CN110564812B - 一种用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶及其制备方法，步骤：用环状DNA模板一，制备RCA产物1；用环状DNA模板二制备RCA产物2；将RCA产物1与骨髓间充质干细胞进行混合，共孵育；将RCA产物2加入，震荡，得到用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。本发明的水凝胶，对干细胞有良好的特异性，是捕获细胞并进行3D细胞培养的重要平台，通过合理的序列设计，亦可以用于其他细胞的特异性捕获。并且该方法操作过程温和，对细胞无明显损伤，在肿瘤共培养模型的构建，组织工程，干细胞分化和器官再生方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用双滚环扩增技术合成DNA水凝胶，并用于捕获细胞的技术及其制备方法。
背景技术
目前，从血液或组织中捕获和培养特定的细胞类型在生物学以及医学研究中得到广泛关注。比如从血液中捕获循环肿瘤细胞用于癌症的临床前期诊断，特异性捕获干细胞并进行3D培养以用于组织工程修复。在捕获细胞后，通常有两种去向，一种是实现细胞的分离，另一种是进行特定细胞的富集培养，在细胞递送和组织工程方面有较好的应用前景。2018年，Wang等人开发了一种新的近红外光辅助氧化石墨烯水凝胶微载体系统，发现NIR响应性GO水凝胶微载体可以防止细胞被免疫系统攻击并促进免疫活性小鼠中肿瘤模型的形成。所以，在体外对细胞进行捕获和3D培养时，选择合适的支架材料至关重要。
水凝胶是一种具有多孔结构和高含水量的高度交联的三维网络，在保证细胞正常代谢活动的同时，给细胞提供了类似于细胞外基质的环境。目前在3D细胞培养方面得到广泛研究的是生物相容性较好的多肽类水凝胶和聚合物水凝胶。而DNA作为一种具有可操控性和序列可设计性的生物材料，可以通过序列设计实现细胞的特异性捕获，使其在3D细胞培养领域具有良好的应用前景。2012年，Luo等人合成由树枝状DNA(包括X-，Y-和T-DNA)组成的DNA水凝胶，成功地实现了对哺乳动物活细胞的原位包封，并能够保持较好的细胞活性。2017年，Yuan等人利用适配体特异性捕获和富集骨髓间充质干细胞，并实现软骨和成骨分化，达到修复膝关节损伤的目的。RCA滚环扩增是合成DNA水凝胶的方式之一，是以环状DNA为模板进行的恒温核酸扩增反应，最后形成周期性重复的DNA片段，通过对DNA序列的灵活设计，可以实现不同的功能应用，比如2012年，Zhao等人通过滚环扩增技术得到3D DNA网络，该3D DNA网络中的多个重复粘附适配体可以用于高效率的捕获分离细胞。
DNA水凝胶结合了DNA和水凝胶的优势，是体外捕获细胞并进行3D细胞培养的重要材料，在现有研究的基础上，以滚环扩增技术为基础，通过合理的序列设计以实现特异性捕获细胞并进行3D细胞培养，这对于体外细胞研究以及组织工程发展具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。
本发明的第二个目的是提供一种用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
a.按比例，将3×10-3～1×10-2nmol的环状DNA模板一，3～8U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.05～0.1nmol的dNTPs，终浓度40～80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μL；于200～450rpm转速下震荡1～15h，得到RCA产物1；
b.按比例，将3×10-3～1×10-2nmol的环状DNA模板二，3～8U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.05～0.1nmol的dNTPs，终浓度40～80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μL；于200～450rpm转速下震荡1～15h，得到RCA产物2；
c.将所述RCA产物1与5×103～20×103个骨髓间充质干细胞进行混合，在37℃，含5％CO2的培养箱中共孵育20～60min；
d.将所述RCA产物2加入c得到的混合体系中，于200～450rpm转速下震荡20～60min。
环状DNA模板一用如下步骤制成：
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1，所述ssDNA-1的碱基数为70～150，设计ssDNA-1的引物1，所述引物1的碱基数为9～30，引物1的3’端和5’端分别与ssDNA-1的5’端和3’端互补配对；
b.将所述5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1和引物1按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度40～80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-1；
c.向200ng的b步骤得到的产物中加入3U的T4 DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应3～8h，得到环状DNA模板一；
环状DNA模板二用如下步骤制成：
d.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2，所述ssDNA-2的碱基数为70～150，设计ssDNA-2的引物2，所述引物2的碱基数为9～30，引物2的3’端和5’端分别与ssDNA-2的5’端和3’端互补配对；
e.将所述ssDNA-2和引物2按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度40～80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-2；
f.向200ng的e步骤得到的产物中加入3U的T4 DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应3～8h，得到环状DNA模板二。
线性ssDNA-1和ssDNA-2序列是部分互补；ssDNA-1含有能够与骨髓间充质干细胞的Apt19S序列互补的序列，所述Apt19S的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
上述方法制备的用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。
本发明的优点：
