CN110004198B - 软刷子快速自组装功能核酸水凝胶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种软刷子快速自组装功能核酸水凝胶的制备方法。该方法将耗时长的水凝胶形成过程缩减至1分钟，显著减少了水凝胶形成的用时；将RCA等温反应引入核酸水凝胶的搭建中，以获得大量长单链DNA作为形成DNA水凝胶的基础单元，解决了传统核酸水凝胶制备中完全依赖人工合成高浓度长链核酸的限制。本发明制备得到的核酸水凝胶具有高粘弹性，其微观形态显示为DNA纳米花结构，其大小以及花瓣致密度会随着软刷子序列的长度和浓度发生改变，实现核酸水凝胶的形貌可控。本发明所建立的核酸水凝胶制备方法在包括分子检测、药物装载与递送等方面，具有非常好的应用前景。

Description

软刷子快速自组装功能核酸水凝胶的制备方法

技术领域

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种软刷子快速自组装功能核酸水凝胶的制备方法。

背景技术

传统的DNA水凝胶制备方法需要耗费大量依赖于人工合成的DNA，导致合成成本很高，同时需要较长的时间方能成胶，操作繁琐，工作量大。与此同时，在DNA水凝胶的制备过程中难以调控其大小及形貌结构，极大地限制了DNA水凝胶的推广应用。核酸扩增方法的完善和发展，为DNA水凝胶的制备提供了新的思路，克服了传统方法中核酸消耗量大,人工合成DNA链长度受限的问题,实现简单高效地获得大量DNA水凝胶构建单元,大大降低制备成本。然而,现有的基于RCA反应产物形成的DNA水凝胶，其粘弹性、微观结构可控等方面的研究十分有限。

发明内容

本发明建立的核酸水凝胶制备的新方法，克服了现有水凝胶制备方法的不足，实现了快速、简单高效、形貌可控的核酸水凝胶的制备。

本发明的一个目的是提供一种制备方法，所述方法基于一种体外恒温核酸扩增技术,所述体外恒温核酸扩增技术的反应体系包括锁式探针和连接引物，其特征在于，所述锁式探针的5’端经过磷酸化修饰且含有与连接引物互补的区域；所述连接引物能够与锁式探针的5’端和3’端杂交形成2段相邻的碱基互补配对区域；

所述互补包括现有技术或公知常识所定义的互补或反向互补，和/或根据现有技术或公知常识所定义的互补原则进行互补或反向互补。

所述聚合酶包括可用于体外核酸扩增技术的聚合酶。

所述连接酶包括可用于体外核酸扩增技术的连接酶。

所述扩增反应体系中的序列包括现有技术或公知常识所定义的序列；所述设计包括现有技术或公知常识所记载的设计方法。

具体的，所述方法还包括下述1)-3)中的至少一种：

1)所述体外核酸扩增技术包括滚环扩增反应，所述滚环扩增反应的反应过程包括：连接反应和扩增反应两部分；

2)所述连接反应包括将锁式探针与引物进行杂交的过程，反应过程包括：80～100℃，5～10min，缓慢降温；将杂交产物在连接酶的作用下，使锁式探针生成环化模板的过程，反应过程包括：16～30℃，20min～3h；

3)所述扩增反应包括环化模板与引物进行扩增的过程，反应过程包括：30～37℃，10h～30h。

4)所述锁式探针包括具长链结构且5’端经过磷酸化修饰的化合物。

再具体的，5’端磷酸化修饰的化学结构为：

具体的，所述方法还包括下述1)-6)中的至少一种：

1)所述锁式探针包括：将序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列5’端经过磷酸化修饰得到的引物；

2)所述连接引物包括序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

3)所述锁式探针包括：将序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列5’端经过磷酸化修饰得到的引物；

