KR101178323B1 - 미량 ｍＲＮＡ의 증폭방법 및 그 이용 - Google Patents

미량 ｍＲＮＡ의 증폭방법 및 그 이용 Download PDF

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Abstract

염기 서열의 길이에 영향을 받지 않고, 짧은 mRNA도 긴 mRNA도 동일하게 효율적으로 증폭할 수 있는 미량 mRNA의 증폭 방법 및 그 이용법을 제공하기 위해서, 본 발명의 미량 mRNA의 증폭 방법은, 미량 mRNA를 포함하는 용액에 더미 RNA를 첨가하여 혼합 용액을 제작하는 제1 공정; 혼합용액을 주형으로 사용한 역전사 반응에 의해 안티센스 DNA를 합성하는 제2 공정; 합성된 안티센스 DNA에 대해 상보적인 센스 DNA를 합성하여, 센스 DNA와 안티센스 DNA로 이루어진 이중사슬 DNA를 형성하는 제3 공정; 형성된 이중사슬 DNA의 센스 DNA의 5' 말단에 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 연결하여 증폭용 이중사슬 DNA를 제작하는 제4 공정; 및 RNA 폴리머라아제에 의해 증폭용 이중사슬 DNA로부터 RNA를 증폭하는 제5 공정을 포함한다.
Figure R1020097006146
미량 mRNA, 더미 RNA, 이중사슬 DNA, 증폭

Description

미량 ｍＲＮＡ의 증폭방법 및 그 이용{TRACE mRNA AMPLIFICATION METHOD AND USE THEREOF}
본 발명은 미량 mRNA의 증폭방법 및 그 이용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 cDNA 라이브러리의 제작, mRNA의 센스사슬의 증폭, mRNA의 센스사슬을 코딩하는 표지 프로브의 제작 및 단계적 서브트랙션(subtraction) 등에 적절하게 사용할 수 있는 미량 mRNA의 증폭방법 및 그 이용에 관한 것이다.
종래의 유전자의 해석수단으로는, 예를 들면 cDNA 라이브러리 등을 해석하는 방법이 알려져 있다. cDNA 라이브러리는 생물의 세포에서 mRNA를 정제하고, 그 mRNA에서 cDNA를 합성함으로써 제작된다. 이때 세포에서 정제된 mRNA는 통상 극미량이다. 생체 내에 다수 존재하는 세포종에서 mRNA를 정제하는 경우에는 mRNA의 정제에 사용하는 세포의 수가 많으면, cDNA 라이브러리를 합성하기 위해 필요한 충분한 양의 mRNA를 얻을 수 있다. 하지만 생체 내에 극히 미량으로 존재하는 세포 (예를 들면 줄기세포, 또는 생식 세포 등)에서 mRNA를 정제하는 경우에서는, cDNA 라이브러리를 합성하기 위해 사용할 수 있는 mRNA의 양에 많은 제한이 따른다. 이 런 경우 cDNA를 합성하기 위해서는 정제한 mRNA를 증폭할 필요가 있다. 따라서, 이전부터 극미량 mRNA를 증폭하는 방법이 개발되고 있다.
상술한 바와 같은 mRNA의 증폭방법으로는 PCR을 사용하여 mRNA를 증폭하는 방법이 일반적이다. mRNA의 구체적인 증폭수단은 하기와 같다. 먼저 mRNA를 세포에서 정제한다. 다음으로 역전사 반응에 의해 cDNA를 조제한다. 이어서, 상기 cDNA를 주형으로 하여 DNA 폴리머라아제에 의해 이중사슬 DNA를 조제한다. 그리고 상기 이중사슬 DNA를 PCR를 이용하여 증폭한다. 마지막으로, 증폭한 이중사슬 DNA에 RNA 폴리머라아제를 작용시켜 mRNA를 조제하고 증폭한 mRNA를 수득한다 (예를 들어, 하기 특허문헌 1 참조)
[특허문헌 1]
일본특허공개 제2002-238575호 공보(2002년 8월 27일 공개)
그러나 상기 특허문헌 1에 기재된 바와 같은 PCR을 이용하여 mRNA를 증폭하는 방법으로는 짧은 mRNA와 긴 mRNA를 같은 효율로 증폭할 수 없다는 문제가 있다.
구체적으로 설명하면, PCR은 짧은 염기서열은 고효율로 증폭할 수 있으나, 긴 염기서열은 효과적으로 증폭할 수 없는 특성이 있다. 그로 인해 특허문헌 1과 같이 PCR을 이용하여 mRNA의 주형이 되는 증폭용 이중사슬 DNA를 증폭하기 위한 수단에서는, 짧은 염기서열을 갖는 증폭용 이중사슬 DNA는 고효율로 증폭되지만 긴 염기서열을 갖는 증폭용 이중사슬은 고효율로 증폭되지 않는다. 결국 mRNA를 합성할 때의 주형이 되는 증폭용 이중사슬 DNA의 증폭량이, 증폭용 이중사슬 DNA의 염기서열의 길이에 의해 달라지게 된다. 따라서 상기 PCR에서 증폭한 증폭용 이중사슬 DNA를 주형으로 mRNA를 증폭하는 경우, 짧은 mRNA는 고효율로 증폭할 수 있으나 긴 mRNA는 같은 효율로 증폭할 수 없다는 문제가 있다. 이러한 단점은 다양성이 높은 cDNA 라이브러리를 제작하고자 하는 경우에 큰 문제가 된다. 즉, 상기 종래의 방법은 cDNA 라이브러리로서 가장 중요한 mRNA의 양적인 분포가 증폭 후에 크게 붕괴되는 문제가 있다.
그러므로, 염기서열의 길이에 영향을 받지 않고 짧은 mRNA도 긴 mRNA도 똑같이 고효율로 증폭할 수 있는 미량 mRNA 증폭방법의 개발이 강하게 요구되고 있다.
[발명의 개시]
상기 종래의 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 염기서열의 길이에 영향을 받지 않고, 짧은 mRNA도 긴 mRNA도 똑같이 고효율로 증폭할 수 있는 미량 mRNA의 증폭방법 및 그 이용법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 검토를 시행한 결과, 증폭대상인 mRNA가 반응액 중에 극미량밖에 존재하지 않는 경우에, 더미(Dummy) RNA를 반응액에 첨가하여 증폭용 이중사슬 DNA를 합성함으로써, RNA 폴리머라아제의 지적기질농도(至適基質濃度)(밀리몰, mM)로까지 증폭용 이중사슬 DNA의 양을 증가시킬 수 있어서, 지금까지 기질 농도가 낮기 때문에 반응속도가 극히 느렸던 RNA 합성반응의 반응속도를 현저히 상승시키는 것이 가능하게 되어 mRNA를 효율적으로 증폭할 수 있다는 사실을 알아내었다. 그리고 이 기술에 따르면, PCR을 사용하여 이중사슬 DNA를 증폭시키는 공정을 거치지 않으므로 mRNA를 그 염기서열의 길이에 영향을 받지 않고 고효율로 증폭시킬 수 있다는 것을 실증하여, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다. 본 발명은 관련된 새로운 견해에 의거하여 완성된 것으로, 이하의 발명을 포함한다.
즉, 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법은 상기 과제를 해결하기 위해, 미량 mRNA를 포함한 용액에 더미 RNA를 첨가하여 혼합용액을 제작하는 제1 공정; 혼합용액을 주형으로 사용한 역전사 반응에 의해 안티센스 DNA를 합성하는 제2 공정; 합성된 안티센스 DNA에 대해 상보적인 센스 DNA를 합성하고, 센스 DNA와 안티센스 DNA로 이루어진 이중사슬 DNA를 형성하는 제3 공정; 형성된 이중사슬 DNA의 센스 DNA의 5’말단에 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 연결하여 증폭용 이중사슬 DNA를 제작하는 제4 공정; 및 RNA 폴리머라아제에 의해 증폭용 이중사슬 DNA에서 RNA를 증폭하는 제5 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 미량 mRNA에 더미 RNA를 첨가함으로써, 혼합용액 중의 RNA양을 증가시킬 수 있다. 그 결과 혼합용액 중의 RNA가 미량 mRNA만 있는 경우와 비교하여, 제작된 증폭용 이중사슬 DNA의 양이 증가한다. 이때 증폭용 이중사슬의 양은 RNA 폴리머라아제의 지적기질농도로 조제된다. 그 결과 RNA 폴리머라아제에 의한 전사반응을 진행시킬 수 있기 때문에, 염기서열의 길이에 영향을 받지 않고 짧은 mRNA도 긴 mRNA도 똑같이 고효율로 증폭할 수 있다.
결국, 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법에 의하면, 초기발현 RNA의 양이 적기 때문에 이중사슬 DNA의 양이 적어져서, 전사반응이 진행되기 어렵다고 하는 문제점을, 더미 RNA를 사용하여 초기발현 RNA농도를 증가시킴으로써 해결할 수 있다는 점이 특징이라고 할 수 있다.
또한, 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법에서, 상기 제4 공정은 제3 공정에서 형성된 이중사슬 DNA의 양 말단에 프로모터 서열을 연결한 후, 이중사슬 DNA의 센스 DNA 3’말단에 연결된 프로모터 서열만을 절단하는 제6 공정을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 미량 mRNA 및 더미 RNA의 센스사슬만을 선택적으로 전사할 수 있고, 그 결과로 센스사슬만을 증폭할 수 있다.
또한, 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법에서, 상기 제4 공정은 제3 공정에서 형성된 이중사슬 DNA의 양 말단에 프로모터 서열을 연결했을 때, 이중사슬 센스 DNA 3’말단에 연결된 프로모터 서열만을 절단할 수 있도록, 이중사슬 DNA의 센스 DNA의 3’말단에 제한효소부위가 형성될 수 있다.
또한, 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법에서, 상기 제4 공정은 절단된 프로모터 서열 및 더미 RNA를 제거하는 제7 공정을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, RNA 폴리머라아제에 의해 RNA를 증폭할 때, 절단된 프로모터 서열에 RNA 폴리머라아제가 결합하지 않고, 상기 이중사슬 DNA의 센스 DNA 5’말단에 연결된 프로모터 서열에서만 RNA를 전사할 수 있다. 따라서 센스사슬의 미량 mRNA와 더미 RNA를 고효율로 전사할 수 있다.
또한, 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법에서, 상기 더미 RNA의 서열은 폴리 A 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법에서, 상기 더미 RNA 서열은 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 16에 의해 표시되는 염기서열일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 미량 mRNA와 더미 RNA는 모두 폴리 A 서열을 가진다. 따라서 미량 mRNA와 더미 RNA를 역전사할 때 올리고 dT 서열을 포함하는 동일한 프라이머를 사용하여 동시에 역전사할 수 있다.
또한, 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법에서, 상기 더미 RNA는 비오틴화될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 비오틴화된 더미 RNA는 스트렙토아비딘(streptavidin)에 대하여 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서 스트렙토아비딘 칼럼(column) 등을 사용함으로써 반응 용액에서 더미 RNA만을 특이적으로 제거할 수 있다.
또한, 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법에서, 상기 RNA 폴리머라아제는 T7 폴리머라아제, T3 폴리머라아제 또는 SP6 폴리머라아제일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 미량 mRNA와 더미 RNA를 고효율로 전사할 수 있다.
또한, 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법에서, 상기 혼합용액 중의 더미 RNA의 농도가 0.5~10μg/μL일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, RNA 폴리머라아제의 반응에 적합한 농도의 증폭용 이중사슬 DNA를 제작할 수 있다. 그 결과 본래 전사반응속도가 느리기 때문에 증폭할 수 없었던 미량 mRNA를 증폭할 수 있다.