本发明的用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶，对干细胞有良好的特异性，是捕获细胞并进行3D细胞培养的重要平台，通过合理的序列设计，亦可以用于其他细胞的特异性捕获。并且该方法操作过程温和，对细胞无明显损伤，在肿瘤共培养模型的构建，组织工程，干细胞分化和器官再生方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为验证合成环状DNA模板一(实施例1制备)和环状DNA模板二(实施例4制备)的电泳图。
图2为用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶(实施例7制备)的照片。
图3为用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的细胞毒性图。
图4为骨髓间充质干细胞在用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶中三维培养的共聚焦荧光显微镜照片。
具体实施方式
骨髓间充质干细胞来源于昆明小鼠。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
实施例1
环状DNA模板一制备方法，包括如下步骤：
设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1和5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2，设计ssDNA-1的引物1和ssDNA-2的引物2，引物1的3’端和5’端分别与ssDNA-1的5’端和3’端互补配对；引物2的3’端和5’端分别与ssDNA-2的5’端和3’端互补配对；
两段部分互补的5’端经过磷酸化修饰的线性ssDNA-1和ssDNA-2和相应引物primer-1和primer-2的具体序列见表1。
表1.脱氧核糖核酸序列
环状DNA模板一的制备：
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1，所述ssDNA-1的碱基数为92，设计ssDNA-1的引物1，引物1的碱基数为22，引物1的3’端和5’端分别与ssDNA-1的5’端和3’端互补配对；ssDNA-1中含有适配体Apt19S的序列。
ssDNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，见表1。
引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，见表1。
适配体Apt19S的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，见表1。
b.将5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1、引物1分别1000rpm离心10min，加入灭菌水溶解至ssDNA-1、引物1终浓度分别为100μmol/L的溶液，在恒温震荡混匀仪中30℃，1000rpm条件下振荡3h；将所述ssDNA-1和引物1按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度80mmol/L的NaCl水溶液，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-1；
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列退火程序：
c.向200ng的c步骤得到的产物中加入3U的T4 DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应8h，得到环状DNA模板一(图1中的circ-DNA-1)。
实施例2
环状DNA模板一的制备：
两段部分互补的5’端经过磷酸化修饰的线性ssDNA-1和ssDNA-2和相应引物primer-1和primer-2的具体序列见表2。
表2.脱氧核糖核酸序列
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1，所述ssDNA-1的碱基数为70，设计ssDNA-1的引物1，引物1的碱基数为9，引物1的3’端和5’端分别与ssDNA-1的5’端和3’端互补配对；ssDNA-1中含有适配体Apt19S的序列。
ssDNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，见表2。
引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，见表2。
适配体Apt19S的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，见表1。
b.将5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1、引物1分别1000rpm离心10min，加入灭菌水溶解至ssDNA-1、引物1终浓度分别为100μmol/L的溶液，在恒温震荡混匀仪中30℃，1000rpm条件下振荡3h；将所述ssDNA-1和引物1按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度40mmol/L的NaCl水溶液，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-1；
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列退火程序：
c向200ng的b步骤得到的产物中加入3U的T4 DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应3h，得到环状DNA模板一；
实施例3
环状DNA模板一的制备，包括如下步骤：
两段部分互补的5’端经过磷酸化修饰的线性ssDNA-1和ssDNA-2和相应引物primer-1和primer-2的具体序列见表3。
表3.脱氧核糖核酸序列
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1，所述ssDNA-1的碱基数为150，设计ssDNA-1的引物1，引物1的碱基数为30，引物1的3’端和5’端分别与ssDNA-1的5’端和3’端互补配对；ssDNA-1中含有适配体Apt19S的序列。
ssDNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，见表3。
引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，见表3。
适配体Apt19S的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，见表1。
