CN112439369B - Dna正四面体-滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法 - Google Patents

Dna正四面体-滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明建立了一种DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法。该方法将快速自组装成的DNA正四面体（TDN）和滚环扩增（RCA）产物相结合，仅需10min即可获得双交联水凝胶，解决了RCA技术制备DNA水凝胶耗时长的问题。同时，TDN的双链结构大大增强了水凝胶网络的机械强度，并为染料、药物等包埋物的高效搭载提供嵌合位点。此外，双交联水凝胶微观上具有由纳米花密集交联形成的蜂巢状结构，其致密度与纳米花的粒径大小可通过TDN浓度和RCA反应时间进行调节，实现了微观形貌可控。本发明实现了快速制备具有包埋物搭载高效、形貌可控、通用性强等优点的TDN‑RCA产物双交联水凝胶，在分子检测、药物装载与递送等方面，具有非常好的应用前景。

Description

DNA正四面体-滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种DNA正四面体-滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法。
背景技术
基于RCA技术制备核酸水凝胶的方法存在耗时长、水凝胶机械强度低，不易搭载包埋物，导致可利用率低的问题。同时，RCA水凝胶的微观结构呈纳米花单一形貌，制备过程种难以对其大小及形貌结构进行调控，极大的限制了DNA水凝胶的推广应用。通过引入核酸自组装的DNA正四面体（TDN）高级结构能够有效弥补RCA技术制备核酸水凝胶的不足，为DNA水凝胶的制备提供了新的思路。一方面，由于TDN能够快速自组装，且以刚性的DNA双链为主要结构，因此直接解决了仅通过RCA技术制备DNA水凝胶耗时长、长单链产物机械强度低的问题，仅需10min即可获得高粘弹性的双交联水凝胶。另一方面，DNA水凝胶的合成对核酸链的长度和浓度具有一定的依赖性，通过将RCA长单链产物与TDN结合的方式显著降低了单一核酸结构制备DNA水凝胶所需的核酸量，从而进一步克服了核酸人工合成成本高对DNA水凝胶应用开发的限制。此外，TDN中的双链结构适合染料、药物等包埋物的嵌入，为DNA水凝胶中装载包埋物提供大量位点，拓宽了DNA水凝胶的应用方式。
发明内容
本发明建立的核酸水凝胶制备的新方法，克服了现有水凝胶制备方法的不足，实现了快速、简单高效、包埋物高效装载、形貌可控的核酸水凝胶的制备。
本发明的一个目的是提供一种制备方法，所述方法基于一种体外恒温核酸扩增技术, 所述体外恒温核酸扩增技术的反应体系包括锁式探针和连接引物，其特征在于，所述锁式探针的5’端经过磷酸化修饰且含有与连接引物互补的区域；所述连接引物能够与锁式探针的5’端和3’端杂交形成2段相邻的碱基互补配对区域；
所述互补包括现有技术或公知常识所定义的互补或反向互补，和/或根据现有技术或公知常识所定义的互补原则进行互补或反向互补。
所述聚合酶包括可用于体外核酸扩增技术的聚合酶。
所述连接酶包括可用于体外核酸扩增技术的连接酶。
所述扩增反应体系中的序列包括现有技术或公知常识所定义的序列，公众可直接人工合成获得，其制备方法属于现有技术；所述设计包括现有技术或公知常识所记载的设计方法。
具体的，所述方法还包括下述1）-3）中的至少一种：
1）所述体外核酸扩增技术包括滚环扩增反应，所述滚环扩增反应的反应过程包括：连接反应和扩增反应两部分；
2）所述连接反应包括将锁式探针与引物进行杂交的过程，反应过程包括：80～100℃，5～10min，缓慢降温；将杂交产物在连接酶的作用下，使锁式探针生成环化模板的过程，反应过程包括：16～30℃，20min～3h；
3）所述扩增反应包括环化模板与引物进行扩增的过程，反应过程包括：30～37℃，10h～30h。
4）所述锁式探针包括具长链结构且5’端经过磷酸化修饰的化合物。
再具体的，5’端磷酸化修饰的化学结构为：
Figure 797189DEST_PATH_IMAGE001
具体的，所述方法还包括下述1）-6）中的至少一种：
1）所述锁式探针包括：将序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列5’端经过磷酸化修饰得到的引物；
2）所述连接引物包括序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
3）所述锁式探针包括：将序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列5’端经过磷酸化修饰得到的引物；