본 발명의 cDNA 라이브러리의 제작방법은 상기 과제를 해결하기 위해 상기 미량 mRNA의 증폭방법을 하나의 공정으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 초기발현의 mRNA량이 미량이어도 효율적으로 mRNA를 증폭할 수 있다. 그러므로 미량 mRNA에서 cDNA 라이브러리를 제작할 수 있다.
본 발명의 프로브의 제작방법은 상기 과제를 해결하기 위해, 상기 미량 mRNA의 증폭방법을 하나의 공정으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 초기발현의 mRNA량이 미량이어도 효율적으로 mRNA를 증폭할 수 있다. 그러므로 미량 mRNA에서 프로브를 제작할 수 있다.
본 발명의 단계적 서브트랙션법은 상기 과제를 해결하기 위해 상기 미량 mRNA의 증폭방법을 하나의 공정으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 초기발현의 mRNA량이 미량이어도 효율적으로 mRNA를 증폭할 수 있다. 그러므로 미량 mRNA에서 단계적 서브트랙션법을 실시할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적, 특징 및 이점은 하기의 설명에 의해 충분히 알 수 있을 것이다. 또한 본 발명의 이익은, 첨부 도면을 참조한 다음 설명으로 명백해질 것이다.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
본 발명의 일 구현예에 대해서, 도 1a, 도 1b, 도 2 내지 도 5를 참조하여 설명하면 하기와 같다. 먼저, 본 발명의 기본 원리에 대하여 종래 기술과 비교하면서 설명한다.
상술한 바와 같이, 종래에는 RNA를 증폭하는 방법으로서, RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열이 연결되는 증폭용 이중사슬 DNA와 RNA 폴리머라아제를 사용하여 RNA를 증폭하는 방법이 사용되었다. 그러나 상기 방법으로는 증폭용 이중사슬 DNA의 양이 많으면 RNA를 증폭할 수 있지만, 증폭용 이중사슬 DNA의 양이 적으면 RNA를 증폭할 수 없다는 문제가 있다.
이와 같이 증폭용 이중사슬 DNA의 양이 적을 때에 RNA를 증폭할 수 없는 이유는, 미카엘리스멘텐식으로부터 용이하게 이해할 수 있다. 즉, cDNA 라이브러리 제작에 사용되는 RNA 폴리머라아제 등의 효소의 지적기질농도는 밀리몰(mM) 정도로 알려져 있다. 상기 지적기질농도(Michaelis 정수:Km 값)는 미카엘리스멘텐식(식 (I) 참조)에서 얻을 수 있다. 한편, 식 (I)에 의하면 Km=(K2+K3)/K1이며, Vmax는 최대반응속도, [S]는 기질 농도를 나타낸다.
V=Vmax[S]/(Km+[S]) .....(I)
[S]=Km일 때, V=Vmax/2이다. 이때, Vmax는 모든 효소가 기질과의 복합체를 형성했을 때의 반응속도이다. 상기 식 (I)에서 [S]가 극단적으로 작은 경우는 효소반응이 거의 진행되지 않는다는 사실을 알 수 있다. 한편 상기 식 (I)에서 [S]는 증폭용 이중사슬 DNA의 농도에 해당하고, 상기 식 (I)에서 반응속도가 계산되는 효소는 RNA 폴리머라아제에 해당한다.
여기에서 특허문헌 1과 같은 종래의 방법에서는 PCR을 사용하여 증폭용 이중사슬 DNA를 증폭하고 그 후, 해당 증폭용 이중사슬 DNA에 RNA 폴리머라아제를 작용시켜 미량 mRNA를 증폭함으로써 상기 문제점을 해결하고 있다.
그러나 상기 PCR을 사용하는 방법에서는 짧은 mRNA와 긴 mRNA를 똑같이 고효율로 증폭할 수 없다. 이 점에 대해서 도 1a를 참고하여 구체적으로 설명한다. 도 1a에서는 주형으로 세 종류의 길이를 갖는 증폭용 이중사슬 DNA를 사용하여, 여기에 DNA 폴리머라아제를 작용시킨 PCR이 예시되어 있다. 이와 같은 PCR에서는 소정의 시간 내에 가장 긴 주형은 1회 증폭되고, 다음으로 긴 주형은 3회 증폭되고, 가장 짧은 주형은 6회 증폭되게 된다. 그 결과 상기 PCR에 의해 증폭된 증폭용 이중사슬 DNA는 짧은 이중사슬 DNA가 많아지면서 동시에 긴 mRNA가 적어지게 된다. 이와 같은 서열의 길이에 의해 양이 편차가 있도록 증폭된, 증폭용 이중사슬 DNA에 RNA 폴리머라아제를 작용시켜 mRNA를 조제하면 결과로 얻을 수 있는 mRNA는 짧은 mRNA가 많아지면서 동시에 긴 mRNA가 적어지게 되는 불리한 점이 있다.
한편, 본 발명에서는 증폭용 이중사슬 DNA를 조제할 때에는 미리 더미 RNA와 증폭대상의 mRNA를 혼재시킨다. 그 결과 증폭대상의 mRNA가 적은 경우에도 역전사 효소의 반응속도를 증가시키게 되어, 효과적인 증폭용 이중사슬 DNA를 합성할 수 있다. 보다 구체적으로 설명하면 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법에서는, 먼저 미량 mRNA에 더미 RNA를 첨가함으로써 모든 RNA의 양을 많게 하여, 외견상 기질농도(Michaelis 정수, Km값)를 상승시킨다. 이 기질 RNA를 사용하여 증폭용 이중사슬 DNA를 제작하므로, 결과적으로 제작된 증폭용 이중사슬 DNA의 양이 RNA 폴리머라아제의 지적기질농도로 조제될 수 있다. 그 결과 mRNA의 양이 적은 경우에 있어서도 본래 진행되지 않는 전사반응을 진행시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법은 RNA 폴리머라아제에 의한 mRNA를 증폭하는 전 단계로서 PCR을 사용할 필요가 없다. 이 때문에 염기서열의 길이에 상관없이 짧은 mRNA와 긴 mRNA를 똑같이 고효율로 증폭할 수 있다. 이점에 대해서는 도 1b를 참조하여 설명한다. 도 1b에서는 RNA 폴리머라아제를 사용하여 RNA를 증폭하는 공정이 도시되어 있다. 본 도면에서는 주형으로 세 종류의 길이를 갖는 증폭용 이중사슬 DNA를 사용하여, 해당 증폭용 이중사슬 DNA에 RNA 폴리머라아제를 작용시켜서 RNA를 증폭하고 있다. 이때 소정의 시간 내에 가장 긴 주형은 6회 증폭되고, 다음으로 긴 주형도 6회 증폭되고, 가장 짧은 주형도 6회 증폭되게 된다. 결국 본 발명에 관련된 mRNA의 증폭방법에서는 소정의 시간 내에 증폭되는 횟수는 증폭용 이중사슬 DNA의 길이에 의존하지 않게 된다. 그러므로 짧은 mRNA와 긴 mRNA를 똑같이 고효율로 증폭할 수 있다.
상술한 바와 같이 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법은 종래의 mRNA 증폭방법과는 전혀 다른 원리에 의해 염기서열의 길이에 영향을 받지 않고, 짧은 mRNA과 긴 mRNA과를 똑같이 고효율로 증폭할 수 있는 획기적인 수법이다. 이하에서 본 발명에 관련된 미량 mRNA의 증폭방법의 각 공정에 대해 상세하게 설명한다.
<미량 mRNA의 증폭방법>
본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법은 미량 mRNA를 포함하는 용액에 더미 RNA를 첨가하여 혼합용액을 제작하는 제1 공정; 혼합용액을 주형으로 사용하여 역전사 반응에 의해 안티센스 DNA를 합성하는 제2 공정; 합성된 안티센스 DNA에 대해 상보적인 센스 DNA를 합성하고 센스 DNA와 안티센스 DNA로 이루어진 이중사슬 DNA를 형성하는 제3 공정; 형성된 이중사슬 DNA의 센스 DNA의 5’말단에 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 연결하여 증폭용 이중사슬 DNA를 제작하는 제4 공정; 및 RNA 폴리머라아제의 의해 증폭용 이중사슬 DNA에서 RNA를 증폭하는 제5 공정을 포함하는 방법으로서, 또 다른 재료, 공정, 조건, 사용기구 등의 구체적인 구성에 대해서는 특별히 한정되는 것은 아니다. 이하에 각 공정에 대해서 상세하게 설명한다.
<제1 공정>
상기 제1 공정은 미량 mRNA를 포함한 용액에 더미 RNA를 첨가하여 혼합용액을 제작하는 공정이다.
본 명세서에서 사용된 “미량 mRNA”의 “미량”이란, 해당 mRNA에서 증폭용 이중사슬 DNA를 합성한 경우, 후단의 제5 공정에 있어서 상기 증폭용 이중사슬 DNA를 주형으로 하여 RNA 폴리머라아제에 의한 전사 반응을 시행했을 때에, 전사반응 속도가 극히 느린 정도의 mRNA의 양을 의미한다. 또한 비교적 mRNA의 양이 많고 RNA 폴리머라아제에 의해 전사반응이 진행되는 경우에도 더미 RNA를 사용함으로써 전사반응 속도를 더욱 증가시킬 수 있음을, 본 명세서에서 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
또한, 본 명세서에서 사용된 “더미 RNA”란 증폭하고자 하는 RNA에 첨가함으로써, 적어도 역전사 반응 시 및 후단의 리가아제 반응 시에 역전사 효소의 기질이 되는 RNA의 양 및 리가아제의 기질이 되는 DNA의 양을 증가시킬 수 있는 RNA를 의미한다.
상기 mRNA는 동물, 식물 또는 미생물 등의 세포 또는 조직 등에서 정제된 mRNA이어도 되고, 또는 합성된 mRNA이어도 되며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한 미량 mRNA의 정제방법도 특별히 한정되는 것이 아니며, 적절한 공지의 방법을 사용하여 정제할 수 있다.
더미 RNA의 서열은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 폴리 A 서열을 포함할 수 있다. 더미 RNA가 폴리 A 서열을 가짐으로써, mRNA와 더미 RNA를 동일한 프라이머를 사용하여 역전사할 수 있다. 예를 들면 상기 프라이머로는 올리고 dT 프라이머를 들 수 있다.
또한, 상기 폴리 A 서열의 길이는, 올리고 dT 프라이머가 특이적으로 어닐링하여 역전사할 수 있는 길이라면 가능하며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 폴리 A 서열은 적어도 18개의 아데닐산으로 이루어질 수 있다.
더욱 구체적으로는 더미 RNA 서열은 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 16에 의해 표시되는 염기서열일 수 있다. 상술한 바와 같이 더미 RNA가 폴리 A 서열을 가짐으로써, 올리고 dT 서열을 포함하는 동일한 프라이머를 사용하여 미량 mRNA와 더미 RNA를 동시에 역전사할 수 있다.
더미 RNA의 제조방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 적절한 공지의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면 더미 RNA는 더미 RNA의 서열을 포함하는 이중사슬 DNA를 도입한 벡터에서 더미 RNA를 발현시킴으로써 제작할 수 있다. 백터를 사용하여 더미 RNA를 제작하는 방법은, 한번 벡터를 구축하면 몇 번이고 더미 RNA를 제작할 수 있기 때문에 낮은 가격으로 대량의 더미 RNA를 제작할 수 있다는 이점이 있다. 구체적으로는 더미 RNA의 염기서열을 코딩하는 센스사슬 DNA와 안티센스 DNA를 합성한 후에 어닐링시켜서 이중사슬 DNA를 형성한다. 그 후 해당 이중사슬 DNA를 발현 벡터 등에 도입하여 공지의 RNA 폴리머라아제에 의해 전사하여 제작할 수 있다. 한편 상기 발현벡터는 특별히 한정되는 것은 아니며, 도입되어 이중사슬 DNA에서 RNA를 전사할 수 있도록 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 갖는 것이면 가능하다.
