JP2002238575A - 微量ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの増幅方法 - Google Patents
微量ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの増幅方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ｃＤＮＡライブリーの作製、サブトラクショ
ンクローニング、マイクロアレイの作製・解析、遺伝子
発現解析への適用が可能である超微量のｍＲＮＡを１０
8倍程度増幅する方法を提供すること。 【解決手段】 オリゴ(ｄｔ)結合磁気ビーズに試料中の
ｍＲＮＡを吸着させた後、磁気ビーズ上で２重鎖ｃＤＮ
Ａを合成し、５′末端にＴ７プロモーター配列を有する
リンカーを付加後、アンチセンス鎖ｃＤＮＡ結合磁気ビ
ーズを除去し、上清中のセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型とし
て、ＳＰ６プロモーター配列を有するリンカーを付加し
たオリゴ(ｄｔ)プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを
再度合成し、この２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の
既知配列をプライマーとしてＰＣＲを行ってｃＤＮＡ混
成物を増幅する。また、かかるｃＤＮＡ混成物を用い
て、Ｔ７やＳＰ６ポリメラーゼにより、センス鎖・アン
チセンス鎖ｃＲＮＡを合成する。
ンクローニング、マイクロアレイの作製・解析、遺伝子
発現解析への適用が可能である超微量のｍＲＮＡを１０
8倍程度増幅する方法を提供すること。 【解決手段】 オリゴ(ｄｔ)結合磁気ビーズに試料中の
ｍＲＮＡを吸着させた後、磁気ビーズ上で２重鎖ｃＤＮ
Ａを合成し、５′末端にＴ７プロモーター配列を有する
リンカーを付加後、アンチセンス鎖ｃＤＮＡ結合磁気ビ
ーズを除去し、上清中のセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型とし
て、ＳＰ６プロモーター配列を有するリンカーを付加し
たオリゴ(ｄｔ)プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを
再度合成し、この２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の
既知配列をプライマーとしてＰＣＲを行ってｃＤＮＡ混
成物を増幅する。また、かかるｃＤＮＡ混成物を用い
て、Ｔ７やＳＰ６ポリメラーゼにより、センス鎖・アン
チセンス鎖ｃＲＮＡを合成する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中に存在する
微量のｍＲＮＡの増幅方法、より詳しくは、ｃＤＮＡラ
イブラリーの作製、サブトラクションクローニング、マ
イクロアレイへの適用が可能である、ＰＣＲ法を組み合
わせた、生体内で発現している超微量のｍＲＮＡを感度
よく増幅する方法に関する。
微量のｍＲＮＡの増幅方法、より詳しくは、ｃＤＮＡラ
イブラリーの作製、サブトラクションクローニング、マ
イクロアレイへの適用が可能である、ＰＣＲ法を組み合
わせた、生体内で発現している超微量のｍＲＮＡを感度
よく増幅する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】マウス、ヒトなどの哺乳類のゲノムの全
遺伝子数は従来約１０万個程度と予想されており、これ
に対応するｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを網羅的にクローン化す
ることは、遺伝子のコードするタンパク質の配列予測、
遺伝子の構造予測、ＤＮＡマイクロアレイの構築等の観
点から、実用的にも基礎研究の上でも極めて重要であ
り、現在、米国、日本をはじめ世界的な取り組みがなさ
れている。例えば、マウスでは既に３万種類程度のｃＤ
ＮＡがクローン化されているが、これらは主に、成体あ
るいは胚に適当量以上存在するｍＲＮＡに由来するもの
であると考えられ、残されたｃＤＮＡの単離が今後の課
題であるといわれている。多細胞高等生物においては、
相当部分の遺伝子は、特化された一部の細胞に限局して
発現している可能性が考えられており、例えば、脳視床
下部における下垂体ホルモン放出因子遺伝子や、膵島細
胞における糖調節ホルモン遺伝子等は、極めて限られた
少数の細胞においてのみ、その発現が見られる。ある一
群の遺伝子は特定の発生段階の限局された領域でのみ発
現している可能性があり、また、他の一群の遺伝子は各
種ストレスや病原体の感染など環境要因の変動にさらさ
れた細胞でのみ誘導される可能性がある。そして、一般
に、より多くのｃＤＮＡ種をクローン化するためには、
種々の発生段階にあるより多くの組織、細胞種について
環境条件を多様化させて調べることの有用性が指摘され
ている。
遺伝子数は従来約１０万個程度と予想されており、これ
に対応するｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを網羅的にクローン化す
ることは、遺伝子のコードするタンパク質の配列予測、
遺伝子の構造予測、ＤＮＡマイクロアレイの構築等の観
点から、実用的にも基礎研究の上でも極めて重要であ
り、現在、米国、日本をはじめ世界的な取り組みがなさ
れている。例えば、マウスでは既に３万種類程度のｃＤ
ＮＡがクローン化されているが、これらは主に、成体あ
るいは胚に適当量以上存在するｍＲＮＡに由来するもの
であると考えられ、残されたｃＤＮＡの単離が今後の課
題であるといわれている。多細胞高等生物においては、
相当部分の遺伝子は、特化された一部の細胞に限局して
発現している可能性が考えられており、例えば、脳視床
下部における下垂体ホルモン放出因子遺伝子や、膵島細
胞における糖調節ホルモン遺伝子等は、極めて限られた
少数の細胞においてのみ、その発現が見られる。ある一
群の遺伝子は特定の発生段階の限局された領域でのみ発
現している可能性があり、また、他の一群の遺伝子は各
種ストレスや病原体の感染など環境要因の変動にさらさ
れた細胞でのみ誘導される可能性がある。そして、一般
に、より多くのｃＤＮＡ種をクローン化するためには、
種々の発生段階にあるより多くの組織、細胞種について
環境条件を多様化させて調べることの有用性が指摘され
ている。
【０００３】産業上有用な遺伝子は、その産物であるｍ
ＲＮＡあるいはタンパク質の解析や調製が容易なｃＤＮ
Ａの形で単離されることが望ましく、ｃＤＮＡの単離は
ｍＲＮＡを出発材料とするが、上記のようにｍＲＮＡ種
の多くは生体の極く限られた組織、細胞にのみ発現して
おり、得られるｍＲＮＡが微量なため、ｃＤＮＡの調製
が困難な場合が多々あり、現在までに多くの微量ｍＲＮ
Ａ／ｃＤＮＡの増幅法が提案されている（Dulac,C.&Axe
l,R. (1995)A novel family of genes encoding putati
ve pheromone receptors in mammals.Cell Vol.83,pp.1
95-206、Mackler S.A.,Brooks,B.P.&Eberwine,J.H. (19
92)Stimulus-induced coordinate changes in mRNA abu
ndance in single postsynaptic hippocampal CA1 nuer
ons. Neuron Vol.9,pp.539-548等）が、それぞれｃＤＮ
Ａライブラリーの調製、ハイブリダイゼーションプロー
ブの調製に特化したものであり、汎用性を有しないもの
がほとんどである。
ＲＮＡあるいはタンパク質の解析や調製が容易なｃＤＮ
Ａの形で単離されることが望ましく、ｃＤＮＡの単離は
ｍＲＮＡを出発材料とするが、上記のようにｍＲＮＡ種
の多くは生体の極く限られた組織、細胞にのみ発現して
おり、得られるｍＲＮＡが微量なため、ｃＤＮＡの調製
が困難な場合が多々あり、現在までに多くの微量ｍＲＮ
Ａ／ｃＤＮＡの増幅法が提案されている（Dulac,C.&Axe
l,R. (1995)A novel family of genes encoding putati
ve pheromone receptors in mammals.Cell Vol.83,pp.1
95-206、Mackler S.A.,Brooks,B.P.&Eberwine,J.H. (19
92)Stimulus-induced coordinate changes in mRNA abu
ndance in single postsynaptic hippocampal CA1 nuer
ons. Neuron Vol.9,pp.539-548等）が、それぞれｃＤＮ
Ａライブラリーの調製、ハイブリダイゼーションプロー
ブの調製に特化したものであり、汎用性を有しないもの
がほとんどである。
【０００４】その他、迅速かつ簡便に被検試料中の特定
の核酸配列を検出する方法として、検出すべき配列に操
作可能に結合したプロモーターを含む２本鎖核酸の製造
方法であって、（a）オリゴヌクレオチドプロモーター
−プライマーを得；（b）プロモーター−プライマーと
検出すべき核酸配列とがハイブリダイズする条件下で、
該プロモーター−プライマーと該検出すべき配列を含有
する核酸とを接触させ、（c）プロモーター−プライマ
ーの３′末端から、検出すべき核酸配列に相補的な伸長
産物を製造させ；（d）工程(c)の産物を３′−５′エキ
ソヌクレアーゼ活性を有する物質と接触させ；（e)プロ
モーター−プライマーのプロモーターと相補的な伸長産
物を、検出すべき配列の３′末端から合成することから
なる方法（特開平１１−８９６００号公報）や、センス
及びアンチセンスｍＲＮＡや一本鎖ｃＤＮＡの合成を含
む遺伝子の保存等種々の方法に有用なポリヌクレオチド
固定化担体、そのポリヌクレオチド固定化担体を用いる
遺伝子の保存方法、並びに、ｓｓ−ｃＤＮＡ、ｄｓ−ｃ
ＤＮＡ、センスｍＲＮＡもしくはアンチセンスｍＲＮＡ
の製造方法（ＷＯ９３／１５２２８）に関する技術が知
られている。上記ＷＯ９３／１５２２８に記載された方
法は、ポリヌクレオチド固定化担体を用いているもの
の、アダプターの付着や固定化担体からのｃＤＮＡの切
出しに制限酵素を用いており、また固定化担体上でのセ
ンス鎖ｃＲＮＡの合成効率が不明であり、かかる方法で
は微量のｍＲＮＡから大量のセンス鎖ｃＲＮＡやｃＤＮ
Ａを遺失なく合成することができない。
の核酸配列を検出する方法として、検出すべき配列に操
作可能に結合したプロモーターを含む２本鎖核酸の製造
方法であって、（a）オリゴヌクレオチドプロモーター
−プライマーを得；（b）プロモーター−プライマーと
検出すべき核酸配列とがハイブリダイズする条件下で、
該プロモーター−プライマーと該検出すべき配列を含有
する核酸とを接触させ、（c）プロモーター−プライマ
ーの３′末端から、検出すべき核酸配列に相補的な伸長
産物を製造させ；（d）工程(c)の産物を３′−５′エキ
ソヌクレアーゼ活性を有する物質と接触させ；（e)プロ
モーター−プライマーのプロモーターと相補的な伸長産
物を、検出すべき配列の３′末端から合成することから
なる方法（特開平１１−８９６００号公報）や、センス
及びアンチセンスｍＲＮＡや一本鎖ｃＤＮＡの合成を含
む遺伝子の保存等種々の方法に有用なポリヌクレオチド
固定化担体、そのポリヌクレオチド固定化担体を用いる
遺伝子の保存方法、並びに、ｓｓ−ｃＤＮＡ、ｄｓ−ｃ
ＤＮＡ、センスｍＲＮＡもしくはアンチセンスｍＲＮＡ
の製造方法（ＷＯ９３／１５２２８）に関する技術が知
られている。上記ＷＯ９３／１５２２８に記載された方
法は、ポリヌクレオチド固定化担体を用いているもの
の、アダプターの付着や固定化担体からのｃＤＮＡの切
出しに制限酵素を用いており、また固定化担体上でのセ
ンス鎖ｃＲＮＡの合成効率が不明であり、かかる方法で
は微量のｍＲＮＡから大量のセンス鎖ｃＲＮＡやｃＤＮ
Ａを遺失なく合成することができない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】神経科学が対象とする
神経組織は限局された領域であることが多く、また発生
生物学が対象とする初期胚は細胞数が少なく、そこから
得られるｍＲＮＡ等は極微量であり、分子生物学的解析
を困難にしている。現在、ｃＤＮＡ増幅法としてＰＣＲ
法が最も広く使われているが、各ｃＤＮＡの含有率の代
表性に問題があり、ＰＣＲサイクル数は極力少なくする
べきである。一方、ｃＤＮＡ合成による線型増幅は、代
表性に優れているが、極微量の試料への適用には問題が
あった。本発明の課題は、ｃＤＮＡライブリーの作製、
サブトラクションクローニング、マイクロアレイへの適
用が可能で、かつ汎用性のある、生体内で発現している
超微量のｍＲＮＡを増幅する方法を提供することにあ
る。
神経組織は限局された領域であることが多く、また発生
生物学が対象とする初期胚は細胞数が少なく、そこから
得られるｍＲＮＡ等は極微量であり、分子生物学的解析
を困難にしている。現在、ｃＤＮＡ増幅法としてＰＣＲ
法が最も広く使われているが、各ｃＤＮＡの含有率の代
表性に問題があり、ＰＣＲサイクル数は極力少なくする
べきである。一方、ｃＤＮＡ合成による線型増幅は、代
表性に優れているが、極微量の試料への適用には問題が
あった。本発明の課題は、ｃＤＮＡライブリーの作製、
サブトラクションクローニング、マイクロアレイへの適
用が可能で、かつ汎用性のある、生体内で発現している
超微量のｍＲＮＡを増幅する方法を提供することにあ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、今回、微
量全ｍＲＮＡを増幅し、特定のｍＲＮＡの変動を定量化
すると共に、ｃＤＮＡライブラリーを容易に構築できる
実験手技の開発を試みた。そして、オリゴ(ｄＴ)を結合
させた磁気ビーズに試料中のｍＲＮＡを吸着させた後、
磁気ビーズ上で２重鎖ｃＤＮＡを合成し、５′末端にＴ
７プロモーター配列を有するリンカーを付加した後、ア
ンチセンス鎖ｃＤＮＡが結合した磁気ビーズを除去し、
上清中のセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６プロモ
ーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プ
ライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを再度合成し、この
２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の既知配列をプライ
マーとしてＰＣＲを行ってｃＤＮＡ混成物を増幅し、次
いでＴ７ポリメラーゼやＳＰ６ポリメラーゼを用いるこ
とにより、試料中のｍＲＮＡを１０8倍程度増幅しうる
ことを見い出し、かかる微量ｍＲＮＡの増幅法を用い
て、ｍＲＮＡのレベルの定量、及びｃＤＮＡライブラリ
ーの構築が可能であることを確認し、本発明を完成する
に至った。
量全ｍＲＮＡを増幅し、特定のｍＲＮＡの変動を定量化
すると共に、ｃＤＮＡライブラリーを容易に構築できる
実験手技の開発を試みた。そして、オリゴ(ｄＴ)を結合
させた磁気ビーズに試料中のｍＲＮＡを吸着させた後、
磁気ビーズ上で２重鎖ｃＤＮＡを合成し、５′末端にＴ
７プロモーター配列を有するリンカーを付加した後、ア
ンチセンス鎖ｃＤＮＡが結合した磁気ビーズを除去し、
上清中のセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６プロモ
ーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プ
ライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを再度合成し、この
２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の既知配列をプライ
マーとしてＰＣＲを行ってｃＤＮＡ混成物を増幅し、次
いでＴ７ポリメラーゼやＳＰ６ポリメラーゼを用いるこ
とにより、試料中のｍＲＮＡを１０8倍程度増幅しうる
ことを見い出し、かかる微量ｍＲＮＡの増幅法を用い
て、ｍＲＮＡのレベルの定量、及びｃＤＮＡライブラリ
ーの構築が可能であることを確認し、本発明を完成する
に至った。
【０００７】すなわち本発明は、以下の〜の工程を
含むことを特徴とする微量ｍＲＮＡの増幅方法試料中
のｍＲＮＡを、オリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に吸着さ
せる工程；担体上でアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセン
ス鎖ｃＤＮＡを合成する工程；得られる２重鎖ｃＤＮ
Ａの少なくともセンス鎖の５′末端に第１のプロモータ
ー配列を有するリンカーを付加する工程；２重鎖ｃＤ
ＮＡを解離させ、担体に結合したアンチセンス鎖ｃＤＮ
Ａを担体と共に除去する工程；解離したセンス鎖ｃＤ
ＮＡを鋳型として、第２のプロモーター配列を有するリ
ンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを用いて、２
