CN113046365B

CN113046365B - 水稻OsATL17基因在调控水稻抗性中的应用

Info

Publication number: CN113046365B
Application number: CN202110367467.XA
Authority: CN
Inventors: 张慧娟; 蒋明
Original assignee: Taizhou University
Current assignee: Taizhou University
Priority date: 2021-04-06
Filing date: 2021-04-06
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2041-04-06
Also published as: CN113046365A

Abstract

本发明植物基因工程技术领域，具体涉及水稻OsATL17基因在调控水稻抗性中的应用。本发明的目的在于为改良水稻抗性提供一种新选择。本发明的技术方案是水稻OsATL17基因在调控水稻抗性中的应用。本发明通过实验验证了水稻OsATL17基因的功能。实验证实本发明的基因OsATL17的沉默植株对干旱的耐性显著降低，预示本发明的基因OsATL17的实施将能创造新型耐干旱植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。

Description

水稻OsATL17基因在调控水稻抗性中的应用

技术领域

本发明植物基因工程技术领域，具体涉及水稻OsATL17基因在调控水稻抗性中的应用。

背景技术

水稻是世界上重要的粮食作物，也是研究单子叶植物功能基因组学的模式植物。在自然生长条件下水稻经常会受到非生物逆境(干旱、低温)和生物逆境(稻瘟菌、白叶枯菌)的危害。

中国由于地形复杂，如四川等地区，造成了灌溉困难。广东、广西、海南地区由于处在单一气团的控制下，很容易造成春旱，而长江中下游、福建、江西等地，由于受到太平洋副热带气团的控制，易造成伏旱现象，而西北地区，由于受夏季风影响甚微，伏旱、秋旱多较为严重。旱灾容易造成水稻生长受到抑制，尤其是水稻孕穗期，如果遭遇干旱，很容易造成空粒，造成严重的减产。因而，选育一些耐干旱的品种就显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于为改良水稻抗性提供一种新选择。

本发明的技术方案是水稻OsATL17基因在调控水稻抗性中的应用。

具体的，所述水稻OsATL17基因的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。

其中，所述调控为正调控。

进一步，所述抗性为抗旱性。

具体的，所述调控为调控水稻脯氨酸含量、可溶性糖含量或/和干旱相关基因的表达水平。

优选的，干旱相关基因OsAP37、OsZIP23、OsPP2C68、OsRAB21和OsERD1。

本发明的有益效果：本发明通过实验验证了水稻OsATL17基因的功能。实验证实本发明的基因OsATL17的沉默植株对干旱的耐性显著降低，预示本发明的基因OsATL17的实施将能创造新型耐干旱植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。这表明了OsATL17正向调控了水稻对干旱逆境的耐性。并进一步研究发现，该调控是通过调节脯氨酸含量、可溶性糖含量和干旱相关基因的表达水平。

附图说明

图1、干旱处理后，OsATL17的表达模式，CK为对照，Drought为干旱。

图2、BMV:OsATL17植株，对干旱的耐性降低。(A)遭受干旱和复水后，BMV:OsATL17沉默植株和对照植株的表型；BMV:00就是指对照植株，也就是该基因没有沉默的植株；BMV：OsATL9指的是该基因沉默的植株；左图是BMV:OsATL17沉默植株和对照植株在没有遭受干旱逆境时，无任何明显差异；右图表示在遭受干旱且复水后，BMV:OsATL17沉默植株与对照植株相比，恢复率下降；即多数植株都死亡了；(B)BMV:OsATL17沉默植株中，OsATL17 基因的沉默效率；(C)干旱逆境下，BMV:OsATL17沉默植株和对照植株的失水率；(D)干旱逆境下，BMV:OsATL17沉默植株和对照植株的存活率。

图3、BMV:OsATL17沉默植株通过调控脯氨酸含量和可溶性糖的含量降低对干旱的耐性。(A)正常(Normal)和干旱(Drought)逆境下，BMV:OsATL17沉默植株和对照植株中脯氨酸的含量；(B)正常和干旱逆境下，BMV:OsATL17沉默植株和对照植株中可溶性糖的含量。

图4、正常(Nor)和干旱(Dro)逆境条件下，BMV:OsATL17和对照植株中，干旱相关基因的表达情况

具体实施方式

下述实施例中用到的主要实验材料与方法：

1、植物材料

所采用的水稻品种为原丰早和IR64，“原丰早”用于干旱逆境处理的表达分析；IR64用于病毒诱导的基因沉默(VIGS)。

2、主要实验试剂

Trizol试剂购买于Thermofisher，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)相关的试剂购买于Takara 公司。其他常规的试剂购买于北京鼎国生物技术有限责任公司。

