CN115976010A - 一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶及其制备方法与应用。本发明在聚合酶链式反应体系中掺入可配对的、碱基部分的5号位含炔丙氨基连接臂修饰的人工核苷酸，制备得到部分碱基上含氨基连接臂的核酸片段，先与点击化学接头反应，再分别与5'端含相应基团的引物进行点击化学反应，得到“毛刷”引物，最后以含有目的片段的环状DNA为模板，利用phi29 DNA聚合酶和所得引物进行滚环扩增，即可。本发明方法简易、普适性高，所得水凝胶具有较高稳定性、交联程度可控以及携带遗传信息等优点。由于毛刷引物RCA方法制备水凝胶可在30℃恒温下进行，无需热循环，这为细胞培养和酶的固定化提供了原位成胶的可能载体。

Description

一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

DNA是可编程的生物大分子，作为生命遗传分子引导生物发育和生命机能运作。从材料化学角度，DNA是一种天然的生物高分子，具有合成高分子无法比拟的特点。例如：碱基互补配对特性使DNA具有精准、高效的自组装能力；DNA序列多样可调，结构精准可控，具有丰富的刺激响应性；自然进化赋予生物体丰富多样的生物酶，可在分子水平对DNA进行精准操作；DNA具有良好的生物相容性和生物可降解性。

因为DNA的这些独特之处，近年来科学家们尝试将DNA作为构筑基元合成多种新型生物材料。其中，DNA水凝胶材料蓬勃发展。水凝胶是一类极为亲水的三维网络结构凝胶，与天然组织在物理性能、化学组成和力学方面性能相近，具有良好的生物相容性、可生物降解性和环境刺激响应性，在组织工程、生物传感器等生物医学领域具有广阔的应用前景。随着水凝胶领域研究的深入，更加精准的合成方法、更灵敏的刺激响应性以及更丰富的功能性已经成为新型应用型水凝胶开发过程中的主要研究方向和目标。DNA水凝胶既利用了水凝胶的骨架结构，也保留了DNA的生物功能，实现了水凝胶材料结构与功能的完美融合，在生物传感器、药物递送、细胞培养、蛋白质合成、智能器件、环境保护等领域表现出广泛的应用前景。

目前已经报道了若干制备DNA水凝胶的方法。例如，通过控制酶或pH将预先形成的DNA结构单元(X、Y、T型DNA)与互补的DNA链相互作用结合。也可以通过使用Y形DNA引物的PCR扩增或多引物滚环复制制备DNA水凝胶。但是，这些水凝胶是通过碱基之间的氢键结合而形成的，稳定性低，序列需要特殊的设计，并且很多性质(如疏密程度、机械性能等等)的可控性有限，极大地限制了DNA水凝胶的推广应用。

phi29 DNA聚合酶是来源于枯草芽孢杆菌噬菌体phi29的嗜温(30℃)DNA聚合酶，属于B型DNA聚合酶。2001年phi29 DNA聚合酶首次被用于等温多重引物滚环扩增(RCA)，利用phi29 DNA聚合酶特殊的链置换和连续合成特性，以环状DNA为模板，以短的与部分环状模板互补的DNA为引物，在phi29 DNA聚合酶的催化下，以dNTPs为原料合成单链DNA。该单链DNA产物包含多个串联重复序列的核酸片段，无需常规PCR所需的热循环步骤即可形成。等温多重引物滚环扩增方法具有高速、有效的特点，短时间内即可实现1万倍的扩增，可连续合成长达70kb的DNA片段。同时，phi29 DNA聚合酶具有3’到5’外切酶校正功能，因而错误率比标准的Taq聚合酶低1000倍。使用phi29 DNA聚合酶的多引物滚环扩增还具有能够产生双链产物的优点，使其应用于后续限制性内切酶消化或其他基因克隆、核酸标记和靶标检测的相关方法成为可能。

碱基修饰核酸含有修饰碱基，这些碱基大多是在天然碱基的不同部位进行化学修饰后而形成的衍生物。相比天然核酸，某些碱基修饰核酸具有更高的稳定性和更加完善的性能，在生物工程、纳米技术和医学等领域具有巨大的应用潜力。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法。这是一种利用非天然核酸元件高效制备具有更加优良性质的核酸水凝胶的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制得的非天然核酸水凝胶。

