JP5078038B2 - 微量mRNAの増幅方法およびその利用 - Google Patents
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Description
〔特許文献1〕
特開2002−238575号公報(平成14年8月27日公開)
しかしながら、上記特許文献1に記載のような、PCRを利用してmRNAを増幅する方法では、短いmRNAと長いmRNAとを同じ効率で増幅することができないという問題点を有している。
V=Vmax[S]/(Km+[S])・・・・・(I)
[S]=Kmであるとき、V=Vmax/2である。このとき、Vmaxは、全ての酵素が、基質との複合体を形成したときの反応速度である。上記(I)式から、[S]が極端に少ない場合には、酵素反応がほとんど進まないことが理解できる。なお、上記(I)式における[S]が、増幅用二本鎖DNAの濃度に相当し、上記(I)式にて反応速度が算出される酵素が、RNAポリメラーゼに相当する。
本発明の微量mRNAの増幅方法は、微量mRNAを含む溶液にダミーRNAを添加して混合溶液を作製する第1工程と、混合溶液を鋳型として用いた逆転写反応によって、アンチセンスDNAを合成する第2工程と、合成されたアンチセンスDNAに対して相補的なセンスDNAを合成して、センスDNAとアンチセンスDNAとからなる二本鎖DNAを形成する第3工程と、形成された二本鎖DNAのセンスDNAの5’末端側にRNAポリメラーゼのプロモーター配列を連結して増幅用二本鎖DNAを作製する第4工程と、RNAポリメラーゼによって、増幅用二本鎖DNAからRNAを増幅する第5工程と、を含む方法であればよく、その他の材料、工程、条件、使用器具等の具体的な構成については特に限定されるものではない。以下に各工程について詳細に説明する。
上記第1工程は、微量mRNAを含む溶液にダミーRNAを添加して混合溶液を作製する工程である。
第2工程は、混合溶液を鋳型として用いた逆転写反応によって、アンチセンスDNAを合成する工程である。
第3工程は、第2工程にて合成されたアンチセンスDNAに対して相補的なセンスDNAを合成して、センスDNAとアンチセンスDNAとからなる二本鎖DNAを形成する工程である。
第4工程は、第3工程にて形成された二本鎖DNAのセンスDNAの5’末端側にRNAポリメラーゼのプロモーター配列を連結して増幅用二本鎖DNAを作製する工程である。
T7プロモーター配列 :5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’(配列番号1)
T3プロモーター配列 :5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’ (配列番号2)
SP6プロモーター配列:5’-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3’(配列番号3)
を挙げることができる。
第5工程は、RNAポリメラーゼによって、増幅用二本鎖DNAからRNAを増幅する工程である。
本発明のcDNAライブラリーの作製方法は、本発明の微量mRNAの増幅方法を一工程として含むものであればよく、その他の材料、工程、条件、使用器具等の具体的な構成については特に限定されるものではない。
本発明のプローブの作製方法は、本発明の微量mRNAの増幅方法を一工程として含むものであればよく、その他の材料、工程、条件、使用器具等の具体的な構成については特に限定されるものではない。
本発明の段階的サブトラクション法(別名:多段差引法)は、本発明の微量mRNAの増幅方法を一工程として含むものであればよく、その他の材料、工程、条件、使用器具等の具体的な構成については特に限定されるものではない。
〔実施例〕
本発明について、実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
まず、本発明のダミーRNA作製用ベクターの作製方法について、図4を用いて説明する。
Sense :5’-AATTCGTCTGGACACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGC-3’(配列番号4)
Antisense:5’-GGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGTATCCAGACG-3’(配列番号5)
上記センス鎖とアンチセンス鎖とを、それぞれの濃度が等しく、かつセンス鎖とアンチセンス鎖との全量が0.35μg/μLとなるように、アニーリングバッファー(10mM Tris-HCl(pH7.5),1mM EDTA,10mM MgCl2)中に溶解した。その後、65℃にて2分間、37℃にて10分間、および室温にて5分間の条件下において順に保温することによってセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせ、ダミーRNAユニットを作製した。なお、上記ダミーRNAユニットの両末端には、EcoRIサイトおよびNotIサイトが形成されており、両制限酵素サイトを用いて、発現ベクターに組み込むことができる。