3、植物种植方法

水稻(Oryza sativa)品种原丰早经过催芽后种植在塑料营养钵(直径8cm，高10cm，每盆播种10株)，置于培养箱中培养。幼苗的生长条件是：28℃，16h光照/8h黑暗。一周龄的水稻幼苗用干旱处理。

水稻品种IR64将水稻种子播种于塑料营养钵中，每钵播种5株，生长温度控制在22～24℃，光周期为14h/10h。待植株生长10～14天时，用于VIGS侵染实验。

4、实施例中用到的引物见表1。

表1实施例中用到的引物

实施例1基因的表达模式分析

干旱胁迫采用三周龄左右的“原丰早”水稻放于空气中自然干燥，干旱处理后0、0.5、1 和2h取样，液氮速冻后于-80℃保存备用。

总RNA的提取采用Trizol的方法，具体操作如下：取叶片在液氮中充分研(研磨要迅速，最好不要超过1分钟)；然后将研磨号的粉末装入离心管中；每使用1mL Trizol加0.2mL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；4℃，10000rpm离心10～15分钟；把水相转移到新管中并加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20～30分钟；4℃，10000rpm离心10分钟，去上清；加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀(每使用1mL至少用1mL 75％乙醇对沉淀进行洗涤)；4℃， 5000rpm离心3分钟，倒出液体；室温放置晾干，根据实验需要，加入30～100μL无RNase 水，溶解RNA。按照Takara反转录试剂盒说明先去除RNA中DNA的污染。然后按照试剂盒说明书进行反转录，获得相应的cDNA。qRT-PCR反应采用SYBR Green I作为反应荧光染料。反应在CFX96TM Real-time System(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)仪器中进行。以水稻Actin基因作为内参基因，检测OsATL17基因的表达量。扩增Actin基因的引物为表1中SEQID No.1和SEQ ID No.2，扩增OsATL17基因的引物为表1中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。扩增体系：Fast Essential DNA Green Master(2×)12.5μL，引物1(10μM)0.5μL，引物2(10 μM)0.5μL，cDNA模板0.5μL，ddH₂O(双蒸水)补足至25μL。扩增程序：反应程序为95℃10 min；95℃20s，60℃20s，72℃延伸20s，进行40个循环。

OsATL17基因的表达受到了干旱逆境的诱导：干旱逆境下，OsATL17基因的表达受到了强烈的诱导。干旱0.5h后，OsATL17基因的表达量显著增加，在干旱1h后达到了最大值，随后稍微有所下降(图1)。

实施例2基因沉默VIGS载体的构建

水稻OsATL17基因的系统座位标识码为Os06g34390(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示，其编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID No.18所示。基因沉默表达载体BMV载体由浙江大学农业与生物技术学院宋凤鸣课题组提供。

采用表1中SEQ ID No.15和SEQ ID No.16为引物，以水稻基因组DNA为模板，扩增OsATL17基因，并将其连接到T/A克隆载体pMD19上。经测序验证正确后，以 pMD19-OsATL17质粒为模板，用特异性引物SEQ ID No.15和SEQ ID No.16进行PCR扩增。 PCR产物经l％琼脂糖胶电泳后，采用DNA Gel Purification Kit(Sangon,Shanghai,China)回收目标条带，用NcoI和AvrⅡ(购于NEB公司)双酶切目标片段和沉默载体BMV，在37℃温浴4h，酶切的体系为：4μL Buffer，1.5μL NcoI，1.5μL AvrⅡ，10μL BMV载体质粒或者目标片段，添加水补充至40μL。酶切后回收BMV载体质粒或者目标片段，16度T4(Takara) 连接酶过夜连接，连接体系为：1μL连接缓冲液，1μL T4连接酶，2μL酶切后回收的BMV 载体质粒，6μL酶切后回收的目标片段。42℃热击转化大肠杆菌JM109(含50mg/L的卡那霉素的LB平板筛选)，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定进行初筛，最终提取质粒进行测序验证，并命名为BMV:OsATL17。经电击法将所述沉默表达载体BMV:OsATL17转入农杆菌。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，选取阳性菌斑，在液体培养基中培养，获得农杆菌菌液，-80℃保存备用。

