CN109295187B

CN109295187B - 一种基于纳米孔对非天然核酸直接测序的错位测序方法

Info

Publication number: CN109295187B
Application number: CN201811284679.6A
Authority: CN
Inventors: 于涵洋; 黄硕; 李欣彤; 阎双红
Original assignee: Nanjing University
Current assignee: Nanjing University
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2038-10-31
Also published as: CN109295187A

Abstract

本发明公开了一种基于纳米孔对非天然核酸直接测序的错位测序方法，包括以下步骤：(1)通过固相合成非天然核酸待测序链，通过酶促连接的方法，将非天然核酸待测序链与DNA引导测序链连接起来，作为完整的待测序链；(2)制备具有单分子分辨能力的纳米传感孔道；(3)将待测序链和DNA引物混合，变性退火构建测序文库，然后与核酸聚合酶一起加入纳米孔的cis室，在电场力作用下核酸链通过纳米孔，读取核酸链过孔时产生的电信号，解析信号得到序列。相对于现有技术，本发明利用低成本的、高效的纳米孔测序方法，首次对连续非天然核酸链实现直接测序。

Description

一种基于纳米孔对非天然核酸直接测序的错位测序方法

技术领域

本发明涉及一种基于纳米孔对非天然核酸直接测序的错位测序方法，属于非天然核酸测序技术领域。

背景技术

非天然核酸是指带有化学修饰的核酸类似物。FANA (2’-deoxy-2’-fluoroarabinonucleic acid，2’-氟代阿拉伯糖核酸)属于一类非天然核酸。与天然核酸相比，FANA的抗酸降解以及抗酶降解能力都更为优越，因为和RNA具有强亲和性，FANA被广泛应用于基因治疗领域。Masad J.Damha团队在2006年报道过反义PS-FANA-DNA嵌合体在活细胞中有较好的抗降解性能。同年，他们比较了FANA修饰的siRNA和天然siRNA分子的基因沉默效率，结果发现含有FANA的siRNA在触发 RNA干扰通路和序列特异性选择上都有更好的性能。另外，关于FANA酶，FANA纳米结构和FANA适配体的报道也陆续出现。

传统的测序方法是用四种不同颜色的荧光基团标记不同的dNTPs(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)，在聚合酶催化发生引物延伸反应的同时，对不同颜色荧光信号的监测来识别模板链的序列。目前应用于传统测序的聚合酶都无法识别FANA底物，所以无法用传统方法对FANA进行直接测序。但是，可以通过间接手段对其测序，采用的方法为先将FANA逆转录为DNA，再对DNA模板进行测序。其中最为关键的步骤是找到一种对FANA底物具有活性的逆转录酶，在此方面，Philipp Holliger等人在2012年报道了对FANA具有催化活性的非天然聚合酶D4K和RT521K，它们都是经过对天然聚合酶 Tgo的变体TgoT再次人工改造而得到的。这些聚合酶可以FANA为模板，接受dNTPs (deoxy-ribonucleoside triphosphates)底物，合成新的DNA链。然而，用这种间接的测序方法有一个缺陷：因为酶催化的核酸聚合反应都存在一定的错误率，所以这种间接测序方法的错误率不仅仅来源于DNA测序过程的错误，实际上还包括FANA逆转录为DNA 和DNA扩增两步反应错误率的叠加，这些因素都会对最终序列的确定造成干扰，因此，本研究致力于寻找一种可以直接对FANA测序的技术。

纳米孔测序技术是一种可以在单分子水平上实现读取长链的测序方法，凭借成本低、速度快、无需扩增、样品免标记等优点，成为最有潜力的“第三代测序技术”。经典的纳米孔测序装置为一个充满电解质溶液的腔体，一层绝缘薄膜将此腔体分为两个小室(cis室和trans室)，由于电泳力的作用，内含纳米尺度通道的某种膜蛋白会插入薄膜中，成为两个小室离子通过的唯一通道。在测序条件下，DNA的磷酸糖环骨架带负电，在外加电场的驱动下会通过纳米孔，此时通过纳米孔的离子数量会减少，相应的电流值会降低。因为每种脱氧核苷酸的结构、电荷密度等不相同，所以它们引起的电流变化也不同，通过对不同电信号的采集，可以获得DNA的序列信息。