또한, 더미 RNA는 공지의 방법에 의해 합성하여 제작할 수 있다. 합성에 의해 더미 RNA를 제작하는 방법은 벡터를 사용하여 제작하는 방법에 비해 비용이 들지만, 더미 RNA에 대한 비오틴화 등의 여러 화학적 변형을 실시할 수 있다는 이점이 있다. 예를 들면 더미 RNA를 비오틴화하면 해당 더미 RNA는 스트렙토아비딘에 대해 특이적으로 결합할 수 있다. 결국 비오틴스트렙토아비딘법에 의해, 반응 혼합액 등의 속에서 상기 더미 RNA만을 특이적으로 제거하는 것이 가능하게 된다.
또한, 더미 RNA는 비오틴화될 수 있다. 더미 RNA가 비오틴화됨으로써, 예를 들면 반응용액 중에서 더미 RNA만을 특이적으로 제거할 수 있다. 예를 들면, 더미 RNA를 비오틴화한 경우 비오틴스트렙토아비딘법에 의해 더미 RNA만을 특이적으로 제거할 수 있다. 더미 RNA를 비오틴화하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 적절한 공지의 방법을 사용할 수 있다.
상기 혼합용액 중의 더미 RNA의 농도는 0.5~10μg/μL일 수 있다. 또한, 상기 혼합용액 중의 더미 RNA의 농도는 0.5~2.5μg/μL인 것이 보다 바람직하고, 1μg/μL인 것이 가장 바람직하다. 또한 이들의 바람직한 농도 범위는 후술하는 실시예에 있어서 발명자들이 예의 검토하여 독자적으로 결정한 농도범위이다. 더미 RNA의 농도가 상기 농도이므로, 혼합용액 중의 RNA의 양 전부를 밀리몰(mM) 정도로 조제할 수 있다. 그 결과 혼합용액에서 제작된 증폭용 이중사슬 DNA의 농도도 밀리몰(mM) 정도가 된다. RNA 폴리머라아제의 지적기질농도는 밀리몰(mM) 정도이므로, 그 결과 본래의 증폭용 이중사슬 DNA의 양이 적기 때문에 진행이 어려운 전사반응을 보다 고효율로 진행시킬 수 있다.
상기 미량 mRNA와 더미 RNA를 포함한 혼합용액의 용매는 후단의 역전사 반응을 저해하는 것이 아니면 가능하며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면 물 또는 트리스-HCl 등 완충액으로 사용하는 재료를 적절히 사용할 수 있다.
<제2 공정>
제2 공정은 혼합용액을 주형으로 사용한 역전사 반응에 의해 안티센스 DNA를 혼합하는 공정이다.
본 공정을 도 2의 단계 1에 모식적으로 나타내었다. 본 공정에서는 도 2의 단계 1에 표시된 바와 같이, 혼합용액 중의 미량 mRNA와 더미 RNA를 주형으로 사용한 역전사 반응에 의해, 상기 미량 mRNA 및 상기 더미 RNA의 안티센스 DNA가 합성된다. 본 공정에서 사용된 역전사 효소는 특별히 한정되는 것은 아니며, 공지의 역전사 효소를 적절하게 사용할 수 있다.
또한, 프라이머로는 미량 mRNA와 더미 RNA에 어닐링할 수 있는 것이면 가능하며, 특별히 한정되는 것은 아니나, 미량 mRNA와 더미 RNA가 모두 폴리 A 서열을 갖는 경우에는 올리고 dT 프라이머를 사용할 수 있다. 올리고 dT 프라이머에 의해 양쪽 RNA를 동시에 역전사할 수 있고 그 결과 단순하게 조작 가능하고 경비를 절약할 수 있다.
<제3 공정>
제3 공정은 제2 공정에서 합성된 안티센스 DNA에 대한 상보적인 센스 DNA를 합성하여, 센스 DNA와 안티센스 DNA에서 만들어진 이중사슬 DNA를 형성하는 공정이다.
본 공정을 도 2의 단계 2에 모식적으로 나타내었다. 본 공정에서는 도 2의 단계 2에 나타낸 바와 같이, DNA 폴리머라아제는 안티센스 DNA에 대한 상보적인 센스 DNA를 합성할 수 있으면 가능하며, 적절한 공지의 DNA 폴리머라아제를 사용할 수 있다.
또한, 제3 공정은 DNA 폴리머라아제가 센스 DNA를 합성하는 전 단계로서, RNase에 의해 상기 제2 공정에서 안티센스 DNA를 합성할 때 주형으로 사용되는 미량 mRNA와 더미 RNA를 분해하는 단계가 포함될 수 있다. 상기 RNase는 미량 mRNA과 더미 RNA를 분해할 수 있는 것이면 가능하며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면 상기 RNase로서 RNase H를 사용할 수 있다.
<제4 공정>
제4 공정은 제3 공정에서 형성된 이중사슬 DNA의 센스 DNA의 5’말단에 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 연결하여 증폭용 이중사슬 DNA를 제작하는 공정이다.
상기 제4 공정은 결과로서 제3 공정에서 형성된 이중사슬 DNA의 센스 DNA 5’말단에만 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 연결하는 공정으로서, 그 방법은 특별히 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 상기 제4 공정은 제3 공정에서 형성된 이중사슬 DNA의 양 말단에 RNA 폴리머라아제의 프로모터서열을 포함하는 증폭 어댑터를 연결한 후, 이중사슬 DNA의 센스 DNA 3’말단에 연결된 증폭 어댑터만을 절단하는 제6 공정을 포함할 수 있다. 이중사슬 DNA의 센스 DNA 3’말단에 연결된 증폭 어댑터만을 절단하는 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 제한효소를 사용하여 절단하는 것이 바람직하다. 제한효소를 사용하여 절단하는 경우에는, 제3 공정에서 형성된 이중사슬 DNA의 양 말단에 프로모터 서열을 연결했을 때 이중사슬 DNA의 센스 DNA 3’말단에 연결되어 프로모터 서열만을 절단할 수 있게, 이중사슬 DNA의 센스 DNA 3’말단에 제한효소부위가 형성되도록 하는 것이 바람직하다. 이때 상기 제한효소는 이중사슬 DNA의 센스 DNA 5’말단에 존재하지 않으면 가능하며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 제한효소부위는 올리고 dT 프라이머 내로 도입하는 것이 바람직하다.
본 공정을 도 2의 단계 3에 모식적으로 나타내었다. 단계 3에서는 먼저 단계 2에서 형성된 이중사슬 DNA의 양 말단에 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 포함하는 증폭 어댑터를 연결하고 있다. 이때, 상기 이중사슬 DNA의 센스 DNA의 3’말단에 증폭 어댑터가 연결되었을 때만, 해당 3’말단에 Not Ⅰ 부위가 형성되도록 올리고 dT 프라이머를 제작한다. 따라서 증폭 어댑터가 연결된 후 이중사슬 DNA를 Not Ⅰ에서 처리하면, 상기 이중사슬 DNA의 센스 DNA의 3’말단에 연결된 증폭 어댑터만을 절단할 수 있다. 또한, 상기 이중사슬 DNA의 5’말단에 연결된 증폭 어댑터만이 절단되도록 하는 것도 가능하다. 이처럼, 연결된 증폭 어댑터의 한쪽을 절단함으로써 센스 RNA만, 또는 안티센스 RNA만을 선택적으로 증폭하는 것이 가능하게 된다.
또한, 상기 제4 공정은 절단된 증폭 어댑터 및 더미 RNA를 제거하는 제7 공정을 포함할 수 있다. 제7 공정에서 절단된 증폭 어댑터 및 더미 RNA를 제거함으로써 후단의 제5 공정에 있어서 RNA 폴리머라아제에 의해 RNA를 증폭할 때, 절단된 증폭 어댑터 및 더미 RNA에 RNA 폴리머라아제가 결합하지 않고, 상기 이중사슬 DNA의 5’말단에 연결된 증폭 어댑터에만 RNA 폴리머라아제가 결합할 수 있다. 따라서 미량 mRNA와 더미 RNA를 고효율로 전사할 수 있음과 동시에, 미량 mRNA의 증폭공정에서 발생하기 쉬운 여러 소음을 감소시킬 수 있다.
상기 제7 공정은 절단된 증폭 어댑터 및 더미 RNA를 제거할 수 있는 것이면 가능하며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 제7 공정으로는 겔 여과 칼럼을 사용한 사이즈 분획법을 사용할 수 있다. 한편, 상기 겔 여과 칼럼은 특별히 한정되지 않아, 분획하고 싶은 사이즈에 따라 적절한 공지의 방법을 사용ㅎ할 수 있다. 상기 겔 여과 칼럼을 사용한 사이즈 분획법을 사용하면, 절단된 증폭 어댑터 및 더미 RNA의 양쪽을 동시에 제거할 수 있다. 또한, 더미 RNA가 비오틴화된 경우, 상기 제7 공정에서는 비오틴·스트렙토아비딘법 등에 의한 더미 RNA 제거공정이 포함될 수 있다. 비오틴은 스트렙토아비딘에 대해서 특이적으로 결합할 수 있음이 알려져 있다. 따라서 반응용액을 스트렙토아비딘 칼럼 등에 통과시키면, 비오틴화된 더미 RNA를 특이적으로 제거할 수 있다.
상기 증폭 어댑터에는 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열이 포함된다. 상기 프로모터 서열로서는 RNA 폴리머라아제가 결합하고, 동시에 해당 프로모터 서열의 하류에 위치하는 염기서열을 전사할 수 있는 것이면 가능하며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 프로모터 서열로서는, T7 프로모터 서열, T3 프로모터 서열 또는 SP6 프로모터 서열을 포함하는 염기서열을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 각 프로모터 서열의 구체적인 염기서열을 예시하면,
T7 프로모터 서열:5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’ (서열번호 1)
T3 프로모터 서열:5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’ (서열번호 2)
SP6 프로모터 서열:5’-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3’(서열번호 3)
을 들 수 있다.
상기 프로모터 서열을 이중사슬 DNA에 연결하는 경우, 상기 프로모터 서열을 포함하는 서열과 해당 서열의 안티센스 DNA를 어닐링시켜 증폭 어댑터를 형성시킨 후, 해당 증폭 어댑터를 이중사슬 DNA에 연결시키는 것이 바람직하다. 한편, 상기 프로모터 서열과 해당 프로모터 서열의 안티센스 DNA 제작방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 공지의 방법을 사용해서 합성할 수 있다.
또한, 상기 증폭 어댑터를 이중사슬 DNA에 연결시키는 경우, DNA 리가아제를 사용해서 연결할 수 있다. 상기 DNA 리가아제로는 증폭 어댑터를 이중사슬 DNA에 연결할 수 있는 것이면 가능하며, 특별히 한정되는 것은 아니다.
〈제5 공정〉
제5 공정은 RNA 폴리머라아제에 의해, 증폭용 이중사슬 DNA에서 RNA를 증폭하는 공정이다.
