图27-29(图27和28中曲线1表示WT，曲线2表示OsDHS OE，曲线3表示OsDHS^C95S OE)及表3的统计数据表明OsDHS^C95S过表达突变体植株叶片失水率、叶绿素浸提速率、表皮蜡质组分含量，与野生型均无显著差别。由此可见，当OsDHS的RING保守氨基酸突变后，不再具有E3泛素连接酶活性，也不再具有调控表皮蜡质结构的功能，因此OsDHS的泛素连接酶活性是其行使生物学功能所必不可少的。

表3

综上所述，OsDHS是具有活性的泛素连接酶，能够通过调控表皮蜡质合成，从而调控植物对干旱胁迫的反应。

序 列 表

<110>中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>水稻RING finge家族E3泛素连接酶OsDHS基因、其编码蛋白及其应用

<160> 14

<210> 1

<211> 495

<212> DNA

<213>粳亚种（Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare）

<220>

<223> 水稻RING finge家族E3泛素连接酶OsDHS基因

<400> 1

atggggttcc ctctggtgtg ctactgcatg gcgatcccca agccgctcat cgccttggcc 60

aagctcctcg ccgccatcag ggaggccctc cagctgatgc tcttcgtcgt cgggatctgc 120

caccacccgg agcgatcggg ccgcccggct gccgtcgacg ccccgctgcc cgacgaggtg 180

aaggaccgcc tcccgcccct cgagttcgcc cagctgctcg cggcctcgga gcacggctgt 240

catggctgcg acgacgacga ggcggtggcg gggtgcatcg tgtgcctgga gaggctggag 300

gcggatgacg tggtgcggcg gctgggcaac tgcgcgcacg cgttccaccg cggctgcatc 360

gaccggtgga tcgacctcgg ccggttgacg tgcccgctgt gccgctccac cctgctgccg 420

cgcgcgcgcc ccgccgccgg cccgcgcggg cgactgggcc gcctcgccac ccgcctcacg 480

ggcgtcgttt ggtga 495

<210> 2

<211> 164

<212> PRT

<213>粳亚种（Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare）

<220>

<223>水稻RING finge家族E3泛素连接酶OsDHS基因编码蛋白

<400> 2

Met Gly Phe Pro Leu Val Cys Tyr Cys Met Ala Ile Pro Lys Pro

5 10 15

Leu Ile Ala Leu Ala Lys Leu Leu Ala Ala Ile Arg Glu Ala Leu

20 25 30

Gln Leu Met Leu Phe Val Val Gly Ile Cys His His Pro Glu Arg

35 40 45

Ser Gly Arg Pro Ala Ala Val Asp Ala Pro Leu Pro Asp Glu Val

50 55 60

Lys Asp Arg Leu Pro Pro Leu Glu Phe Ala Gln Leu Leu Ala Ala

65 70 75

Ser Glu His Gly Cys His Gly Cys Asp Asp Asp Glu Ala Val Ala

80 85 90

Gly Cys Ile Val Cys Leu Glu Arg Leu Glu Ala Asp Asp Val Val

95 100 105

Arg Arg Leu Gly Asn Cys Ala His Ala Phe His Arg Gly Cys Ile

110 115 120

Asp Arg Trp Ile Asp Leu Gly Arg Leu Thr Cys Pro Leu Cys Arg

125 130 135

Ser Thr Leu Leu Pro Arg Ala Arg Pro Ala Ala Gly Pro Arg Gly

140 145 150

Arg Leu Gly Arg Leu Ala Thr Arg Leu Thr Gly Val Val Trp

155 160 164

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 正向引物F1

<400> 3

caccggatccatggggttccctctggtgt 29

<210>4

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 反向引物R1

<400> 4

cagactagttcaccaaacgacgcccgt 27

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 正向引物F2

<400> 5

gtcgggatctgccaccacc 19

<210>6

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 反向引物R2

<400> 6

cagccatgacagccgtgct 19

<210> 7

<211>23

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 正向引物F3

<400> 7

agaccttcaacacccctgctatg 23

<210> 8

<211>18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 正向引物R3

<400> 8

tcacgcccagcaaggtcg 18

<210> 9

<211>24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 正向引物F4

<400> 9

ggcaccatgcagtagcacaccaga 24

<210>10

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 反向引物R4

<400> 10

aaactctggtgtgctactgcatgg 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 正向引物F5

<400> 11

gccgagcttggccaaggcgatgag 24

<210>12

<211> 24

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 反向引物R5

<400> 12

aaacctcatcgccttggccaagct 24

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 正向引物F6

<400> 13

agtattgccaactgtgcgtagc 22

<210>14

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 反向引物R6

<400> 14

cgacgacgaagagcatcagc 20

Claims (5)

1.水稻RING finge家族E3泛素连接酶OsDHS基因，其特征在于该OsDHS基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的OsDHS基因的编码蛋白，其特征在于该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1所述的OsDHS基因在调控植物对干旱胁迫的反应中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述植物为水稻。

5.如权利要求1所述的OsDHS基因在调控水稻表皮蜡质合成中的应用。