但是，目前纳米孔测序技术多应用于天然核酸，尚没有一种可以对连续的非天然核酸链测序的方法。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种基于纳米孔对非天然核酸直接测序的错位测序方法。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种基于纳米孔对非天然核酸直接测序的错位测序方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备待测序非天然核酸，通过固相合成非天然核酸待测序链，通过酶促连接的方法，将待测序的非天然核酸链和DNA引导测序链连接起来，形成完整的待测序链；

(2)制备具有单分子分辨能力的纳米传感孔道；

(3)将待测序链和DNA引物，变性，退火，然后与核酸聚合酶一起加入纳米孔的cis室，实施电压，读取信号，解析信号得出序列。

所述非天然核酸不限于2’-氟代阿拉伯糖核酸(FANA)，也可以应用到其他非天然核酸测序，如：苏糖核酸(TNA)、锁核酸(LNA)等。

所述具有单分子分辨能力的纳米传感孔道可以是蛋白纳米孔，如：Mycobacteriumsmegmatis porin A(MspA)，α-hemolysin，aerolysin等，或DNA纳米孔。

所述非天然核酸的序列长度为大于14个。

步骤(1)所述制备待测序链的方法包括以下步骤：

(1)利用DNA合成仪，合成一条非天然核酸序列作为待测序链的5’部分，合成一条5’端带有磷酸修饰的DNA序列作为待测序链的3’部分。

(2)利用T4 DNA连接酶，在一条能够起到桥梁作用的DNA互补链的辅助下，将上述5’端磷酸修饰的DNA序列与非天然核酸序列连接起来。

步骤(2)所述制备具有单分子分辨能力的纳米传感孔道为MspA，其制备方法包括以下步骤：

(1)将编码MspA基因的质粒转化进入大肠杆菌进行MspA蛋白表达，镍柱层析法纯化；

(2)在电泳力的作用下，将MspA纳米孔插入到在Teflon装置中自组装形成的磷脂双分子层中，磷脂双分子层将Teflon装置隔成两个充满缓冲液的分离室，分别为cis室和trans室，在cis端上加负极，在trans端上加正极，即得MspA 纳米孔测序体系。

优选：

步骤(3)所述实施电压为180mV。

步骤(3)所述核酸聚合酶为具有聚合功能的蛋白质马达蛋白，如：phi29DNA聚合酶。

由于现有的聚合酶对FANA等非天然核酸的活性太低，无法使用。如对FANA有活性的RT521K等，工作温度较高，纳米孔测序系统无法满足。纳米孔测序系统要求在常温工作，温度高，噪音大，会对信号分析造成障碍。所以本发明设计了错位测序的方法，其本质是利用聚合酶的活性中心与纳米孔信号识别位点在空间上有一定的高度差，约为2.1nm，例如，当DNA与FANA的连接处到达聚合酶活性中心时，会有一定长度的FANA碱基通过纳米孔的信号识别位点，通过这个过程，可以对一定长度的非天然核酸直接测序。

技术效果：相对于现有技术，本发明利用低成本的、高效的纳米孔测序方法，首次对连续非天然核酸链测序。

附图说明

图1为FANAx制备，其中：a.T4 DNA连接酶介导的51nt FANA/DNA嵌合体和 46nt磷酸修饰DNA连接。b.变性凝胶电泳分析连接反应产物；

图2为RT521K和phi29DNAP介导的FANAx逆转录反应，其中：1和2是分别是RT521K组在室温和65℃下反应产物，3和4是phi29DNAP组在室温和30℃下的反应产物；

图3为FANA三种单碱基聚合物测序，其中：a.FANA单体结构。b.FANA三种单碱基聚合物测序方法示意图。c.FANA三种单碱基聚合物堵孔电流信号值。d.FANA三种单碱基聚合物多次堵孔电流信号值统计分析；

图4为FANAx纳米孔测序，其中：a.测序过程示意图。b.FANAx模板和逆转录引物杂交示意图。c.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析phi29DNAP介导的FANAx体外逆转录产物。d.FANAx测序信号。e.多次FANAx测序信号统计；

图5为FANA30测序，其中：a.测序模板和逆转录引物杂交示意图。b.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析phi29DNAP介导的FANA30逆转录反应产物。c.DNA30测序信号。 d.FANA30测序信号。e.FANA30测序信号与DNA30测序信号差值统计；

图6为Phi29DNAP对FANA模板逆转录活性酶动力学研究，其中：a.测序模板和逆转录引物杂交示意图。b.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析phi29DNAP介导的FANA42 逆转录反应产物。c.FANA42测序信号。d.FANA42测序信号分析。e.phi29DNAP结合到FANA/DNA连接处之后的过孔信号值。f.phi29DNAP结合到FANA/DNA连接处之后，发生的合成外切过程分析。g.phi29DNAP结合到FANA/DNA连接处之后,总体趋势向合成方向进行。