本发明的再一目的在于提供通过上述非天然核酸水凝胶的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

(1)上下游“毛刷”引物的制备：

a.在聚合酶链式反应体系中掺入可配对的、碱基部分的5号位含炔丙氨基连接臂的人工核苷酸，制备得到部分碱基上含氨基连接臂的核酸片段；

b.将步骤a所得核酸片段与点击化学接头反应，在核酸片段部分核苷酸上修饰接头；

c.根据目的片段的序列设计并合成分别与目的环状DNA两条链互补配对的上、下游引物，并将上、下游引物5'端修饰能与接头发生点击化学反应的基团；

d.将步骤b所得部分核苷酸上含接头的核酸片段，分别与步骤c所得5'端含修饰基团的上、下游引物进行点击化学反应，得到上、下游“毛刷”引物；

(2)核酸水凝胶的制备：

以目的环状DNA为模板，利用phi29 DNA聚合酶和步骤(1)所得上游“毛刷”引物或下游“毛刷”引物或依次加入二者，进行滚环扩增(RCA)；扩增产物浓缩后高温退火，即得到所述的非天然核酸水凝胶。

步骤a中所述的聚合酶链式反应体系中的聚合酶可以是Taq聚合酶、OneTaq聚合酶、Q5聚合酶、KOD聚合酶、DeepVent聚合酶或SFM4-3聚合酶中的任意一种；

当所述的聚合酶为SFM4-3时，还可以在聚合酶链式反应体系中掺入可配对的、糖基部分的2号位点上含氟基团修饰的人工核苷酸，制备得到碱基上含氨基修饰同时糖基上含氟基团修饰的核酸片段，再进行后续反应。

当所述的聚合酶为SFM4-3时，还可以在聚合酶链式反应体系中掺入非天然碱基对dTPT3和dNaM，制备得到含非天然碱基对的核酸片段，再进行后续反应。

当所述的聚合酶为SFM4-3时，聚合酶链式反应体系中的核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸混合物，或核糖核苷酸混合物，或脱氧核糖核苷酸/核糖核苷酸混合物，制备得到相应的核酸片段，再进行后续反应。

步骤a中所述的掺入的方式可以是完全替代或部分替代天然核苷酸中的一种或多种，以最终得到的核酸片段中碱基上含氨基连接臂的核酸含量为10％～40％为优。

步骤a中所述的核酸片段中碱基上含氨基连接臂的核酸优选为间隔分布，更优选为等间隔分布，长度优选为50～200bp；更优选为70～100bp；最优选为75bp。

步骤b中所述的点击化学接头可选自NHS-DBCO(二苯基环辛炔-琥珀酰亚胺酯)接头、NHS-TCO(反式环辛烯-琥珀酰亚胺酯)接头；优选为NHS-DBCO接头。

步骤b中所述的核酸片段与点击化学接头的配比优选为摩尔比1:1000～1500；更优选为1:1000。

步骤b中所述的反应的条件优选为温度35～40℃、时间10～15h，更优选为温度37℃、时间12h。

步骤b中所述的反应优选在pH＝8.4～8.6的PBS缓冲液体系中进行。

步骤c中所述的能与接头发生点击化学反应的基团优选为叠氮基团。

步骤d中所述的核酸片段与上游引物或下游引物的配比优选为摩尔比优选为8～12:1；更优选为10:1。

步骤d中所述的反应的体系中还含有NaCl、Tween20；更优选组成如下：0.8～1.2mol/LNaCl、0.04～0.06％Tween20、2～4μmol/L核酸片段、20～40μmol/L 5端上游引物或下游引物；最优选组成如下：1mol/L NaCl、0.05％Tween20、3.3μmol/L核酸片段、33μmol/L 5端上游引物或下游引物。

步骤d中所述的反应的条件优选为温度45～55℃、时间10～15h，更优选为温度50℃、时间12h。

步骤d中所述的反应优选在pH＝7.3～7.5的PBS缓冲液体系中进行。

步骤(2)中所述的滚环扩增的具体操作优选如下：

在1×phi29DNA聚合酶缓冲液中加入3～5μmol/L步骤(1)所得上游“毛刷”引物或下游“毛刷”引物将其退火到模板上，然后加入0.4～0.6mmol/L dNTPs、0.02～0.03mg/mLBSA(牛血清白蛋白)和0.2～0.3U/μL phi29DNA聚合酶，30℃孵育10～15h；更优选为：在phi29DNA聚合酶缓冲液中加入4μmol/L步骤(1)所得上游“毛刷”引物或下游“毛刷”引物将其退火到模板上，然后加入0.5mmol/L dNTPs、0.025mg/mL BSA和0.25U/μL phi29DNA聚合酶，30℃孵育12h。