상기 제5 공정은 도 2의 단계 4에 나타낸 바와 같이, 상기 제4 공정에서 형성된 증폭용 이중사슬 DNA와 RNA 폴리머라아제를 이용하여 미량 mRNA와 더미 RNA를 증폭하는 공정이다. 상기 RNA 폴리머라아제는, 증폭용 이중사슬 DNA에 연결된 증폭 어댑터 중의 프로모터 서열에 결합하고, 동시에 해당 프로모터 서열의 하류에 위치하는 DNA에서 RNA를 전사할 수 있는 것이면 가능하며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 RNA 폴리머라아제는, T7 폴리머라아제, T3 폴리머라아제 또는 SP6 폴리머라아제일 수 있다. 또한, 상기 프로모터 서열로는 각 RNA 폴리머라아제에 의해 전사 제어를 받을 수 있는 프로모터 서열을 사용할 수 있다.
<cDNA 라이브러리의 제작방법>
본 발명의 cDNA 라이브러리의 제작방법은 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법을 하나의 공정으로서 포함하는 것이면 가능하며, 그 밖의 재료, 공정, 조건, 사용기구 등의 구체적인 구성은 특별히 한정되는 것은 아니다.
구체적으로 본 발명의 cDNA 라이브러리의 제작방법은 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법에 의해 얻어지는 증폭된 mRNA로부터 이중사슬 DNA를 제작하고, 그 후, 해당 이중사슬 DNA를 벡터에 도입하는 공정을 포함할 수 있다. 그 제작방법도 특별히 한정되는 것은 아니며, 공지의 방법을 적절히 사용하여 제작할 수 있다 (예를 들면, “바이오 매뉴얼 시리즈 2 유전자 라이브러리 작성법” (노지마 히로시·편저) 요도사, 1994, 또는 “기초생화학 실험법” (오오시마 타이로·편저) 제 4권, 핵산·유전자 실험 Ⅱ, 동경화학동인, 2000 참조).
본 발명의 cDNA 라이브러리의 제작방법의 일례를 도 4에 모식적으로 나타내었다. 한편, 본 발명이 하기의 설명에 한정되는 것은 아니라는 것을 명심해야 할 것이다.
도 5의 단계 1은, 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법의 제5 공정에서 증폭된 mRNA를 주형으로 사용한 역전사 반응에 의해, 안티센스 DNA를 합성하는 단계이다. 그 방법은 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법의 제2 공정에 따르면 된다. 한편, 상기 제5 공정에서 증폭된 mRNA에는 증폭된 미량 mRNA와 증폭된 더미 RNA가 포함된다.
도 5의 단계 2는, 상기 단계 1에서 합성된 안티센스 DNA에 상보적인 센스 DNA를 합성해서 센스 DNA와 안티센스 DNA로 이루어진 이중사슬 DNA를 형성하는 단계이다. 그 방법은 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법의 제3 공정에 따르면 된다.
도 5의 단계 3은, 상기 단계 2에서 형성된 이중사슬 DNA의 센스 DNA의 5’말단에 DNA 리가아제를 사용하여 연결 어댑터를 연결하는 단계이다. 상기 DNA 리가아제로는, 연결 어댑터를 이중사슬 DNA의 양말단에 연결할 수 있는 것이면 가능하며, 특별히 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 연결 어댑터는 이중사슬 DNA의 양말단에 연결할 수 있는 것이면 가능하며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 상기 올리고 dT 프라이머의 염기서열은, 연결 어댑터가 이중사슬 DNA의 양 말단에 연결된 경우에, 한쪽의 연결 어댑터만이 제한효소에 의해 절단될 수 있는 염기서열을 가지는 것이 바람직하다. 상기 제한효소는 특별히 한정된 것은 아니다. 예를 들면, 도 5의 단계 3에서는 상기 제한효소가 Not Ⅰ인 경우를 예시하고 있다. 또한, 상기 연결 어댑터는 이중사슬 DNA에 연결되지 않은 쪽이 제한효소 부위가 되도록 제작될 수 있다. 상기 제한효소 부위는 특별히 한정된 것은 아니다. 예를 들면, 도 5의 단계 3에서는 상기 제한효소 부위가 Bgl Ⅱ 부위인 경우를 예시하고 있다. 그 결과, 단계 3에서 Not Ⅰ에 의해 처리된 후의 이중사슬 DNA의 양 말단에는 Bgl Ⅱ 부위 및 Not Ⅰ 부위가 존재하므로 용이하게 벡터에 도입할 수 있다.
상기 단계 3의 다음으로, 절단된 연결 어댑터와 증폭된 더미 RNA를 제거하기 위해, 단계 4가 포함될 수 있다. 단계 4는 절단된 연결 어댑터와 증폭된 더미 RNA가 제거될 수 있는 것이면 가능하며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 단계 4로서 겔 여과 칼럼을 사용한 부위 분획법을 사용할 수 있다. 한편, 상기 겔 여과 칼럼은 특별히 한정되지 않아, 분획하고자 하는 사이즈에 따라 적절한 공지의 방법을 사용할 수 있다. 또한 상기 단계 4는 여러 차례 시행하는 것이 바람직하다. 단계 4를 여러 차례 시행함으로써 절단된 연결 어댑터와 증폭된 더미 RNA를 보다 고효율로 제거할 수 있다.
상기 단계 1~4를 거쳐 정제된 이중사슬 DNA를 DNA 리가아제를 이용하여 벡터에 도입시킴으로써, cDNA 라이브러리를 제작할 수 있다. 상기 벡터는 특별히 한정되는 것이 아니며, 적절한 공지의 벡터를 이용할 수 있다. 예를 들면, 플라스미드벡터(Plasmid vector), 코스미드벡터(Cosmid vector), 또는 파아지벡터(Phage vector) 등 공지의 벡터를 이용할 수 있다.
<프로브의 제작방법>
본 발명의 프로브 제작방법은 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법을 하나의 공정으로서 포함하는 것이면 가능하며, 그 밖의 재료, 공정, 조건, 사용기구 등의 구체적인 구성은 특별히 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명의 프로브의 제작방법은, 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법에 의해 증폭된 mRNA를 이용하여 프로브를 제작하는 방법이다. 본 명세서에서 “프로브”라는 것은 RNA 프로브 및 DNA 프로브를 가리킨다. mRNA로부터 RNA 프로브 또는 DNA 프로브를 제작하는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 적절한 공지의 방법 (예를 들면, “바이오 매뉴얼 시리즈 2 유전자 라이브러리 작성법” : (노지마 히로시·편저) 요도사, 1994, 또는 “기초생화학 실험법” (오오시마 타이로·편저) 제 4권, 핵산·유전자 실험 Ⅱ, 동경화학동인, 2000 참조) 에 따라 제작할 수 있다.
본 발명의 프로브의 제작방법은, 예를 들면, cDNA 마이크로어레이용의 프로브를 제작할 수 있다.
<단계적 서브트랙션법>
본 발명의 단계적 서브트랙션법 (별칭: 다단차인법)은 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법을 하나의 공정으로서 포함하는 것이면 가능하며, 그 밖의 재료, 공정, 조건, 사용기구 등의 구체적인 구성은 특별히 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명의 단계적 서브트랙션법은 본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법에 의해 증폭된 mRNA를 피검 대상으로 사용해 시행되는 단계적 서브트랙션법이다. 상기 단계적 서브트랙션법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 적절한 공지의 방법 (예를 들면, “바이오 매뉴얼 시리즈 2 유전자 라이브러리 작성법”(노지마 히로시·편저) 요도사, 1994, 또는 “기초생화학 실험법”(오오시마 타이로·편저) 제 4권, 핵산·유전자 실험 Ⅱ, 동경화학동인, 2000 참조)에 따라 제작할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 특징을 나타내는 도면이다.
도 1b는 본 발명의 특징을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예를 나타내는 것으로, 본 발명의 미량 mRNA 증폭방법의 각 공정을 나타내는 흐름도이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예를 나타내는 것으로, 더미 RNA의 제작방법을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예를 나타내는 것으로, 본 발명의 cDNA 라이브러리 제작방법의 각 단계를 나타내는 흐름도이다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 제작된 더미 RNA 제작용 벡터의 모식도이다.
도 6a는 본 발명의 실시예에서 더미 RNA의 최적량을 검토한 결과를 나타내는 전기영동도이다.
도 6b는 본 발명의 실시예에서 더미 RNA의 최적량을 검토한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7a는 본 발명의 실시예에서 증폭 가능한 미량 mRNA량을 나타내는 전기영동도이다.
도 7b는 본 발명의 실시예에서 증폭 가능한 미량 mRNA량을 나타내는 전기영동도이다.
도 7c는 본 발명의 실시예에서 증폭 가능한 미량 mRNA량을 나타내는 전기영동도이다.
도 8은 본 발명의 실시예에서 cDNA 라이브러리의 인서트 길이의 분포를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 증폭된 mRNA의 사이즈 분포를 나타내는 그래프이다.
도 9b는 증폭된 mRNA의 사이즈 분포를 나타내는 그래프이다.
도 10a는 증폭된 mRNA의 사이즈 분포의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 10b는 증폭된 mRNA의 사이즈 분포의 비교를 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 실시예에서 한 종류의 RNA에 대한 증폭효과를 나타내는 전기영동도이다.
도 12는 본 발명의 실시예에서 서로 다른 염기서열을 갖는 더미 RNA를 사용한 경우의 mRNA의 증폭효과를 나타내는 전기영동도이다.
도 13은 본 발명의 실시예에서 형광색소 교환실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 본 발명의 실시예에서 cDNA 라이브러리의 제작공정을 나타내는 흐름도이다.
본 발명에 대해서 실시예에 근거해 보다 구체적으로 설명하겠지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서, 변경, 수정 및 변형할 수 있다.
[1: 더미 RNA 제작용 벡터의 제작]
먼저, 본 발명의 더미 RNA 제작용 벡터의 제작방법에 대해, 도 4를 사용하여 설명한다.
먼저, 더미 RNA의 센스사슬과 안티센스사슬이 어닐링해서 이루어지는 더미 RNA 유닛을 제작하였다. 더미 RNA 유닛을 제작하기 위해서 더미 RNA의 센스사슬과 안티센스사슬을 각각 합성하였다. 한편, 상기 센스사슬의 5’말단은, 벡터로의 도입을 위해서 인산화하였다. 이하에, 센스사슬 및 안티센스사슬의 염기서열을 나타내었다.
센스 : 5’-AATTCGTCTGGACACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGC-3’
(서열번호 4)
안티센스 : 5’-GGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGTATCCAGACG-3’
(서열번호 5)
상기 센스사슬과 안티센스사슬의 농도를 각각 동일하게 하고, 동시에 센스사슬과 안티센스사슬과의 전량이 0.35μg/μL이 되도록 어닐링버퍼(10mM 트리스-HCL (pH7.5), 1mM EDTA, 10mM MgCl₂) 중에 용해하였다. 그 후, 65℃에서 2분간, 37℃에서 10분간 및 실온에서 5분간의 조건하에서 차례로 보온함으로써 센스사슬과 안티센스사슬을 어닐링시켜 더미 RNA 유닛을 제작하였다. 한편, 상기 더미 RNA 유닛의 양 말단에는, EcoR 1 부위 및 Not Ⅰ 부위가 형성되고, 양 제한효소 부위를 이용하여 발현 벡터에 도입할 수 있다.
이어서, 상기 더미 RNA 유닛을 도입하기 위한 벡터를 제작하였다. 해당 벡터로서는, pAP 3neo (다카라 바이오사제)를 사용하였다. pAP 3neo를 EcoR1 및 Not Ⅰ로 절단한 후, 아가로스 겔에 전기영동하고, 해당 아가로스 겔에서 pAP 3neo를 정제하였다. 이어서, 상기 pAP 3neo에, 상기 더미 RNA 카세트를 도입함으로써 더미 RNA제작용 벡터(pDurin-1)을 제작하였다.