图7为FANA，TNA和LNA的化学结构。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。

实施例1：前期验证

验证性内容主要包括：

(1)合成三种3’端生物素标记的FANA的A，C和U聚合物单链(表1，FANA polyA，FANApolyC，FANA polyU)，用来静态模拟单种FANA碱基的堵孔信号，结果如附图3所示。

(2)合成一条带有无碱基位点单体的FANA/DNA嵌合体(FANAx)，验证FANA 测序可行性，包括体外逆转录实验和测序信号的读取，结果如附图4所示。

具体的设计过程：

1.设计待测序的FANA单链。

a.3’端生物素标记的三种FANA的A，C和U单链，用来静态模拟单种FANA 碱基的堵孔信号，结果如附图3所示。

b.3’端生物素标记的四种FANA单体组合序列，模拟不同FANA组合过孔时信号。

c.3’端是DNA单体，5’端是FANA单体组成的DNA/FANA序列，作为待测序链，结果如附图4所示。

2.通过化学合成的方法得到FANA单体，包括四种核苷亚磷酸酰胺(FANAnucleoside phosphoramidites)，作为固相合成的底物。

3.利用DNA合成仪，化学合成FANA单链，包括3’端生物素标记的四种碱基的单一聚合物单链，和带有无碱基位点的FANA单链。

4.分析FANA体外逆转录的可行性。

a.以模块化的FANA链为模板，外源添加荧光修饰的DNA引物，在非天然核酸聚合酶RT521K或天然核酸聚合酶phi29的作用下，进行体外逆转录反应。

b.利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析每个逆转录反应产物的长度。

5.MspA单分子测序孔道的制备。

6.将3’端带有生物素修饰的FANA polyA、FANA polyC、FANA polyU三条FANA 链进行验证性的序列分辨实验，初步证明纳米孔对于FANA分子具有序列识别功能。

7.使用具有链置换活性的DNA聚合酶作为分子马达的纳米孔测序方法，进行不同序列的FANA链的纳米孔测序实验。

详细的制备及操作过程如下：

(1)三条3’端带有生物素修饰的FANA polyA、FANA polyC、FANA polyU链合成。

a.称量0.5g DNA nucleoside phosphoramidites和0.5g FANA nucleosidephosphoramidites溶于5ml乙腈中，称量6mg 3’端生物素固相载体，装入合成柱子，利用ABI349DNA自动合成仪合成。反应结束后，将载体转移到1.5ml EP管中，向载体中加入300μl浓氨水，55℃水浴下，反应16h，将混合物在12000rpm转速下离心2min，上清液转移至另一个1.5ml EP管中，加入30μl浓度为3M，pH＝5.3的NaOAc水溶液，涡流振荡器混合均匀后，再加入1ml无水乙醇，涡流振荡混合均匀后，放入-80℃冰箱，冷冻1h后取出，12000rpm离心2min，弃上清。

b.向a)步骤中的沉淀中加入200μl 6X TBE 8M尿素溶液，振荡溶解，用12％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，20W运行2h，切胶回收，将切下来的胶条放入0.5M NaCl溶液中，80℃浸泡2h，用C18层析柱除去多余盐分，离心浓缩收集样品。

(2)FANAx合成。

FANAx由T4 DNA连接酶介导，在桥梁DNA互补序列辅助下，将一段FANA/DNA 嵌合体和一段磷酸修饰的DNA连接起来，FANA/DNA嵌合体是按照(1)a步骤所述方法合成，磷酸修饰DNA来自公司订购，反应体系50μl，含有FANA/DNA嵌合体5μM，磷酸修饰DNA 25μM，互补链25μM，T4 DNA连接酶40U/μl，震荡混匀后，25℃孵育2h，向反应产物中加入10μl 6X TBE 8M尿素溶液，震荡混匀，90℃孵育5min，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，切胶回收，C18柱子除盐，离心浓缩收集样品。