4）所述连接引物包括将序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；
5）所述滚环扩增反应的产物经琼脂糖电泳分析得到大于5000bp的DNA长单链；
6）所述滚环扩增反应的产物呈具有一定粘弹性的水凝胶状态。
本发明的另一个目的是提供一种制备方法，所述方法包括DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的制备，所述DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的制备体系包括由滚环扩增反应获得的长单链DNA产物和四条DNA单链（Tar、Tbr、Tcr、Tdr）自组装形成的DNA正四面体。
优选地，所述滚环扩增反应包括锁式探针；所述锁式探针上编辑有靶标特异性适配体的互补序列，以使滚环扩增产物中含有靶标特异性的适配体序列。
所述四条DNA单链Tar、Tbr、Tcr、Tdr中包括下述1）-3）中至少一种情况：
1）各条DNA单链序列由三个链间两两互补序列A、B、C，两个非互补短铰链序列a、b，一个非互补长铰链序列c，以及一个连接臂序列X组成；
2）各条DNA单链序列中序列A、B、C是长度17nt且无重复的核酸序列，序列a、b是长度2nt且无重复的核酸序列，序列c是长度6nt的重复T核酸序列，序列X是长度为18nt与RCA长单链DNA产物中各单元序列互补的核酸序列；
3）各条DNA单链序列由5’端至3’端方向，是按照序列A、序列a、序列B、序列b、序列C、序列c和序列X的顺序依次排列的核酸序列；
具体的，所述四条DNA单链Tar、Tbr、Tcr、Tdr中还包括下述情况：
1）所述DNA单链Tar中Tar-A序列与Tcr-A序列互补，Tar-B序列与Tbr-B序列互补，Tar-C序列与Tdr-C序列互补；
2）所述DNA单链Tbr中Tbr-A序列与Tdr-A序列互补，Tbr-C序列与Tcr-C序列互补；
3）所述DNA单链Tcr中Tcr-B序列与Tdr-B序列互补，Tar-B序列与Tbr-B序列互补，Tar-C序列与Tdr-C序列互补；
还具体的，所述的制备方法，还包括1）-4）中的至少一种：
1）所述Tar序列包括序列表中的SEQ ID NO：3所示核酸序列和/或SEQ ID NO：3所示核酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的核酸序列。
2）所述Tbr序列包括序列表中的SEQ ID NO：4所示核酸序列和/或SEQ ID NO：4所示核酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的核酸序列。
3）所述Tcr序列包括序列表中的SEQ ID NO：5所示核酸序列和/或SEQ ID NO：5所示核酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的核酸序列。
4）所述Tdr序列包括序列表中的SEQ ID NO：6所示核酸序列和/或SEQ ID NO：6所示核酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加的核酸序列。
再具体的，所述制备方法还包括以下步骤：
1）分别量取等量的四条DNA单链于200 μL PCR管中，加入TEM 缓冲液使得体系体积为30 μL，分别制备浓度为80 μM 和100 μM 的TDN体系（标记为T100 和T80）。95℃孵育3min，然后快速降温至4℃，保持5 min，4℃保存备用；
2）按照RCA反应常规步骤，制备反应时间分别为10 h、8 h、6 h、4 h 的RCA产物，反应体系各30 μL，（标记为R10、R8、R6、R4），4℃保存备用；
3）将TDN体系和RCA体系按照1:1（v/v）混合，用枪头手动混匀100次后，95℃孵育5min，自然冷却至室温，即可获得DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶。
4）称量离心管和水凝胶的总质量，标记为m1，将获得的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶转移至浓度分别为10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL，体积为100 μL的多柔比星（Dox）溶液中，37℃避光振荡，孵育24 h。再次称量离心管和剩余缓冲液的总质量，标记为m2。计算m2-m1的值即为水凝胶的质量。对孵育后的Dox溶液进行荧光测量，并根据Dox标准曲线计算Dox的剩余量。根据公式Dox搭载量=（Dox的加入量-Dox的剩余量）/水凝胶的质量，即可获得单位质量水凝胶的Dox搭载量。