实施例3VIGS沉默植株的获得

取实施例2获得载体于-80℃保存的菌株，在含有50mg/L Kan的YEP固体养基上28℃划线培养2～3d；挑取单克隆于含抗生素的50ml YEP培养基中，250rpm，28℃培养，使菌液浓度达到OD₅₉₅为1.0，将分别含有BMV:OsATL17和病毒粒子p1300m/RNA1+2(该病毒粒子可帮助携带基因的病毒载体在植物体内的移动，由浙江大学农业与生物技术学院宋凤鸣课题组提供)农杆菌液等体积混合。对照组使用分别含BMV和p1300m/RNA1+2的农杆菌混合液。混合后农杆菌菌液4000rpm离心10min，去上清，并用等体积的诱导缓冲液重悬，28℃培养3h后，添加100μM乙酰丁香酮(AS)，0.4g/L L-半胱氨酸，0.15g/L二巯基苏糖醇(DTT)， 0.75mg/L硝酸银。诱导缓冲液配方：10mM 2-吗啉乙磺酸(MES)，10mM MgCl₂，200μM 乙酰丁香酮(AS)。

将生长两周的幼苗倒置于农杆菌浸入缓冲液中，进行抽真空处理。真空压力为-4000Pa，侵染时间为7min。侵染完后，将缓冲液叶面喷施于幼苗，将幼苗置于24/22℃(白天/黑夜)， 14h光照/10h黑暗的培养箱内培养。

参照实施例1中的方法提取总RNA样品。按照Takara反转录试剂盒说明先去除RNA中DNA的污染。然后按照试剂盒说明书进行反转录，获得相应的cDNA。qRT-PCR反应采用SYBR Green I作为反应荧光染料。反应在CFX96TM Real-time System(Bio-Rad,Hercules,CA, USA)仪器中进行。用qRT-PCR检测基因的沉默效率。以水稻Actin基因作为内参基因，检测OsATL17基因的表达量。扩增Actin基因的引物为表1中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，扩增OsATL17基因的引物为表1中SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。扩增体系：Fast Essential DNAGreen Master(2×)12.5μL，引物1(10μM)0.5μL，引物2(10μM)0.5μL，cDNA模板0.5μL，ddH₂O(双蒸水)补足至25μL。扩增程序：反应程序为95℃10min；95℃20s，60℃20s， 72℃延伸20s，进行40个循环。

结果见图2B。从图中可以看出OsATL17基因在BMV:OsATL17沉默植株中的沉默效率约为62％。

实施例4水稻OsATL17基因在调控水稻抗性中应用

将30天苗龄的沉默植株和对照植株同时转移到同一个容器，容器的一侧种上沉默植株，另一侧则种上对照植株，每侧至少有10个植株，设3次重复。恢复生长10天后停止浇水， 10天后复水，复水后12天统计植株的存活率，生物量，脯氨酸含量和可溶性糖含量等指标。

失水率测定：将三个月大的水稻植株充分吸水过夜，每个株系取三株水稻，每株取5张叶片，失水前称量每张叶片的质量，然后在室温条件下放置2h、4h、7h、10h后分别称重记录，最后将所有叶片在80℃烘箱中过夜烘干；失水率为失水质量占鲜重的百分比。

可溶性糖的测定：水稻叶片可溶性糖选用蒽酮法进行测定。取水稻叶片0.5g，经液氮研磨充分，放于加有10mL无菌水的试管中，沸水浴煮沸20min，静置冷却后离心10min(4000rpm)，取1mL上清液加入含有5mL蒽酮试剂的洁净试管中，沸水浴煮沸10min，静置冷却，取上清在620nm波长处测定吸光值，并根据标准曲线算得可溶性糖数值(X)。水稻中可溶性糖含量(％)＝X×提取液体积(mL)×稀释倍数/[测定用样品液的体积(mL)×样品重量(g)×10⁶]×100。

脯氨酸含量的测定：称取水稻叶片组织0.5g，用液氮研磨至粉末状，然后将其转移到含 5mL 3％的磺基水杨酸溶液向试管中，在沸水浴中煮沸10min(提取过程中注意要经常摇动试管)，冷却后离心10min(4000rpm)，取滤液于干净试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取 2mL提取液于另一干净试管中，向其中加入2mL冰醋酸和2mL 2.5％酸性茚三酮溶液，放入沸水中煮沸30min，溶液逐渐呈现红色。冷却后向其中加入4mL甲苯，摇荡30秒钟，静置10min，取上层溶液与洁净试管中，离心5min(4000rpm)。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520nm波长处测定吸光度值。根据吸光度值从标准曲线中查的脯氨酸数值(X)，根据公式X×提取液总体积(mL)/样品鲜重(g)×测定时所用提取液体积(mL)算得水稻叶片中脯氨酸含量(μg·g^－1Fw)。