上記pDurin−1を用いてダミーRNAを作製する方法は、以下の1)〜11)に従った。また、上記pDurin−1を用いてダミーRNAを作製する方法について、図3に模式的に示す。
ダミーRNA:5’-AATTCGTCTGGACACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(配列番号6)
合成されたダミーRNAを、1μg/mLの濃度になるように水に溶かした後、−20℃または−80℃にて保存した。なお、以下の実験には、ビオチン化されたダミーRNAを用いた。
二本鎖DNAの作製方法は、以下の1)〜10)に従った。
(T7)Linker Primer:5’-GAGAGAGAGAGAGAGATAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(配列番号7)
3)室温にて10分間放置することによって、mRNAと(T7)Linker Primerとをアニーリングさせた。
二本鎖DNAの作製時におけるダミーRNAの量と、二本鎖DNAの作製効率との関係を検討した。
hsGAPDH-F:5’-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3’(配列番号8)
hsGAPDH-R:5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’(配列番号9)
PCR反応の後、PCR反応産物(5μL)を2%アガロースゲルにて電気泳動した。電気泳動後、各バンドの蛍光強度(intensity)を「Socion Image(NIH Image)」にて測定した。なお、結果については後述する〔結果1〕にて説明する。
293T細胞またはHeLa細胞から抽出したmRNA(約0.1ng(約10細胞に相当)、または約0.01ng(約1細胞に相当))に1.0μgのダミーRNAを添加したサンプルと、ダミーRNAを添加しないサンプルとを調整した。
増幅用二本鎖DNAの作製方法は、以下の1)〜13)に従った。
Sense T7 :5’-CACTAGTACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAATTCCCCGGG-3’(配列番号10)
Antisense T7:5’-CCCGGGGAATTCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGTACTAGTGAGCT-3’(配列番号11)
上記Sense T7とAntisense T7とを、それぞれの濃度が等しく、かつSense T7とAntisense T7との全量が0.35μg/μLとなるように、アニーリングバッファー(10mM Tris-HCl(pH7.5),1mM EDTA,10mM MgCl2)中に溶解した。その後、65℃にて2分間、37℃にて10分間、および室温にて5分間の条件下にて順に保温することによってSense T7とAntisense T7とをアニーリングさせ、増幅アダプターを作製した。上記増幅アダプターを、−20℃にて保存した。
1)上記〔6:増幅用二本鎖DNAの作製〕にて回収した沈殿物を水に溶解した後、ストレプトアビジンを加え、十分に攪拌した後、室温にて5分間静置した。
cDNAライブラリーの作製工程を図14に示すとともに、その詳細について以下に説明する。
BamHI(BglII)-SmaI断片:5’-GATCCCCGGG-3’(配列番号12)
SmaI断片 :5’-CCCGGG -3’ (配列番号13)
なお、当該アダプターの作製方法は、上述したSense T7とAntisense T7とからなる増幅アダプターの作製方法に従った。
図6(a)および図6(b)に、ダミーRNAの最適量を検討した結果を示す。なお、本実施例では、ダミーRNAの効果を検討するにあたって、GAPDHのcDNA化の効率を指標にしている。しかしながら、GAPDHは単なる指標の一例であって、ダミーDNAは、その他の遺伝子のcDNA化についてもGAPDHと同様の効果を有することは当業者であれば容易に理解するであろう。
図7(a)、図7(b)および図7(c)に、増幅可能な微量mRNAの量を検討した電気泳動図を示す。
図8に、cDNAライブラリーのインサートの長さの分布を示す。なお、上記実施例においては、6.6×105cfuのコロニーを得た。当該コロニーについて、インサート挿入率を検討したところ38.3%(23クローン/60クローン)であった。また、23クローンのうち、ヒトの遺伝子が挿入されているものは15クローンであり、当該15クローンのうち、2クローンのみが、同じ遺伝子(表1のサンプル3)を挿入していた。
ダミーRNAによって増幅されたcDNAプールのサイズの偏り、およびmRNA増幅効率の上昇効果について、微量RNAの正確な分析が可能なアジレント(Agilent)社製のバイオアナライザー(Bioanalyzer2100)を用いて評価した。