本发明的另一方面，制备方法还包括装载包埋物与纯化步骤，具体为：
1）将包埋物水溶液与透明的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶在混匀仪中常温避光孵育，转速为150 rpm，孵育时间为90 min，随后将上清和胶体分离；
2）将分离出的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶浸入ddH2O中一定时间；
3）去除上清，剩下即为纯化装载完毕的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶。
本发明的另一方面，上述制备方法中可选的，滚环扩增反应包括连接反应和扩增反应两部分；
所述连接反应包括将锁式探针与引物进行杂交；将杂交产物在连接酶的作用下，使锁式探针生成环化模板；所述锁式探针上编辑有靶标特异性适配体的互补序列；
所述扩增反应包括环化模板与引物进行扩增，获得长单链DNA产物。
本发明的另一方面，提供一种DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶或由上述制备方法制备的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的应用，可通过靶标响应释放包埋物进行可视化检测。
可选的，靶标响应释放包埋物可通过靶标与其特异性适配体序列相结合导致水凝胶网络解组装，从而实现水凝胶中荧光染料、药物等包埋物的释放。
可选的，本发明的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶可用于分子检测、药物装载与递送。
本发明的有益效果：
1、本发明通过将DNA正四面体与滚环扩增产物交联组装的方式仅需10min即可获得核酸水凝胶，实现其高效制备，较仅依靠滚环扩增一种方式制备核酸水凝胶的速率有较大提升；
2、本发明构建的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶由于包含大量DNA正四面体的双链结构而显著增强了水凝胶网络的机械强度，同时为染料、药物等多种包埋物提供了嵌合位点，便于后续药物递送、释放等方面的应用；
3、本发明通过DNA正四面体与滚环长单链产物的相互交联，微观上形成了由纳米花密集交联成的蜂巢结构，为以纳米花为基础的微观结构提供了新的形貌；
4、本发明通过调整DNA正四面体浓度和RCA反应时间实现了微观形貌可控。
附图说明
图1为DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的制备原理图。
图2为RCA 产物的1.5%琼脂糖凝胶电泳结果。
图3为不同组合的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶成胶结果。A：T100+R10水凝胶；B：泳道1-8 分别为T100+R10、T100+R8、T100+R6、T100+R4、T80+R10、T80+R8、T80+R6和T80+R4的水凝胶组合体系；C：TDN反应体系浓度为100 μM时与不同反应时间的RCA产物组装成胶的结果；D：TDN反应体系浓度为80 μM时与不同反应时间的RCA产物组装成胶结果。
图4为T80 系列水凝胶SEM 图像比较（低倍镜下）。A-D：分别为T80 + R4、T80 +R6、T80 + R8、T80 + R10 水凝胶组合体系（比例尺=5μm）。
图5为T80 系列水凝胶SEM 图像比较（高倍镜下）。A-D：分别为T80 + R4、T80 +R6、T80 + R8、T80 + R10 水凝胶组合体系（比例尺=1μm）。
图6为T100 系列水凝胶SEM 图像比较（低倍镜下）。A-D：分别为T100 + R4、T100 +R6、T100 + R8、T100 + R10 水凝胶组合体系（比例尺=10μm）。
图7为T100 系列水凝胶SEM 图像比较（高倍镜下）。A-D：分别为T100 + R4、T100 +R6、T100 + R8、T100 + R10 水凝胶组合体系（比例尺=1μm）。
图8为T100系列水凝胶时间扫描测试。A-D：分别为T100 + R10、T100 + R8、T100 +R6、T100 + R4水凝胶组合体系。
图9为T80系列水凝胶时间扫描测试。A-D：分别为T80 + R10、T80 + R8、T80 + R6、T80 + R4水凝胶组合体系。
图10为T100系列水凝胶频率扫描测试。A-D：分别为T100 + R10、T100 + R8、T100+ R6、T100 + R4水凝胶组合体系。
图11为T80系列水凝胶频率扫描测试。A-D：分别为T80 + R10、T80 + R8、T80 +R6、T80 + R4水凝胶组合体系。
图12为Dox吸光值标准曲线。