[2:더미 RNA의 조정]
상기 pDurin-1을 사용하여 더미 RNA를 제작하는 방법은, 하기 1)~11)의 방법에 따랐다. 또한, 상기 pDurin-1을 사용하여 더미 RNA를 제작하는 방법에 대해서, 도 3에 모식적으로 나타내었다.
1) 먼저, 10μg의 pDurin-1에 20μL의 10×Not Ⅰ 버퍼 (100mM 트리스-HCL (pH7.5), 1.5M NaCl, 70mM MgCl2, 10mM DTT, 0.1% BSA, 0.1% 트리톤 X-100)를 첨가하고, 다시 물을 첨가해 전량을 200μL로 하였다.
2) 5 유닛의 Not Ⅰ을 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 보온하였다. 반응 후, pDurin-1이 절단되어 있는 것을, 아가로스 전기영동으로 확인하였다.
3) 상기 반응액에 반응액과 동량(210μL)의 페놀·클로로포름 용액(1:1)을 첨가하여 교반하였다.
4) 마이크로파아지에서 1분간 원심분리를 시행하였다.
5) 원심분리 후, 상청액을 새 마이크로파아지 튜브에 옮겨, 상청액의 약 0.08배의 양(17μL)의 3M 초산나트륨과 상청액의 약 2배의 양(420μL)의 에탄올을 첨가하여 드라이아이스 속에서 15분간 냉각하였다.
6) 마이크로파아지에서 15분간 원심분리하여, 얻어진 침전물을 500μL의 70% 에탄올을 사용하여 가볍게 씻은 후, 2초간 원심분리를 시행하였다. 상청액을 제거한 후, 다시 2초간 원심분리를 시행하였다. 마이크로 튜브의 바닥에 모인 소량의 70% 에탄올을 제거한 후, 침전물을 건조시키지 않고 젖은 상태에서 다음 조작으로 진행하였다.
7) Not Ⅰ에서 절단된 pDurin-1을 포함하는 상기 침전물에, 20μL의 10×T7 Pol 버퍼 (400mM 트리스-HCL (pH8.0), 80mM MgCl₂, 20mM 스퍼미딘, 50mM DTT), 16μL의 25mM NTP 믹스를 첨가하고, 다시 물을 첨가해 전량을 200μL로 하였다.
8) 50 유닛(약 1~5μL)의 T7 RNA 폴리머라아제를 첨가해 37℃에서 60분간 보온하였다.
9) 다시 5 유닛(약 1μL)의 DNase I(RNase 활성의 혼입이 없는 것)을 첨가해 37℃에서 20분간 보온하였다.
10) 상기 3)~6)과 같은 조작을 시행하여, 침전물을 얻었다.
11) 10)에서 얻어진 침전물에 100μL의 TE (10mM 트리스-HCL (pH 7.5), 0.1mM EDTA)를 첨가해, 더미 RNA의 농도를 UV미터로 측정하였다. 한편, 용액이 OD260=1.0이면, 해당 용액 중의 더미 RNA의 농도는 40μg/μL이다. 더미 RNA의 농도를 측정한 후, 더미 RNA의 농도가 5μg/μL이 되도록 TE를 더 첨가하였다. 그 후, 더미 RNA를 마이크로파아지 튜브 등에 분주하여, 20℃ 또는 80℃로 보존하였다. 상술한 바와 같이 하여, 더미 RNA 제작용 벡터를 이용하여 더미 RNA를 제작하였다.
또한, 상기 방법 이외의 방법으로서, 화학합성에 의해 더미 RNA를 제작하였다. 이 때, 더미 RNA를 화학 합성함과 동시에 그 3’말단을 비오틴화하였다. 비오틴화한 더미 RNA를 HPLC에 의해 정제하였다. 한편, 이처럼 비오틴화된 더미 RNA는 구입도 가능하다. 이하에 상기 더미 RNA의 염기서열을 나타낸다.
더미 RNA : 5’-AATTCGTCTGGACACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’
(서열번호 6)
합성된 더미 RNA를 1μg/mL의 농도가 되도록 물에 녹인 후, 20℃ 또는 80℃로 보존하였다. 이상의 실험에는 비오틴화된 더미 RNA를 사용하였다.
[3: 이중사슬 DNA의 제작]
이중사슬 DNA의 제작방법은 하기 1)~10)에 따랐다.
1) 먼저, 1ng 정도의 라이브러리화하고자 하는 미량 mRNA(대략 100개의 세포유래)에 더미 RNA를 0, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 또는 10.0μg 첨가하고, 각각의 전량이 7.5μL가 되도록 5mM 트리스-HCL (pH7.5)를 첨가하였다. 다음으로 65℃에서 5분간 가열처리한 후, 냉각하였다. 한편, 미량 mRNA의 취득 방법은 공지의 mRNA 취득 방법에 따랐다. 구체적으로는, QuickPrep Micro mRNA Purification Kit(아머샴 바이오사이언스사제)를 사용하여 미량 mRNA를 취득하였다. 또한, 구체적인 조작은 첨부한 프로토콜에 따랐다. 한편, mRNA 추출 시 더미 RNA를 첨가하면, RNase에 의한 mRNA의 분해를 최소한으로 억제할 수 있다. 또한, 본 실시예에서는 미량 mRNA로서 293T 세포유래 또는 HeLa 세포유래의 mRNA를 사용하였다.
2) 상기 미량 mRNA와 더미 RNA와의 혼합물에, 2.5μL의 10×First Strand buffer(500mM 트리스-HCL (pH8.3), 750mM KCl, 30mM MgCl₂), 2.5μL의 0.1M DTT, 1.5μL의 10×First Strand Mixture(10mM dATP, 10mM dGTP, 10mM dTTP, 5mM 5-methyl-dCTP), 1.0μL(1.6μg)의 (T7) 링커 프라이머 및 0.5μL(20 유닛)의 RNase Inhibitor(프로메가사제)를 순차적으로 첨가하였다. 그 후, 물을 첨가해 전량을 25μL로 하였다. 한편, 이하에 (T7) 링커 프라이머의 서열을 나타낸다. 한편, 상기 (T7) 링커 프라이머는 HPLC에 의해서 정제된 것을 사용하였다.
(T7) 링커 프라이머:
5'-GAGAGAGAGAGAGAGATAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
(서열번호 7)
3) 실온에서 10분간 방치함으로써, mRNA와 (T7) 링커 프라이머를 어닐링하였다.
4) 1μL(50 유닛)의 StrataScript RT(스트라테이진사제, 스트라테이진 cDNA 신테시스 키트)와 0.5μL의 수퍼스크립트 Ⅲ(인비트로겐사제)을 첨가해, 42℃에서 45분간 반응시켰다. 그 후, 다시 0.5μL의 수퍼스크립트 Ⅲ을 더 첨가해, 50℃에서 30분간 반응시켰다. 그 후, 다시 55℃에서 30분간 반응시켰다.
5) 반응 종료 후, 반응액을 얼음 속으로 옮겼다.
6) 상기 반응액을 얼음 속에서 냉각한 상태로 20μL의 10×Second Strand Buffer (188mM 트리스-HCL (pH8.3), 906mM KCl, 46mM MgCl₂), 7.5μL의 0.1M DTT 및 3μL의 Second Strand Nucleotide Mixture(10mM dATP, 10mM dGTP, 10mM dTTP, 25mM dCTP)를 첨가하였다. 그 후, 냉각한 물을 첨가해 전량을 200μL로 하였다.
7) 다시, 얼음 속에서 5분간 보냉하였다.
8) 1.5μL(2 유닛)의 RNase H (다카라 바이오사제)와 10μL(50 유닛)의 E.coli DNA 폴리머라아제 I(다카라 바이오사제)을 넣었다.
9) 16℃에서 50분간 반응시켰다.
10) 200μL의 페놀·클로로포름 용액을 첨가하여 잘 교반한 후, 원심분리(15,000rpm, 3분, 4℃)를 시행하였다. 상청액을 새 튜브에 옮겨 에탄올 침전(80℃에서 10분 이상)을 시행한 후, 침전물을 70% 에탄올로 세정하였다. 침전물은 건조시키지 않고 이하의 공정에 사용하였다.
[4: 더미 RNA의 최적량에 관한 검토]
이중사슬 DNA의 제작 시에 있어서 더미 RNA의 양과 이중사슬 DNA의 제작효율과의 관계를 검토하였다.
상기 침전물을 85mL의 물에 용해한 후, 그 중의 1μL를 템플릿으로서 사용하였다. 해당 템플릿에 대해서, 1μL의 10×Ex 버퍼, 0.8μL의 dNTP 믹스, 하기의 프라이머(hsGAPDH-F 및 hsGAPDH-R)를 각각 1μL, 0.1μL의 Ex taq, 5.1μL의 물을 첨가하여 전량을 10μL로 하였다. 그리고 95℃에서 5분간 변성한 후, 95℃에서 30초간의 변성반응, 55℃에서 30초간의 어닐링 반응 및 72℃에서 1분간의 신장 반응으로 이루어진 사이클을 30~50 사이클을 시행하는 PCR 반응을 시행하였다. 한편, 미량 mRNA가 약 1 세포 유래인 경우에 상기 사이클 수는 50 사이클인 것이 바람직 하며, 미량 mRNA가 약 10 세포 유래인 경우에 상기 사이클 수는 40 사이클인 것이 바람직하고, 미량 mRNA가 약 100 세포 유래인 경우에 상기 사이클 수는 30 사이클일 수 있다.
hsGAPDH-F : 5’-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3’ (서열번호 8)
hsGAPDH-R : 5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’ (서열번호 9)
PCR 반응 후, PCR 반응산물(5μL)을 2% 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 전기영동 후, 각 밴드의 형광강도를 “Socion Image(NIH Image)”로 측정하였다. 한편, 결과에 대해서는 후술하는 [결과 1]에서 설명한다.
[5: 미량 mRNA의 양에 관한 검토]
293T 세포 또는 HeLa 세포에서 추출한 mRNA (약 0.1ng (약 10 세포에 상당), 또는 약 0.01ng (약 1 세포에 상당)에 1.0μg의 더미 RNA를 첨가한 샘플과 더미 RNA를 첨가하지 않은 샘플을 조정하였다.
해당 샘플을 사용하여 상술한 방법에 따라 이중사슬 DNA를 제작하였다. 그리고 상기 [4 : 더미 RNA의 최적량에 관한 검토]에 기재한 방법에 따라 본 발명의 증폭방법에 의해 증폭 가능한 미량 mRNA의 양에 대해서 검토하였다. 미량 mRNA가 0.01ng인 경우에는 PCR 반응의 사이클 수를 50 사이클로 하고, 미량 mRNA가 0.1ng인 경우에는 PCR 반응의 사이클 수를 40 사이클로 하였다. 결과에 대해서는 후술하는 [결과 2]에서 설명한다.
[6 : 증폭용 이중사슬 DNA의 제작]
증폭용 이중사슬 DNA의 제작방법은 이하의 1)~13)에 따랐다.
1) 증폭 어댑터를 제작하기 위해서, 센스사슬과 안티센스사슬을 각각 합성하였다. 상기 센스사슬에는 T7 폴리머라아제의 프로모터 서열이 포함되어 있다. 이하에 센스사슬 및 안티센스사슬의 염기서열을 나타낸다.
센스 T7: 5’-CACTAGTACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAATTCCCCGGG-3’
(서열번호 10)
안티센스 T7: 5’-CCCGGGGAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGTACTAGTGAGCT-3’
(서열번호 11)
상기 센스 T7과 안티센스 T7의 농도를 각각 동일하게 하고, 동시에 센스 T7과 안티센스 T7의 전량이 0.35μg/μL이 되도록, 어닐링 버퍼(10mM 트리스-HCL (pH7.5), 1mM EDTA, 10mM MgCl₂) 중에 용해하였다. 그 후, 65℃에서 2분간, 37℃에서 10분간 및 실온에서 5분간의 조건 하에서 순서대로 보온함으로써 센스 T7과 안티센스 T7을 어닐링시켜, 증폭 어댑터를 제작하였다. 상기 증폭 어댑터를 20℃에서 보존하였다.