所述的退火的条件优选为95℃加热5min，逐渐冷却至室温(20～30℃)后于冰上放置5min。

步骤(2)中所述的浓缩的条件优选如下：5000～7000rpm转速下离心25～35min；更优选如下：6000rpm转速下离心30min。

步骤(2)中所述的高温退火的操作优选如下：在95℃加热5min后逐渐冷却至室温。

步骤(2)中所述的目的环状DNA长度优选为0～5000bp，更优选为100～3000bp。

一种非天然核酸水凝胶，通过上述方法制备得到。

上述非天然核酸水凝胶在生物医学领域中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明探究了一种简易、普适性高的核酸水凝胶制作方法。

2.本发明通过酶法合成碱基上有修饰的核酸，提供了共价结合位点，通过引入共价键解决了DNA水凝胶稳定性低的问题。

3.该方法引入共价键位点密度和分布可精确控制，从而可控制水凝胶的交联程度。

4.该方法具有稳定性较高、交联程度可控以及携带遗传信息等优点，在此基础上增加了DNA水凝胶的潜在应用。

5.该方法制备水凝胶可在30℃恒温下进行，无需热循环，这为细胞培养和酶的固定化提供了可以原位成胶的载体。

附图说明

图1为本发明毛刷引物的制作流程示意图。

图2为实施例1毛刷引物制备电泳图，泳道1为含有胞嘧啶核苷酸的碱基连接炔丙氨基的PCR产物；泳道2为PCR产物偶联NHS-DBCO产物；泳道3为连有NHS-DBCO的核酸与5’端叠氮修饰的引物反应产物。

图3为本发明新型核酸水凝胶的制作流程示意图。

图4为实施例3毛刷引物RCA制备水凝胶电泳图，泳道1为毛刷上游引物RCA产物；泳道2为毛刷下游引物再次RCA产物。

图5为实施例3毛刷引物RCA制备水凝胶形貌表征，其中，图a)为水凝胶照片；图b)为Cyber gold核酸染料染色后在紫外灯下的照片；图c)为水凝胶荧光显微镜观察结果图；图d)为扫描电镜观察结果图。

图6为实施例5保真度测试的9个样品测序结果图。

图7为实施例5核酸上的炔丙氨基疏密度可控性验证图，其中，图a)为验证的流程示意图；图b)为含有不同密度炔丙氨基的PCR产物与NHS-FAM反应后的电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

下述实施例中涉及的材料或试剂：

Cyber Gold购自：百萤生物科技有限公司，型号为TJ702；

SFM4-3聚合酶、SF-WT聚合酶：已在文献“Chen T,Hongdilokkul N,Liu Z,etal.Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition andamplification of C2-modified DNA[J].Nature Chemistry,2016.”中公开；

Q5 DNA聚合酶购自：New England Biolabs，型号为M0491S；

Deep Vent聚合酶购自：New England Biolabs，型号为M0258S；

OneTaq聚合酶购自：New England Biolabs，型号为M0480L；

Taq聚合酶购自：New England Biolabs，型号为M0267S；

5-propargylamino-dCTP购自：芜湖华仁科技有限公司，型号为HR-00104022；

2’-fluoro-dCTP购自：芜湖华仁科技有限公司，型号为HR-00104018；

2’-fluoro-dUTP购自：芜湖华仁科技有限公司，型号为HR-00104020；

2’-methoxy-GTP购自：芜湖华仁科技有限公司，型号为HR-00104003；

dNTP套装购自：New England Biolabs，型号为N0446S；

rNTP套装购自：New England Biolabs，型号为N0450S；

dTPT3-biotin、dNaM：已在文献“Li L,Degardin M,Lavergne T,et al.Natural-like Replication of an Unnatural Base Pair for the Expansion of the GeneticAlphabet and Biotechnology Applications[J].Journal of the American ChemicalSociety,2014,136(3):826-829.”中公开；

链霉亲和素购自：New England Biolabs，型号为N7021S；

1×SF聚合酶缓冲液配方：50mmol/L Tris·HCl(pH 8.5)，50mmol/LKCl，6.5mmol/LMgCl₂；

NHS-DBCO购自：广州亿涛生物科技有限公司，型号为bcd6；

phi29DNA聚合酶购自：New England Biolabs，型号为M0269S；

磷酸氢二钠购自：上海泰坦科技股份有限公司，型号为G81291A；

磷酸二氢钠购自：上海泰坦科技股份有限公司，型号为81292C；

吐温20(Tween20)购自：上海泰坦科技股份有限公司，型号为G89190B；

NHS-FAM购自：上海拓旸生物科技有限公司，型号为HY-15938；

1×binding and washing buffer配方：10mmol/L Tris·HCl(pH7.4)，1mol/LNaCl，0.1％Tween20，1mmol/L EDTA；