图13为DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶对Dox的搭载效果。A：肉眼观察DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶搭载前（上排）、后（下排）的对比；B：DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶对不同浓度Dox的搭载量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下所述实施例进一步说明本发明的内容和实施方式，其描述较为具体和详细，但不应理解为对本发明专利范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围之内。
实施例1、DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的制备与表征
（一）实验材料
本实施例所采用的实验试剂信息见表1，所设计的引物的核苷酸序列见表2和序列表。
Figure 969544DEST_PATH_IMAGE002
除表1中实验试剂外，实验用水均来自Milli-Q纯水系统。其他试剂均购自国药集团。
Figure 859003DEST_PATH_IMAGE003
表2中，锁式探针的5’端经磷酸化修饰,其化学结构为：
Figure 754409DEST_PATH_IMAGE004
表2中所列的序列均为人工合成。
（二）RCA反应
1）连接反应
如图1所示，RCA反应的第一步是将锁式探针在连接引物的辅助下经T4连接酶作用连接形成环型扩增模板。滚环扩增连接体系组成如下（表3）所示。首先，将表3中的组分混合后置于PCR仪中95℃加热5 min，以1℃/min的速度缓慢冷却到室温。随后，加入1μL T4 DNA连接酶（40 U/μL）于以上体系中，25℃孵育2 h，65℃孵育10 min，使T4连接酶失活，终止反应。
Figure 336700DEST_PATH_IMAGE005
2）扩增反应
RCA反应的第二步是将连接产物在phi 29 DNA聚合酶以及dNTPs的作用下进行滚环扩增反应从而获得大量长单链DNA（single-strand DNAs，ssDNAs）扩增产物。滚环扩增反应的扩增体系组成如下（表4）所示。首先，将表3中的组分混合后于32℃下孵育2 h。随后，于65℃孵育10 min使phi29 DNA聚合酶失活以终止扩增反应。按照相同步骤，制备反应时间分别为10 h、8 h、6 h、4 h 的RCA产物，反应体系各30 μL，（标记为R10、R8、R6、R4），4℃保存备用。
Figure 730772DEST_PATH_IMAGE006
3）RCA反应长单链产物验证
RCA反应长单链产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行验证说明。如图2所示，由于引物探针是ssDNA且较短，因此在1.5%的琼脂糖凝胶中的迁移率太快，因此无法呈现在胶图中；泳道2到泳道3说明引物探针与锁式探针的成功连接，泳道4说明在1 h内所获得的DNA产物的分子量已远超过5000 bp，即RCA反应具有很高的扩增效率，能够生成大量的长ssDNAs，由于该DNA产物的分子量过大，因此琼脂糖凝胶的胶孔中出现了明亮的条带。
（三）TDN结构自组装
分别量取等量的四条DNA单链于200 μL PCR管中，加入TEM 缓冲液使得体系体积为30 μL，分别制备浓度为80 μM 和100 μM 的TDN体系（标记为T100 和T80）。95℃孵育3min，然后快速降温至4℃，保持5 min，4℃保存备用；
（四）DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的构建与表征
1）DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的构建
将TDN体系和RCA体系按照1:1（v/v）混合，用枪头手动混匀100次后，95℃孵育5min，自然冷却至室温，即可获得DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶。
2）DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的表征
通过光学照片、SEM以及流变学测试等三种方式对制备的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶进行表征。
1）光学照片记录DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的宏观形态