2) [3: 이중사슬 DNA의 제작]에서 정제한 침전물에 10μL의 10×T4 DNA 폴리머라아제 버퍼, 5μL의 2.5mM dNTP 믹스처 및 물을 첨가해, 전량을 100μL로 하였다. 해당 용액에 3.5μL(약 5 유닛)의 T4 DNA 폴리머라아제를 첨가해 37℃에서 10 분간 반응시켰다. 다음으로 100μL 페놀·클로로포름 용액을 더 첨가하여 교반한 후, 원심분리를 시행하였다. 그 후, 상청액을 새 튜브에 옮겨 에탄올 침전(80℃에서 10분 이상)을 시행한 후, 침전물을 70% 에탄올로 세정하였다. 해당 공정에 의해 평활말단화된 이중사슬 DNA를 얻었다.
3) 상기 평활말단화된 이중사슬 DNA(침전물)에 2μL의 10×리가아제 버퍼(500mM 트리스-HCL (pH7.5), 70mM MgCl₂, 10mM DTT), 2μL의 10mM rATP 및 1μL의 증폭 어댑터(0.35μg)를 첨가한 후, 다시 물을 첨가해 전량을 18.5μL로 하였다.
4) 1.5μL(약 4 유닛)의 T4 DNA 리가아제를 첨가한 후, 8℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.
5) 70℃에서 30분간 가열 처리를 함으로써 리가아제를 실활시켰다. 다음으로 5초간 원심분리를 시행하여 상청액을 정제하였다.
6) 이때, [3: 이중사슬 DNA의 제작]에서 침전에 의해 정제된 이중사슬 DNA의 양 말단에는 증폭 어댑터가 접속되어 있다. 이 경우, 해당 이중사슬 DNA에 T7 RNA 폴리머라아제를 작용시키면 미량 mRNA의 센스사슬뿐만 아니라 안티센스사슬도 전사된다. 따라서 Not Ⅰ로 처리하여 미량 mRNA의 안티센스사슬의 전사를 제어하는 증 폭 어댑터만을 제거하였다. 먼저, 상기 상청액에 27μL의 Not Ⅰ 버퍼 서플리먼트(278mM NaCl, 8mM MgCl₂, 1.8mM DTT, 0.018% 트리톤 X-100) 및 3μL의 Not Ⅰ을 첨가해 37℃에서 90분간 반응시켰다. 반응 후, 5μL의 10×STE 및 2μg의 tRNA를 첨가하였다. 상술한 바와 같이하여, mRNA를 증폭하기 위한 증폭용 이중사슬 DNA를 제작하였다.
7) 다음으로 제한효소에 의해 절단된 증폭 어댑터를 제거하기 위해 CHROMA SPIN-400(클론테크사제)을 사용하여 사이즈 분획을 시행하였다. 먼저, CHROMA SPIN-400을 균일하게 현탁(칼럼을 상하로 흔들어 섞는 것)하고나서 상하의 뚜껑을 제거하였다. CHROMA SPIN-400을 부속 튜브(또는 뚜껑을 제거한 1.5mL 마이크로파아지 튜브)에 두어, 10분간 정치하여 칼럼 중에 잉여로 존재하는 1×TE(100mM NaCl, 10mM 트리스-HCL (pH8.0), 1mM EDTA)를 배출하였다. 다시, 상기 CHROMA SPIN-400과 1.5mL 마이크로파아지 튜브를 15mL의 플라스틱 튜브에 넣어, 그 상태로 저속원심을 시행하였다. 또한, 저속원심기(BECKMAN J2-21)를 사용하여, 1800rpm, 3분간의 조건(700×g)으로 원심분리를 시행하였다.
8) 저속원심분리 후, 1.5mL 마이크로파아지 튜브에서 나온 버퍼를 제거하고, 다시 1800rpm으로 3분간의 조건에서 원심분리를 시행하였다.
9) 저속원심분리 후, 1.5mL 마이크로파아지 튜브에서 나온 버퍼를 제거하였 다.
10) 상기 CHROMA SPIN-400을 새 1.5mL 마이크로파아지 튜브에 삽입하여 CHROMA SPIN-400의 중심 수지 상에, 6)에서 제작한 증폭용 이중사슬 DNA를 10μL 첨가하였다. 새로운 마이크로파아지 튜브에 삽입된 CHROMA SPIN-400을 15mL의 플라스틱 튜브에 넣어, 저속원심기를 사용하여 1800rpm, 5분간의 조건으로 원심분리를 시행하였다.
11) 마이크로파아지 튜브에서 나온 샘플(약 50 μL)에 130μL의 TE, 20μL의 5M NaCl 및 동량의 페놀·클로로포름 용액을 첨가하여 잘 교반한 후, 2분간 원심분리하였다.
12) 상층의 수층을 새 튜브로 옮겨, 400μL의 100% 에탄올을 첨가해 교반한 후, 80℃에서 10분간, 또는 20℃에서 하룻밤 동안 정치하였다.
13) 상기 수층을 15000rpm, 10분간, 4℃의 조건에서 원심분리하여 침전물을 회수한 후, 해당 침전물을 70% 에탄올로 세정하였다.
이상의 공정에 의해 증폭용 이중사슬 DNA를 제작하였다.
[7: 더미 RNA의 제거]
1) 상기 [6: 증폭용 이중사슬 DNA의 제작]에서 회수한 침전물을 물에 용해한 후, 스트렙토아비딘을 첨가하여 충분히 교반한 후, 실온에 5분간 정치하였다.
2) 반응용액에 페놀·클로로포름 용액을 첨가하여 교반하고, 수층을 회수하였다. 또한, 더미 RNA·스트렙토아비딘 복합체는 페놀·클로로포름층으로 이동하므로, 수층을 회수함으로써 더미 RNA를 제거할 수 있다.
3) 2)에서 남은 페놀·클로로포름 층에 TE를 첨가하여 교반한 후, 재차 수층을 회수하였다.
4) 상기 2) 및 3)의 공정에서 회수한 수층에 스트렙토아비딘을 첨가하여, 상기 1)~3)의 공정을 반복 시행하였다.
5) 미니센트-30 필터(동소제)(MINICENT-30(Cat.#08627))을 사용하여, 회수한 수층에서 증폭용 이중사슬 DNA를 정제하였다. 또한, 정제 방법은 첨부한 프로토콜에 따랐다.
[8: cDNA 라이브러리의 제작]
cDNA 라이브러리의 제작공정을 도 14에 나타냄과 동시에, 상세한 사항을 이 하에 설명한다.
1) 제작한 증폭용 이중사슬 DNA(침전물)에 1μL의 더미 RNA(5μg/μL), 10μL 10×T7 Pol 버퍼, 8μL의 25mM NTPmix, 및 물을 첨가하여 전량을 95μL~99μL로 하였다.
2) 상기 용액에 50 유닛(약 1~5μL)의 T7 RNA 폴리머라아제를 첨가하여, 37℃에서 60분간 보온하였다.
3) CHROMA SPIN-400을 사용하여 상술한 방법에 따라 증폭된 과잉량의 더미 RNA를 제거하였다. 또한, 더미 RNA가 제거된 후 증폭된 mRNA는 에탄올 침전에 의해 침전물로서 회수하였다. 또한 본 실시예에서는 여기서 얻어진 mRNA를 사용하여 [3: 이중사슬 DNA의 제작]~[8: cDNA 라이브러리의 제작]의 3)의 공정을 합계 4회 반복 증폭한 mRNA를 이후의 공정에 사용하였다.
4) 상기 3)에서 회수된 mRNA에 7.5μL의 5mM 트리스-HCL(pH7.5)을 첨가하여, 65℃에서 5분간 가열 처리 후, 냉각하였다.
5) 상기 용액에, 2.5μL의 10×First Strand Buffer, 2.5μL의 0.1M DTT, 1.5μL의 10×First Strand Mixture, 1.0μL(1.6μg)의 (T7) 링커 프라이머(서열번호 7) 및 0.5μL(20 유닛)의 RNase Inhibiter(프로메가사제)를 순차적으로 첨가하였다. 그 후, 물을 첨가하여 전량을 25μL로 하였다.
6) 상기 용액을 실온에 10분간 방치함으로써 mRNA와 (T7) 링커 프라이머를 어닐링하였다.
7) 상기 용액에 1μL(50 유닛)의 StrataScript RT(스트라테이진사제, 스트라테이진 cDNA 신테시스 키트)와 0.5μL의 수퍼스크립트 Ⅲ(인비트로겐사제)를 첨가하여, 42℃에서 45분간 반응시켰다. 그 후, 0.5μL의 수퍼스크립트 Ⅲ을 더 첨가하여 50℃에서 30분간 반응시킨 후, 다시 55℃에서 30분간 반응시켰다.
8) 반응 종료 후, 상기 용액을 얼음 속으로 옮겼다.
9) 상기 용액을 얼음 속에서 냉각시킨 상태로 20μL의 10×Second Strand Buffer, 7.5μL의 0.1M DTT 및 3μL의 Second Strand Nucleotide Mixture를 첨가하였다. 그 후, 냉각시킨 물을 첨가하여 전량을 200μL로 하였다.
10) 상기 용액을 거듭 얼음 속에서 5분간 보냉하였다.
11) 상기 용액에, 1.5μL(2 유닛)의 Rnase H(다카라바이오사제)와 10μL(50 유닛)의 E. coli DNA 폴리머라아제Ⅰ(다카라바이오사제)를 첨가하였다.
12) 상기 용액을, 16℃에서 150분간 반응시켰다.
13) 상기 용액에 200μL의 페놀·클로로포름용액을 첨가하여 잘 교반시킨 후, 원심분리(15,000rpm, 3분, 4℃)를 시행하였다. 상청액을 새 튜브로 옮겨 에탄올 침전(-80℃에서 10분 이상)을 시행한 후, 침전물을 70％ 에탄올에서 세정하였다.
14) 상기 침전물에 10μL의 10×T4 DNA 폴리머라아제 버퍼, 5μL의 2.5mM dNTP 믹스처 및 물을 첨가하여 전량을 100μL로 하였다. 해당 용액에 3.5μL (약 5 유닛)의 T4 DNA 폴리머라아제를 첨가하여, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이어서 100μL의 페놀·클로로포름용액을 첨가하여 교반시킨 후, 원심분리를 시행하였다. 그 후 상청액을 새 튜브로 옮겨서 에탄올 침전(-80℃에서 10분 이상)을 시행한 후, 침전물을 70％ 에탄올에서 세정하였다. 해당 공정에 의해 평활말단화된 이중사슬 DNA를 얻었다.
15) 상기 평활말단화된 이중사슬 DNA(침전물)에, 2μL의10×리가아제 버퍼, 2μL의 10mM rATP 및 두 종류의 어댑터(전량 1μL, 0.35μg)을 첨가한 후, 물을 첨 가하여 전량을 20μL로 하였다. 또한, 상기 어댑터의 한쪽은, 이하 서열번호 12에서 나타내는 BamHI(Bgl Ⅱ)-SmaI 단편이 복수 연결된 서열을 갖는 이중사슬 DNA로 이루어진 어댑터이다. 그리고 상기 어댑터의 다른 한쪽은, 이하 서열번호 13에서 나타낸 SmaI 단편이 복수 연결된 서열을 갖는 이중사슬 DNA로 된 어댑터이다.