重鎖ｃＤＮＡを合成する工程；２重鎖ｃＤＮＡ両端の
リンカー部分の配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、
ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程；（請求項１）や、以下
の〜の工程を含むことを特徴とする微量ｍＲＮＡの
増幅方法試料中のｍＲＮＡを、オリゴ(ｄＴ)を結合さ
せた担体に吸着させる工程；担体上でアンチセンス鎖
ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮＡを合成する工程；得ら
れる２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端に
第１のプロモーター配列を有するリンカーを付加する工
程；２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、担体に結合したアン
チセンス鎖ｃＤＮＡを担体と共に除去する工程；解離
したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモータ
ー配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライ
マーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを合成する工程；２重
鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の配列をプライマーとし
てＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程；前
記第１のプロモーター配列及び／又は第２のプロモータ
ー配列を利用して、インビトロ転写系によりセンス鎖ｃ
ＲＮＡ及び／又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡを合成する工
程；（請求項２）や、担体が磁気ビーズであることを特
徴とする請求項１又は２記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法
（請求項３）や、第１のプロモーター配列を有するリン
カーとして、その５′末端が非対合末端、３′末端が平
滑末端であるリンカーを使用することを特徴とする請求
項１〜３のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法（請
求項４）や、第１のプロモーター配列を有するリンカー
及び／又は第２のプロモーター配列を有するリンカーと
して、該プロモーター配列の５′側及び／又は３′側に
制限酵素認識配列を有するリンカーを使用することを特
徴とする請求項１〜４のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの
増幅方法（請求項５）や、第１のプロモーター配列と第
２のプロモーター配列が異なることを特徴とする請求項
１〜５のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法（請求
項６）や、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモ
ーターが、該プロモーターを特異的に転写することがで
きるＲＮＡポリメラーゼが存するプロモーターであるこ
とを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の微量ｍＲ
ＮＡの増幅方法（請求項７）や、プロモーター特異的に
転写することができるＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７プロ
モーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターから
選ばれることを特徴とする請求項７記載の微量ｍＲＮＡ
の増幅方法（請求項８）や、第１のプロモーター配列を
有するリンカーが、配列番号１及び２で表される塩基配
列からなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記
載の微量ｍＲＮＡの増幅方法（請求項９）や、第２のプ
ロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄ
Ｔ)プライマーが、配列番号３で表される塩基配列から
なることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の微
量ｍＲＮＡの増幅方法（請求項１０）に関する。
含むことを特徴とする微量ｍＲＮＡの増幅方法試料中
のｍＲＮＡを、オリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に吸着さ
せる工程；担体上でアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセン
ス鎖ｃＤＮＡを合成する工程；得られる２重鎖ｃＤＮ
Ａの少なくともセンス鎖の５′末端に第１のプロモータ
ー配列を有するリンカーを付加する工程；２重鎖ｃＤ
ＮＡを解離させ、担体に結合したアンチセンス鎖ｃＤＮ
Ａを担体と共に除去する工程；解離したセンス鎖ｃＤ
ＮＡを鋳型として、第２のプロモーター配列を有するリ
ンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを用いて、２
重鎖ｃＤＮＡを合成する工程；２重鎖ｃＤＮＡ両端の
リンカー部分の配列をプライマーとしてＰＣＲを行い、
ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程；（請求項１）や、以下
の〜の工程を含むことを特徴とする微量ｍＲＮＡの
増幅方法試料中のｍＲＮＡを、オリゴ(ｄＴ)を結合さ
せた担体に吸着させる工程；担体上でアンチセンス鎖
ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮＡを合成する工程；得ら
れる２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端に
第１のプロモーター配列を有するリンカーを付加する工
程；２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、担体に結合したアン
チセンス鎖ｃＤＮＡを担体と共に除去する工程；解離
したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモータ
ー配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライ
マーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを合成する工程；２重
鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の配列をプライマーとし
てＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程；前
記第１のプロモーター配列及び／又は第２のプロモータ
ー配列を利用して、インビトロ転写系によりセンス鎖ｃ
ＲＮＡ及び／又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡを合成する工
程；（請求項２）や、担体が磁気ビーズであることを特
徴とする請求項１又は２記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法
（請求項３）や、第１のプロモーター配列を有するリン
カーとして、その５′末端が非対合末端、３′末端が平
滑末端であるリンカーを使用することを特徴とする請求
項１〜３のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法（請
求項４）や、第１のプロモーター配列を有するリンカー
及び／又は第２のプロモーター配列を有するリンカーと
して、該プロモーター配列の５′側及び／又は３′側に
制限酵素認識配列を有するリンカーを使用することを特
徴とする請求項１〜４のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの
増幅方法（請求項５）や、第１のプロモーター配列と第
２のプロモーター配列が異なることを特徴とする請求項
１〜５のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法（請求
項６）や、第１のプロモーター及び／又は第２のプロモ
ーターが、該プロモーターを特異的に転写することがで
きるＲＮＡポリメラーゼが存するプロモーターであるこ
とを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の微量ｍＲ
ＮＡの増幅方法（請求項７）や、プロモーター特異的に
転写することができるＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７プロ
モーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターから
選ばれることを特徴とする請求項７記載の微量ｍＲＮＡ
の増幅方法（請求項８）や、第１のプロモーター配列を
有するリンカーが、配列番号１及び２で表される塩基配
列からなることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記
載の微量ｍＲＮＡの増幅方法（請求項９）や、第２のプ
ロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄ
Ｔ)プライマーが、配列番号３で表される塩基配列から
なることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の微
量ｍＲＮＡの増幅方法（請求項１０）に関する。
【０００８】また本発明は、請求項１〜１０のいずれか
記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法を用いることを特徴とす
る遺伝子のクローニング方法（請求項１１）や、請求項
１〜１０のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法によ
り得られるセンス鎖ｃＤＮＡ、アンチセンス鎖ｃＤＮ
Ａ、センス鎖ｃＲＮＡ又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡの少
なくとも１つを標識化して用いることを特徴とするサブ
トラクションクローニング方法（請求項１２）や、請求
項１〜１０のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法に
より得られるセンス鎖ｃＤＮＡ、アンチセンス鎖ｃＤＮ
Ａ、センス鎖ｃＲＮＡ又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡの少
なくとも１つを用いることを特徴とするマイクロアレイ
（請求項１３）や、請求項１〜１０のいずれか記載の微
量ｍＲＮＡの増幅方法により得られるｃＤＮＡがベクタ
ーに導入されていることを特徴とするｃＤＮＡライブラ
リー（請求項１４）や、オリゴ(ｄＴ)を結合させた担
体、第１のプロモーター配列を有するリンカー、前記第
１のプロモーター配列とは異なる第２のプロモーター配
列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマー
を含むことを特徴とする微量ｍＲＮＡ増幅用キット（請
求項１５）や、担体が磁気ビーズであることを特徴とす
る請求項１５記載の微量ｍＲＮＡ増幅用キット（請求項
１６）に関する。
記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法を用いることを特徴とす
る遺伝子のクローニング方法（請求項１１）や、請求項
１〜１０のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法によ
り得られるセンス鎖ｃＤＮＡ、アンチセンス鎖ｃＤＮ
Ａ、センス鎖ｃＲＮＡ又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡの少
なくとも１つを標識化して用いることを特徴とするサブ
トラクションクローニング方法（請求項１２）や、請求
項１〜１０のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法に
より得られるセンス鎖ｃＤＮＡ、アンチセンス鎖ｃＤＮ
Ａ、センス鎖ｃＲＮＡ又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡの少
なくとも１つを用いることを特徴とするマイクロアレイ
（請求項１３）や、請求項１〜１０のいずれか記載の微
量ｍＲＮＡの増幅方法により得られるｃＤＮＡがベクタ
ーに導入されていることを特徴とするｃＤＮＡライブラ
リー（請求項１４）や、オリゴ(ｄＴ)を結合させた担
体、第１のプロモーター配列を有するリンカー、前記第
１のプロモーター配列とは異なる第２のプロモーター配
列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマー
を含むことを特徴とする微量ｍＲＮＡ増幅用キット（請
求項１５）や、担体が磁気ビーズであることを特徴とす
る請求項１５記載の微量ｍＲＮＡ増幅用キット（請求項
１６）に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法
としては、試料中のｍＲＮＡを、オリゴ(ｄＴ)を結合
させた担体に吸着させる工程；担体上でアンチセンス
鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮＡを合成する工程；得
られる２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端
に第１のプロモーター配列を有するリンカーを付加する
工程；２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、担体に結合したア
ンチセンス鎖ｃＤＮＡを担体と共に除去する工程；解
離したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモー
ター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プラ
イマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを合成する工程；２
重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の配列をプライマーと
してＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程；を
含むことを特徴とする方法や、上記〜の工程に加え
て、前記第１のプロモーター配列及び／又は第２のプ
ロモーター配列を利用して、インビトロ転写系によりセ
ンス鎖ｃＲＮＡ及び／又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡを合
成する工程；をも含むことを特徴とする方法であれば特
に制限されるものではなく、その一例が図１に示されて
いる。
としては、試料中のｍＲＮＡを、オリゴ(ｄＴ)を結合
させた担体に吸着させる工程；担体上でアンチセンス
鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮＡを合成する工程；得
られる２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端
に第１のプロモーター配列を有するリンカーを付加する
工程；２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、担体に結合したア
ンチセンス鎖ｃＤＮＡを担体と共に除去する工程；解
離したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモー
ター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プラ
イマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを合成する工程；２
重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の配列をプライマーと
してＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程；を
含むことを特徴とする方法や、上記〜の工程に加え
て、前記第１のプロモーター配列及び／又は第２のプ
ロモーター配列を利用して、インビトロ転写系によりセ
ンス鎖ｃＲＮＡ及び／又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡを合