如图3A-B 所示，DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶在成胶之后形态上发生了团聚，即水凝胶的表面变成球面，且流动性增加。在95℃高温退火之前，体系粘性较大。手指弹打离心管，预凝胶样品会出现气泡，且粘附于管内壁；退火之后，再次弹打离心管，胶态以球状在内壁流动。图3C-D是将获得的不同组合的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶系用移液枪挑出，可以发现离心管中有水残留，说明成胶过程中有水分析出。用枪头将胶体系挑起，可以发现水凝胶明显的团聚，呈水滴状。此外，核酸含量越高，所获得的水凝胶的体积就越大。
2）SEM表征DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的微观结构
先将样品用液氮进行快速冷冻，然后放入冷冻干燥仪完全干燥。在20 mA的条件下喷铂6 min，并以5 kV电压进行电镜扫描。
图4和图5所示的是T80 系列DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶经SEM低倍镜和高倍镜下观察的微观结构对比结果，图A 至图D，TDN反应体系浓度相同，RCA反应时间分别为4h、6h、8h、10h。如图4所示，随着RCA 时间的延长，T80 系列水凝胶的微观结构逐渐由二维平面网络向三维空间网络结构过渡，这主要是由于RCA反应时间较短，获得的长单链产物较少，但当RCA反应时间增长，足够量的长单链DNA与TDN交联形成三维网络结构。进一步，如图5所示，随着RCA 时间的延长，纳米花的数量增加，粒径逐渐变大，纳米花的形状也更加具体且规则。
图6至图7所示的分别是T100 系列DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶经SEM低倍镜和高倍镜下观察的微观结构对比结果，图A 至图D，TDN反应体系浓度相同，RCA反应时间分别为4 h、6 h、8 h、10 h。如图6所示，在TDN反应体系浓度为100 μM 时，水凝胶的微观结构以三维空间网络体系为主，且随着RCA 反应时间的延长，网络更加致密且规则。如图7所示，网络结构的内部存在纳米花，且纳米花的形貌随RCA反应时间增长变得更加具体。
3）流变学测试表征DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的机械强度
Figure 673189DEST_PATH_IMAGE007
对样品进行时间扫描测试可以简单快速得出样品是否成胶以及水凝胶的稳定性。如图8所示，对T100 系列的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶进行时间扫描测试，四种组合的水凝胶体系储能模量均大于损耗模量，说明均形成了凝胶。同时，四种组合的水凝胶储能模量随着反应时间的延长保持稳定。对不同组合的储能模量进行比较，发现储能模量G'为1>2>4> 3，而损耗模量G''为1>2>4>3，即储存模量和损耗模量随着RCA 时间的延长，以及TDN比重的增加，并不是呈严格的上升趋势。四种组合的储存模量分别稳定在175Pa、61 Pa、7 Pa和18 pa，损耗模量稳定在33 Pa、15 Pa、0.5 Pa和5 Pa。
如图9所示，对T80 系列的TDN-RCA 水凝胶进行时间扫描测试，四种组合的水凝胶体系储能模量均大于损耗模量，说明均形成了凝胶。对不同组合的储能模量G'进行比较，可以发现1>2>3> 4，而损耗模量G''为1>2>3>4，即储存模量和损耗模量随着RCA 时间的延长，及TDN比重的增加，呈上升趋势。四种组合的储存模量的值分别稳定在243 Pa、53 Pa、30 Pa和5 pa，损耗模量稳定在33 Pa、14 Pa、5 Pa和0.5 Pa。
对水凝胶进行频率扫描测试可以得出水凝胶的力学性质随着频率改变所发生的变化。如图10所示，在频率变化范围内，组合T100+R10和T100+R8的储能模量和损耗模量均随着频率的增加而增加，且储能模量的增加较损耗模量的增加快，这两种组合的储能模量始终大于损耗模量，即这两种体系始终处于凝胶态。组合T100+R6中的剪切模量和损耗模量均随着频率的增加而明显增加，损耗模量增加的比储能模量增加的快，所以两者频率为7Hz 时出现交点，即发生了凝胶态到溶液态的转变。
如图11所示，在频率变化的整个范围内，组合T80 + R10 的储能模量和损耗模量随着频率的增加略微增加，组合T80+R8和T80+R6的储能模量和损耗模量均随着频率的增加而明显增加，T80+R8储能模量的增加较损耗模量的增加快，而T80+R6损耗模量的增加较储能模量的增加快，这三种组合的储能模量始终大于损耗模量，即始终处于凝胶态。组合T80+R4中的剪切模量和损耗模量均随着频率的增加而快速增加，且损耗模量增加的比储能模量增加的快，所以两者在频率为7 Hz时相交，即发生了凝胶态到溶液态的转变。