ダミーRNAを用いて作製したナノcDNAライブラリーのmRNAの種類について、増幅が偏った遺伝子を含まないかを調べるため、アジレント(Agilent)社のcDNAマイクロアレイ(2色法、Dyeswap法)を用いて検証した。
上述した例は、細胞から精製したmRNA、つまり様々な種類のmRNAを含むmRNA混合物を増幅した場合について検討したものである。そこで、本願発明の方法が、一種類のmRNAをも効率よく増幅することができるか否かについて検討した。
GAPDH S :5’-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’(配列番号14)
GAPDH AS :5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTGAGCACAGGGTACTTTATTG-3’(配列番号15)
ヒトGAPDHの相当するDNA断片(約1300bp)を抽出した後、当該DNA断片をTA−クローニング法によってpT7Blueベクター(invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA)に挿入した。
異なる配列を有するダミーRNAも同様のmRNA増幅効果を有するか否か検討した。
ダミーRNA:5’-AATCTGTCGCGGCCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’(配列番号16)
図12に示すように、本実施例の方法であれば、異なる配列を有するダミーRNAを用いた場合であっても、mRNAをも増幅することができた。なお、図12では、PCR法を用いてヒトGAPDHのmRNAの増幅を確認しており、このときPCR法の増幅回数は40回であった。
Claims (11)
- 微量mRNAを含む溶液にダミーRNAを添加して混合溶液を作製する第1工程と、
混合溶液を鋳型として用いた逆転写反応によって、アンチセンスDNAを合成する第2工程と、
合成されたアンチセンスDNAに対して相補的なセンスDNAを合成して、センスDNAとアンチセンスDNAとからなる二本鎖DNAを形成する第3工程と、
形成された二本鎖DNAのセンスDNAの5’末端側にRNAポリメラーゼのプロモーター配列を連結して増幅用二本鎖DNAを作製する第4工程と、
RNAポリメラーゼによって、増幅用二本鎖DNAからRNAを増幅する第5工程と、を含み、
前記ダミーRNAの配列が、ポリA配列を含み、
前記第2工程では、プライマーとしてオリゴdTプライマーを用いることを特徴とする微量mRNAの増幅方法。 - 前記第4工程は、第3工程にて形成された二本鎖DNAの両末端側にプロモーター配列を連結したあと、二本鎖DNAのセンスDNAの3’末端側に連結されたプロモーター配列のみを切断する第6工程を含むことを特徴とする請求項1に記載の微量mRNAの増幅方法。
- 前記第4工程は、第3工程にて形成された二本鎖DNAの両末端にプロモーター配列を連結したとき、二本鎖DNAのセンスDNAの3’末端側に連結されたプロモーター配列のみを切断できるように、二本鎖DNAのセンスDNAの3’末端側に制限酵素サイトが形成されることを特徴とする請求項2に記載の微量mRNAの増幅方法。
- 前記第4工程は、切断されたプロモーター配列およびダミーRNAを除去する第7工程を含むことを特徴とする請求項2または3に記載の微量mRNAの増幅方法。
- 前記ダミーRNAの配列が、配列番号4、配列番号6または配列番号16によって示される塩基配列であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の微量mRNAの増幅方法。
- 前記ダミーRNAは、ビオチン化されていることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の微量mRNAの増幅方法。
- 前記RNAポリメラーゼが、T7ポリメラーゼ、T3ポリメラーゼまたはSP6ポリメラーゼであることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の微量mRNAの増幅方法。
- 前記混合溶液中の前記ダミーRNAの濃度が0.5〜10μg/μLであることを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の微量mRNAの増幅方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の微量mRNAの増幅方法を一工程として含むことを特徴とするcDNAライブラリーの作製方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の微量mRNAの増幅方法を一工程として含むことを特徴とするプローブの作製方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の微量mRNAの増幅方法を一工程として含むことを特徴とする段階的サブトラクション法。
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