成する工程；をも含むことを特徴とする方法であれば特
に制限されるものではなく、その一例が図１に示されて
いる。
【００１０】上記工程における試料としては、動物、
植物、微生物等の細胞・組織等のｍＲＮＡを含むもので
あれば特に制限されるものではなく、これら細胞溶解液
等のｍＲＮＡを含む液体サンプルの調製は常法により行
うことができるが、グアニジンチオシアネートの存在下
等のＲＮａｓｅ活性が阻害された緩衝液中で行うことが
好ましい。本発明によると、例えば、細胞をグアニジン
チオシアネートを用いて溶解した後、細胞１個程度に含
まれる全ＲＮＡ量０．１ｎｇ程度以上を単離すればよ
く、その中に増幅しようとする標的ｍＲＮＡが５ｐｇ以
上程度含まれていればよい。また、工程において用い
られる担体としては、水不溶性の担体で、加熱変性時に
溶融しないものであればどのようなものでもよいが、ポ
リエチレンビーズ、プラスチックプレート、磁気ビーズ
等を好適に例示することができるが、これらの中でも工
程における担体に結合したアンチセンス鎖ｃＤＮＡを
担体と共に除去する操作を簡便に実施することができる
磁気ビーズが特に好ましい。また、工程〜を磁気ビ
ーズ等の担体上で行うことにより、反応液の交換等が容
易となり、試料の逸失が少ない。
植物、微生物等の細胞・組織等のｍＲＮＡを含むもので
あれば特に制限されるものではなく、これら細胞溶解液
等のｍＲＮＡを含む液体サンプルの調製は常法により行
うことができるが、グアニジンチオシアネートの存在下
等のＲＮａｓｅ活性が阻害された緩衝液中で行うことが
好ましい。本発明によると、例えば、細胞をグアニジン
チオシアネートを用いて溶解した後、細胞１個程度に含
まれる全ＲＮＡ量０．１ｎｇ程度以上を単離すればよ
く、その中に増幅しようとする標的ｍＲＮＡが５ｐｇ以
上程度含まれていればよい。また、工程において用い
られる担体としては、水不溶性の担体で、加熱変性時に
溶融しないものであればどのようなものでもよいが、ポ
リエチレンビーズ、プラスチックプレート、磁気ビーズ
等を好適に例示することができるが、これらの中でも工
程における担体に結合したアンチセンス鎖ｃＤＮＡを
担体と共に除去する操作を簡便に実施することができる
磁気ビーズが特に好ましい。また、工程〜を磁気ビ
ーズ等の担体上で行うことにより、反応液の交換等が容
易となり、試料の逸失が少ない。
【００１１】工程におけるオリゴ(ｄＴ)は常法により
合成されたものであればどのようなものでもよく、オリ
ゴ(ｄＴ)の重合度としてはｍＲＮＡのポリ(Ａ)とハイブ
リダイズして、ｍＲＮＡをオリゴ(ｄＴ)を結合させた担
体に吸着させうる重合度であれば特に制限されないが、
５〜２００、特に１０〜３０程度が好ましい。また、オ
リゴ(ｄＴ)に代えてポリＵ等のｍＲＮＡのポリ(Ａ)に相
補的な配列を含んでいるものも使用することができ、こ
れらの使用も本発明に含まれる。かかるオリゴ(ｄＴ)と
上記磁気ビーズ等の担体とを結合させる方法としては特
に制限されるものではなく、例えば、共有結合法、イオ
ン結合法、物理吸着法、ビオチン−アビジン系を用いる
方法等を例示することができる。
合成されたものであればどのようなものでもよく、オリ
ゴ(ｄＴ)の重合度としてはｍＲＮＡのポリ(Ａ)とハイブ
リダイズして、ｍＲＮＡをオリゴ(ｄＴ)を結合させた担
体に吸着させうる重合度であれば特に制限されないが、
５〜２００、特に１０〜３０程度が好ましい。また、オ
リゴ(ｄＴ)に代えてポリＵ等のｍＲＮＡのポリ(Ａ)に相
補的な配列を含んでいるものも使用することができ、こ
れらの使用も本発明に含まれる。かかるオリゴ(ｄＴ)と
上記磁気ビーズ等の担体とを結合させる方法としては特
に制限されるものではなく、例えば、共有結合法、イオ
ン結合法、物理吸着法、ビオチン−アビジン系を用いる
方法等を例示することができる。
【００１２】工程のオリゴ(ｄＴ)を結合させた担体に
試料中のｍＲＮＡを吸着させる反応は、オリゴ(ｄＴ)結
合担体とポリ(Ａ)+ＲＮＡ含有試料とを緩衝液中でイン
キュベーションし、担体に結合しているオリゴ(ｄＴ)と
ｍＲＮＡのポリ(Ａ)とをハイブリダイズすることにより
行うことができる。かかるハイブリダイゼーションのた
めのインキュベーションは、温度２０〜２５℃で５分程
度穏やかな攪拌下で行うことが好ましい。上記緩衝液と
しては、ＲＮａｓｅ活性が極力除去された緩衝液が好ま
しい。また、インキュベーション後、上記緩衝液等を用
いて、試料中の担体非結合成分を不溶性担体から洗浄・
除去することが好ましい。
試料中のｍＲＮＡを吸着させる反応は、オリゴ(ｄＴ)結
合担体とポリ(Ａ)+ＲＮＡ含有試料とを緩衝液中でイン
キュベーションし、担体に結合しているオリゴ(ｄＴ)と
ｍＲＮＡのポリ(Ａ)とをハイブリダイズすることにより
行うことができる。かかるハイブリダイゼーションのた
めのインキュベーションは、温度２０〜２５℃で５分程
度穏やかな攪拌下で行うことが好ましい。上記緩衝液と
しては、ＲＮａｓｅ活性が極力除去された緩衝液が好ま
しい。また、インキュベーション後、上記緩衝液等を用
いて、試料中の担体非結合成分を不溶性担体から洗浄・
除去することが好ましい。
【００１３】上記工程で調製された担体結合オリゴ
(ｄＴ)−ポリ(Ａ)+ＲＮＡ複合体は、工程の磁気ビー
ズ等の担体上でのアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖
ｃＤＮＡの合成に用いられる。アンチセンス鎖ｃＤＮＡ
の合成は、オリゴ(ｄＴ)をプライマーとし、ｍＲＮＡを
鋳型として、デオキシヌクレオチドの存在下、逆転写酵
素を用いて反応させ、ポリ(Ａ)+ＲＮＡ−担体結合ｃＤ
ＮＡ複合体を担体上で調製することにより行うことがで
きる。センス鎖ｃＤＮＡの合成は、ポリ(Ａ)+ＲＮＡ−
担体結合ｃＤＮＡ複合体を、ＲＮａｓｅ含有液で処理し
てポリ(Ａ)+ＲＮＡを消化・除去するか、希ＮａＯＨ溶
液を用いてポリ(Ａ)+ＲＮＡを解離・除去し、次いであ
るいは並行して、担体結合アンチセンス鎖ｃＤＮＡを鋳
型として、デオキシヌクレオチドの存在下、ＤＮＡポリ
メラーゼを反応させ、センス鎖ｃＤＮＡ−担体結合アン
チセンス鎖ｃＤＮＡ複合体を担体上で調製することによ
り行うことができるが、センス鎖ｃＤＮＡ断片の連結を
促進するため、ＤＮＡリガーゼを存在させておくことが
好ましい。また、得られる２重鎖ｃＤＮＡの５′末端を
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより平滑化し
ておくことが好ましい。
(ｄＴ)−ポリ(Ａ)+ＲＮＡ複合体は、工程の磁気ビー
ズ等の担体上でのアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖
ｃＤＮＡの合成に用いられる。アンチセンス鎖ｃＤＮＡ
の合成は、オリゴ(ｄＴ)をプライマーとし、ｍＲＮＡを
鋳型として、デオキシヌクレオチドの存在下、逆転写酵
素を用いて反応させ、ポリ(Ａ)+ＲＮＡ−担体結合ｃＤ
ＮＡ複合体を担体上で調製することにより行うことがで
きる。センス鎖ｃＤＮＡの合成は、ポリ(Ａ)+ＲＮＡ−
担体結合ｃＤＮＡ複合体を、ＲＮａｓｅ含有液で処理し
てポリ(Ａ)+ＲＮＡを消化・除去するか、希ＮａＯＨ溶
液を用いてポリ(Ａ)+ＲＮＡを解離・除去し、次いであ
るいは並行して、担体結合アンチセンス鎖ｃＤＮＡを鋳
型として、デオキシヌクレオチドの存在下、ＤＮＡポリ
メラーゼを反応させ、センス鎖ｃＤＮＡ−担体結合アン
チセンス鎖ｃＤＮＡ複合体を担体上で調製することによ
り行うことができるが、センス鎖ｃＤＮＡ断片の連結を
促進するため、ＤＮＡリガーゼを存在させておくことが
好ましい。また、得られる２重鎖ｃＤＮＡの５′末端を
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより平滑化し
ておくことが好ましい。
【００１４】次いで、上記工程で得られた担体結合２
重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端に第１の
プロモーター配列を有するリンカーが工程において付
加される。かかる第１のプロモーター配列を有するリン
カーとしては、ＤＮＡリガーゼ等により担体結合２重鎖
ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端に結合しうる
ものであれば、単鎖あるいは２重鎖のどちらでもよい
が、操作の簡便性からして２重鎖が好ましく、例えば、
その５′末端が非対合末端、３′末端が平滑末端である
リンカーを使用することもできる。また、上記第１のプ
ロモーター配列を有するリンカーとして、該プロモータ
ー配列の５′側及び／又は３′側に制限酵素認識部位
（配列）を有するリンカーを使用することが、ｃＤＮＡ
を解析するときなど好ましい場合が多いが、ｃＤＮＡ混
成物を増幅する工程までの間に、上記認識部位に相当
する制限酵素を使用することは、試料に由来するｃＤＮ
Ａを消化・分解する可能性があるので好ましくない。そ
して、この工程においては、担体結合２重鎖ｃＤＮＡ
のアンチセンス鎖のオリゴ(ｄＴ)からなる５′末端は磁
気ビーズ等の担体上に固定されているため、この断端が
遮蔽されており、まずセンス鎖ｃＤＮＡの５′末端に第
１のプロモーター配列を有するリンカーを確実に結合さ
せることができ、後の工程においてセンス鎖ｃＤＮＡ
の３′末端に第２のプロモーター配列を有するリンカー
を付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを特異的に連結でき
るよう工夫されている。さらに、上記第１のプロモータ
ー配列を有するリンカー構造を、事前にｍＲＮＡのキャ
ップ部位に直接連結するリンカーの構造に組み込むと、
完全長ｃＤＮＡの増幅が容易となる。
重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端に第１の
プロモーター配列を有するリンカーが工程において付
加される。かかる第１のプロモーター配列を有するリン
カーとしては、ＤＮＡリガーゼ等により担体結合２重鎖
ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′末端に結合しうる
ものであれば、単鎖あるいは２重鎖のどちらでもよい
が、操作の簡便性からして２重鎖が好ましく、例えば、
その５′末端が非対合末端、３′末端が平滑末端である
リンカーを使用することもできる。また、上記第１のプ
ロモーター配列を有するリンカーとして、該プロモータ
ー配列の５′側及び／又は３′側に制限酵素認識部位
（配列）を有するリンカーを使用することが、ｃＤＮＡ
を解析するときなど好ましい場合が多いが、ｃＤＮＡ混
成物を増幅する工程までの間に、上記認識部位に相当
する制限酵素を使用することは、試料に由来するｃＤＮ
Ａを消化・分解する可能性があるので好ましくない。そ
して、この工程においては、担体結合２重鎖ｃＤＮＡ
のアンチセンス鎖のオリゴ(ｄＴ)からなる５′末端は磁
気ビーズ等の担体上に固定されているため、この断端が
遮蔽されており、まずセンス鎖ｃＤＮＡの５′末端に第
１のプロモーター配列を有するリンカーを確実に結合さ
せることができ、後の工程においてセンス鎖ｃＤＮＡ
の３′末端に第２のプロモーター配列を有するリンカー
を付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを特異的に連結でき
るよう工夫されている。さらに、上記第１のプロモータ
ー配列を有するリンカー構造を、事前にｍＲＮＡのキャ
ップ部位に直接連結するリンカーの構造に組み込むと、
完全長ｃＤＮＡの増幅が容易となる。
【００１５】上記第１のプロモーター配列としては、該
プロモーターを特異的に転写することができるＲＮＡポ
リメラーゼが存するプロモーター配列であることが好ま
しく、特に第１のプロモーター配列と後述する第２のプ
ロモーター配列とが異なる場合、例えば、第１のプロモ
ーター配列としてＴ７プロモーター配列を、第２のプロ
モーター配列としてＳＰ６プロモーター配列を用いる場
合、工程において、Ｔ７プロモーター配列を特異的に
転写することができるＴ７ポリメラーゼを用いることに
より、工程においてアンチセンス鎖ｃＲＮＡを特異的
に増幅することができる。上記プロモーター特異的に転
写することができるＲＮＡポリメラーゼが存するプロモ
ーター配列としては、Ｔ７プロモーター配列（５′−Ｔ
ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−
３′；配列番号６）、ＳＰ６プロモーター配列（５′−
ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ−
３′；配列番号７）、Ｔ３プロモーター配列（５′−Ａ
ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３′；配列
番号８）等を具体的に例示することができる。そして、
これら第１のプロモーター配列を有するリンカーは、Ｄ
ＮＡ合成装置を用いて常法により調製することができ
る。
プロモーターを特異的に転写することができるＲＮＡポ
リメラーゼが存するプロモーター配列であることが好ま
しく、特に第１のプロモーター配列と後述する第２のプ
ロモーター配列とが異なる場合、例えば、第１のプロモ
ーター配列としてＴ７プロモーター配列を、第２のプロ
モーター配列としてＳＰ６プロモーター配列を用いる場
合、工程において、Ｔ７プロモーター配列を特異的に
転写することができるＴ７ポリメラーゼを用いることに
より、工程においてアンチセンス鎖ｃＲＮＡを特異的
に増幅することができる。上記プロモーター特異的に転
写することができるＲＮＡポリメラーゼが存するプロモ
ーター配列としては、Ｔ７プロモーター配列（５′−Ｔ
ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ−
３′；配列番号６）、ＳＰ６プロモーター配列（５′−
ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ−
３′；配列番号７）、Ｔ３プロモーター配列（５′−Ａ
ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧ−３′；配列
番号８）等を具体的に例示することができる。そして、
これら第１のプロモーター配列を有するリンカーは、Ｄ
ＮＡ合成装置を用いて常法により調製することができ
る。
【００１６】上記５′末端に第１のプロモーター配列を
有するリンカーが付加された担体結合２重鎖ｃＤＮＡ
は、次の工程において、２重鎖が解離させられ、アン
チセンス鎖ｃＤＮＡが担体と共に除去される。２重鎖ｃ
ＤＮＡを解離する方法としては特に制限されるものでは
なく、例えば低塩濃度溶液中で９０〜１００℃にて約１
〜１０分間加熱して２重鎖ｃＤＮＡを熱変性することに
より行われる。かかる２重鎖ｃＤＮＡを解離させた後の
アンチセンス鎖ｃＤＮＡ結合担体の除去は常法により行
うことができ、例えば、担体が磁気ビーズの場合は磁石
等の磁性体を用いて、また担体がポリエチレンビーズの
場合は遠心分離若しくは濾過等により除去することがで
きるが、溶液中に遊離状態で残存するセンス鎖ｃＤＮＡ
の逸失を最少限度に留めることができる点で、担体とし
て磁気ビーズを用いることが好ましい。
有するリンカーが付加された担体結合２重鎖ｃＤＮＡ
は、次の工程において、２重鎖が解離させられ、アン
チセンス鎖ｃＤＮＡが担体と共に除去される。２重鎖ｃ
ＤＮＡを解離する方法としては特に制限されるものでは
なく、例えば低塩濃度溶液中で９０〜１００℃にて約１
〜１０分間加熱して２重鎖ｃＤＮＡを熱変性することに
より行われる。かかる２重鎖ｃＤＮＡを解離させた後の
アンチセンス鎖ｃＤＮＡ結合担体の除去は常法により行
うことができ、例えば、担体が磁気ビーズの場合は磁石
等の磁性体を用いて、また担体がポリエチレンビーズの
場合は遠心分離若しくは濾過等により除去することがで
きるが、溶液中に遊離状態で残存するセンス鎖ｃＤＮＡ
の逸失を最少限度に留めることができる点で、担体とし
て磁気ビーズを用いることが好ましい。
【００１７】次の工程において、工程で解離したセ
ンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモーター配列
を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを
用いて、２重鎖ｃＤＮＡが再び合成される。上記工程
により得られる遊離状態のセンス鎖ｃＤＮＡを含む溶液
に、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加し
たオリゴ(ｄＴ)プライマーが加えられ、センス鎖ｃＤＮ
Ａの３′端のポリ(Ａ)部分に上記プライマーのオリゴ
(ｄＴ)をハイブリダイズさせ、センス鎖ｃＤＮＡと前記
オリゴ(ｄＴ)プライマーとの複合体を作製する。上記第
２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリ
ゴ(ｄＴ)プライマーにおける第２のプロモーター配列を
有するリンカーとしては、該プロモーター配列の５′側
及び／又は３′側に制限酵素認識配列を有するリンカー
を使用することが、ｃＤＮＡを解析するときなど好まし