BMV:OsATL17沉默植株，与对照植株相比，对干旱的抗性降低：沉默植株和对照植株同时转移到同一个容器，容器的一侧种上沉默植株，另一侧则种上对照植株。恢复生长10天后停止浇水，10天后复水，观察现象。OsATL17确实沉默的植株，与对照植株相比，对干旱的抗性降低。与对照植株相比，BMV:OsATL17沉默植株的失水率增加，存活率下降(图2)，这些都表明OsATL17正向调控对干旱的耐性。

OsATL17沉默调控了脯氨酸和可溶性糖的含量：干旱逆境下，检测BMV:OsATL17沉默植株和对照植株体内的脯氨酸含量和可溶性糖含量。结果显示，干旱条件下，BMV:OsATL17 沉默植株体内的脯氨酸含量(图3A)和可溶性糖含量(图3B)比对照植株显著降低。这表明了OsATL17沉默会降低植株体内脯氨酸含量和可溶性糖含量。

参照实施例1中的方法提取总RNA样品。按照Takara反转录试剂盒说明先去除RNA中 DNA的污染。然后按照试剂盒说明书进行反转录，获得相应的cDNA。qRT-PCR反应采用SYBR Green I作为反应荧光染料。反应在CFX96TM Real-time System(Bio-Rad,Hercules,CA, USA)仪器中进行。

以水稻Actin基因作为内参基因，对已报道的跟植物干旱耐受有关基因OsAP37、OsZIP23、OsPP2C68、OsRAB21和OsERD1的表达量进行检测。扩增Actin的引物为表1中SEQ IDNo.1 和SEQ ID No.2，扩增OsAP37、OsZIP23、OsPP2C68、OsRAB21和OsERD1的引物为表1 中SEQ ID No.5～14。扩增体系：Fast Essential DNA Green Master(2×)12.5μL，引物1(10μM) 0.5μL，引物2(10μM)0.5μL，cDNA模板0.5μL，ddH₂O(双蒸水)补足至25μL。扩增程序：反应程序为95℃10min；95℃20s，60℃20s，72℃延伸20s，进行40个循环。

如图4所示，干旱逆境条件下，BMV:OsATL17沉默植株，与对照植株相比，抑制了干旱相关基因的表达情况。这些都表明了OsATL17沉默降低对干旱逆境的耐性，可能是通过对干旱相关基因表达的调控来实现的。

序列表

<110> 台州学院

<120> 水稻OsATL17基因在调控水稻抗性中的应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagctgcggg tatccatgag a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcaatgccag ggaacatagt g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcggcgat catcaactac 20

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgaccgcaca accacaa 17

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aagtgactcc gactcctcgt c 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttcagatcc agatcgaaag ct 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggagcagcaa aagaatgagg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtcttcagc ttcaccatcc 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcagctccg acaacatct 19

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctgggtgac actctctcta caag 24

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccacggcacc gggatgacc 19

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agcttctcct tgatcttgtc ca 22

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

actgtagtat tacttgatga gata 24

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caatatttga tgtcatgaca at 22

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tatccatggg acgacgacga ccaccacca 29

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atacctaggc caccaccttc ccttgacagc 30

<210> 17

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgtcctcgc cgccgtctga tccgagctcc ggtggtggcg atggcggctc ggccgtgccg 60