b.将5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1、引物1分别1000rpm离心10min，加入灭菌水溶解至ssDNA-1、引物1终浓度分别为100μmol/L的溶液，在恒温震荡混匀仪中30℃，1000rpm条件下振荡3h；将所述ssDNA-1和引物1按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度80mmol/L的NaCl水溶液，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-1；
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列退火程序：
c.向200ng的b步骤得到的产物中加入3U的T4 DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应8h，得到环状DNA模板一；
实施例4
环状DNA模板二的制备方法，包括如下步骤：
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2，所述ssDNA-2的碱基数为92，设计ssDNA-2的引物2，引物2的碱基数为22，引物2的3’端和5’端分别与ssDNA-2的5’端和3’端互补配对；
ssDNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，见表1。
引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，见表1。
b.将5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2、引物2分别1000rpm离心10min，加入灭菌水溶解至ssDNA-2、引物2终浓度分别为100μmol/L的溶液，在恒温震荡混匀仪中30℃，1000rpm条件下振荡3h；将所述ssDNA-2和引物2按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度80mmol/L的NaCl水溶液，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-2；
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列退火程序：
c.向200ng的b步骤得到的产物中加入3U的T4 DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应8h，得到环状DNA模板二(图1中的circ-DNA-2)。
实施例5
环状DNA模板二的制备方法，包括如下步骤：
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2，所述ssDNA-2的碱基数为70，设计ssDNA-2的引物2，引物2的碱基数为9，引物2的3’端和5’端分别与ssDNA-2的5’端和3’端互补配对
ssDNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，见表2。
引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，见表2。
b.将5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2、引物2分别1000rpm离心10min，加入灭菌水溶解至ssDNA-2、引物2终浓度分别为100μmol/L的溶液，在恒温震荡混匀仪中30℃，1000rpm条件下振荡3h；将所述ssDNA-2和引物2按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度40mmol/L的NaCl水溶液，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-2；
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列退火程序：
c向200ng的b步骤得到的产物中加入3U的T4 DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应3h，得到环状DNA模板二；
实施例6
环状DNA模板二的制备：
a.设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2，所述ssDNA-2的碱基数为150，设计ssDNA-2的引物2，引物2的碱基数为30，引物2的3’端和5’端分别与ssDNA-2的5’端和3’端互补配对；
ssDNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，见表3。
引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，见表3。
b.将5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2、引物2分别1000rpm离心10min，加入灭菌水溶解至ssDNA-2、引物2终浓度分别为100μmol/L的溶液，在恒温震荡混匀仪中30℃，1000rpm条件下振荡3h；将所述ssDNA-2和引物2按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度80mmol/L的NaCl水溶液，用无菌水补齐至20μL，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-2；
将混合后的液体置于PCR仪中进行下列退火程序：
c.向200ng的b步骤得到的产物中加入3U的T4 DNA连接酶，终浓度1×T4 buffer，22℃下恒温反应8h，得到环状DNA模板二；
实施例7
一种用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
a.将5×10-3nmol的环状DNA模板一(实施例1制备)，5U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.1nmol的dNTPs，终浓度80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μL；于450rpm转速下震荡6h，得到RCA产物1；
b.将5×10-3nmol的环状DNA模板二(实施例4制备)，5U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.1nmol的dNTPs，终浓度80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μL；于450rpm转速下震荡6h，得到RCA产物2；