い場合が多いが、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程まで
の間に、制限酵素認識部位に相当する制限酵素を使用す
ることは試料に由来するｃＤＮＡを消化・分解する可能
性があるので好ましくない。上記第２のプロモーター配
列としては、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモータ
ー配列、Ｔ３プロモーター配列等の特異的に転写するこ
とができるＲＮＡポリメラーゼが存するプロモーター配
列であることが好ましく、特に第２のプロモーター配列
と前述の第１のプロモーター配列とが異なる場合、例え
ば、第２のプロモーター配列としてＳＰ６プロモーター
配列を、第１のプロモーター配列としてＴ７プロモータ
ー配列を用いる場合、工程において、ＳＰ６プロモー
ター配列を特異的に転写することができるＳＰ６ポリメ
ラーゼを用いることにより、アンチセンスｃＲＮＡを特
異的に増幅することができる。そして、これら第２のプ
ロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄ
Ｔ)プライマーは、ＤＮＡ合成装置を用いて常法により
合成することができる。
ンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロモーター配列
を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを
用いて、２重鎖ｃＤＮＡが再び合成される。上記工程
により得られる遊離状態のセンス鎖ｃＤＮＡを含む溶液
に、第２のプロモーター配列を有するリンカーを付加し
たオリゴ(ｄＴ)プライマーが加えられ、センス鎖ｃＤＮ
Ａの３′端のポリ(Ａ)部分に上記プライマーのオリゴ
(ｄＴ)をハイブリダイズさせ、センス鎖ｃＤＮＡと前記
オリゴ(ｄＴ)プライマーとの複合体を作製する。上記第
２のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリ
ゴ(ｄＴ)プライマーにおける第２のプロモーター配列を
有するリンカーとしては、該プロモーター配列の５′側
及び／又は３′側に制限酵素認識配列を有するリンカー
を使用することが、ｃＤＮＡを解析するときなど好まし
い場合が多いが、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工程まで
の間に、制限酵素認識部位に相当する制限酵素を使用す
ることは試料に由来するｃＤＮＡを消化・分解する可能
性があるので好ましくない。上記第２のプロモーター配
列としては、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモータ
ー配列、Ｔ３プロモーター配列等の特異的に転写するこ
とができるＲＮＡポリメラーゼが存するプロモーター配
列であることが好ましく、特に第２のプロモーター配列
と前述の第１のプロモーター配列とが異なる場合、例え
ば、第２のプロモーター配列としてＳＰ６プロモーター
配列を、第１のプロモーター配列としてＴ７プロモータ
ー配列を用いる場合、工程において、ＳＰ６プロモー
ター配列を特異的に転写することができるＳＰ６ポリメ
ラーゼを用いることにより、アンチセンスｃＲＮＡを特
異的に増幅することができる。そして、これら第２のプ
ロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄ
Ｔ)プライマーは、ＤＮＡ合成装置を用いて常法により
合成することができる。
【００１８】センス鎖ｃＤＮＡと前記オリゴ(ｄＴ)プラ
イマーとの複合体を用い、センス鎖ｃＤＮＡを鋳型とし
て、デオキシヌクレオチドの存在下、ＤＮＡポリメラー
ゼ又は逆転写酵素を反応させることにより、両５′端に
プロモーター配列を有するリンカー部分が付加された２
重鎖ｃＤＮＡを合成することができる。工程では、こ
の２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の既知配列をプラ
イマーとしてＰＣＲを行い、全ｃＤＮＡ混成物を増幅す
る。ＰＣＲはサーマルサイクラー（Perkin-Elmer社製）
等を用いて常法により行うことができる。工程までの
過程により１０μｇ程度のｃＤＮＡ混成物を得ることが
できる。このｃＤＮＡ混成物を用いると、ｃＤＮＡライ
ブラリーの構築が可能となる。また、全ｃＤＮＡ混成物
を数十分子種程度に希釈し、ＰＣＲを行い、このＰＣＲ
産物を電気泳動等により分離し、ゲルから切り出したｃ
ＤＮＡバンドから塩基配列を直接決定することもでき
る。
イマーとの複合体を用い、センス鎖ｃＤＮＡを鋳型とし
て、デオキシヌクレオチドの存在下、ＤＮＡポリメラー
ゼ又は逆転写酵素を反応させることにより、両５′端に
プロモーター配列を有するリンカー部分が付加された２
重鎖ｃＤＮＡを合成することができる。工程では、こ
の２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の既知配列をプラ
イマーとしてＰＣＲを行い、全ｃＤＮＡ混成物を増幅す
る。ＰＣＲはサーマルサイクラー（Perkin-Elmer社製）
等を用いて常法により行うことができる。工程までの
過程により１０μｇ程度のｃＤＮＡ混成物を得ることが
できる。このｃＤＮＡ混成物を用いると、ｃＤＮＡライ
ブラリーの構築が可能となる。また、全ｃＤＮＡ混成物
を数十分子種程度に希釈し、ＰＣＲを行い、このＰＣＲ
産物を電気泳動等により分離し、ゲルから切り出したｃ
ＤＮＡバンドから塩基配列を直接決定することもでき
る。
【００１９】工程により大量に増幅された、両端にプ
ロモーター配列を有するリンカー部分が付加された２重
鎖ｃＤＮＡにおける前記第１のプロモーター配列及び／
又は第２のプロモーター配列を利用して、ＲＮＡポリメ
ラーゼを用いるインビトロ転写系により、センス鎖ｃＲ
ＮＡ及び／又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡを大量に合成す
ることができる。前記のように、第１のプロモーター配
列と第２のプロモーター配列が異なる場合、センス鎖ｃ
ＲＮＡ又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡを個別に合成するこ
とができる。この工程により、工程までの過程によ
り得られた１０μｇ程度のｃＤＮＡ混成物を用いて、１
００μｇ程度のセンス鎖及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡ混
成物を容易に調製することができる。この１００μｇ程
度のＲＮＡ量は、通常の分子生物学的実験には十分な量
であり、例えば、センス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖
ｃＲＮＡ混成物を用いてサブトラクションクローニング
が可能となる。
ロモーター配列を有するリンカー部分が付加された２重
鎖ｃＤＮＡにおける前記第１のプロモーター配列及び／
又は第２のプロモーター配列を利用して、ＲＮＡポリメ
ラーゼを用いるインビトロ転写系により、センス鎖ｃＲ
ＮＡ及び／又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡを大量に合成す
ることができる。前記のように、第１のプロモーター配
列と第２のプロモーター配列が異なる場合、センス鎖ｃ
ＲＮＡ又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡを個別に合成するこ
とができる。この工程により、工程までの過程によ
り得られた１０μｇ程度のｃＤＮＡ混成物を用いて、１
００μｇ程度のセンス鎖及びアンチセンス鎖ｃＲＮＡ混
成物を容易に調製することができる。この１００μｇ程
度のＲＮＡ量は、通常の分子生物学的実験には十分な量
であり、例えば、センス鎖ｃＲＮＡ及びアンチセンス鎖
ｃＲＮＡ混成物を用いてサブトラクションクローニング
が可能となる。
【００２０】上記のように、本発明の微量ｍＲＮＡの増
幅方法を用いると、生体内で一過性に発現する超微量の
ｍＲＮＡであっても、通常の分子生物学的実験に十分な
量まで増幅することができることから、本発明の微量ｍ
ＲＮＡの増幅方法は、遺伝子の検出やクローニング、ｃ
ＤＮＡライブラリーの作製、マイクロアレイの作製・解
析等に幅広く利用することができる。本発明の遺伝子の
クローニング方法としては、上記本発明の微量ｍＲＮＡ
の増幅方法を用いる方法であれば特に制限されるもので
はなく、かかる遺伝子のクローニング方法により、遺伝
子のクローニングの他、遺伝子の検出や遺伝子のスクリ
ーニングを行うことができる。より具体的には、本発明
の微量ｍＲＮＡの増幅方法により増幅されたｃＤＮＡ又
はｃＲＮＡを標識化し、これら標識化されたｃＤＮＡ又
はｃＲＮＡを用いて、リバース−ノーザンハイブリダイ
ゼーション、サブトラクションクローニング、ＤＮＡア
レイ等の解析を行うことができる。また、本発明により
増幅されたｃＤＮＡ又はｃＲＮＡに対して、通常のサザ
ンハイブリダイゼーションやノーザンハイブリダイゼー
ションを行うことも可能である。さらに、本発明の微量
ｍＲＮＡの増幅方法により調製した完全長ｃＤＮＡを用
いる場合には、インビトロ転写・翻訳によりタンパク質
を合成し、２次元電気泳動法等により解析することによ
り、発現量の変動する遺伝子数や発現産物の同定が可能
となる。
幅方法を用いると、生体内で一過性に発現する超微量の
ｍＲＮＡであっても、通常の分子生物学的実験に十分な
量まで増幅することができることから、本発明の微量ｍ
ＲＮＡの増幅方法は、遺伝子の検出やクローニング、ｃ
ＤＮＡライブラリーの作製、マイクロアレイの作製・解
析等に幅広く利用することができる。本発明の遺伝子の
クローニング方法としては、上記本発明の微量ｍＲＮＡ
の増幅方法を用いる方法であれば特に制限されるもので
はなく、かかる遺伝子のクローニング方法により、遺伝
子のクローニングの他、遺伝子の検出や遺伝子のスクリ
ーニングを行うことができる。より具体的には、本発明
の微量ｍＲＮＡの増幅方法により増幅されたｃＤＮＡ又
はｃＲＮＡを標識化し、これら標識化されたｃＤＮＡ又
はｃＲＮＡを用いて、リバース−ノーザンハイブリダイ
ゼーション、サブトラクションクローニング、ＤＮＡア
レイ等の解析を行うことができる。また、本発明により
増幅されたｃＤＮＡ又はｃＲＮＡに対して、通常のサザ
ンハイブリダイゼーションやノーザンハイブリダイゼー
ションを行うことも可能である。さらに、本発明の微量
ｍＲＮＡの増幅方法により調製した完全長ｃＤＮＡを用
いる場合には、インビトロ転写・翻訳によりタンパク質
を合成し、２次元電気泳動法等により解析することによ
り、発現量の変動する遺伝子数や発現産物の同定が可能
となる。
【００２１】上記リバース−ノーザンハイブリダイゼー
ション方法としては、その一例が図７に示されているよ
うに、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により得られる
増幅された混成２重鎖ｃＤＮＡから、まずジゴキシゲニ
ン（Digoxigenin；ＤＩＧ）等で標識された基質リボヌ
クレオチドの存在下にセンス鎖ｃＲＮＡ混成物をインビ
トロで合成する。他方、特定の遺伝子のクローン化ｃＤ
ＮＡからアンチセンス鎖ｃＲＮＡをインビトロで合成
し、これを変性アガロースゲル等を用いて電気泳動後、
ナイロンメンブランやニトロセルロース膜に写しとって
膜上に固定し、この膜上に固定されたアンチセンス鎖ｃ
ＲＮＡに、前記ＤＩＧ等で標識化されたセンス鎖ｃＲＮ
Ａ混成物を反応させ、次いでハイブリダイズしたｃＲＮ
Ａを、例えばアルカリフォスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗
体と化学発光基質等を用いて検出することにより行うこ
とができる。かかるリバース−ノーザンハイブリダイゼ
ーションを、特定条件下の細胞由来のｍＲＮＡと対照細
胞由来のｍＲＮＡとに個別に行い、それらの結果を比較
することにより、発生過程において生体内で発現量の変
動する遺伝子や特定の薬剤の存在下で発現量の変動する
遺伝子等のｍＲＮＡレベルの変化を検出することができ
る。
ション方法としては、その一例が図７に示されているよ
うに、本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により得られる
増幅された混成２重鎖ｃＤＮＡから、まずジゴキシゲニ
ン（Digoxigenin；ＤＩＧ）等で標識された基質リボヌ
クレオチドの存在下にセンス鎖ｃＲＮＡ混成物をインビ
トロで合成する。他方、特定の遺伝子のクローン化ｃＤ
ＮＡからアンチセンス鎖ｃＲＮＡをインビトロで合成
し、これを変性アガロースゲル等を用いて電気泳動後、
ナイロンメンブランやニトロセルロース膜に写しとって
膜上に固定し、この膜上に固定されたアンチセンス鎖ｃ
ＲＮＡに、前記ＤＩＧ等で標識化されたセンス鎖ｃＲＮ
Ａ混成物を反応させ、次いでハイブリダイズしたｃＲＮ
Ａを、例えばアルカリフォスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗
体と化学発光基質等を用いて検出することにより行うこ
とができる。かかるリバース−ノーザンハイブリダイゼ
ーションを、特定条件下の細胞由来のｍＲＮＡと対照細
胞由来のｍＲＮＡとに個別に行い、それらの結果を比較
することにより、発生過程において生体内で発現量の変
動する遺伝子や特定の薬剤の存在下で発現量の変動する
遺伝子等のｍＲＮＡレベルの変化を検出することができ
る。
【００２２】本発明のサブトラクションクローニング方
法としては、上記本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法によ
り得られるセンス鎖ｃＤＮＡ、アンチセンス鎖ｃＤＮ
Ａ、センス鎖ｃＲＮＡ又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡのう
ちの少なくとも１つを標識化して用いる方法であれば、
どのようなサブトラクションクローニング方法であって
も特に制限されるものではないが、以下に示すサブトラ
クションによるクローニングを例示することができる。
特定条件下の細胞由来のｍＲＮＡを、本発明の微量ｍＲ
ＮＡの増幅方法により増幅し、大量のセンス鎖ｃＲＮＡ
混成物を調製する。一方、対照細胞由来のｍＲＮＡを、
本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により増幅し、大量の
アンチセンス鎖ｃＲＮＡ混成物を調製する。かかるアン
チセンス鎖ｃＲＮＡ混成物の調製に際して、ビオチン化
リボヌクレオチドを基質に用いて標識する。次に、前記
センス鎖ｃＲＮＡ混成物とビオチン標識アンチセンス鎖
ｃＲＮＡ混成物をハイブリダイゼーションさせ、続いて
アビジン結合磁気ビーズを反応せしめた後、磁性体等を
用いてハイブリダイズしていないアンチセンス鎖ｃＲＮ
Ａや、センス鎖ｃＲＮＡ−アンチセンス鎖ｃＲＮＡ複合
体を系外に除去し、特定条件下の細胞のみに発現してい
るｍＲＮＡに由来するハイブリダイズしていないセンス
鎖ｃＲＮＡを得て、これを鋳型とし、アンチセンス鎖ｃ
ＤＮＡを合成した後、ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅し、
次いで、このｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを用いて
大腸菌を形質転換し、以後、常法によりディファレンシ
ャル・ハイブリダイゼーションを行う。かかるサブトラ
クションクローニング方法においては、例えば、１個の
マウスの初期胚、１匹のマウスの微小な脳神経核・組織
領域から出発することが可能である。
法としては、上記本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法によ
り得られるセンス鎖ｃＤＮＡ、アンチセンス鎖ｃＤＮ
Ａ、センス鎖ｃＲＮＡ又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡのう
ちの少なくとも１つを標識化して用いる方法であれば、
どのようなサブトラクションクローニング方法であって
も特に制限されるものではないが、以下に示すサブトラ
クションによるクローニングを例示することができる。
特定条件下の細胞由来のｍＲＮＡを、本発明の微量ｍＲ
ＮＡの増幅方法により増幅し、大量のセンス鎖ｃＲＮＡ
混成物を調製する。一方、対照細胞由来のｍＲＮＡを、
本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により増幅し、大量の
アンチセンス鎖ｃＲＮＡ混成物を調製する。かかるアン
チセンス鎖ｃＲＮＡ混成物の調製に際して、ビオチン化
リボヌクレオチドを基質に用いて標識する。次に、前記
センス鎖ｃＲＮＡ混成物とビオチン標識アンチセンス鎖
ｃＲＮＡ混成物をハイブリダイゼーションさせ、続いて
アビジン結合磁気ビーズを反応せしめた後、磁性体等を
用いてハイブリダイズしていないアンチセンス鎖ｃＲＮ
Ａや、センス鎖ｃＲＮＡ−アンチセンス鎖ｃＲＮＡ複合
体を系外に除去し、特定条件下の細胞のみに発現してい
るｍＲＮＡに由来するハイブリダイズしていないセンス