4)所述连接引物包括将序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

5)所述滚环扩增反应的产物经琼脂糖电泳分析得到大于5000bp的DNA长单链；

6)所述滚环扩增反应的产物呈具有一定粘弹性的水凝胶状态。

还具体的，所述锁式探针为：

5’-phosphoraylated-

CTGATAAGCTATCCTAGTCGTAACTTGTAGCATCATTCTCCGATTCCGTTCAACATCAGT

所述锁式探针公众可直接人工合成获得，其制备方法属于现有技术。

本发明的另一个目的是提供一种制备方法，所述方法包括软刷子快速自组装功能核酸水凝胶的制备,所述软刷子快速自组装功能核酸水凝胶的制备体系包括一对L型探针A、B，其特征在于，所述一对L型探针A、B均包括：与RCA长单链DNA产物部分互补配对的核苷酸序列以及游离的软刷子序列；所述与RCA长单链DNA产物部分互补配对的核苷酸序列可结合于RCA长单链DNA产物的各单元中；所述游离的软刷子序列与RCA长单链DNA产物不发生结合。；

所述A、B只用于区别不同的互补序列，不用于排序。

具体的，所述L型探针包括下述1)中的至少一种情况：

1)序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列和/或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列表中SEQ ID NO：3—SEQ ID NO：10所示核苷酸序列具有相同功能的核苷酸序列；

还具体的，所述软刷子快速自组装功能核酸水凝胶的制备方法还包括下述1)-2)中所述的至少一种：

1)在L型探针与RCA产物进行自组装之前，需要先将RCA产物的水凝胶状态通过搅拌的方式进行扰乱，直到RCA产物的粘弹性消失；

2)将L型探针加入到搅拌之后的RCA产物中，通过1分钟的短时间搅拌方式使L型探针与RCA产物进行部分互补杂交。

本发明的再一个目的是提供一种制备方法，所述方法包括软刷子快速自组装功能核酸水凝胶的纯化，其特征在于，去除制备过程中核酸扩增反应体系引入的复杂组分。

具体的，所述方法还包括下述1)-3)中至少一种：

1)将软刷子快速自组装功能核酸水凝胶浸入ddH₂O中一定时间；

2)将上一步的水凝胶样品放入离心机进行高速离心，离心速度为10000～14000g,离心时间为5～20min；

3)去除上清，剩下即为纯化后的软刷子快速自组装功能核酸水凝胶。

附图说明

图1为RCA水凝胶表征图。(A)加入引物(左)和不加入引物(右)的RCA产物；(B)对搅拌前的RCA产物进行凝胶程度的测试；(C)RCA产物的琼脂糖电泳分析。

图2为RCA水凝胶的SEM表征和流变学分析结果图。(A)RCA水凝胶的SEM图(标尺＝2μM)；RCA水凝胶的(B)频率扫描和(C)温变扫描的流变学分析结果。

图3为搅拌后的RCA产物图。

图4为软刷子功能核酸水凝胶原理图。其中两张插图显示在添加一对100μM L型探针A&B-f28之前(左)和之后(右)形成软刷子功能核酸水凝胶的状态。

图5为光学照片记录洗涤(A)前、(B)后含100μM L型探针A&B-f28软软刷子功能核酸水凝胶的对比图。

图6为含L型探针A&B-f28软刷子功能核酸水凝胶的洗涤过程及洗涤前后水凝胶体积对比图。

图7为含L型探针A&B-f28软刷子功能核酸水凝胶(A)洗涤前与(B)洗涤后微观尺度下外部与内部结构SEM图像的比较。(C-F)含L型探针A&B-f28软刷子功能核酸水凝胶(C-D)洗涤前和(E-F)洗涤后微观尺度下内部结构的SEM图像比较。比例尺＝2μm。

图8为光学照片与SEM图像记录L型探针浓度对软刷子功能核酸水凝胶宏观体积与微观结构的影响。(A)水凝胶样品1-5中分别含有0μM，50μM，100μM，150μM和300μM的L型探针。(B-F)水凝胶样品1-5的SEM图像(比例尺＝2μm)。