下述实施例中涉及的序列均委托上海生物工程股份有限公司合成。

实施例1毛刷引物的制备

表1序列名称和序列

(1)获得含修饰碱基的DNA：

在1×Q5聚合酶缓冲液中加入模板T75(4nmol/L，75bp，表1)、上游引物T75-F(0.3μmol/L，表1)、下游引物T75-R(0.3μmol/L，表1)，天然的dGTP、dTTP、dATP和含修饰的5-propargylamino-dCTP各0.2mmol/L，20U/ml Q5聚合酶，进行PCR反应(反应条件：98℃2min；98℃10s、70℃30s、72℃1min，循环20次；72℃5min)，获得碱基含修饰的5-propargylamino-dCTP的PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化。

(2)制作“毛刷引物”：

制作方法如图1所示。在1×PBS(pH 8.5)缓冲液中加入1μmol/L步骤(1)得到的碱基含修饰的5-propargylamino-dCTP的PCR产物和1mmol/L NHS-DBCO，在37℃孵育12h后，用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证是否反应。将反应产物用30kDa的Amicon过滤器在6000rpm转速下加入1×PBS(pH7.4)离心洗涤6次，每次15min。

在1×PBS(pH 7.4)缓冲液中加入1mol/L NaCl、0.05％Tween20、3.3μmol/L与NHS-DBCO反应后的PCR产物、5端有叠氮修饰的上游引物N₃-F(33μmol/L，表1)和5端有叠氮修饰的下游引物N₃-R(33μmol/L，表1)在50℃孵育12h后，用6％PAGE胶进行凝胶电泳验证是否反应。将反应产物用30kDa的Amicon过滤器在6000rpm转速下加入1×PBS(pH7.4)离心6次，每次15min。如图2所示，含有炔丙氨基修饰的核酸与NHS-DBCO反应后，条带整体上移且条带单一，表明核酸上的氨基完全偶联NHS-DBCO；在与5’端修饰叠氮的引物反应后，条带再次大幅度上移，说明DBCO与叠氮Click反应成功，使核酸链连接上了多条引物，形成了毛刷引物。

实施例2新型核酸水凝胶的制备

在1×phi29DNA聚合酶缓冲液中加入毛刷上游引物(4μmol/L)，将其退火到pUC57质粒(0.4μmol/L)上(反应条件：95℃，5min，逐渐冷却至室温后于冰上放置5min)。退火后加入dNTPs(0.5mmol/L)、BSA(0.025mg/mL)和phi29DNA聚合酶(0.25U/μL)，30℃孵育12h。制备流程如图3所示。用1％琼脂糖进行凝胶电泳验证是否有堵在孔里的大分子。若想获得双链的DNA水凝胶，则将毛刷上游引物RCA产物与毛刷下游引物再进行一轮RCA。如图4所示，M为DNAMarker；泳道1为毛刷上游引物RCA产物；泳道2为毛刷下游引物以泳道1的产物为模板再次RCA产物。

所得RCA产物用30kDa的Amicon过滤器在6000rpm转速下离心30min，在95℃加热5min后逐渐冷却至室温形成水凝胶。

实施例3非天然核酸水凝胶的表征

1)通过照片表征形貌，如图5a)所示，这种方式制备的水凝胶呈现溶胀性，用核酸染料Cyber gold染色，如图5b)所示，在紫外下具有明显荧光团。

2)用荧光显微镜表征形貌，取10μL核酸交联形成的大分子絮状液，滴加在载玻片上，取1μL Cyber Gold核酸染料与之混匀，静置15min，盖上盖玻片，将荧光显微镜调到绿光通道进行观察拍摄，如图5c)所示，呈交联絮状。

3)用扫描电子显微镜表征形貌，取5μL核酸交联形成的大分子絮状液，滴加在玻璃片上，用冷冻真空干燥机将其干燥。在干燥后的样品表面喷金，即可用扫描电镜观察拍摄。观察其内部的精细结构，如图5d)所示。

实施例4不同修饰核苷酸的扩增效率研究

表2序列名称和序列

注：X为dNaM

1)不同聚合酶对带修饰核酸的PCR制备：

①用SFM4-3聚合酶

在1×SF聚合酶缓冲液中加入模板T75(4nmol/L，表2)、上游引物T75-F(0.5μmol/L，表2)、下游引物T75-R(0.5μmol/L，表2)，天然的dGTP、dTTP、dATP和含修饰的5-propargylamino-dCTP各0.4mmol/L，0.1％BSA以及400nmol/L SFM4-3聚合酶，进行PCR反应(反应条件：94℃2min；94℃30s、50℃1min、55℃2min，循环15次；55℃5min)。用6％PAGE胶进行凝胶电泳。