鎖ｃＲＮＡを得て、これを鋳型とし、アンチセンス鎖ｃ
ＤＮＡを合成した後、ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅し、
次いで、このｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを用いて
大腸菌を形質転換し、以後、常法によりディファレンシ
ャル・ハイブリダイゼーションを行う。かかるサブトラ
クションクローニング方法においては、例えば、１個の
マウスの初期胚、１匹のマウスの微小な脳神経核・組織
領域から出発することが可能である。
【００２３】本発明のマイクロアレイとしては、上記本
発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により得られるセンス鎖
ｃＤＮＡ、アンチセンス鎖ｃＤＮＡ、センス鎖ｃＲＮＡ
又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡのうちの少なくとも１つを
用いて作製されるマイクロアレイであればどのようなも
のでもよく、マイクロアレイの作製は、「ＤＮＡマイク
ロアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社２０００年３月１６
日発行）の２６〜３４頁に記載された方法など、従来公
知の方法により行うことができる。また、かかるマイク
ロアレイを用いたゲノム解析も、文献（Nature Vol.40
7, September 7(2000) Appendix 9-19）に記載された方
法など、従来公知の方法により行うことができる。
発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により得られるセンス鎖
ｃＤＮＡ、アンチセンス鎖ｃＤＮＡ、センス鎖ｃＲＮＡ
又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡのうちの少なくとも１つを
用いて作製されるマイクロアレイであればどのようなも
のでもよく、マイクロアレイの作製は、「ＤＮＡマイク
ロアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社２０００年３月１６
日発行）の２６〜３４頁に記載された方法など、従来公
知の方法により行うことができる。また、かかるマイク
ロアレイを用いたゲノム解析も、文献（Nature Vol.40
7, September 7(2000) Appendix 9-19）に記載された方
法など、従来公知の方法により行うことができる。
【００２４】本発明のｃＤＮＡライブラリーとしては、
上記本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により得られるｃ
ＤＮＡ混成物がベクターに導入されているものであれば
どのようなものでもよく、上記ベクターとしては、プラ
スミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター
など従来公知のライブラリー作製用のベクターを例示す
ることができる。本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法によ
ると、工程〜により増幅ｃＤＮＡ混成物を調製する
まで制限酵素を使用する必要がないことから、一部のｃ
ＤＮＡの欠失を招くことがない。かかるｃＤＮＡライブ
ラリーの作製は、例えば、１個のマウスの初期胚、１匹
のマウスの微小な脳神経核・組織領域から出発すること
が可能である。また、ｃＤＮＡライブラリー作製に用い
られるｃＤＮＡ混成物として、工程で得られたｃＲＮ
Ａ混成物から、さらに逆転写酵素を用いて合成したｃＤ
ＮＡ混成物を用いることもできる。
上記本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により得られるｃ
ＤＮＡ混成物がベクターに導入されているものであれば
どのようなものでもよく、上記ベクターとしては、プラ
スミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター
など従来公知のライブラリー作製用のベクターを例示す
ることができる。本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法によ
ると、工程〜により増幅ｃＤＮＡ混成物を調製する
まで制限酵素を使用する必要がないことから、一部のｃ
ＤＮＡの欠失を招くことがない。かかるｃＤＮＡライブ
ラリーの作製は、例えば、１個のマウスの初期胚、１匹
のマウスの微小な脳神経核・組織領域から出発すること
が可能である。また、ｃＤＮＡライブラリー作製に用い
られるｃＤＮＡ混成物として、工程で得られたｃＲＮ
Ａ混成物から、さらに逆転写酵素を用いて合成したｃＤ
ＮＡ混成物を用いることもできる。
【００２５】また、先行技術（ＷＯ９３／１５２２８）
では、ｃＤＮＡをプラスミドベクターに一方向性に挿入
するため、制限酵素消化による断端配列を利用してお
り、これにより一部のｃＤＮＡが失われることになる
が、本発明においては、制限酵素消化を用いることな
く、ＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エキソヌクレアー
ゼ活性を利用して調製した、その両端に特異的な制限酵
素切断端配列を有するｃＤＮＡ断片を利用してプラスミ
ドベクターに一方向性かつ１コピーの挿入を行うことが
可能となる。後述する実施例において詳しく説明されて
いるように、例えば、ｄＡＴＰとｄＴＴＰのみ含有し、
ｄＣＴＰとｄＧＴＰを含まない反応液中で、Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼを作用させると、その３′→５′エキソ
ヌクレアーゼ活性により、３′端側からＣ及び／又はＧ
からなるヌクレオチド部分がＡ又はＴが現出するところ
まで除去されて５′突出末端が形成され、制限酵素ＡＶ
ａＩ及びＡｃｃＩ断端を有するｃＤＮＡ断片等を調製す
ることができ、かかるｃＤＮＡ断片を利用するとプラス
ミドベクターに一方向性かつ１コピーの挿入を行うこと
ができる。
では、ｃＤＮＡをプラスミドベクターに一方向性に挿入
するため、制限酵素消化による断端配列を利用してお
り、これにより一部のｃＤＮＡが失われることになる
が、本発明においては、制限酵素消化を用いることな
く、ＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エキソヌクレアー
ゼ活性を利用して調製した、その両端に特異的な制限酵
素切断端配列を有するｃＤＮＡ断片を利用してプラスミ
ドベクターに一方向性かつ１コピーの挿入を行うことが
可能となる。後述する実施例において詳しく説明されて
いるように、例えば、ｄＡＴＰとｄＴＴＰのみ含有し、
ｄＣＴＰとｄＧＴＰを含まない反応液中で、Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼを作用させると、その３′→５′エキソ
ヌクレアーゼ活性により、３′端側からＣ及び／又はＧ
からなるヌクレオチド部分がＡ又はＴが現出するところ
まで除去されて５′突出末端が形成され、制限酵素ＡＶ
ａＩ及びＡｃｃＩ断端を有するｃＤＮＡ断片等を調製す
ることができ、かかるｃＤＮＡ断片を利用するとプラス
ミドベクターに一方向性かつ１コピーの挿入を行うこと
ができる。
【００２６】本発明の微量ｍＲＮＡ増幅用キットとして
は、オリゴ(ｄＴ)を結合させた磁気ビーズ等の担体、第
１のプロモーター配列を有するリンカー、前記第１のプ
ロモーター配列とは異なる第２のプロモーター配列を有
するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを含む
ものであれば特に制限されるものではないが、前記工程
〜で使用する各種緩衝液等を含むものが好ましい。
本発明の微量ｍＲＮＡ増幅用キットを用いると、前記サ
ブトラクションクローニングや、マイクロアレイの作製
・解析や、ｃＤＮＡライブラリーの構築を簡便に行うこ
とができる。
は、オリゴ(ｄＴ)を結合させた磁気ビーズ等の担体、第
１のプロモーター配列を有するリンカー、前記第１のプ
ロモーター配列とは異なる第２のプロモーター配列を有
するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを含む
ものであれば特に制限されるものではないが、前記工程
〜で使用する各種緩衝液等を含むものが好ましい。
本発明の微量ｍＲＮＡ増幅用キットを用いると、前記サ
ブトラクションクローニングや、マイクロアレイの作製
・解析や、ｃＤＮＡライブラリーの構築を簡便に行うこ
とができる。
【００２７】
【実施例】以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体
的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定
されるものではない。 実施例１［微量ｍＲＮＡ増幅法（ＭＳＭＡＰ）；図１参
照］ ［ＲＮＡサンプル液の調製］ラット初代培養肝細胞から
酸・グアニジンチオシアネート・フェノール・クロロホ
ルム抽出法（ＡＧＰＣ法）により全ＲＮＡを抽出し、１
μｇの全ＲＮＡを含む１０μｌの水溶液を出発材料とし
た。これを滅菌水を用いて段階希釈し、ＲＮＡ量（ｎ
ｇ）が１０2、１０、１、１０-1、１０-2、１０-3を含
む各サンプル液及びネガティブコントロールとしてＲＮ
Ａ量（ｎｇ）が０のサンプル液それぞれ１０μｌを調製
した。
的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定
されるものではない。 実施例１［微量ｍＲＮＡ増幅法（ＭＳＭＡＰ）；図１参
照］ ［ＲＮＡサンプル液の調製］ラット初代培養肝細胞から
酸・グアニジンチオシアネート・フェノール・クロロホ
ルム抽出法（ＡＧＰＣ法）により全ＲＮＡを抽出し、１
μｇの全ＲＮＡを含む１０μｌの水溶液を出発材料とし
た。これを滅菌水を用いて段階希釈し、ＲＮＡ量（ｎ
ｇ）が１０2、１０、１、１０-1、１０-2、１０-3を含
む各サンプル液及びネガティブコントロールとしてＲＮ
Ａ量（ｎｇ）が０のサンプル液それぞれ１０μｌを調製
した。
【００２８】［オリゴ(ｄＴ)磁気ビーズへのポリ(Ａ)+
ＲＮＡの吸着（図１ステップ１）］上記ＲＮＡ１μｇを
含む水溶液１０μｌを６５℃にて５分間保温後氷上で急
冷し、２５μｇのオリゴ(ｄＴ)磁気ビーズ（Dynal社製D
ynabeads Oligo(dT)25）を懸濁した１０μｌの２×結合
緩衝液［１×結合緩衝液の組成：１０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ］に加え、室温で５分間インキュベートし、ポリ
(Ａ)+ＲＮＡをオリゴ(ｄＴ)にアニールさせた。ポリ
(Ａ)ＲＮＡ吸着オリゴ(ｄＴ)ビーズを磁石（Dynal社製M
PC-E/E1）による吸引と分散を繰り返すことにより、５
０μｌの０．３×結合緩衝液にて２回洗滌した。
ＲＮＡの吸着（図１ステップ１）］上記ＲＮＡ１μｇを
含む水溶液１０μｌを６５℃にて５分間保温後氷上で急
冷し、２５μｇのオリゴ(ｄＴ)磁気ビーズ（Dynal社製D
ynabeads Oligo(dT)25）を懸濁した１０μｌの２×結合
緩衝液［１×結合緩衝液の組成：１０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ］に加え、室温で５分間インキュベートし、ポリ
(Ａ)+ＲＮＡをオリゴ(ｄＴ)にアニールさせた。ポリ
(Ａ)ＲＮＡ吸着オリゴ(ｄＴ)ビーズを磁石（Dynal社製M
PC-E/E1）による吸引と分散を繰り返すことにより、５
０μｌの０．３×結合緩衝液にて２回洗滌した。
【００２９】［磁気ビーズ上での２重鎖ｃＤＮＡの合成
（図１ステップ２）］上記ポリ(Ａ)+ＲＮＡ吸着オリゴ
(ｄＴ)磁気ビーズを、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．
４）、５０ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Gibco BRL社製SuperSc
riptII）２００ユニットを含む２０μｌの反応混合液に
懸濁し、４２℃にて５０分間（１０分ごとに攪拌しビー
ズを浮遊させながら）インキュベートして、アンチセン
ス鎖ｃＤＮＡを合成した。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）０．８μｌを加えて反応を停止し、ｍＲＮＡ／
ｃＤＮＡビーズを１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）／
１ｍＭ ＥＤＴＡ（以下、ＴＥ溶液という）５０μｌに
て３回洗滌した。続いて、同ビーズを１９ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ８．３）、９１ｍＭ塩化カリウム、４．６ｍＭ
塩化マグネシウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、３．８
ｍＭ ＤＴＴ、０．１５ｍＭ ＮＡＤ、１ｍＭ ｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼＩ（Gibco BRL社製）５ユニット、
大腸菌ＤＮＡリガーゼ（Gibco BRL社製）５ユニット、
大腸菌ＲＮａｓｅＨ（Gibco BRL社製）１ユニットを含
む２０μｌの反応混合液に懸濁し、１６℃にて１時間イ
ンキュベートして、センス鎖ｃＤＮＡを合成し、磁気ビ
ーズ固定２重鎖ｃＤＮＡを得た。さらに、１ユニット／
μｌ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics社
製）０．５μｌを追加し、１６℃にて１０分間インキュ
ベートして、５′末端の平滑化を徹底した。０．５Ｍ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．８μｌを加えて反応を停止
し、２重鎖ｃＤＮＡビーズをＴＥ溶液５０μｌにて３回
洗滌した。
（図１ステップ２）］上記ポリ(Ａ)+ＲＮＡ吸着オリゴ
(ｄＴ)磁気ビーズを、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．
４）、５０ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Gibco BRL社製SuperSc
riptII）２００ユニットを含む２０μｌの反応混合液に
懸濁し、４２℃にて５０分間（１０分ごとに攪拌しビー
ズを浮遊させながら）インキュベートして、アンチセン
ス鎖ｃＤＮＡを合成した。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）０．８μｌを加えて反応を停止し、ｍＲＮＡ／
ｃＤＮＡビーズを１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）／
１ｍＭ ＥＤＴＡ（以下、ＴＥ溶液という）５０μｌに
て３回洗滌した。続いて、同ビーズを１９ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ８．３）、９１ｍＭ塩化カリウム、４．６ｍＭ
塩化マグネシウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、３．８
ｍＭ ＤＴＴ、０．１５ｍＭ ＮＡＤ、１ｍＭ ｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼＩ（Gibco BRL社製）５ユニット、
大腸菌ＤＮＡリガーゼ（Gibco BRL社製）５ユニット、
大腸菌ＲＮａｓｅＨ（Gibco BRL社製）１ユニットを含
む２０μｌの反応混合液に懸濁し、１６℃にて１時間イ
ンキュベートして、センス鎖ｃＤＮＡを合成し、磁気ビ
ーズ固定２重鎖ｃＤＮＡを得た。さらに、１ユニット／
μｌ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics社
製）０．５μｌを追加し、１６℃にて１０分間インキュ
ベートして、５′末端の平滑化を徹底した。０．５Ｍ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．８μｌを加えて反応を停止
し、２重鎖ｃＤＮＡビーズをＴＥ溶液５０μｌにて３回
洗滌した。
【００３０】［ｃＤＮＡ５′末端へのプロモーター配列
の付加とセンス鎖ｃＤＮＡの分取（図１ステップ３およ
び４）］配列番号１で表される５２ｍｅｒの塩基配列か
らなるupper strandと、配列番号２で表される５０ｍｅ
ｒの塩基配列からなるlower strandのオリゴヌクレオチ
ドを、ＤＮＡシンセサイザーを用いて常法により合成し
た。lower strandの５′末端はＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（宝酒造社製）を用いてリン酸化した。両鎖を常
法によりアニールし、２重鎖とし、図２に示したＭＳＭ
ＡＰ−５′−Ｔ７リンカーを得た。上記の２重鎖ｃＤＮ