c.将所述RCA产物1与10×103个骨髓间充质干细胞进行混合，在37℃，含5％CO2的培养箱中共孵育30min；
d.将所述RCA产物2加入c得到的混合体系中，于400rpm转速下震荡20min，得到用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶，见图2，图4。
实施例8
一种用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
a.将3×10-3nmol的环状DNA模板一(实施例2制备)，3U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.05nmol的dNTPs，终浓度40mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μL；于450rpm转速下震荡15h，得到RCA产物1；
b.将3×10-3nmol的环状DNA模板二(实施例5制备)，3U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.05nmol的dNTPs，终浓度40mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μL；于450rpm转速下震荡15h，得到RCA产物2；
c.将所述RCA产物1与5×103个骨髓间充质干细胞进行混合，在37℃，含5％CO2的培养箱中共孵育60min；
d.将所述RCA产物2加入c得到的混合体系中，于450rpm转速下震荡60min，得到用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。
实施例9
一种用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
a.将1×10-2nmol的环状DNA模板一(实施例3制备)，8U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.1nmol的dNTPs，终浓度80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μL；于200rpm转速下震荡1h，得到RCA产物1；
b.将1×10-2nmol的环状DNA模板二(实施例6制备)，8U的phi 29 DNA聚合酶，终浓度1×phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2×BSA，0.1nmol的dNTPs，终浓度80mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100μL；于200rpm转速下震荡1h，得到RCA产物2；
c.将所述RCA产物1与20×103个骨髓间充质干细胞进行混合，在37℃，含5％CO2的培养箱中共孵育20min；
d.将所述RCA产物2加入c得到的混合体系中，于200rpm转速下震荡20min，得到用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。
实施例10
细胞毒性实验，包括以下步骤：
a.将22.2mg用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶(实施例7制备)浸入1mL细胞培养液中得到胶的浸提液，浓度设为100％。
b.在96孔板的每个孔中加入1×104个骨髓间充质干细胞(MSCs)，分别加入细胞培养液稀释的浓度为0，20％，40％，60％，80％，100％胶的浸提液，将加样完成后的96孔板在CO2培养箱中37℃下培养24h。
c.吸去上清，加入90ml细胞培养液，再加入10mLMTT溶液，在CO2培养箱中37℃下继续培养4h。吸去上清，每孔加入100μLFormazan溶解液，震荡10min。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。计算各个样品孔细胞相对活力。实验结果见图3。从图3所示的实验结果可知，用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶没有细胞毒性，实施例8、9的实验结果与实施例7相似。
序列表
<110> 天津大学
<120> 一种用于捕获细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶及其制备方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtttgatg ttcctaaagt acctccagtc tactcctccc cctgaatcct gacccaaata 60
ctggatacgc acgagcatag agggattggc tg 92
<210> 2
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagccaatcc ctctatgctc gagtactcgt cgaagcaatc gaaccatata cataatgccg 60
cgatcacttt atgctctagg aacatcaaac ga 92
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taggaacatc aaacgacagc ca 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tggctgtcgt ttgatgttcc ta 22
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccagtctac tcctccccct gaatcctgac ccaaatactg gatacgcac 49
<210> 6
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgtttagta cctccagtct actcctcccc ctgaatcctg acccaaatac tggatacgca 60
caaggatctg 70
<210> 7
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacatccttg agtactcgtc gaagcaatcg aaccatatac ataatgccgc gatcacttgg 60
tactgtacga 70
<210> 8
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaacgacag 9
<210> 9
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgtcgtac 9
<210> 10