②用Q5DNA聚合酶

在1×Q5聚合酶缓冲液中加入模板T75(4nmol/L，表2)、上游引物T75-F(0.3μmol/L，表2)、下游引物T75-R(0.3μmol/L，表2)，天然的dGTP、dTTP、dATP和含修饰的5-propargylamino-dCTP各0.2mmol/L，20U/mL Q5DNA聚合酶，进行PCR反应(反应条件：98℃2min；98℃10s、70℃30s、72℃1min，循环20次；72℃5min)。用6％PAGE胶进行凝胶电泳。

③用OneTaqDNA聚合酶

在1×OneTaq聚合酶缓冲液中加入模板T75(4nmol/L，表2)、上游引物T75-F(0.2μmol/L，表2)、下游引物T75-R(0.2μmol/L，表2)，天然的dGTP、dTTP、dATP和含修饰的5-propargylamino-dCTP各0.2mmol/L，50U/mL OneTaqDNA聚合酶，进行PCR反应(反应条件：94℃2min；94℃30s、66℃1min、68℃1min，循环30次；68℃5min)。用6％PAGE胶进行凝胶电泳。

④用TaqDNA聚合酶

在1×Thermopol反应缓冲液中加入模板T75(2nmol/L，表2)、上游引物T75-F(0.2μmol/L，表2)、下游引物T75-R(0.2μmol/L，表2)，天然的dGTP、dTTP、dATP和含修饰的5-propargylamino-dCTP各0.2mmol/L，25U/mL Taq聚合酶，进行PCR反应(反应条件：95℃2min；95℃30s、54℃1min、68℃1min，循环30次；68℃5min)。用6％PAGE胶进行凝胶电泳。

实验结果表明，以上四种聚合酶PCR产物均有明显条带，表明定向进化的聚合酶及天然聚合酶均能将5-propargylamino-dCTP整合到核酸产物中，获得含有炔丙氨基修饰的核酸。

2)通过SFM4-3聚合酶PCR同时掺入有碱基修饰(5-propargylamino-dCTP)和糖基修饰(2’-fluoro-dUTP)的核苷酸：

方法同上SFM4-3聚合酶PCR条件，将dTTP替换成2’-fluoro-dUTP。结果显示，SFM4-3可通过PCR同时整合碱基上修饰和糖基上修饰的核苷酸。

3)通过SFM4-3聚合酶PCR同时掺入有碱基修饰核苷酸(5-propargylamino-dCTP)和非天然碱基对(dTPT3/dNaM)：

在1×OneTaq聚合酶缓冲液中加入模板TC6(16nmol/L，表2)，上游引物TC6-F(2.5μmol/L，表2)，下游引物TC6-R(2.5μmol/L，表2)，天然的dGTP、dTTP、dATP和含修饰的5-propargylamino-dCTP各0.3mmol/L，MgSO₄(1.2mmol/L)，dTPT3-biotin(15μmol/L)，dNaM(0.1mmol/L)，Deep Vent聚合酶(2.42U/mL)，SFM4-3聚合酶(140nmol/L)，进行PCR反应(反应条件：94℃2min；94℃30s、50℃1min、55℃4min，循环15次；55℃10min)。

掺入的dTPT3带有生物素(biotin)标记，生物素能与链霉亲和素结合，可检验PCR产物中是否含有非天然碱基对(dTPT3/dNaM)，而修饰的氨基能与生物素-N-琥珀酰亚胺基酯(NHS-biotin)反应继而与链霉亲和素结合。PCR产物分别与链霉亲和素、NHS-biotin反应：

①将PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化后加入链霉亲和素(0.1mg/mL)37℃孵育2h；

②将PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化后在1×PBS(pH 8.5)缓冲液中加入5.6mmol/LNHS-biotin，37℃孵育12h后再次用DNA纯化试剂盒纯化；