Ａビーズを６６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭ
塩化マグネシウム、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、Ｍ
ＳＭＡＰ−５′−Ｔ７リンカー１μｇ、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ（宝酒造社製）３５０ユニットを含む２０μｌの
反応混合液に懸濁し（最後に酵素液１μｌを加えて反応
開始）、４℃にて１晩インキュベートし（ローテーター
にて持続的に撹拌）、ＭＳＭＡＰ−５′−Ｔ７リンカー
を２重鎖ｃＤＮＡの５′末端に連結した（図１ステップ
３）。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．８μｌを
加えて反応を停止し、リンカー連結２重鎖ｃＤＮＡビー
ズをＴＥ溶液５０μｌにて３回洗滌した。続いて、同ビ
ーズをＴＥ溶液２０μｌに懸濁し、９５℃にて５分間イ
ンキュベートして、熱融解によりセンス鎖ｃＤＮＡを解
離させた。アンチセンス鎖ｃＤＮＡビーズを磁石に吸引
し、センス鎖ｃＤＮＡを含む上清を分取した（図１ステ
ップ４）。
の付加とセンス鎖ｃＤＮＡの分取（図１ステップ３およ
び４）］配列番号１で表される５２ｍｅｒの塩基配列か
らなるupper strandと、配列番号２で表される５０ｍｅ
ｒの塩基配列からなるlower strandのオリゴヌクレオチ
ドを、ＤＮＡシンセサイザーを用いて常法により合成し
た。lower strandの５′末端はＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（宝酒造社製）を用いてリン酸化した。両鎖を常
法によりアニールし、２重鎖とし、図２に示したＭＳＭ
ＡＰ−５′−Ｔ７リンカーを得た。上記の２重鎖ｃＤＮ
Ａビーズを６６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、５ｍＭ
塩化マグネシウム、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、Ｍ
ＳＭＡＰ−５′−Ｔ７リンカー１μｇ、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ（宝酒造社製）３５０ユニットを含む２０μｌの
反応混合液に懸濁し（最後に酵素液１μｌを加えて反応
開始）、４℃にて１晩インキュベートし（ローテーター
にて持続的に撹拌）、ＭＳＭＡＰ−５′−Ｔ７リンカー
を２重鎖ｃＤＮＡの５′末端に連結した（図１ステップ
３）。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．８μｌを
加えて反応を停止し、リンカー連結２重鎖ｃＤＮＡビー
ズをＴＥ溶液５０μｌにて３回洗滌した。続いて、同ビ
ーズをＴＥ溶液２０μｌに懸濁し、９５℃にて５分間イ
ンキュベートして、熱融解によりセンス鎖ｃＤＮＡを解
離させた。アンチセンス鎖ｃＤＮＡビーズを磁石に吸引
し、センス鎖ｃＤＮＡを含む上清を分取した（図１ステ
ップ４）。
【００３１】［ｃＤＮＡ３′末端へのプロモーター配列
の付加とアンチセンス鎖ｃＤＮＡの再合成（図１ステッ
プ５）］センス鎖ｃＤＮＡ溶液４μｌに、配列番号３で
表される６８ｍｅｒの塩基配列からなる、ＳＰ６プロモ
ーター配列を付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーＭＳＭＡ
Ｐ−３′−ＳＰ６プライマー５０ｎｇを加え、合計５μ
ｌとした。９０℃にて３分間加熱した後、氷上にて急冷
し、これに各終濃度２０ｍＭトリス塩酸（ＰＨ８．
４）、５０ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡを加え、４２℃にて５分間プレインキュベートし
た後、さらにＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Gibco BRL社製Sup
erScriptII）２００ユニット（１μｌ）を加え２０μｌ
の反応混合液とした。４２℃にて１時間インキュベート
して、アンチセンス鎖ｃＤＮＡを合成し、２重鎖ｃＤＮ
Ａとした。反応終了後、ドライアイス上にて凍結させ、
−２５℃に保管した。この状態で少なくとも１年間保存
することができた。
の付加とアンチセンス鎖ｃＤＮＡの再合成（図１ステッ
プ５）］センス鎖ｃＤＮＡ溶液４μｌに、配列番号３で
表される６８ｍｅｒの塩基配列からなる、ＳＰ６プロモ
ーター配列を付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーＭＳＭＡ
Ｐ−３′−ＳＰ６プライマー５０ｎｇを加え、合計５μ
ｌとした。９０℃にて３分間加熱した後、氷上にて急冷
し、これに各終濃度２０ｍＭトリス塩酸（ＰＨ８．
４）、５０ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化マグネシ
ウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡを加え、４２℃にて５分間プレインキュベートし
た後、さらにＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Gibco BRL社製Sup
erScriptII）２００ユニット（１μｌ）を加え２０μｌ
の反応混合液とした。４２℃にて１時間インキュベート
して、アンチセンス鎖ｃＤＮＡを合成し、２重鎖ｃＤＮ
Ａとした。反応終了後、ドライアイス上にて凍結させ、
−２５℃に保管した。この状態で少なくとも１年間保存
することができた。
【００３２】［ｃＤＮＡ混成物の増幅（図１ステップ
６）］２段階のＰＣＲにより、ｃＤＮＡ混成物の増幅を
行なった。プライマーとしては、２重鎖ｃＤＮＡ両端の
リンカー部分の既知配列、すなわち配列番号４で表され
る２０ｍｅｒの塩基配列からなる５′ＰＣＲプライマー
（図２）と、配列番号５で表される２０ｍｅｒの塩基配
列からなる３′ＰＣＲプライマー（図２）を用いた。第
１段階のＰＣＲは、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．
２）、１０ｍＭ塩化カリウム、６ｍＭ硫酸アンモニウ
ム、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％ Triton X-10
0、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ）、１０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、上記２重鎖
ｃＤＮＡ溶液２μｌ、５′ＰＣＲプライマー０．１ｎｍ
ｏｌ、３′ＰＣＲプライマー０．１ｎｍｏｌ、熱耐性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製Pfu DNAポリメラー
ゼ）３ユニットを含む１００μｌの反応混合液中で行な
った。なお、ＰＣＲの条件は、９４℃にて１分間熱変
性、５７℃にて２分間アニーリング、７２℃にて２分間
伸長反応させるというサイクルを１５回繰り返すという
条件で行なった。第２段階のＰＣＲは、第１段階のＰＣ
Ｒ産物混合液５μｌずつを５本のチューブに分注し、各
チューブの他の組成は第１段階と同様の１００μｌの反
応混合液中で行なった。なお、ＰＣＲの条件は、上記第
１段階と同様の条件で行なった。５本の産物混合液（全
ＲＮＡ１μｇの１／２００に相当）を１本に集め、０．
５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０μｌと１０％ ＳＤＳ
１０μｌとを加えて反応を停止した。ＴＥ飽和フェノー
ル５００μｌによる抽出２回、ＴＥ飽和フェノール／ク
ロロフォルム（５０：５０）５００μｌによる抽出２
回、クロロフォルム５００μｌによる抽出２回の後、残
された約４５０μｌの産物混合液に、キャリアーとして
グリコーゲン（Roche Diagnostics社製）２０μｇ（１
μｌ）を加え、さらに５Ｍ酢酸アンモニウム２／３容
（３００μｌ）、エタノール２容（１．５ｍｌ）を加
え、氷上に１時間保管後、遠心により産物を回収した。
沈殿を７０％エタノール１ｍｌにて洗滌した後、風乾
し、ＴＥ溶液２０μｌに溶解した。以上の方法により、
全ＲＮＡ１μｇの１／２００相当量を第２段階のＰＣＲ
に適用した場合、通常、約１０μｇの増幅ｃＤＮＡ混成
物が得られることがわかった。図３に示すように、第２
段階のＰＣＲの各サイクルにおける増幅ｃＤＮＡ混成物
を１％アガロースゲルにて電気泳動後、エチジウムブロ
マイドにて蛍光染色すると、１２サイクル以上で約４０
００ｂｐの長さに及ぶｃＤＮＡの増幅が認められた。上
記のように、通常、第２段階のＰＣＲのサイクル数とし
ては、合成量が飽和していない１５サイクル程度を用い
た。また、図４に示すように、出発材料の全ＲＮＡは
０．１ｎｇまで少量化が可能であった。これに含まれる
ｍＲＮＡを２ｐｇと仮定し、この全量を増幅した場合、
理論上２ｍｇの増幅ｃＤＮＡが得られることになり、こ
の段階までで１０9倍の増幅が可能であることが明らか
になった。
６）］２段階のＰＣＲにより、ｃＤＮＡ混成物の増幅を
行なった。プライマーとしては、２重鎖ｃＤＮＡ両端の
リンカー部分の既知配列、すなわち配列番号４で表され
る２０ｍｅｒの塩基配列からなる５′ＰＣＲプライマー
（図２）と、配列番号５で表される２０ｍｅｒの塩基配
列からなる３′ＰＣＲプライマー（図２）を用いた。第
１段階のＰＣＲは、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．
２）、１０ｍＭ塩化カリウム、６ｍＭ硫酸アンモニウ
ム、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．１％ Triton X-10
0、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ）、１０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、上記２重鎖
ｃＤＮＡ溶液２μｌ、５′ＰＣＲプライマー０．１ｎｍ
ｏｌ、３′ＰＣＲプライマー０．１ｎｍｏｌ、熱耐性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製Pfu DNAポリメラー
ゼ）３ユニットを含む１００μｌの反応混合液中で行な
った。なお、ＰＣＲの条件は、９４℃にて１分間熱変
性、５７℃にて２分間アニーリング、７２℃にて２分間
伸長反応させるというサイクルを１５回繰り返すという
条件で行なった。第２段階のＰＣＲは、第１段階のＰＣ
Ｒ産物混合液５μｌずつを５本のチューブに分注し、各
チューブの他の組成は第１段階と同様の１００μｌの反
応混合液中で行なった。なお、ＰＣＲの条件は、上記第
１段階と同様の条件で行なった。５本の産物混合液（全
ＲＮＡ１μｇの１／２００に相当）を１本に集め、０．
５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０μｌと１０％ ＳＤＳ
１０μｌとを加えて反応を停止した。ＴＥ飽和フェノー
ル５００μｌによる抽出２回、ＴＥ飽和フェノール／ク
ロロフォルム（５０：５０）５００μｌによる抽出２
回、クロロフォルム５００μｌによる抽出２回の後、残
された約４５０μｌの産物混合液に、キャリアーとして
グリコーゲン（Roche Diagnostics社製）２０μｇ（１
μｌ）を加え、さらに５Ｍ酢酸アンモニウム２／３容
（３００μｌ）、エタノール２容（１．５ｍｌ）を加
え、氷上に１時間保管後、遠心により産物を回収した。
沈殿を７０％エタノール１ｍｌにて洗滌した後、風乾
し、ＴＥ溶液２０μｌに溶解した。以上の方法により、
全ＲＮＡ１μｇの１／２００相当量を第２段階のＰＣＲ
に適用した場合、通常、約１０μｇの増幅ｃＤＮＡ混成
物が得られることがわかった。図３に示すように、第２
段階のＰＣＲの各サイクルにおける増幅ｃＤＮＡ混成物
を１％アガロースゲルにて電気泳動後、エチジウムブロ
マイドにて蛍光染色すると、１２サイクル以上で約４０
００ｂｐの長さに及ぶｃＤＮＡの増幅が認められた。上
記のように、通常、第２段階のＰＣＲのサイクル数とし
ては、合成量が飽和していない１５サイクル程度を用い
た。また、図４に示すように、出発材料の全ＲＮＡは
０．１ｎｇまで少量化が可能であった。これに含まれる
ｍＲＮＡを２ｐｇと仮定し、この全量を増幅した場合、
理論上２ｍｇの増幅ｃＤＮＡが得られることになり、こ
の段階までで１０9倍の増幅が可能であることが明らか
になった。
【００３３】［ｃＲＮＡ混成物の合成（図１ステップ
７）］上記増幅ｃＤＮＡ混成物を鋳型として、センス鎖
およびアンチセンス鎖ｃＲＮＡをそれぞれＴ７およびＳ
Ｐ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて以下のように特異的
に合成した。４０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、６ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭスペル
ミジン、１ｍＭ ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、Ｕ
ＴＰ）、ＲＮａｓｅインヒビター（Roche Diagnostics
社製）４ユニット、増幅ｃＤＮＡ混成物０．３μｇ、Ｔ
７ ＲＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics社製）また
はＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics社
製）４０ユニットを含む２０μｌの反応混合液を３７℃
にて２時間インキュベートして、ｃＲＮＡを合成した。
続いて、ＲＮａｓｅ活性を含まないＤＮａｓｅＩ（１０
ユニット／μｌ Roche Diagnostics社製）２μｌを加
え、さらに３７℃にて１５分間インキュベートすること
により鋳型ｃＤＮＡを分解し、最後に０．５Ｍ ＥＤＴ
Ａ（ｐＨ８．０）０．８μｌを加えて反応を停止した。
続いて５Ｍ酢酸アンモニウム２／３容（１５．２μ
ｌ）、エタノール２容（７６μｌ）を加え、氷上に１０
分間保管後、遠心により産物を回収した。回収した産物
（沈殿物）を７０％エタノール０．１ｍｌにて洗滌した
後、風乾し、滅菌水１０μｌに溶解した。なお、上記の
結果、増幅ｃＤＮＡ混成物０．３μｇから、通常、約１
０μｇの増幅ｃＲＮＡ混成物が得られることがわかっ
た。以上のことから、出発材料の１μｇの全ＲＮＡ（約
２０ｎｇ ｍＲＮＡ）から起算してルーチンに１０8倍、
０．１ｎｇの全ＲＮＡから出発した場合理論上最大で１
０12倍の増幅が可能であると計算された。図５に示すよ
うに、増幅ｃＲＮＡ混成物を１％アガロース／ＭＯＰＳ
酢酸／ホルムアルデヒドゲルにて電気泳動後、エチジウ
ムブロマイドにて蛍光染色すると、約２０００ｂの長さ
に及ぶｃＲＮＡの合成が認められた。
７）］上記増幅ｃＤＮＡ混成物を鋳型として、センス鎖
およびアンチセンス鎖ｃＲＮＡをそれぞれＴ７およびＳ
Ｐ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて以下のように特異的
に合成した。４０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、６ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭスペル
ミジン、１ｍＭ ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、Ｕ
ＴＰ）、ＲＮａｓｅインヒビター（Roche Diagnostics
社製）４ユニット、増幅ｃＤＮＡ混成物０．３μｇ、Ｔ
７ ＲＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics社製）また
はＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics社
製）４０ユニットを含む２０μｌの反応混合液を３７℃
にて２時間インキュベートして、ｃＲＮＡを合成した。
続いて、ＲＮａｓｅ活性を含まないＤＮａｓｅＩ（１０
ユニット／μｌ Roche Diagnostics社製）２μｌを加
え、さらに３７℃にて１５分間インキュベートすること
により鋳型ｃＤＮＡを分解し、最後に０．５Ｍ ＥＤＴ
Ａ（ｐＨ８．０）０．８μｌを加えて反応を停止した。
続いて５Ｍ酢酸アンモニウム２／３容（１５．２μ
ｌ）、エタノール２容（７６μｌ）を加え、氷上に１０
分間保管後、遠心により産物を回収した。回収した産物
（沈殿物）を７０％エタノール０．１ｍｌにて洗滌した
後、風乾し、滅菌水１０μｌに溶解した。なお、上記の
結果、増幅ｃＤＮＡ混成物０．３μｇから、通常、約１
０μｇの増幅ｃＲＮＡ混成物が得られることがわかっ
た。以上のことから、出発材料の１μｇの全ＲＮＡ（約
２０ｎｇ ｍＲＮＡ）から起算してルーチンに１０8倍、
０．１ｎｇの全ＲＮＡから出発した場合理論上最大で１
０12倍の増幅が可能であると計算された。図５に示すよ