(3)RT521K和phi29DNAP介导的FANAx逆转录实验。

总反应体系为20μl，包含10nM引物(表1，Cy5.5primer)，50nM模板(表1， FANAx)，50μM dNTPs和1X ThermoPol buffer[20mM Tris-HCl,10mM(NH₄)₂SO₄,10 mM KCl,2mMMgSO₄,0.1％Triton X-100,pH 8.8)或者1X phi29DNAP反应缓冲液[50 mM Tris-HCl,10mMMgCl₂,10mM(NH₄)₂SO₄,4mM DTT,pH 7.5)。反应体系在94℃下孵育4min，在冰上降温15min后，加入2μl RT521K(1mg/ml)或者phi29(10U/μl)，分别在30℃，65℃和室温下避光延伸1h。加入10μl 6X TBE 8M尿素溶液中止反应， 90℃孵育5min，12％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析反应产物，100W下运行2.5h。

(4)MspA单分子测序孔道的制备

a.MspA蛋白表达。将1μl编码C端带有His标签的MspA蛋白基因的质粒 (100ng/μl)转化进入100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，旋涂到卡那霉素LB培养基平板上，37℃过夜培养，挑选单克隆扩大培养，体积为1L， 100mM IPTG诱导表达，超声破碎后取上清，镍柱层析法纯化，SDS-PAGE 分析洗脱产物。

b.MspA纳米孔测序体系制备。在电泳力的作用下，将MspA纳米孔插入到在 Teflon装置中形成的直径约为100μm磷脂双分子层中，成分为磷酸胆碱。磷脂双分子层将Teflon装置隔成两个充满缓冲液的分离室，分别为cis室和 trans室，在两端上加上Ag/AgCl电极对，电流流通后，电流信息通过膜片钳装置被放大，并记录下来。

(5)测序实验

a.FANA polyA、FANA polyU、FANA polyC测序。将三种FANA polymer加入到cis室，终浓度为20nM，两端实施电压为100mV 900ms；-50mV 100ms 和0mV 100ms，循环1000次。

b.Phi29DNAP介导的测序。经过退火的测序模板(FANAx)5nM，引物(表1， primer)和锁链(表1，blocker)，1mM dNTPs和5nM phi29DNAP被加入cis 室，实施电压为180mV。

本发明验证方法基于三种FANA的A，C和U聚合物单链的测序，静态模拟单种 FANA碱基的堵孔信号实验，设计了生物素和链霉亲和素相互作用，链霉亲和素堵在 MspA纳米孔上部，使FANA碱基部分固定在孔中，实现堵孔电流信号读取，除了A， C和U，此方法还可以应用于G和T的静态模拟实验。

基于带有无碱基位点单体的FANA/DNA嵌合体，和随机序列FANA/DNA嵌合体，本发明利用T4 DNA连接酶将一段FANA/DNA嵌合体和一段5’端磷酸修饰的DNA连接起来，这个方法可以制备较长单链，比一次性合成一条较长的单链反应物产量高。

基于FANAx的测序，在FANA碱基前面加上一个无碱基位点，当无碱基位点走到纳米孔信号采集位点时，会产生一个很高的电信号值，在这个特征信号之后出现的信号就为FANA信号，无碱基位点起到一个特征标识作用。

实施例2：测序实例

验证性内容主要包括：

(1)合成一条随机序列FANA/DNA嵌合体(FANA30)，对比DNA和FANA测序信号差别，包括体外逆转录实验和测序信号的读取，结果如附图5所示。

(2)合成一条模块化的FANA/DNA嵌合体(FANA42)，研究phi29DNAP作为

FANA逆转录酶的活性动力学，包括体外逆转录实验和测序信号的读取，结果如附图6所示。

具体的设计过程：

1.设计两条3’端是DNA单体，5’端是FANA单体的DNA/FANA嵌合体序列，

a.FANA30链中间有30个随机序列的FANA单体。

b.FANA42链中，5’端为42个模块化序列的FANA单体。

2.利用DNA合成仪，化学合成FANA单链，包括FANA42和FANA30中5’端的 40个碱基序列。利用酶促连接的方法，制备FANA30链。

3.分析逆转录的可能性。

a.以模块化的FANA30和FANA42为模板，外源添加荧光修饰的DNA引物，在非天然核酸聚合酶RT521K或天然核酸聚合酶phi29的作用下，进行体外逆转录反应。

4.MspA单分子测序孔道的制备。

5.使用具有链置换活性的DNA聚合酶作为分子马达的纳米孔测序方法，进行不同序列的FANA链的纳米孔测序实验。

详细的制备及操作过程如下：

(1)FANA30和FANA42合成。

a.FANA42是按照实施例1，(1)a步骤所述方法合成。

b.FANA30是按照实施例1，(2)步骤所述方法合成FANA与DNA连接的待测序链。

(2)RT521K和phi29DNAP介导的FANA30和FANA42逆转录实验，操作步骤与实施例1，(3)所述步骤相同。

(3)MspA纳米孔制备，制备方法与实施例1，(4)所述方法相同。

(4)测序实验，操作步骤与实施例1，(5)b所述步骤相同。

基于FANA30的测序，通过比较相同序列DNA和FANA碱基过孔信号的平台差异，证实了FANA和DNA在本发明中的测序方法下，有明显的不同，实现了对FANA直接测序。