图9为含有不同浓度L型探针的软刷子功能核酸水凝胶的纳米花平均直径统计图。

图10为软刷子长度对软刷子功能核酸水凝胶形成速率、宏观体积与微观结构的影响。(A)软刷子长度对水凝胶形成速率的影响。(B)水凝胶样品1-6对应于搅拌后RCA产物，含有随机序列的搅拌后RCA产物，以及分别含有0nt，14nt，28nt和56nt软刷子的软刷子功能核酸水凝胶。(C-H)样品1-6的SEM图像(比例尺＝200nm)。

图11为软刷水凝胶长度对软刷子功能核酸水凝胶频率扫描流变学分析的影响。(A)搅拌后RCA产物,(B)搅拌后RCA产物中加入随机序列A&B-f28，分别含有(C)0nt，(D)14nt，(E)28nt和(F)56nt软刷子的软刷子功能核酸水凝胶。

图12为软刷水凝胶长度对软刷子功能核酸水凝胶温变扫描流变学分析的影响。(A)搅拌后RCA产物,(B)搅拌后RCA产物中加入随机序列A&B-f28，分别含有(C)0nt，(D)14nt，(E)28nt和(F)56nt软刷子的软刷子功能核酸水凝胶。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下所述实施例进一步说明本发明的内容和实施方式，其描述较为具体和详细，但不应理解为对本发明专利范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围之内。

实施例1、RCA水凝胶的制备

(一)实验材料

本实施例所采用的实验试剂信息见表1，所设计的引物的核苷酸序列见表2和序列表。

表1

除表1中实验试剂外，实验用水均来自Milli-Q纯水系统。其他试剂均购自国药集团。

表2

表2中，锁式探针的5’端经磷酸化修饰,其化学结构为：

表2中所列的序列均为人工合成。

(二)RCA反应

1)连接反应

RCA反应的第一步是将锁式探针在连接引物的辅助下经T4连接酶作用连接形成环型扩增模板。滚环扩增连接体系组成如下(表3)所示。首先，将表3中的组分混合后置于PCR仪中90℃加热5min，以1℃/min的速度缓慢冷却到室温。随后，加入2μL T4 DNA连接酶(40U/μL)于以上体系中，用枪头轻轻吹吸混匀，于室温孵育1h。

表3滚环扩增连接体系

2)扩增反应

RCA反应的第二步是将连接产物在phi 29DNA聚合酶以及dNTPs的作用下进行滚环扩增反应从而获得大量长单链DNA(single-strand DNAs，ssDNAs)扩增产物。滚环扩增反应的扩增体系组成如下(表4)所示。首先，将表3中的组分混合后于30℃下孵育24h。随后，于65℃孵育10min使phi29 DNA聚合酶失活以终止扩增反应。

表4滚环扩增反应的扩增体系

(三)RCA水凝胶的验证

经RCA反应形成的RCA水凝胶主要通过光学照片记录水凝胶状态、琼脂糖凝胶电泳、SEM表征以及流变学测试等四种方式进行验证说明。

1)光学照片记录水凝胶状态

首先，通过拍摄照片对比有/无加入连接引物的RCA反应所获得的产物，RCA反应结束后可以观察到PCR管中的样品呈现分散均匀且浑浊的水凝胶状态，说明生成了大量的ssDNAs(图1A-左)；若不加入引物，在同等条件下扩增24h后仍为澄清透明的液体，没有ssDNAs产物生成(图1A-右)。

为了更加清楚地观察RCA水凝胶的状态，随后将PCR管中的RCA产物放在平皿中，当用枪头吸取RCA水凝胶前体时，可以看到水凝胶具有一定的粘弹性且发生了形变；用枪头RCA水凝胶打出时，该凝胶能够形成具有拉伸性质的凝胶并以胶滴的形式悬挂在枪头下方(图1B)。