うに、増幅ｃＲＮＡ混成物を１％アガロース／ＭＯＰＳ
酢酸／ホルムアルデヒドゲルにて電気泳動後、エチジウ
ムブロマイドにて蛍光染色すると、約２０００ｂの長さ
に及ぶｃＲＮＡの合成が認められた。
【００３４】［増幅ｃＲＮＡ混成物のノーザンハイブリ
ダイゼーション解析（図６）］ラット初代培養肝細胞に
由来する全ＲＮＡ２μｇ、およびその増幅センス鎖ｃＲ
ＮＡ混成物０．３μｇを１％アガロース／ＭＯＰＳ酢酸
／ホルムアルデヒドゲルにて電気泳動後、ＲＮＡ蛍光バ
ンドを検出し、さらに常法によりナイロンメンブレンに
ブロットした。アルギナーゼｃＤＮＡを鋳型にしてRoch
e Diagnostics社製のキットを用いてＤＩＧ標識したア
ンチセンス鎖ｃＲＮＡを合成し、これをプローブに用い
てハイブリダイゼーションを行なった。同社のプロトコ
ルに従い、アルカリフォスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体
と化学発光基質CDP-Starを用い、発光シグナルをＸ線フ
ィルムに検出した。約１．６ｋｂのアルギナーゼｍＲＮ
Ａおよびセンス鎖ｃＲＮＡが検出された。
ダイゼーション解析（図６）］ラット初代培養肝細胞に
由来する全ＲＮＡ２μｇ、およびその増幅センス鎖ｃＲ
ＮＡ混成物０．３μｇを１％アガロース／ＭＯＰＳ酢酸
／ホルムアルデヒドゲルにて電気泳動後、ＲＮＡ蛍光バ
ンドを検出し、さらに常法によりナイロンメンブレンに
ブロットした。アルギナーゼｃＤＮＡを鋳型にしてRoch
e Diagnostics社製のキットを用いてＤＩＧ標識したア
ンチセンス鎖ｃＲＮＡを合成し、これをプローブに用い
てハイブリダイゼーションを行なった。同社のプロトコ
ルに従い、アルカリフォスファターゼ結合抗ＤＩＧ抗体
と化学発光基質CDP-Starを用い、発光シグナルをＸ線フ
ィルムに検出した。約１．６ｋｂのアルギナーゼｍＲＮ
Ａおよびセンス鎖ｃＲＮＡが検出された。
【００３５】［標識ｃＲＮＡ混成物を用いたリバース−
ノーザンハイブリダイゼーション解析（図７，８）］ク
ローン化遺伝子由来のｃＲＮＡをフィルターに固定し、
これに、検体試料に由来する標識反対鎖ｃＲＮＡ混成物
をハイブリダイズさせ、特定のｍＲＮＡのレベルを測定
することを可能にする方法の原理を図７に、実験例を図
８に示した。β−アクチン、グリセルアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、およびアルギ
ナーゼのｃＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写系によ
りアンチセンス鎖ｃＲＮＡを合成した。各ｃＲＮＡ０．
５μｇを１％アガロース／ＭＯＰＳ酢酸／ホルムアルデ
ヒドゲルにて電気泳動後、常法によりナイロンメンブレ
ンにブロットした。一方、１０-6Ｍデキサメサゾンおよ
び３×１０-8Ｍグルカゴンにて２時間処理あるいは無処
理のラット初代培養肝細胞の全ＲＮＡに由来する増幅ｃ
ＤＮＡ混成物を鋳型として、Roche Diagnostics社製の
キットを用いてＤＩＧ標識したセンス鎖ｃＲＮＡ混成物
を合成した。同社のプロトコルに従い、アンチセンス鎖
ｃＲＮＡブロットに対して、０．５μｇ／ｍｌのＤＩＧ
標識センス鎖ｃＲＮＡ混成物を６８℃にて１晩反応さ
せ、ハイブリダイズしたＲＮＡに由来するシグナルを化
学発光としてＸ線フィルムに検出した。その結果、β−
アクチン、Ｇ３ＰＤＨのｍＲＮＡレベルに変化が認めら
れないのに対し、デキサメサゾンおよびグルカゴン処理
によりアルギナーゼｍＲＮＡレベルが上昇するのが確認
できた。
ノーザンハイブリダイゼーション解析（図７，８）］ク
ローン化遺伝子由来のｃＲＮＡをフィルターに固定し、
これに、検体試料に由来する標識反対鎖ｃＲＮＡ混成物
をハイブリダイズさせ、特定のｍＲＮＡのレベルを測定
することを可能にする方法の原理を図７に、実験例を図
８に示した。β−アクチン、グリセルアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、およびアルギ
ナーゼのｃＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写系によ
りアンチセンス鎖ｃＲＮＡを合成した。各ｃＲＮＡ０．
５μｇを１％アガロース／ＭＯＰＳ酢酸／ホルムアルデ
ヒドゲルにて電気泳動後、常法によりナイロンメンブレ
ンにブロットした。一方、１０-6Ｍデキサメサゾンおよ
び３×１０-8Ｍグルカゴンにて２時間処理あるいは無処
理のラット初代培養肝細胞の全ＲＮＡに由来する増幅ｃ
ＤＮＡ混成物を鋳型として、Roche Diagnostics社製の
キットを用いてＤＩＧ標識したセンス鎖ｃＲＮＡ混成物
を合成した。同社のプロトコルに従い、アンチセンス鎖
ｃＲＮＡブロットに対して、０．５μｇ／ｍｌのＤＩＧ
標識センス鎖ｃＲＮＡ混成物を６８℃にて１晩反応さ
せ、ハイブリダイズしたＲＮＡに由来するシグナルを化
学発光としてＸ線フィルムに検出した。その結果、β−
アクチン、Ｇ３ＰＤＨのｍＲＮＡレベルに変化が認めら
れないのに対し、デキサメサゾンおよびグルカゴン処理
によりアルギナーゼｍＲＮＡレベルが上昇するのが確認
できた。
【００３６】［ｃＤＮＡ混成物よりのｃＤＮＡライブラ
リーの作製（図９）］ＰＣＲによる増幅前あるいは増幅
後のｃＤＮＡ混成物は、その両端に構築された特殊な配
列を利用して、pUC18/19、pGEM-3Zf(+)/(-)等のプラス
ミドベクターに一方向性に、かつ１コピーのみ挿入する
ことが可能である。ｃＤＮＡ混成物の５′末端の配列 ５′−ＣＣＧＧＡ・・・・・−３′ ３′−ＧＧＣＣＴ・・・・・−５′ に対して、ｄＡＴＰとｄＴＴＰのみが存在し、ｄＣＴＰ
とｄＧＴＰが存在しない反応液中で、Ｔ４ ＤＮＡポリ
メラーゼを作用させると、その３′→５′エキソヌクレ
アーゼ活性により、 ５′−ＣＣＧＧＡ・・・・・−３′ ３′−Ｔ・・・・・−５′ の５′突出末端を形成できる。この末端は、pUC18/19、
pGEM-3Zf(+)/(-)等のポリリンカー部位をＡｖａＩにて
消化した際形成される５′突出末端と相補的である。同
様にして、ｃＤＮＡ混成物の３′末端の配列 ５′−ＣＧＡ・・・・・−３′ ３′−ＧＣＴ・・・・・−５′ に対して、 ５′−ＣＧＡ・・・・・−３′ ３′−Ｔ・・・・・−５′ の５′突出末端を形成できる。この末端は、pUC18/19、
pGEM-3Zf(+)/(-)等のポリリンカー部位をＡｃｃＩにて
消化した際形成される５′突出末端と相補的である。こ
の特質を利用して、各ｃＤＮＡを一方向性にプラスミド
のＡｖａＩ−ＡｃｃＩ部位に挿入できる。また、各ｃＤ
ＮＡの両端はリン酸化されていないため、ｃＤＮＡ同士
の連結がおこらず、１コピーのみ挿入される。
リーの作製（図９）］ＰＣＲによる増幅前あるいは増幅
後のｃＤＮＡ混成物は、その両端に構築された特殊な配
列を利用して、pUC18/19、pGEM-3Zf(+)/(-)等のプラス
ミドベクターに一方向性に、かつ１コピーのみ挿入する
ことが可能である。ｃＤＮＡ混成物の５′末端の配列 ５′−ＣＣＧＧＡ・・・・・−３′ ３′−ＧＧＣＣＴ・・・・・−５′ に対して、ｄＡＴＰとｄＴＴＰのみが存在し、ｄＣＴＰ
とｄＧＴＰが存在しない反応液中で、Ｔ４ ＤＮＡポリ
メラーゼを作用させると、その３′→５′エキソヌクレ
アーゼ活性により、 ５′−ＣＣＧＧＡ・・・・・−３′ ３′−Ｔ・・・・・−５′ の５′突出末端を形成できる。この末端は、pUC18/19、
pGEM-3Zf(+)/(-)等のポリリンカー部位をＡｖａＩにて
消化した際形成される５′突出末端と相補的である。同
様にして、ｃＤＮＡ混成物の３′末端の配列 ５′−ＣＧＡ・・・・・−３′ ３′−ＧＣＴ・・・・・−５′ に対して、 ５′−ＣＧＡ・・・・・−３′ ３′−Ｔ・・・・・−５′ の５′突出末端を形成できる。この末端は、pUC18/19、
pGEM-3Zf(+)/(-)等のポリリンカー部位をＡｃｃＩにて
消化した際形成される５′突出末端と相補的である。こ
の特質を利用して、各ｃＤＮＡを一方向性にプラスミド
のＡｖａＩ−ＡｃｃＩ部位に挿入できる。また、各ｃＤ
ＮＡの両端はリン酸化されていないため、ｃＤＮＡ同士
の連結がおこらず、１コピーのみ挿入される。
【００３７】以下に、前記増幅ｃＤＮＡ混成物をpUC19
に挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した実験例を示
す。５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．８）、７ｍＭ塩化マ
グネシウム、１５ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０ｍＭメルカプトエタノール、０．２ｍｇ
／ｍｌ ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＡＴＰ、０．１ｍＭｄＴ
ＴＰ、増幅ｃＤＮＡ混成物１．２μｇ、Ｔ４ ＤＮＡポ
リメラーゼ（Roche Diagnostics社製）２．５ユニット
を含む１００μｌの反応混合液を３７℃にて５分間イン
キュベートして、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性に
よりｃＤＮＡの両３′端よりＣおよびＧヌクレオチド残
基を除去した。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）４μ
ｌを加えて反応を停止した。キャリアーとしてグリコー
ゲン（Roche Diagnostics社製）２０μｇ（１μｌ）を
加え、ＴＥ飽和フェノール１００μｌによる抽出２回、
ＴＥ飽和フェノール／クロロフォルム（５０：５０）１
００μｌによる抽出２回、クロロフォルム１００μｌに
よる抽出２回の後、産物混合液に５Ｍ酢酸アンモニウム
２／３容（６７ｍｌ）、エタノール２容（３３４ｍｌ）
を加え、氷上に１０分間保管後、遠心により産物を回収
した。回収した産物（沈殿物）を７０％エタノール０．
５ｍｌにて洗滌した後、風乾し、ＴＥ溶液２０μｌに溶
解した。一方、pUC19をＡｖａＩおよびＡｃｃＩにより
消化し、アガロース電気泳動後、ベクター部分のバンド
を含むゲルを切り出し、ＤＮＡをGlassmilk（Bio 101社
製）を用いて精製した。ＡｖａＩ／ＡｃｃＩ末端構成ｃ
ＤＮＡ混成物約５ｎｇとＡｖａＩ／ＡｃｃＩ消化pUC19
約５ｎｇを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、常
法により大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルをトランス
フォームした。約２００コロニーのトランスフォーマン
トが得られ、そのうち無作為に選んだ１２クローンにつ
いて液体培養後プラスミドを抽出した。これをＣｌａＩ
およびＨｉｎｄIIIにて消化し、１％アガロース電気泳
動にて解析した。その結果を図９に示す。このことか
ら、１１クローンにｃＤＮＡ由来と考えられるインサー
トが確認され、その長さは約２００〜１０００ｂｐであ
ることがわかった。以上のことから、ｃＤＮＡ混成物１
μｇを用いると、約４万クローンからなるｃＤＮＡライ
ブラリーを、プラスミドをベクターに用いて容易に構築
することが可能であることが明らかになった。
に挿入し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した実験例を示
す。５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．８）、７ｍＭ塩化マ
グネシウム、１５ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０ｍＭメルカプトエタノール、０．２ｍｇ
／ｍｌ ＢＳＡ、０．１ｍＭ ｄＡＴＰ、０．１ｍＭｄＴ
ＴＰ、増幅ｃＤＮＡ混成物１．２μｇ、Ｔ４ ＤＮＡポ
リメラーゼ（Roche Diagnostics社製）２．５ユニット
を含む１００μｌの反応混合液を３７℃にて５分間イン
キュベートして、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性に
よりｃＤＮＡの両３′端よりＣおよびＧヌクレオチド残
基を除去した。０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）４μ
ｌを加えて反応を停止した。キャリアーとしてグリコー
ゲン（Roche Diagnostics社製）２０μｇ（１μｌ）を
加え、ＴＥ飽和フェノール１００μｌによる抽出２回、
ＴＥ飽和フェノール／クロロフォルム（５０：５０）１
００μｌによる抽出２回、クロロフォルム１００μｌに
よる抽出２回の後、産物混合液に５Ｍ酢酸アンモニウム
２／３容（６７ｍｌ）、エタノール２容（３３４ｍｌ）
を加え、氷上に１０分間保管後、遠心により産物を回収
した。回収した産物（沈殿物）を７０％エタノール０．
５ｍｌにて洗滌した後、風乾し、ＴＥ溶液２０μｌに溶
解した。一方、pUC19をＡｖａＩおよびＡｃｃＩにより
消化し、アガロース電気泳動後、ベクター部分のバンド
を含むゲルを切り出し、ＤＮＡをGlassmilk（Bio 101社
製）を用いて精製した。ＡｖａＩ／ＡｃｃＩ末端構成ｃ
ＤＮＡ混成物約５ｎｇとＡｖａＩ／ＡｃｃＩ消化pUC19
約５ｎｇを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、常
法により大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルをトランス
フォームした。約２００コロニーのトランスフォーマン
トが得られ、そのうち無作為に選んだ１２クローンにつ
いて液体培養後プラスミドを抽出した。これをＣｌａＩ
およびＨｉｎｄIIIにて消化し、１％アガロース電気泳
動にて解析した。その結果を図９に示す。このことか
ら、１１クローンにｃＤＮＡ由来と考えられるインサー
トが確認され、その長さは約２００〜１０００ｂｐであ
ることがわかった。以上のことから、ｃＤＮＡ混成物１
μｇを用いると、約４万クローンからなるｃＤＮＡライ
ブラリーを、プラスミドをベクターに用いて容易に構築
することが可能であることが明らかになった。
【００３８】
【発明の効果】本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法は、ヒ
トなど高等生物の限局された細胞、組織に由来する微量
のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを増幅することが可能な汎用性を
有する方法であり、本発明によると、磁気ビーズ上での
ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅と、それに
続くインビトロＲＮＡ合成を組み合わせることにより、
ｍＲＮＡの一億倍程度の増幅が容易にでき、ｃＤＮＡの
増幅のみでも、単一細胞からのライブラリー調製が十分
可能となり、限局された細胞からの各種ｃＤＮＡの単離
にきわめて有用である。また、ｃＤＮＡの両端に連結し
たＴ７及びＳＰ６のプロモーター配列を利用し、センス
鎖及びアンチセンス鎖両方のｃＲＮＡを特異的に合成す
ることができ、サブトラクションクローニングや各鎖特
異的標識プローブを調製することができる。かかる各鎖
特異的標識プローブは、ＤＮＡマイクロアレイ等の高感
度解析に極めて有用である。さらに、特異的に合成され
たセンス鎖ｃＲＮＡを用いてタンパク質のインビトロ合
成も可能となる。そして、ｃＤＮＡ各端の潜在的制限酵
素認識部位構成配列により、プラスミドへの一方向かつ
１コピーの挿入が可能であり、クローン化後の解析が容
易となる。このように本発明は、微量試料に由来するｃ
ＤＮＡの単離とその遺伝子発現解析に汎用性が高く、遺
伝子資源の発見、開発に極めて有用である。
トなど高等生物の限局された細胞、組織に由来する微量
のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを増幅することが可能な汎用性を
有する方法であり、本発明によると、磁気ビーズ上での
ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅と、それに
続くインビトロＲＮＡ合成を組み合わせることにより、
ｍＲＮＡの一億倍程度の増幅が容易にでき、ｃＤＮＡの
増幅のみでも、単一細胞からのライブラリー調製が十分
可能となり、限局された細胞からの各種ｃＤＮＡの単離
にきわめて有用である。また、ｃＤＮＡの両端に連結し
たＴ７及びＳＰ６のプロモーター配列を利用し、センス
鎖及びアンチセンス鎖両方のｃＲＮＡを特異的に合成す
ることができ、サブトラクションクローニングや各鎖特
異的標識プローブを調製することができる。かかる各鎖
特異的標識プローブは、ＤＮＡマイクロアレイ等の高感
度解析に極めて有用である。さらに、特異的に合成され
たセンス鎖ｃＲＮＡを用いてタンパク質のインビトロ合
成も可能となる。そして、ｃＤＮＡ各端の潜在的制限酵
素認識部位構成配列により、プラスミドへの一方向かつ
１コピーの挿入が可能であり、クローン化後の解析が容
易となる。このように本発明は、微量試料に由来するｃ
ＤＮＡの単離とその遺伝子発現解析に汎用性が高く、遺
伝子資源の発見、開発に極めて有用である。