基于FANA42在phi29DNAP介导下逆转录酶活性动力学研究中，通过对长时间电信号的追踪，发现phi29DNAP对FANA模板的延伸是一个“合成”，“外切”交替进行的过程，并且总的趋势是向“合成”趋势进行，证实了phi29DNAP对FANA模板具有一定的逆转录活性。

生物素标记的FANA的A，C和U聚合物单链，FANAx，FANA30和FANA42可以合成不同序列或不同长度，不局限于表1中所列的序列。

表1本发明中所用到的序列

注：下划线部分为FANA，X为无碱基位点，其他为DNA。

序列表

<110> 南京大学

<120> 一种基于纳米孔对非天然核酸直接测序的错位测序方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> FANA(FANA)

<400> 1

gccgtccctc tgtccgccgt ccctctgtcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 50

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> FANA(FANA)

<400> 2

gccgtccctc tgtccgccgt ccctctgtcc cccccccccc cccccccccc 50

<210> 3

<211> 50

<212> DNA/RNA

<213> FANA(FANA)

<400> 3

gccgtccctc tgtccgccgt ccctctgtcc uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu 50

<210> 4

<211> 96

<212> DNA/RNA

<213> FANA(FANA)

<400> 4

aaaaaacgtc agaauguuag aauguuagaa uguuagaaug uuagaatgtt agaatgtttc 60

agatctcact atcgcattct catgcaggtc gtagcc 96

<210> 5

<211> 96

<212> DNA/RNA

<213> FANA(FANA)

<400> 5

aaaaaacguc agaauguuag aauguuagaa uguuagaaug uuagaatgtt agaatgtttc 60

agatctcact atcgcattct catgcaggtc gtagcc 96

<210> 6

<211> 86

<212> DNA/RNA

<213> FANA(FANA)

<400> 6

aaaaaacgtc uguuacaugc aagcuuggcg uaaucauguu agaatgtttc agatctcact 60

atcgcattct catgcaggtc gtagcc 86

<210> 7

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaaaacgtc tgttacatgc aagcttggcg taatcatgtt agaatgtttc agatctcact 60

atcgcattct catgcaggtc gtagcc 86

<210> 8

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgtacgcct acggttttcc gtaggcgtac gcggctacga cctgcatgag aatgc 55

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatagtgaga tctgatttcc caaatttaaa 30

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggctacgacc tgcatgagaa tgc 23

Claims

1.一种基于纳米孔对非天然核酸直接测序的错位测序方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)制备具有单分子分辨能力的纳米传感孔道；

2.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述非天然核酸为2’-氟代阿拉伯糖核酸(FANA)，苏糖核酸(TNA)、或锁核酸(LNA)。

3.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述具有单分子分辨能力的纳米传感孔道为蛋白纳米孔或DNA纳米孔。

4.根据权利要求3所述的测序方法，其特征在于，所述蛋白纳米孔为Mycobacteriumsmegmatis porin A(MspA)，α-hemolysin或aerolysin。

5.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述非天然核酸的序列长度为大于14个。

6.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，步骤(1)所述制备待测序链的方法包括以下步骤：

(1)利用DNA合成仪，合成一条非天然核酸序列作为待测序链的5’部分，合成一条5’端带有磷酸修饰的DNA序列作为待测序链的3’部分；

7.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，步骤(2)所述具有单分子分辨能力的纳米传感孔道为MspA，其制备方法包括以下步骤：

(2)在电泳力的作用下，将MspA纳米孔插入到在Teflon装置中自组装形成的磷脂双分子层中，磷脂双分子层将Teflon装置隔成两个充满缓冲液的分离室，分别为cis室和trans室，在cis端上加负极，在trans端上加正极，即得MspA纳米孔测序体系。

8.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，步骤(3)所述实施电压为180mV。

9.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，步骤(3)所述核酸聚合酶为具有聚合功能的蛋白质马达蛋白。

10.根据权利要求9所述的测序方法，其特征在于，所述蛋白质马达蛋白为DNA聚合酶。