2)琼脂糖凝胶电泳

1％琼脂糖凝胶的配制：用电子天平称取1g琼脂糖粉末加到三角瓶中，然后加入100mL 1×TAE缓冲液，将三角瓶放入微波炉中加热融化，冷却至不烫手，倒入凝胶槽中，插上梳子，在室温凝固30min后即可使用。

跑胶：4μL样品加入1μL 6×Loading buffer和1μL 6×SYBR GREEN II混合均匀，在1％琼脂糖凝胶上进行点样。将电泳仪的电压设为120V，电泳时间为25min。

琼脂糖凝胶电泳的结果也表明，RCA反应具有很高的扩增效率，能够生成大量的长ssDNAs，由于该DNA产物的分子量过大，因此被截留在琼脂糖胶的孔中难以移动(图1C)。

3)SEM表征

先将样品用液氮进行快速冷冻，然后放入冷冻干燥仪完全干燥。在20mA的条件下喷铂6min，并以5kV电压进行电镜扫描。

通过图2A中RCA水凝胶的SEM表征可以看出，RCA产物为纳米花球形结构，直径在1～2μm之间，纳米花的内部呈现分层状，层与层之间相互编织，形成大量的孔状结构。

4)流变学测试

按照表5设置流变学测试中的参数。

表5流变学实验的参数设置

由图2B和2C中RCA产物的频率扫描和温变扫描的流变学分析结果可知，在整个频率扫描过程中，弹性模量(G’)一直大于(G”)，随着频率的升高，G’和G”均逐渐增大；而在温变扫描中，G’和G”没有发生明显的变化，展现出相对较好的热稳定性。

实施例2、快速自组装软刷子功能核酸水凝胶

(一)实验材料

本实施例所设计的引物的核苷酸序列见表6和序列表。

表6

表6中，L型探针(A或B)由两部分组成，一部分是与RCA产物互补的序列，另一部分是游离序列，其游离于RCA产物中的长ssDNAs而不与其结合，称为“软刷子”。

表6中，下划线标注的序列是RCA反应获得的长ssDNAs产物与L型探针中互补区域杂交后剩余的游离序列。

表6中，核酸名称一列中，括号内的内容说明了软刷子序列在与RCA产物杂交后游离的碱基数量。

表6中所列的序列均为人工合成。

(二)软刷子功能核酸水凝胶的制备与表征

1)软刷子功能核酸水凝胶的制备

由于RCA水凝胶本身具有粘弹性的，因此为了增加RCA产物和L型探针之间的接触面积和相互交联，同时凸显L型探针对水凝胶机械特性的增强作用，首先用枪头搅拌RCA水凝胶以破坏其凝胶状态，直至粘弹性消失。如图3搅拌后的RCA产物，由于无法用枪头吸起形成凝胶束，也无法以较低的形式挂在枪头下方，因此只能称之为浓溶液。

然后，分别取6μL 100μM L型探针A&B-f28加入60μL经搅拌失去粘弹性的RCA产物中，经过不到1分钟的搅拌即可获得软刷子功能核酸水凝胶。如图4所示，与未加入L型探针的对照样品相比，在搅拌后的RCA产物中加入L型探针获得的水凝胶更多，体积更大，这个现象说明L型探针的加入使得RCA产物再次由浓溶液恢复成水凝胶的状态。同时形成的水凝胶能够通过枪头吸取形成较细的凝胶束；将凝胶用枪头打出时，凝胶以胶滴的形式挂在枪头下方(图5A)。

2)软刷子功能核酸水凝胶的洗涤

为避免复杂的RCA反应体系对水凝胶形貌产生影响，对上一步制备得到的水凝胶进行洗涤。在软刷子功能核酸水凝胶样品中加入500μL ddH₂O，浸泡5min，经14000g高速离心10min后，去上清。洗涤后水凝胶体积略微减小(图6)。同时，如图5B所示，通过枪头吸取洗涤后的水凝胶能够形成较粗的凝胶束，并且经枪头打出时会凝聚成更大的胶滴挂在枪头尖端，说明水凝胶弹性较洗涤前大大增强。