③将上一步与NHS-biotin反应并纯化后所得产物与链霉亲和素(0.1mg/mL)在37℃孵育2h；

④用6％PAGE胶进行凝胶电泳。结果显示SFM4-3可通过PCR同时整合碱基上带修饰的核苷酸和非天然碱基对。

4)通过SFM4-3聚合酶PCR同时掺入有糖基修饰核苷酸(2’-fluoro-dCTP)和非天然碱基对(dTPT3TP/dNaMTP)：

在1×Taq聚合酶缓冲液中加入模板TC6(16nmol/L，表2)，上游引物TC6-F(2.5μmol/L，表2)，下游引物TC6-R(2.5μmol/L，表2)，天然的dGTP、dTTP、dATP和含修饰的2’-fluoro-dCTP各0.5mmol/L，MgSO₄(2mmol/L)，MnCl₂(0.1mmol/L)，dTPT3^BioTP(0.1mmol/L)，dNaMTP(0.1mmol/L)，Deep Vent聚合酶(2.42U/mL)，SFM4-3聚合酶(280nmol/L)，进行PCR反应(反应条件：94℃2min；94℃30s、50℃1min、55℃1h，循环15次；55℃1h)。

掺入的dTPT3带有生物素标记，生物素能与链霉亲和素结合，可检验PCR产物中是否含有非天然碱基对(dTPT3/dNaM)。将PCR产物用DNA纯化试剂盒纯化后加入链霉亲和素(0.1mg/mL)37℃孵育2h后，用6％PAGE胶进行凝胶电泳。结果显示SFM4-3可通过PCR同时整合糖基上带修饰的核苷酸和非天然碱基对。

5)通过SFM4-3聚合酶PCR同时掺入核糖和脱氧核糖核苷酸：

在1×SF聚合酶缓冲液中加入模板T75(20nmol/L，表2)，上游引物T75-F(2μmol/L，表2)，下游引物T75-R(2μmol/L，表2)，天然的dTTP、GTP、ATP和含修饰的5-propargylamino-dCTP各1mmol/L，TritonX-100(0.1％)，BSA(0.1％)，MgCl₂(2mmol/L)，SFM4-3聚合酶(400nmol/L)或者等浓度的SF-WT野生型聚合酶，进行PCR反应(反应条件：94℃2min；94℃30s、49℃1min、50℃1h，循环15次；50℃2h)。用6％PAGE胶进行凝胶电泳。结果显示SFM4-3能通过PCR合成脱氧和非脱氧核苷酸杂合的核酸链，而野生型聚合酶SF-WT不能。SFM4-3可为合成杂合水凝胶骨架提供条件。

实施例5利用Q5聚合酶PCR精确控制氨基修饰的疏密度

表3序列名称和序列

1)利用Q5聚合酶PCR检测5-propargylamino-dCTP的保真度

①对5-propargylamino-DNA进行PCR。PCR体系(终浓度)：dATP，dGTP，dTTP，5-propargylamino-dCTP各0.2mmol/L，Q5聚合酶20U/ml，1×Q5聚合酶缓冲液，Biotin-T75(4nmol/L，表3)，上游引物T75-F(0.3μmol/L，表3)，下游引物T75-R(0.3μmol/L，表3)。利用该体系进行PCR反应(反应条件：98℃2min；98℃10s、70℃30s、72℃1min，循环20次；72℃5min)。PCR产物(5-propargylamino-DNA)纯化后用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，用Cyber gold染色。

②对5-propargylamino-DNA进行PCR的保真度检测

A.将Biotin-T75模板去除：取15μL的链霉亲和素磁珠，用5×binding andwashing buffer洗涤三次，1×binding and washing buffer洗涤一次后，加入纯化后的PCR产物，37℃摇床2h，在磁力架上静至30min后，吸取上清液进行纯化。

B.将纯化后的5-propargylamino-DNA产物用dNTPs进行PCR扩增，PCR体系的模板为纯化后的5-propargylamino-DNA产物，dNTPs 0.2mmol/L，Q5聚合酶20U/mL，1×Q5聚合酶缓冲液，上游引物T75-CL-F(0.5μmol/L，表3)，下游引物T75-CL-R(0.5μmol/L，表3)。

C.克隆测序：PCR产物经EcoRI和HindIII酶切后插入同样酶切的pUC19质粒中。将酶连产物化学转化入大肠杆菌XL1-Blue细胞，在含氨苄青霉素的琼脂板上接种，37℃过夜。挑选单菌落进行PCR，将阳性克隆送至测序，测序结果与原始T75模板进行比较，观察是否有突变情况。结果如图6所示，共测9个样品，中间29个碱基(方框)都没有突变。