BamHI(Bgl Ⅱ)-SmaI단편 : 5'-GATCCCCGGC-3' (서열번호 12)
SmaI단편 : 5'-CCCGGG-3' (서열번호 13)
또한, 해당 어댑터의 제작방법은, 상술한 센스 T7과 안티센스 T7로 이루어진 증폭 어댑터 제작방법을 따랐다.
16) 상기 용액에 1.5μL(약 4 유닛)의 T4 DNA 리가아제를 첨가한 후, 8℃에서 하룻밤 반응시켰다.
17) 상기 용액에 대해 70℃에서 30분간 가열 처리함으로써, 리가아제를 실활시켰다. 이어서, 5초간 원심분리를 시행하여 상청액을 정제하였다.
18) 상기 용액에, 27μL의 NotⅠ버퍼 서플리먼트 및 3μL의 NotⅠ을 첨가하여, 37℃에서 90분간 반응시켰다. 반응 후, 5μL의 10×STE 및 2μg의 tRNA를 첨가하였다. 그 후, CHROMEA SPIN-400을 사용하여 상술한 방법에 따라 잔존하는 더미 RNA등을 제거하였다. 또한, 더미 RNA 등이 제거된 후의 이중사슬 DNA는, 에탄올 침전에 의해 침전물로 회수하였다.
19) 상기 침전물에 3μL의 10×리가아제 버퍼, 3μL의 10mM rATP 및 1μL(100ng~300ng)의 pAP 3neo벡터(NotⅠ및 Bgl Ⅱ에서 절단해 둠)를 첨가한 후, 물을 첨가하여 전량을 30μL로 하였다.
20) 상기 용액에 3μL(4 유닛)의 T4 DNA 리가아제를 첨가한 후, 12℃에서 하룻밤 반응시켰다.
21) 상기 용액을 70℃에서 30분간 가열하였다.
22) 가열 후, 상기 용액에 70μL의 TE 및 100μL의 페놀·클로로포름용액을 첨가하여 교반한 후, 1분간 원심분리(15,000rpm)를 시행하였다. 원심분리 후, 100μL의 상청액을 회수하였다. 필터(밀리포어사제의 UFCP3TK50)을 사용하여 상기 상청액을 무균화하였다.
23) 상기 무균화한 용액(5μL)을, 전기천공법(Electroporation)으로 대장균(GIBCO-BRL사제의 ElectroMAX DH12S Cells)에 도입하였다. 또한, 일렉트로포레이션은 2.5kv, 129옴의 조건 하에서 시행하였다. 전압을 가한 후의 대장균을 SOC배지에서 37℃에서 1시간 배양하였다.
24) 상기 대장균을 100mL의 LB배지(암피실린을 50mg/L의 농도로 포함한다)에 옮겼다. 10μL 또는 100μL의 대장균 함유 LB배지를, 각각 암피실린을 함유하는 LB배지(고체 배지)위에 뿌리고 37℃에서 하룻밤 배양하여, 대장균의 형질변환효율을 산출하였다. 또한, 나머지 대장균 함유 LB배지는 OD600 =1.0에 도달할 때까지 37℃에서 수 시간 배양하였다. 배양 후, 대장균 함유 LB배지에 DMSO를 첨가하여 해당 용액을 -80℃에서 동결 보존하였다.
또한, 라이브러리 제작에 있어서, 통상의 cRNA 라이브러리 제작 프로토콜(예를 들면 “바이오 매뉴얼 시리즈 2 유전자 라이브러리의 작성법” (노지마 히로시·편저) 요도사, 1994 또는 “기초 생화학 실험법” (오오시마 타이로·편저) 제4권, 핵산·유전자 실험Ⅱ, 동양 화학 동인, 2000 참조)를 참조하여 제작할 수도 있다. 또한, 결과에 대해서는 후술하는 [결과 3]에서 설명한다.
[결과 1]
도 6a 및 도 6b에 더미 RNA의 최적량을 검토한 결과를 나타내었다. 또한, 본 실시예에서는, 더미 RNA의 효과를 검토하는 데 있어서, GAPDH의 cDNA화의 효율을 지표로 하고 있다. 그러나 GAPDH는 단지 지표의 일례로, 더미 DNA는 다른 유전자의 cDNA화에 대해서도 GAPDH와 같은 효과를 가진다는 사실을 당업자라면 쉽게 이해할 것이다.
도 6a 및 도 6b에 나타낸 것처럼, 약 1ng의 라이브러리화하고자 하는 미량 mRNA(약 100개의 세포 유래)에, 더미 RNA를 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 또는 10.0μg 첨가한 경우에는 모두 더미 RNA를 첨가하지 않은 경우와 비교하여, cDNA가 고효율로 합성되는 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 것처럼 미량 mRNA에 더미 RNA 1μg을 첨가한 경우가 가장 고효율로 cDNA를 합성할 수 있었다.
[결과 2]
도 7a, 도 7b 및 도 7c에 증폭 가능한 미량 mRNA의 양을 검토한 전기영동도를 나타내었다.
도 7a 및 도 7b에 나타낸 것처럼 미량 mRNA(293T 세포 유래)의 양이 0.1ng인 경우에도, 미량 mRNA의 양이 0.01ng인 경우에도, 모두 cDNA가 고효율로 합성되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 7c에 나타낸 것처럼 HeLa 세포 유래의 미량 mRNA(0.01ng)에서도 cDNA가 고효율로 합성되는 것을 확인할 수 있었다.
[결과 3]
도 8에, cDNA 라이브러리의 인서트 길이 분포를 나타내었다. 또한, 상기 실시예에서는 6.6×105cfu의 콜로니를 얻었다. 해당 콜로니에 대해, 인서트 삽입률을 검토한 결과 38.3%(23클론/60클론)이었다. 또한 23 클론 중 인간 유전자가 삽입되 어 있는 것은 15 클론이며, 해당 15 클론 중 2 클론만이 같은 유전자(표 3의 샘플 3)를 삽입하고 있었다.
도 8에 나타낸 것처럼, 본 발명의 방법에서 제작한 cDNA 라이브러리에는 긴 인서트가 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 인서트의 평균 길이는 0.75kb이었다.
또한, cDNA 라이브러리의 인서트 서열의 판독 결과를 하기 표 1에 나타냈다.
Figure 112009018069973-pct00001
본 발명의 방법으로 제작된 cDNA 라이브러리의 품질과, 100만개의 293T 세포에서 추출한 mRNA를 사용하여 종래의 방법(Kobori M et al., Genes Cells, 1998 ; 3 : 459-475)에서 제작한 cDNA 라이브러리의 품질을 다시 비교하였다.
구체적으로는, 임의로 선택한 28 유전자에 대해 해당 유전자가 상기 라이브러리에 포함되어 있는지 여부를 PCT법을 사용하여 검토하였다.
표 2에, 본 발명의 방법으로 제작된 cDNA 라이브러리 및 종래의 방법으로 제작된 cDNA 라이브러리 양쪽에 포함되어 있는 유전자를 나타내었다.
Figure 112009018069973-pct00002
표 2에 나타낸 것처럼, 28 유전자 중 25 유전자는 양쪽의 라이브러리에 포함되어 있었다.
또한 표 3에, 종래의 방법으로 제작한 cDNA 라이브러리에만 존재한 유전자를 나타내었다.
Figure 112009018069973-pct00003
표 1~3에서도 밝혀진 바와 같이, 본 발명의 방법으로 제작한 cDNA 라이브러리에는, 다양성이 풍부한 인서트가 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 본 발명의 방법으로 제작한 cDNA 라이브러리에는, 세포 내 발현량이 낮은 유전자도 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 본 발명의 방법으로 제작된 라이브러리는 다량의 mRNA를 사용하여 제작된 라이브러리와 비교해도 손색없는 복잡도, 삽입 효율 및 평균 사슬 길이를 가지고 있다.
[결과 4]
더미 RNA에 의해 증폭된 cDNA풀(Pool) 사이즈의 편차 및 mRNA 증폭효율의 상승효과에 대해서, 미량 RNA의 정확한 분석이 가능한 어질런트사에서 제작한 바이오 분석기(Bioanalyzer2100)를 사용하여 평가하였다.
구체적으로는 더미 RNA를 사용하여 첫 번째의 mRNA의 증폭을 시행하고 그 후, GAPDH의 증폭을 PCR법에 의해 확인하였다. 그리고, 증폭된 mRNA와 더미 RNA를 사용하여, 두 번째 mRNA의 증폭을 시행하고 그 후, 더미 RNA의 mRNA증폭 효과를 조사하였다.
먼저 상술한 프로토콜에 따라 증폭용 이중사슬 DNA를 제작한 후, 형광 색소(Cy5)를 사용하여 라벨화 cRNA의 증폭을 시행하였다. 그 후, 실험 결과를 일렉트로 페로그램(Electro pherogram)(중합)을 사용하여 표시하게 하였다.
그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, 더미 RNA를 사용하여 증폭을 시행한 cRNA는 더미 RNA를 첨가하지 않은 증폭에 비해 6배 이상의 증폭 상승이 관찰되었다. 만약을 위해, 별도의 형광 색소(Cy3)를 사용하여 같은 실험을 실행한 경우에도 더미 RNA를 사용한 경우 청색선에서 30배 이상의 증폭 효과가 인정되었다(도 9b 참조).
녹색 선은 RNA 사다리의 정점을 나타내고, 더미 RNA를 첨가한 두 줄의 청색 선은 더미 RNA를 첨가하지 않은 것에 비해, 4kb 이상의 고효율로 전사 증폭되어 있는 것을 알 수 있다. 그 결과는 더미 RNA를 첨가함으로써, 소수의 mRNA를 역전사 효소에 의해 cDNA화하고, T7 RNA 폴리머라아제에 의한 전사증폭에서의 효소 반응이 편차 없이 광범위한 mRNA에 대해 균일하게 시행되고 있는 것을 나타낸다. 이 점은 증폭의 편차를 피할 수 없는 PCR법과 비교해 더미 RNA를 사용하는 기술이 우수하다는 것을 시사한다.
[결과 5]
더미 RNA를 사용하여 제작한 나노cDNA 라이브러리의 mRNA의 종류에 대해, 증폭이 편향된 유전자를 포함하지 않은 지의 여부를 조사하기 위해, 어질런트사의 cDNA 마이크로어레이(2색법, Dyeswap법)를 사용하여 검증하였다.
구체적으로는, 10개의 HeLa 세포 상당의 극미량 RNA에서 더미 RNA를 사용하여 증폭한 나노cDNA 라이브러리(+dRNA)와, 100만 개 정도의 HeLa 세포 유래의 대량 mRNA를 사용하여 종래의 방법에 따라 제작한 cDNA 라이브러리(-dRNA)를 비교하였다.
먼저, 양쪽의 cDNA 라이브러리에서 유래한 플라스미드DNA(PlasmidDNA)를 사용하여 T7 RNA 폴리머라아제에 의해 mRNA를 전사시킨 후, RNase를 사용하여 상기 mRNA를 처리하였다.
상기 mRNA를 시료로 하여 상술한 프로토콜에 따라 증폭용 이중사슬 DNA를 제작한 후, 형광 색소(Cy5)를 사용하여 라벨화 cRNA의 증폭을 시행하였다. 이상의 각각의 RNA 농도를 측정한 결과, 나노cDNA 라이브러리가 0.06mg/mL, 통상의 나노 cDNA 라이브러리가 0.53mg/mL이었다. 또한 이들의 사이즈 분포를 바이오 분석기(Bioanalyzer 2100)를 사용하여 평가한 결과, Cy5 표지(도 10a참조)에서도 Cy3 표지(도 10b 참조)에서도 모두 동일한 정도의 취득률과 사이즈 분포를 나타내었다.