gggacggcga gctccaactt cacgctgctg tacatcatca tcgccgtcct cgtcggcgtg 120

atcctgtaca tggcgatccg gtacggccgg tcggtgatgt cggagtggcg ccagctgcag 180

gccggcggcg gcggcggcga gccgcgcgcc gcgctgctcg ggctgagctc ggacgacatc 240

gacgcgctcc ccacgttcac gtaccgggcg cgcggggcgg cggcgtcgcc gctggtcggc 300

ggcggcggga ggaggggcgg cggcagcggc aaggggaagg gggcgacgac ggtggtggtg 360

gagtgcgtgg tgtgcctgca ggagctcgcc gacggcgacg tggtgcgcgt gctgccggcg 420

tgcaggcact tcttccacgg cggctgcatc gacctctggc tgcgcgccca ctccacgtgc 480

ccggtgtgcc gcgcgcaccc ggagcccgac ggcgtgcggc tcagcgacgt cgtggccgtg 540

tcgccgccgc tgccgcagct gcgccggtgc ggcctgtcgc cggagcggcc cacggcggcg 600

tcgcgcgccc tggcggacat cctggcacgt tctccattga ggggcaacac cacctcgacg 660

acgacgacca ccaccaccgg cggaccgatc acgtcgacgt cgtcgaagtc gccgtcgtca 720

ccggttcaag cggcgatcat caactacgtg caggcctcac gttcgccgtc tccgacggcg 780

taccacagcc tgaacgagcg gtggccgagc tcgccgacgc cggttgtggt tgtgcggtcg 840

aagtcgccgt cgccgtcgtc gccaccgata ggtggtctga gtctgcagac gacgacggcg 900

gcggcggcga gaggcgtcgg cgtggtggaa ggggtggatg caggtgcaac cacgtcggcg 960

tcggcgtcgg cgccaacgca ggtggtggcg ctgtcaaggg aaggtggtgg ttcgcggtcc 1020

aagtcgccgt cgccggtgcc acattaa 1047

<210> 18

<211> 348

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Met Ser Ser Pro Pro Ser Asp Pro Ser Ser Gly Gly Gly Asp Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ala Val Pro Gly Thr Ala Ser Ser Asn Phe Thr Leu Leu Tyr Ile

20 25 30

Ile Ile Ala Val Leu Val Gly Val Ile Leu Tyr Met Ala Ile Arg Tyr

35 40 45

Gly Arg Ser Val Met Ser Glu Trp Arg Gln Leu Gln Ala Gly Gly Gly

50 55 60

Gly Gly Glu Pro Arg Ala Ala Leu Leu Gly Leu Ser Ser Asp Asp Ile

65 70 75 80

Asp Ala Leu Pro Thr Phe Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Ala Ala Ala Ser

85 90 95

Pro Leu Val Gly Gly Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser Gly Lys Gly

100 105 110

Lys Gly Ala Thr Thr Val Val Val Glu Cys Val Val Cys Leu Gln Glu

115 120 125

Leu Ala Asp Gly Asp Val Val Arg Val Leu Pro Ala Cys Arg His Phe

130 135 140

Phe His Gly Gly Cys Ile Asp Leu Trp Leu Arg Ala His Ser Thr Cys

145 150 155 160

Pro Val Cys Arg Ala His Pro Glu Pro Asp Gly Val Arg Leu Ser Asp

165 170 175

Val Val Ala Val Ser Pro Pro Leu Pro Gln Leu Arg Arg Cys Gly Leu

180 185 190

Ser Pro Glu Arg Pro Thr Ala Ala Ser Arg Ala Leu Ala Asp Ile Leu

195 200 205

Ala Arg Ser Pro Leu Arg Gly Asn Thr Thr Ser Thr Thr Thr Thr Thr

210 215 220

Thr Thr Gly Gly Pro Ile Thr Ser Thr Ser Ser Lys Ser Pro Ser Ser

225 230 235 240

Pro Val Gln Ala Ala Ile Ile Asn Tyr Val Gln Ala Ser Arg Ser Pro

245 250 255

Ser Pro Thr Ala Tyr His Ser Leu Asn Glu Arg Trp Pro Ser Ser Pro

260 265 270

Thr Pro Val Val Val Val Arg Ser Lys Ser Pro Ser Pro Ser Ser Pro

275 280 285

Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Gln Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Arg

290 295 300

Gly Val Gly Val Val Glu Gly Val Asp Ala Gly Ala Thr Thr Ser Ala

305 310 315 320

Ser Ala Ser Ala Pro Thr Gln Val Val Ala Leu Ser Arg Glu Gly Gly

325 330 335

Gly Ser Arg Ser Lys Ser Pro Ser Pro Val Pro His

340 345

Claims

1.水稻OsATL17基因在调控水稻抗性中的应用；

所述水稻OsATL17基因的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；

所述调控为正调控；

所述抗性为抗旱性。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控为调控水稻脯氨酸含量、可溶性糖含量或/和干旱相关基因的表达水平。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，干旱相关基因OsAP37、OsZIP23、OsPP2C68、OsRAB21和OsERD1。