2)修饰基团位点可控性验证

将含有不同疏密度dCTP/dGTP的核酸作为模板，模板中相邻两个dCTP或dGTP之间间隔3、5和10个碱基的序列(T3、T5和T10)，以5-propargylamino-dCTP替代dCTP作为底物，用Q5DNA聚合酶通过PCR获取含有不同密度5-propargylamino-dCTP的核酸，将含有炔丙氨基的核酸与过量的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(NHS-FAM)反应。由于碱基上修饰的氨基能与NHS偶联，核酸上修饰的氨基密度不同则连接NHS-FAM的密度不同，从而核酸呈现的荧光强度也有差异，具体方法为：以dCTP或dGTP间隔3、5和10个碱基的序列作为模板(T3、T5和T10)进行PCR。在1×Q5 DNA聚合酶缓冲液和1×Q5 High GC Enhancer中加入T3、T5和T10(各5.5nM，表3)、天然的dGTP、dTTP、dATP和含修饰的5-propargylamino-dCTP各0.2mmol/L、上下游引物T-F和T-R(各0.5μmol/L，表3)、Q5DNA聚合酶(20U/mL)。设置PCR扩增的程序：94℃2min；94℃10s、70℃30s、72℃1min，20个循环；72℃5min。将三种模板的PCR产物纯化后，在1×PBS(pH 8.5)中，分别加入等浓度的三种纯化产物(1μmol/L)和过量的NHS-FAM(200μmol/L)，在37℃下反应12h(设置三个平行对照组)。用6％Native PAGE胶进行凝胶电泳。根据荧光强度即可判断氨基的疏密度，验证Q5DNA聚合酶对5-propargylamino-dCTP的保真度。方法如图7a)所示。与NHS-FAM反应后的结果如图7b)所示，三组平行实验的核酸条带的荧光强度从高到低依次为：T3为模板的偶联产物、T5为模板的偶联产物、T10为模板的偶联产物。说明结合NHS-FAM的含量依次减少，核酸中的氨基密度依次降低，这与模板的dCTP/dGTP密度一致，证实了Q5 DNA聚合酶对炔丙氨基修饰的核酸的保真度高，能通过Q5 DNA聚合酶PCR合成炔丙氨基疏密度可控的非天然核酸。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>  华南理工大学

<120>  一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶及其制备方法与应用

<160>  15

<170>  SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T75

<400> 1

ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 60

ataaagtgta aagcc 75

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T75-F

<400> 2

ctgtttcctg tgtgaaattg ttat 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T75-R

<400> 3

tggctttaca ctttatgctt ccg 23

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> N3-F

<400> 4

aatattattg aagcatttat cagggt 26

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> N3-R

<400> 5

ttttgccttc ctgtttttgc tc 22

<210> 6

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TC6

<220>

<223> 第39和40位核苷酸之间含有非天然核苷酸dNaM

<400> 6

cacacaggaa acagctatga cgaattcagt gtggagagag tagttaaaca ggaaacaggg 60

atcgggcgga gaagcttcct atagtgagtc gtattaattt c 101

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TC6-F

<400> 7

cacacaggaa acagctatga cgaattc 27

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> TC6-R

<400> 8

gaaattaata cgactcacta taggaagctt 30

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T75-CL-F

<400> 9

atgatcatga attcctgttt cctgtgtgaa attgttat 38

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T75-CL-R

<400> 10

atagaattaa gcttgctcgt atgttgtgtg ga 32

<210> 11

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T3

<400> 11

aacgatcttg ccattgctac catcttgatc tagatctagt tcttgaacat gtactagttc 60

atgtacaagt actagatcta gatcatgtac atgtactaga acatgttcta gaacaagttc 120

atgatctagt tctagtactt gatcatgatc aagatcaagt tctagaactt gttctggttc 180

atggttatgg cagcacggta 200

<210> 12

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T5

<400> 12

aacgatcttg ccattgctac catcttgata tcatatgtta tctttagtat acattagtta 60

acataagatt actaatgatt acttatgatt acataagaaa acattagata tcaaaagtta 120

actaatgaat tcttatgtat ccttttggta acaattgatt tcaattgata tctatggttc 180

atggttatgg cagcacggta 200

<210> 13

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T10

<400> 13

aacgatcttg ccattgctac catcttgatt taaattgtat attttagtat aaattagtta 60

atttaagttt ataaatgatt aatttagttt aaataagtat taatatgtta taaaaagata 120

tttatagaat taaatagtaa tattttgtat aatattgaat taaattgaat attatggttc 180

atggttatgg cagcacggta 200

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T-F

<400> 14

aacgatcttg ccattgctac catct 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> T-R

<400> 15

taccgtgctg ccataaccat gaacc 25

Claims (10)