实施例2、DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的中Dox的装载
（一）实验材料
本实施例所采用的实验试剂信息见表6。
表6
实验试剂 厂家 级别
Dox Sigma 生物试剂
除表6中实验试剂外，实验用水均来自Milli-Q纯水系统。其他试剂均购自国药集团。
（二）DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的中Dox的装载
1）Dox的装载
本发明中选择Dox作为示例以证明DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶具有染料或药物的搭载能力。以Dox 在488 nm处的吸光值为纵坐标，以dox 的浓度（μg/mL）为横坐标制作标准曲线。如图12所示，基于吸光值的标准曲线的线性拟合效果很好，且拥有更大的线性范围（5-100 μg/mL），因此后续的搭载实验基于吸光值的标准曲线进行搭载量的计算。
2）计算装载率
首先，称量离心管和水凝胶的总质量，标记为m1，将获得的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶转移至浓度分别为10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL，体积为100 μL的多柔比星（Dox）溶液中，37℃避光振荡，孵育24 h。再次称量离心管和剩余缓冲液的总质量，标记为m2。计算m2-m1的值即为水凝胶的质量。然后，通过测量DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶孵育前后Dox溶液的吸光值，通过作差法和标准曲线计算Dox 的搭载量。最终根据公式Dox搭载量=（Dox的加入量-Dox的剩余量）/水凝胶的质量，即可获得单位质量水凝胶的Dox搭载量。
如图13A所示，经过12 h 的振荡孵育，水凝胶的颜色从白色半透明变成橙红色，且溶液的颜色明显变浅，该现象直接说明DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶优良的搭载性能。由搭载后的结果可以看出，Dox浓度越高，水凝胶的颜色越深，说明水凝胶的搭载量越大。如图13B所示，随着Dox 浓度的增加，DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶对Dox 的搭载量也逐渐增大，当Dox 浓度为100 μg/mL 时，最高搭载量可达0.124 μg/mL。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> DNA正四面体-滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tgcctagcct tcctagtcgt aacttgtagc atcattctcc gattccgtgc gtcagctg 58
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aggctaggca cagctgacgc 20
<210> 3
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgataccgc cgagaagagc acatcgttcg acattacaaa gtctgaatcc ttacattttt 60
tcgtcagctg tgcctagcc 79
<210> 4
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cataacctgg gagcgtagat aatgtcgaac gatgtgacag ttgacggacc actatttttt 60
tcgtcagctg tgcctagcc 79
<210> 5
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cttctcggcg gtatcatcta agggtgcatc acagcaaaat agtggtccgt caactttttt 60
tcgtcagctg tgcctagcc 79
<210> 6
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tacgctccca ggttatgttt gctgtgatgc acccttcgtg taaggattca gacttttttt 60
tcgtcagctg tgcctagcc 79

Claims (8)