此外，采用SEM表征方法对洗涤前后样品的微观结构进行了内部和外部的观察。洗涤前(图7A，7C-D)，样品的外部结构由较厚的板层组成，样品的内部是纳米花结构且纳米花周围存在一些小板块；洗涤后(图7B，7E-F)，样品的外部板层变得很薄，连板层下方的纳米花结构都能透过板层印出来，撕裂后的样品可以清楚地看到内部有许多纳米花簇拥在一起，未见小板块。由此说明洗涤使纳米花由被包裹态变成裸露态，露出的许多小孔可以增强吸水性，导致水凝胶弹性增强。

实施例3、软刷子功能核酸水凝胶的宏观体积与微观结构的控制

主要通过两种方式对软刷子功能核酸水凝胶的宏观体积与微观结构进行控制：一是调整L型探针的浓度；二是调整L型探针中游离序列即“软刷子”的长度。

(一)实验材料

本实施例所设计的引物的核苷酸序列见表7和序列表。

表7

表7中，L型探针(A或B)由两部分组成，一部分是与RCA产物互补的序列，另一部分是游离序列，其游离于RCA产物中的长ssDNAs而不与其结合，称为“软刷子”。

表7中，下划线标注的序列是RCA反应获得的长ssDNAs产物与L型探针中互补区域杂交后剩余的游离序列。

表7中，核酸名称一列中，括号内的内容说明了软刷子序列在与RCA产物杂交后游离的碱基数量。

表7中，RA-f28和RB-f28是两条随机序列，其中包括与L型探针A-f28和B-f28相同的游离序列，但两条随机序列中没有与RCA产物互补部分。

表7中所列的序列均为人工合成。

(二)L型探针浓度对软刷子功能核酸水凝胶的影响

1)软刷子功能核酸水凝胶的制备

由于RCA水凝胶本身具有粘弹性的，因此为了增加RCA产物和L型探针之间的接触面积和相互交联，同时凸显L型探针对水凝胶机械特性的增强作用，首先用枪头搅拌RCA水凝胶以破坏其凝胶状态，直至粘弹性消失。

然后，各取6μL 0μM，50μM，100μM，150μM和300μM的L型探针A&B-f28分别加入60μL经搅拌失去粘弹性的RCA产物中，经过不到1分钟的搅拌即可获得软刷子功能核酸水凝胶。

2)软刷子功能核酸水凝胶的洗涤

为避免复杂的RCA反应体系对水凝胶形貌产生影响，对上一步制备得到的水凝胶进行洗涤。在软刷子功能核酸水凝胶样品中加入500μL ddH₂O，浸泡5min，经14000g高速离心10min后，去上清。

3)光学照片记录L型探针浓度对软刷子功能核酸水凝胶宏观体积的影响

首先，通过拍摄照片对比加入的不同浓度L型探针对软刷子功能核酸水凝胶宏观体积的影响。如图8A所示，随着L型探针浓度的升高，水凝胶的宏观体积也呈现显著性增大，即当L型探针为0μM时，水凝胶的体积最小；当L型探针为300μM时，水凝胶的体积最大。

4)SEM表征L型探针浓度对软刷子功能核酸水凝胶微观结构的影响

先将样品用液氮进行快速冷冻，然后放入冷冻干燥仪完全干燥。在20mA的条件下喷铂6min，并以5kV电压进行电镜扫描。

通过图8B-F中RCA水凝胶的SEM表征可以看出，当L型探针的浓度为0μM时，纳米花直径最小(图8B)；当L型探针的浓度为50μM和100μM时，纳米花直径变大(图8C-D)；当L型探针的浓度为150μM和300μM时，不仅出现了巨型纳米花而且组成纳米花的花瓣更加致密(图8E-F)，其中加入300μM L型探针所生成的巨型纳米花的直径显著大于150μM L型探针所对应的纳米花。在获得的SEM图像的基础上，利用Image-pro plus 6.0统计软件计算出含有不同浓度L型探针的软刷子功能核酸水凝胶中纳米花的平均直径(图9)，结果显示随着L型探针浓度的增加，纳米花的平均直径从1.5μm逐渐扩大到2μm。由此可知，L型探针的浓度大大影响了水凝胶的宏观体积和微观结构。