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcgtttgatg ttcctatgca caagtacctg actgtcctga tgctagaaat gcttccagtc 60
tactcctccc cctgaatcct gacccaaata ctggatacgc acgagcatag agggattgcc 120
tgatgattga ctgcctatga tgtctggctg 150
<210> 11
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagccaatgc ctctatgctt aatcataggc agtcaatcat caggcaatcc ctctatgctc 60
tgtactgact gcattgacga ctgaaactgg aatcccgtac tagttccata gcatttctag 120
catcaggaca gtcaggtact tagcaaacga 150
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtgcatagga acatcaaacg acagccagac 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
taagcataga ggcattggct gtgctttgct 30
Claims (2)
1.一种用于捕获骨髓间充质干细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
a．按比例，将3×10-3~ 1×10-2 nmol的环状DNA模板一，3 ~ 8 U的phi 29 DNA聚合酶，
终浓度1× phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2 × BSA，0.05 ~ 0.1 nmol的dNTPs，终浓度
40 ~ 80 mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100 
L；于200 ~ 450 rpm 转速下震荡1 ~ 15
h，得到滚环扩增产物1；
b. 按比例，将3×10-3~ 1×10-2 nmol的环状DNA模板二，3 ~ 8 U的phi 29 DNA聚合酶，
终浓度1× phi 29 DNA聚合酶缓冲液，终浓度2 × BSA，0.05 ~ 0.1 nmol的dNTPs，终浓度
40 ~ 80 mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至100 
L；于200 ~ 450 rpm 转速下震荡1 ~ 15
h，得到滚环扩增产物2；
c. 将所述滚环扩增产物1与5×103~ 20×103个骨髓间充质干细胞进行混合，在37℃，含5% CO2的培养箱中共孵育20 ~ 60 min；
d. 将所述滚环扩增产物2加入步骤c得到的混合体系中，于200 ~ 450 rpm转速下震荡20 ~ 60 min；
所述环状DNA模板一用如下步骤制成：
A. 设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1，所述ssDNA-1的碱基数为70~ 150，设计ssDNA-1的引物1，所述引物1的碱基数为9 ~ 30，引物1的3’端和5’端分别与ssDNA-1的5’端和3’端互补配对；
B. 将所述5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-1和引物1按照摩尔比为1:1的比例混合，加入
终浓度40 ~ 80 mmol/L的NaCl，用无菌水补齐至20 
L，按照退火程序合成末端有缺口的
环状DNA-1；
C. 向200 ng的B步骤得到的产物中加入3U的T4 DNA连接酶，终浓度1 × T4 buffer，反应，得到环状DNA模板一；
所述环状DNA模板二用如下步骤制成：
D. 设计合成5’端经过磷酸化修饰的ssDNA-2，所述ssDNA-2的碱基数为70~ 150，设计ssDNA-2的引物2，所述引物2的碱基数为9 ~ 30，引物2的3’端和5’端分别与ssDNA-2的5’端和3’端互补配对；
E. 将所述ssDNA-2和引物2按照摩尔比为1:1的比例混合，加入终浓度40 ~ 80 mmol/L
的NaCl，用无菌水补齐至20 
L，按照退火程序合成末端有缺口的环状DNA-2；
F. 向200 ng的E步骤得到的产物中加入3 U的T4 DNA连接酶，终浓度1 × T4 buffer，反应，得到环状DNA模板二；
所述线性ssDNA-1和ssDNA-2序列是部分互补；ssDNA-1含有能够与骨髓间充质干细胞的Apt19S序列互补的序列，所述Apt19S的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述退火程序为：95 ℃2 min；65℃2 min，60 ℃ 5 min 30 s，每30 s降温0.5 ℃，进行80次循环；20 ℃ 30 s，4 ℃10 min。
2.权利要求1的方法制备的用于捕获骨髓间充质干细胞的双滚环扩增脱氧核糖核酸水凝胶。
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| A pure DNA hydrogel with stable catalytic ability produced by one-step rolling circle amplification;Yishun Huang等;《Chemical Communications》;20170217;第53卷;第3038-3041页 * |
| A rapidly self-assembling soft-brush DNA hydrogel based on RCA products;Huan Song等;《Chemical Communications》;20190412;第55卷;第5375-5378页 * |
| DNA Hydrogel with Tunable pH-Responsive Properties Produced by Rolling Circle Amplification;Wanlin Xu等;《Chemistry-A European Journal》;20171025;第23卷;第18276–18281页 * |
| DNA水凝胶的制备及生物应用;宋萍等;《化学进展》;20160524;第28卷(第5期);第628-636页 * |
| 基于超分支滚环扩增技术的DNA水凝胶的制备及性能研究;赫庆坤等;《胶体与聚合物》;20180915;第36卷(第3期);第137-140页 * |
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