1.一种基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)上下游“毛刷”引物的制备：

a.在聚合酶链式反应体系中掺入可配对的、碱基部分的5号位含炔丙氨基连接臂的人工核苷酸，制备得到部分碱基上含氨基连接臂的核酸片段；

b.将步骤a所得核酸片段与点击化学接头反应，在核酸片段部分核苷酸上修饰接头；

c.根据目的片段的序列设计并合成分别与目的环状DNA两条链互补配对的上、下游引物，并将上、下游引物5'端修饰能与接头发生点击化学反应的基团；

d.将步骤b所得部分核苷酸上含接头的核酸片段，分别与步骤c所得5'端含修饰基团的上、下游引物进行点击化学反应，得到上、下游“毛刷”引物；

(2)核酸水凝胶的制备：

以目的环状DNA为模板，利用phi29 DNA聚合酶和步骤(1)所得上游“毛刷”引物或下游“毛刷”引物或依次加入二者，进行滚环扩增；扩增产物浓缩后高温退火，即得到所述的非天然核酸水凝胶。

2.根据权利要求1所述的基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的滚环扩增的具体操作如下：在1×phi29DNA聚合酶缓冲液中加入3～5μmol/L步骤(1)所得上游“毛刷”引物或下游“毛刷”引物将其退火到模板上，然后加入0.4～0.6mmol/L dNTPs、0.02～0.03mg/mL牛血清白蛋白和0.2～0.3U/μL phi29DNA聚合酶，30℃孵育10～15h；

所述的退火的条件为95℃加热5min，逐渐冷却至室温后于冰上放置5min；

步骤(2)中所述的浓缩的条件如下：5000～7000rpm转速下离心25～35min；

步骤(2)中所述的高温退火的操作如下：在95℃加热5min后逐渐冷却至室温。

3.根据权利要求1所述的基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的目的环状DNA长度为0～5000bp，进一步为100～3000bp。

4.根据权利要求1-3任一项所述的基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，其特征在于：

步骤a中所述的聚合酶链式反应体系中的聚合酶为Taq聚合酶、OneTaq聚合酶、Q5聚合酶、KOD聚合酶、DeepVent聚合酶或SFM4-3聚合酶中的任意一种。

5.根据权利要求4所述的基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，其特征在于：

当所述的聚合酶为SFM4-3时，在聚合酶链式反应体系中掺入可配对的、糖基部分的2号位点上含氟基团修饰的人工核苷酸，制备得到碱基上含氨基修饰同时糖基上含氟基团修饰的核酸片段，再进行后续反应；

和/或，在聚合酶链式反应体系中掺入非天然碱基dTPT3和dNaM，制备得到含非天然碱基对的核酸片段，再进行后续反应；

聚合酶链式反应体系中的核苷酸是脱氧核糖核苷酸混合物，或核糖核苷酸混合物，或脱氧核糖核苷酸/核糖核苷酸混合物。

6.根据权利要求1-3任一项所述的基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，其特征在于：

步骤a中所述的掺入的方式是完全替代或部分替代天然核苷酸中的一种或多种，最终得到的核酸片段中碱基上含氨基连接臂的核酸含量为10％～40％；

步骤a中所述的核酸片段中碱基上含氨基连接臂的核酸为间隔分布，长度为50～200bp。

7.根据权利要求1-3任一项所述的基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，其特征在于：

步骤b中所述的点击化学接头选自NHS-DBCO接头、NHS-TCO接头；

步骤b中所述的核酸片段与点击化学接头的配比为摩尔比1:1000～1500；

步骤b中所述的反应的条件为温度35～40℃、时间10～15h；

步骤b中所述的反应在pH＝8.4～8.6的PBS缓冲液体系中进行；

步骤c中所述的能与接头发生点击化学反应的基团为叠氮基团。

8.根据权利要求1-3任一项所述的基于非天然核酸元件滚环扩增技术的水凝胶的制备方法，其特征在于：

步骤d中所述的核酸片段与上游引物或下游引物的配比为摩尔比8～12:1；

步骤d中所述的反应的体系中还含有NaCl、Tween20；组成如下：0.8～1.2mol/L NaCl、0.04～0.06％Tween20、2～4μmol/L核酸片段、20～40μmol/L 5端上游引物或下游引物；

步骤d中所述的反应的条件为温度45～55℃、时间10～15h；

步骤d中所述的反应在pH＝7.3～7.5的PBS缓冲液体系中进行。

9.一种非天然核酸水凝胶，其特征在于：通过权利要求1-8任一项所述的方法制备得到。

10.权利要求9所述的非天然核酸水凝胶在生物医学领域中的应用。

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