(三)软刷子长度对软刷子功能核酸水凝胶的影响

1)软刷子功能核酸水凝胶的制备

由于RCA水凝胶本身具有粘弹性的，因此为了增加RCA产物和L型探针之间的接触面积和相互交联，同时凸显L型探针对水凝胶机械特性的增强作用，首先用枪头搅拌RCA水凝胶以破坏其凝胶状态，直至粘弹性消失。

然后，各取6μL 100μM的L型探针A&B-f0、f14、f28、f56分别加入60μL经搅拌失去粘弹性的RCA产物中，经过不到1分钟的搅拌即可获得软刷子功能核酸水凝胶。

2)软刷子功能核酸水凝胶的洗涤

为避免复杂的RCA反应体系对水凝胶形貌产生影响，对上一步制备得到的水凝胶进行洗涤。在软刷子功能核酸水凝胶样品中加入500μL ddH₂O，浸泡5min，经14000g高速离心10min后，去上清。

3)软刷子长度对软刷子功能核酸水凝胶形成速率的影响

以加入L型探针后搅拌时感受到明显阻力作为软刷子功能核酸水凝胶形成的判断标准，如图10A，随着DNA软刷碱基数量的增加，水凝胶形成所使用的时间越少。当软刷子长度为0nt时需要47.08s；当软刷子长度为56nt时，只需要28.92s，大大缩短了水凝胶的形成时间。因此软刷子长度越长，即游离序列碱基数量越多，越能加快水凝胶的形成。

4)光学照片记录软刷子长度对软刷子功能核酸水凝胶宏观体积的影响

首先，通过拍摄照片对比未加入L型探针，加入随机序列A&B-f28以及加入含有不同长度软刷子的L型探针所形成的软刷子功能核酸水凝胶。如图10B所示，RCA产物中未加入L型探针或者加入随机序列(不含有与RCA产物杂交的互补区域但含有28nt软刷子)时，水凝胶体积较小；加入含有不同长度软刷子的L型探针后，水凝胶体积都显著增大。

5)SEM表征软刷子长度对软刷子功能核酸水凝胶微观结构的影响

先将样品用液氮进行快速冷冻，然后放入冷冻干燥仪完全干燥。在20mA的条件下喷铂6min，并以5kV电压进行电镜扫描。

通过图10C-F中RCA水凝胶的SEM表征可以看出，RCA产物中不加入L型探针时，纳米花的直径较小，且花瓣较疏松(图10C)；RCA产物中加入随机序列时，纳米花的直径和花瓣密度，与未加入L型探针的情况类似(图10D)；当L型探针的软刷子为0nt时，纳米花的直径显著大于未加入L型探针或者加入随机序列的RCA产物，且花瓣密度也显著增大(图10E)；当L型探针的软刷子为14nt和28nt时，花瓣的密度较图10E更大(图10F-G)；当L型探针的软刷子为56nt时，花瓣的密度达到最大，且花瓣厚度也显著增厚(图10H)。从以上结果得知，随着软刷子长度，即游离序列的碱基数量增多，水凝胶的宏观体积、微观纳米花的平均直径、花瓣密度和厚度均显著增加。

6)流变学测试分析软刷子长度对软刷子功能核酸水凝胶机械特性的影响按照表5设置流变学测试中的参数。

在频率扫描中，当RCA产物中未加入L型探针或者加入随机序列时，G’和G”曲线始终接近。频率在0～2Hz范围内，G’和G”曲线具有多个交点，即表明弹性和粘性性能接近；频率在2～10Hz范围内，G’和G”产生一个交点，且交点前呈凝胶态(G’>G”)，交点后呈液态(G’＜G”)(图11A-B)。当RCA产物中加入L型探针后，整个频率扫描的全程都未出现交点且G’始终大于G”，说明当频率处于0.1～10Hz范围内，样品始终处于弹性性能较好的凝胶态，进一步说明了软刷子越长有助于增强水凝胶的弹性性能(图11C-F)。