1.一种DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的制备体系包括由滚环扩增反应获得的长单链DNA产物和四条DNA单链Tar、Tbr、Tcr、Tdr自组装形成的DNA正四面体；
所述滚环扩增反应包括锁式探针；所述锁式探针上编辑有靶标特异性适配体的互补序列，以使滚环扩增产物中含有靶标特异性的适配体序列；
所述四条DNA单链Tar、Tbr、Tcr、Tdr具有以下结构：
1）各条DNA单链序列由三个链间两两互补序列A、B、C，两个非互补短铰链序列a、b，一个非互补长铰链序列c，以及一个连接臂序列X组成；
2）各条DNA单链序列中序列A、B、C是长度17nt且无重复的核酸序列，序列a、b是长度2nt且无重复的核酸序列，序列c是长度6nt的重复T核酸序列，序列X是长度为18nt与RCA长单链DNA产物中各单元序列互补的核酸序列；
3）各条DNA单链序列由5’端至3’端方向，是按照序列A、序列a、序列B、序列b、序列C、序列c和序列X的顺序依次排列的核酸序列；
所述四条DNA单链Tar、Tbr、Tcr、Tdr中还包括下述结构：
1）所述DNA单链Tar中Tar-A序列与Tcr-A序列互补，Tar-B序列与Tbr-B序列互补，Tar-C序列与Tdr-C序列互补；
2）所述DNA单链Tbr中Tbr-A序列与Tdr-A序列互补，Tbr-C序列与Tcr-C序列互补；
3）所述DNA单链Tcr中Tcr-B序列与Tdr-B序列互补，Tar-B序列与Tbr-B序列互补，Tar-C序列与Tdr-C序列互补。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，四条DNA单链Tar、Tbr、Tcr、Tdr中为如下结构：
1）所述Tar序列为序列表中的SEQ ID NO：3所示核酸序列；
2）所述Tbr序列为序列表中的SEQ ID NO：4所示核酸序列；
3）所述Tcr序列为序列表中的SEQ ID NO：5所示核酸序列；
4）所述Tdr序列为序列表中的SEQ ID NO：6所示核酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下步骤：
1）分别量取等量的四条DNA单链于PCR管中，加入TEM 缓冲液，分别制备浓度为80 μM和100 μM 的TDN体系；90-98℃孵育，然后快速降温，保存备用；
2）按照RCA反应常规步骤，制备反应时间分别为10 h、8 h、6 h、4 h 的RCA产物，保存备用；
3）将TDN体系和RCA体系按照1:1（v/v）混合，用枪头手动混匀后，90-98℃孵育，自然冷却至室温，即可获得DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶。
4.如权利要求3所述DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，还包括装载包埋物与纯化步骤，具体为：
1）将包埋物水溶液与透明的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶在混匀仪中常温避光孵育，离心孵育，随后将上清和胶体分离；
2）将分离出的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶浸入ddH2 O中一定时间；
3）去除上清，剩下即为纯化装载完毕的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶。
5.如权利要求3的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述滚环扩增反应包括连接反应和扩增反应两部分；
所述连接反应包括将锁式探针与引物进行杂交；将杂交产物在连接酶的作用下，使锁式探针生成环化模板；所述锁式探针上编辑有靶标特异性适配体的互补序列；
所述扩增反应包括环化模板与引物进行扩增，获得长单链DNA产物。
6.如权利要求1-5任一所述制备方法制备的DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的应用，其特征在于，可通过靶标响应释放包埋物进行可视化检测。
7.如权利要求6所述DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的应用，其特征在于，所述靶标响应释放包埋物可通过靶标与其特异性适配体序列相结合导致水凝胶网络解组装，从而实现水凝胶中荧光染料、药物的释放。
8.权利要求6或7所述DNA正四面体—滚环扩增产物双交联水凝胶的应用，其特征在于，可用于分子检测、药物装载与递送。
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