다음, 이들 표지 RNA를 프로브로 하여 44,000개의 cDNA가 탑재되어 있는 cDNA 마이크로어레이(어질런트사제인 “어질런트 Hu44K”)를 사용하여 형광 색소 교환 실험(DyeSwap)을 시행하였다. 또한 형광색소 교환실험의 실험결과는 (-dRNA/Cy3 vs +dRNA/Cy5)/ (+dRNA/Cy3 vs -dRNA/Cy3)에서 구하였다. 구체적으로는, 1개의 어레이상에 Cy3 및 Cy5에 의해 각각 표지된 두 종류의 샘플을 경합적으로 하이브리드화 시켜서 실험결과를 구하였다.
도 13에, 형광색소 교환실험의 결과를 나타내었다. 또한, 도 13에서는 같은 형광 강도를 갖는 유전자군은 중앙 영역의 흑색으로 나타내고, 더미 RNA를 첨가한 경우에 하이브리드화 강도가 증가한 유전자군은 상측의 진회색으로 나타냈으며, 더미 RNA를 첨가함으로써 하이브리드화 강도가 감소한 유전자군은 하측의 연회색으로 나타내었다.
각각의 프로브가 하이브리드화한 cDNA의 강도 분포를 비교한 결과, 양쪽은 불과 몇 개의 유전자만 다를 뿐, 패턴이 대체로 일치하였다. 이것은 양쪽 cDNA 라이브러리의 품질이 거의 일치하는 cDNA 분자종을 갖는다는 것을 시사한다. 즉, 더미 RNA를 사용하여 10개의 HeLa 세포 상당의 극미량 RNA를 출발점으로 하여 제작한 나노 cDNA 라이브러리가 고품질인 것으로 밝혀졌다.
[결과 6]
상술한 예는, 세포에서 정제한 mRNA 즉 다양한 종류의 mRNA를 함유하는 mRNA 혼합물을 증폭한 경우에 대해 검토한 것이다. 거기서, 본 발명의 방법이 한 종류의 mRNA를 고효율로 증폭하는 것이 가능한지 그 여부를 검토하였다.
한 종류의 mRNA로는 인간 GAPDH의 mRNA를 사용하였다. 인간 GAPDH의 mRNA는 하기의 GAPDH S프라이머 및 GAPDH AS프라이머를 사용한 PCR법에 의해 HeLa cDNA 라이브러리에서 복제하였다.
GAPDH S: 5'-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3' (서열번호 14)
GAPDH AS:
5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTGAGCACAGGGTACTTTATTG-3'
(서열번호 15)
인간 GAPDH에 상당하는 DNA단편 (약 1300bp)을 추출한 후, 해당 DNA단편을 TA-복제법에 의해 pT7 블루 벡터(인비트로겐 Corp., Carlsbad, CA, USA)에 삽입하였다.
얻어진 벡터를 BamHI처리에 의해 직쇄상(直鎖狀)으로 한 후, 정제하였다. 정제 후, MEG Ascript(엠비온사제)를 사용하여 RNA를 전사하였다(37℃에서 4시간). 그 후, 터보 DNA-프리(엠비온사사제)를 첨가하여, 37℃에서 1시간의 DNase처리를 시행하였다. 그 후 전사된 RNA를 정제하였다.
상기 인간 GAPDH의 mRNA를 사용하여, 상술한 [3: 이중사슬 DNA의제작]~[6: 증폭용 이중사슬 DNA의 제작]에 따라 증폭용 이중사슬 DNA를 제작하였다. 또한, 본 실시예에서 사용한 인간 GAPDH의 mRNA의 양은, 4.9, 0.49, 0.049, 또는 0.0049fg이었다. 또한 본 실시예에서 사용한 더미 RNA는, 서열번호 6에 나타난 더미 RNA이었다.
도 11에 나타낸 것처럼, 본 실시예의 방법이라면, 0.49fg/mL라는 미량농도의 mRNA도 증폭할 수 있었다. 또한, 도 11에서는, PCR법을 사용하여 인간 GAPDH의 mRNA의 증폭을 확인하였으며, 이때 PCR법의 증폭회수는 40회였다.
[결과 7]
상이한 서열을 갖는 더미 RNA도 같은 mRNA증폭 효과를 갖는지의 여부를 검토하였다.
상술한 [3: 이중사슬 DNA의 제작]~[6: 증폭용 이중사슬 DNA 제작]에 따라 1μg의 서열번호 16에 나타낸 더미 RNA를 사용하여, 10개의 293T 세포에서 정제한 mRNA(약0.1ng)을 증폭하였다. 이하에 더미 RNA의 염기서열을 나타내었다. 또한 도 12의 더미 RNA는 “Not Ⅰ-dRNA”로 나타내었다.
더미 RNA: 5'-AATCTGTCGCGGCCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'
(서열번호 16)
도 12에 나타낸 것처럼, 본 실시예의 방법이라면, 상이한 서열을 갖는 더미 RNA를 사용한 경우에도 mRNA를 증폭할 수 있다. 또한 도 12에서는 PCR법을 사용하여 인간 GAPDH의 mRNA의 증폭을 확인하였으며, 이때 PCR법의 증폭회수는 40회였다.
본 발명은 이상에서 설명하여 나타낸 각 구성에 한정되는 것은 아니고, 특허 청구의 범위에 나타낸 범위 내에서 변경 가능하며, 상이한 실시 형태나 실시예에 여러 방법으로 개시된 기술적 수단을 적절히 조합시켜 얻어지는 실시 형태나 실시예에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
본 발명의 미량 mRNA의 증폭방법은 미량 mRNA를 포함하는 용액에 더미 RNA를 첨가하여 혼합용액을 제작하는 제1 공정; 혼합용액을 주형으로 사용한 역전사 반응에 의해 안티센스 DNA를 합성하는 제2 공정; 합성된 안티센스 DNA에 대해 상보적인 센스 DNA를 합성하여 센스 DNA와 안티센스 DNA로 이루어진 이중사슬 DNA를 형성하는 제3 공정; 형성된 이중사슬 DNA의 5' 말단에 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 연결하여 증폭용 이중사슬 DNA를 제작하는 제4 공정; 및 RNA 폴리머라아제에 의해 증폭용 이중사슬 DNA에서 RNA를 증폭하는 제5 공정을 포함한다.
상기의 방법에 의하면, 이중사슬 DNA를 증폭시키기 위해서 PCR을 사용하지 않기 때문에, 증폭하는 미량 mRNA의 염기서열의 길이에 영향을 받지 않고, 짧은 mRNA과 긴 mRNA 모두 고효율로 증폭할 수 있는 효과를 나타낸다. 그러므로 cDNA 라이브러리, 프로브의 제작이나 단계적 서브트랙션의 실시 등에 이용할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서는 미량 mRNA를 더미 RNA와 함께 증폭시키기 때문에 미량 mRNA를 고효율로 증폭시킬 수 있고, 동시에 증폭된 미량 mRNA에 편차가 없다.
그를 위해, 본 발명은, RT-PCR, cDNA 마이크로어레이, cDNA 라이브러리의 제작, mRNA의 증폭, (예를 들면, SPIA등) mRNA를 사용한 표지 프로브의 제작 및 단계적 서브트랙션에 이용할 수 있을 뿐 아니라, 미량 mRNA의 증폭 공정을 필요로 하는 분야에 널리 응용할 수 있다.
또한, 현재의 연구 경향은 한 세포에서 여러 세포를 대상으로 한 나노 레벨의 분석으로 진전되어 있고, 극소량의 mRNA에서 cRNA를 고효율로 합성할 수 있다 면, 그 만큼 상세한 데이터를 얻을 수 있다. 따라서 본 발명은 소수의 세포밖에 채취할 수 없어, 유전자 레벨의 해석이 늦어지던 줄기 세포의 연구나, 환자의 환부 조직을 사용한 병인해석에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명과 다단차인법(多段差引法)을 조합시킴으로써, 한 개의 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 포괄적인 단리를 할 수 있을 것이다.
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Claims (12)

  1. 삭제
  2. 미량 mRNA를 포함하는 용액에 더미(dummy) RNA를 첨가하여 혼합 용액을 제작하는 제1 공정;
    상기 혼합용액 중의 미량 mRNA 및 더미 RNA 모두를 주형으로 사용한 역전사 반응에 의해 안티센스 DNA를 합성하는 제2 공정;
    합성된 안티센스 DNA에 대해 상보적인 센스 DNA를 합성하여, 센스 DNA와 안티센스 DNA로 이루어진 이중사슬 DNA를 형성하는 제3 공정;
    형성된 이중사슬 DNA의 센스 DNA의 5' 말단에 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 연결하여 증폭용 이중사슬 DNA를 제작하는 제4 공정; 및
    RNA 폴리머라아제에 의해 증폭용 이중사슬 DNA로부터 RNA를 증폭하는 제5 공정을 포함하고,
    상기 제4 공정이 상기 제3 공정에서 형성된 이중사슬 DNA의 양 말단에 프로모터 서열을 연결한 후, 이중사슬 DNA의 센스 DNA의 3' 말단에 연결된 프로모터 서열만을 절단하는 제6 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 미량 mRNA의 증폭방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제4 공정은 상기 제3 공정에서 형성된 이중사슬 DNA의 양 말단에 프로모터 서열을 연결했을 때, 이중사슬 DNA의 센스 DNA의 3' 말단에 연 결된 프로모터 서열만을 절단할 수 있도록 이중사슬 DNA의 센스 DNA의 3' 말단에 제한효소 부위가 형성되는 것을 특징으로 하는 미량 mRNA의 증폭방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 제4 공정은 절단된 프로모터 서열 및 더미 RNA를 제거하는 제7 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 미량 mRNA의 증폭방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 더미 RNA의 서열이 폴리 A 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 미량 mRNA의 증폭방법.
  6. 미량 mRNA를 포함하는 용액에 더미(dummy) RNA를 첨가하여 혼합 용액을 제작하는 제1 공정;
    상기 혼합용액 중의 미량 mRNA 및 더미 RNA 모두를 주형으로 사용한 역전사 반응에 의해 안티센스 DNA를 합성하는 제2 공정;
    합성된 안티센스 DNA에 대해 상보적인 센스 DNA를 합성하여, 센스 DNA와 안티센스 DNA로 이루어진 이중사슬 DNA를 형성하는 제3 공정;
    형성된 이중사슬 DNA의 센스 DNA의 5' 말단에 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 연결하여 증폭용 이중사슬 DNA를 제작하는 제4 공정; 및
    RNA 폴리머라아제에 의해 증폭용 이중사슬 DNA로부터 RNA를 증폭하는 제5 공정을 포함하고,
    상기 더미 RNA의 서열이 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 16에 의해 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는 미량 mRNA의 증폭방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 더미 RNA는 비오틴화된 것을 특징으로 하는 미량 mRNA의 증폭방법.
  8. 제2항에 있어서, 상기 RNA 폴리머라아제가 T7 폴리머라아제, T3 폴리머라아제 또는 SP6 폴리머라아제인 것을 특징으로 하는 미량 mRNA의 증폭방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 혼합용액 중 상기 더미 RNA의 농도가 0.5~10μg/μL인 것을 특징으로 하는 미량 mRNA의 증폭방법.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 미량 mRNA의 증폭방법을 한 공정으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA 라이브러리의 제작방법.
  11. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 미량 mRNA의 증폭방법을 한 공정으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브의 제작방법.
  12. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 미량 mRNA의 증폭방법을 한 공정으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 단계적 서브트랙션법.
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