在温变扫描中，随着温度的不断增加，当RCA产物中未加入L型探针或者加入随机序列时，G’值始终稳定在6pa左右，并不会随着温度的升高而发生变化，这是由于RCA产物是由长ssDNAs组成，形成的纳米花结构也比较稳定，对温度不敏感，因此G’一直都处在相同的位置(图12A-B)；当RCA产物中加入L型探针后，无论软刷子长短，G’值都会随着温度的升高而逐渐降低(图12C-F)。此外，图12C-F中的G’值-温度的公式和趋势线，表明软刷子为0、14和28nt时，趋势线的斜率在0.06左右；当软刷子增长为56nt时，趋势线的斜率为0.11左右，几乎是前者的2倍，即G’下降更快。由此可知，在RCA产物中加入L型探针后，即使当应力增加到100％，依旧可以保持较高的弹性性能，且软刷子为56nt时弹性性能最高。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 软刷子快速自组装功能核酸水凝胶的制备方法

<130> MP1907752Z

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgataagct atcctagtcg taacttgtag catcattctc cgattccgtt caacatcagt 60

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tagcttatca gactgatgtt ga 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgataagct atcctagtcg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catcattctc cgattccgtt 20

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgataagct atcctagtcg atactccccc aggt 34

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaccttcctc cgcacatcat tctccgattc cgtt 34

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgataagct atcctagtcg atactccccc aggtaacctt cctccgca 48

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atactccccc aggtaacctt cctccgcaca tcattctccg attccgtt 48

<210> 9

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctgataagct atcctagtcg atactccccc aggtaacctt cctccgcata cacctgttat 60

gcaaacgcag tagcct 76

<210> 10

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atactccccc aggtaacctt cctccgcata cacctgttat gcaaacgcag tagcctcatc 60

attctccgat tccgtt 76

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gttacgatgg actctcctaa atactccccc aggtaacctt cctccgca 48

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atactccccc aggtaacctt cctccgcaac ctggtcatct tccacttt 48

Claims (5)

1.一种软刷子快速自组装功能核酸水凝胶的制备方法,所述方法包括软刷子快速自组装功能核酸水凝胶的制备,所述软刷子快速自组装功能核酸水凝胶的制备体系包括一对L型探针A、B，其特征在于，所述一对L型探针A、B均包括：与RCA长单链DNA产物部分互补配对的核苷酸序列以及游离的软刷子序列；所述与RCA长单链DNA产物部分互补配对的核苷酸序列可结合于RCA长单链DNA产物的各单元中；所述游离的软刷子序列与RCA长单链DNA产物不发生结合。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述L型探针包括下述中的至少一种情况：

序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述软刷子快速自组装功能核酸水凝胶的制备方法还包括以下步骤：

1)在L型探针与RCA产物进行自组装之前，需要先将RCA产物的水凝胶状态通过搅拌的方式进行扰乱，直到RCA产物的粘弹性消失；

2)将L型探针加入到搅拌之后的RCA产物中，通过1分钟的短时间搅拌方式使L型探针与RCA产物进行部分互补杂交。

4.如权利要求1-2所述的方法，其特征在于，所述方法包括软刷子快速自组装功能核酸水凝胶的纯化，其特征在于，去除制备过程中核酸扩增反应体系引入的复杂组分。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

1)将软刷子快速自组装功能核酸水凝胶浸入ddH₂O中一定时间；

2)将上一步的水凝胶样品放入离心机进行高速离心，离心速度为10000～14000g,离心时间为5～20min；

3)去除上清，剩下即为纯化后的软刷子快速自组装功能核酸水凝胶。

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