【００３９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION <120> Amplification method of a very small quantity mRNA <130> 12-259 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MSMAP-5'-T7 linker upper strand <400> 1 ccggaatcga ttaatacgac tcactatagg gagatgtcta gaatctcgag tc 52 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MSMAP-5'-T7 linker lower strand <400> 2 gactcgagat tctagacatc tccctatagt gagtcgtatt aatcgattcc 50 <210> 3 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MSMAP-3'-SP6 primer <400> 3 cgataccatg gatttaggtg acactataga ataccggata tcgcggatcc tttttttttt 60 tttttttt 68 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:5' PCR primer <400> 4 ccggaatcga ttaatacgac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:3' PCR primer <400> 5 cgataccatg gatttaggtg 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:T7 promoter sequence <400> 6 taatacgact cactataggg aga 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:SP6 promoter sequence <400> 7 atttaggtga cactatagaa tac 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:T3 promoter sequence <400> 8 aattaaccct cactaaaggg 20
【図１】本発明の微量ｍＲＮＡ増幅法により、ｃＤＮＡ
混成物やｃＲＮＡ混成物を合成する、各工程別の概略を
示す図である。
混成物やｃＲＮＡ混成物を合成する、各工程別の概略を
示す図である。
【図２】本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法に用いられる
リンカーやプライマーの構造を示す図である。
リンカーやプライマーの構造を示す図である。
【図３】本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により、全Ｒ
ＮＡからｃＤＮＡ混成物を増幅した結果を示す図であ
る。第１段階のＰＣＲ産物混合液５μｌを用いて、第２
段階のＰＣＲを１００μｌの反応混合液中で行った。各
サイクル数の反応の後１０μｌを抜取り、アガロース電
気泳動を行なってｃＤＮＡ混成物の増幅を解析した。レ
ーンＭはＤＮＡ分子量マーカーを泳動した。
ＮＡからｃＤＮＡ混成物を増幅した結果を示す図であ
る。第１段階のＰＣＲ産物混合液５μｌを用いて、第２
段階のＰＣＲを１００μｌの反応混合液中で行った。各
サイクル数の反応の後１０μｌを抜取り、アガロース電
気泳動を行なってｃＤＮＡ混成物の増幅を解析した。レ
ーンＭはＤＮＡ分子量マーカーを泳動した。
【図４】本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により、段階
希釈した全ＲＮＡからｃＤＮＡ混成物を増幅した結果を
示す図である。用いた全ＲＮＡ量に相当する細胞の概数
も示した。ＰＣＲは１段階のみで、４０サイクル行なっ
た。レーンＭはＤＮＡ分子量マーカーを泳動した。
希釈した全ＲＮＡからｃＤＮＡ混成物を増幅した結果を
示す図である。用いた全ＲＮＡ量に相当する細胞の概数
も示した。ＰＣＲは１段階のみで、４０サイクル行なっ
た。レーンＭはＤＮＡ分子量マーカーを泳動した。
【図５】本発明の微量ｍＲＮＡの増幅方法により増幅し
たｃＤＮＡ混成物から、センス鎖およびアンチセンス鎖
ｃＲＮＡ混成物を合成した結果を示す図である。レーン
Ｍは分子量マーカーとして全ＲＮＡを泳動した。
たｃＤＮＡ混成物から、センス鎖およびアンチセンス鎖
ｃＲＮＡ混成物を合成した結果を示す図である。レーン
Ｍは分子量マーカーとして全ＲＮＡを泳動した。
【図６】全ＲＮＡおよび増幅ｃＲＮＡ混成物のノーザン
ハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。レ
ーン１および２は、ラット初代培養肝細胞由来の全ＲＮ
Ａおよびその増幅センス鎖ｃＲＮＡ混成物を電気泳動
後、蛍光染色した結果を示す。これらをブロット後、ア
ルギナーゼｍＲＮＡおよびｃＲＮＡを検出した（レーン
３および４）。
ハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。レ
ーン１および２は、ラット初代培養肝細胞由来の全ＲＮ
Ａおよびその増幅センス鎖ｃＲＮＡ混成物を電気泳動
後、蛍光染色した結果を示す。これらをブロット後、ア
ルギナーゼｍＲＮＡおよびｃＲＮＡを検出した（レーン
３および４）。
【図７】本発明におけるリバース−ノーザンハイブリダ
イゼーション解析の概要を示す図である。
イゼーション解析の概要を示す図である。
【図８】リバース−ノーザンハイブリダイゼーション解
析の結果を示す図である。
析の結果を示す図である。
【図９】増幅ｃＤＮＡ混成物を用いて、ｃＤＮＡライブ
ラリーを作製し、各クローンのインサートの長さを検定
した結果である。レーン１２を除く全てのクローンにイ
ンサートが認められた。レーンＭはＤＮＡ分子量マーカ
ーを泳動した。
ラリーを作製し、各クローンのインサートの長さを検定
した結果である。レーン１２を除く全てのクローンにイ
ンサートが認められた。レーンＭはＤＮＡ分子量マーカ
ーを泳動した。
Claims (16)
- 【請求項１】 以下の〜の工程を含むことを特徴と
する微量ｍＲＮＡの増幅方法。 試料中のｍＲＮＡを、オリゴ(ｄＴ)を結合させた担体
に吸着させる工程； 担体上でアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮ
Ａを合成する工程； 得られる２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′
末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーを付加
する工程； ２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、担体に結合したアンチセ
ンス鎖ｃＤＮＡを担体と共に除去する工程； 解離したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロ
モーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)
プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを合成する工程； ２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の配列をプライマ
ーとしてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工
程； - 【請求項２】 以下の〜の工程を含むことを特徴と
する微量ｍＲＮＡの増幅方法。 試料中のｍＲＮＡを、オリゴ(ｄＴ)を結合させた担体
に吸着させる工程； 担体上でアンチセンス鎖ｃＤＮＡ及びセンス鎖ｃＤＮ
Ａを合成する工程； 得られる２重鎖ｃＤＮＡの少なくともセンス鎖の５′
末端に第１のプロモーター配列を有するリンカーを付加
する工程； ２重鎖ｃＤＮＡを解離させ、担体に結合したアンチセ
ンス鎖ｃＤＮＡを担体と共に除去する工程； 解離したセンス鎖ｃＤＮＡを鋳型として、第２のプロ
モーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)
プライマーを用いて、２重鎖ｃＤＮＡを合成する工程； ２重鎖ｃＤＮＡ両端のリンカー部分の配列をプライマ
ーとしてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡ混成物を増幅する工
程； 前記第１のプロモーター配列及び／又は第２のプロモ
ーター配列を利用して、インビトロ転写系によりセンス
鎖ｃＲＮＡ及び／又はアンチセンス鎖ｃＲＮＡを合成す
る工程； - 【請求項３】 担体が磁気ビーズであることを特徴とす
る請求項１又は２記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。 - 【請求項４】 第１のプロモーター配列を有するリンカ
ーとして、その５′末端が非対合末端、３′末端が平滑
末端であるリンカーを使用することを特徴とする請求項
１〜３のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。 - 【請求項５】 第１のプロモーター配列を有するリンカ
ー及び／又は第２のプロモーター配列を有するリンカー
として、該プロモーター配列の５′側及び／又は３′側
に制限酵素認識配列を有するリンカーを使用することを
特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の微量ｍＲＮＡ
の増幅方法。 - 【請求項６】 第１のプロモーター配列と第２のプロモ
ーター配列が異なることを特徴とする請求項１〜５のい
ずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。 - 【請求項７】 第１のプロモーター及び／又は第２のプ
ロモーターが、該プロモーターを特異的に転写すること
ができるＲＮＡポリメラーゼが存するプロモーターであ
ることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の微量
ｍＲＮＡの増幅方法。 - 【請求項８】 プロモーター特異的に転写することがで
きるＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６
プロモーター、Ｔ３プロモーターから選ばれることを特
徴とする請求項７記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。 - 【請求項９】 第１のプロモーター配列を有するリンカ
ーが、配列番号１及び２で表される塩基配列からなるこ
とを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の微量ｍＲ
ＮＡの増幅方法。 - 【請求項１０】 第２のプロモーター配列を有するリン
カーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーが、配列番号３
で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項１
〜９のいずれか記載の微量ｍＲＮＡの増幅方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれか記載の微量
ｍＲＮＡの増幅方法を用いることを特徴とする遺伝子の
クローニング方法。 - 【請求項１２】 請求項１〜１０のいずれか記載の微量
ｍＲＮＡの増幅方法により得られるセンス鎖ｃＤＮＡ、
アンチセンス鎖ｃＤＮＡ、センス鎖ｃＲＮＡ又はアンチ
センス鎖ｃＲＮＡの少なくとも１つを標識化して用いる
ことを特徴とするサブトラクションクローニング方法。 - 【請求項１３】 請求項１〜１０のいずれか記載の微量
ｍＲＮＡの増幅方法により得られるセンス鎖ｃＤＮＡ、
アンチセンス鎖ｃＤＮＡ、センス鎖ｃＲＮＡ又はアンチ
センス鎖ｃＲＮＡの少なくとも１つを用いることを特徴
とするマイクロアレイ。 - 【請求項１４】 請求項１〜１０のいずれか記載の微量
ｍＲＮＡの増幅方法により得られるｃＤＮＡがベクター
に導入されていることを特徴とするｃＤＮＡライブラリ
ー。 - 【請求項１５】 オリゴ(ｄＴ)を結合させた担体、第１
のプロモーター配列を有するリンカー、前記第１のプロ
モーター配列とは異なる第２のプロモーター配列を有す
るリンカーを付加したオリゴ(ｄＴ)プライマーを含むこ
とを特徴とする微量ｍＲＮＡ増幅用キット。 - 【請求項１６】 担体が磁気ビーズであることを特徴と
する請求項１５記載の微量ｍＲＮＡ増幅用キット。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001041428A JP3853161B2 (ja) | 2001-02-19 | 2001-02-19 | 微量ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの増幅方法 |
| US10/468,510 US20040086906A1 (en) | 2001-02-19 | 2002-02-18 | Method of amplifying mrna and cdna in microquantities |
| EP02712417A EP1362912A4 (en) | 2001-02-19 | 2002-02-18 | METHOD FOR AMPLIFICATING MRNA AND CDNA IN MICRO AMOUNTS |
| PCT/JP2002/001360 WO2002066632A1 (fr) | 2001-02-19 | 2002-02-18 | Methode d'amplification d'arnm et d'adnc dans des micro-quantites |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001041428A JP3853161B2 (ja) | 2001-02-19 | 2001-02-19 | 微量ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの増幅方法 |
Publications (2)
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|---|---|
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Family
ID=18903875
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001041428A Expired - Fee Related JP3853161B2 (ja) | 2001-02-19 | 2001-02-19 | 微量ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの増幅方法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP1362912A4 (ja) |
| JP (1) | JP3853161B2 (ja) |
| WO (1) | WO2002066632A1 (ja) |
Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
| JP2007181453A (ja) * | 2005-12-08 | 2007-07-19 | Keio Gijuku | 配列データの取得方法ならびにそれを利用したターゲット遺伝子の抽出方法及び蛋白質の設計方法 |
| WO2008032574A1 (fr) | 2006-09-11 | 2008-03-20 | Osaka University | Procédé d'amplification d'arnm à l'état de trace et son utilisation |
| JPWO2005118791A1 (ja) * | 2004-06-03 | 2008-04-03 | 独立行政法人放射線医学総合研究所 | 微量試料を用いる網羅的遺伝子発現プロフィール解析法 |
| US9145586B2 (en) | 2012-11-29 | 2015-09-29 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method of labeling a target nucleic acid |
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|---|---|---|---|---|
| WO2006085616A1 (ja) * | 2005-02-10 | 2006-08-17 | Riken | 核酸配列増幅方法 |
| JP5073967B2 (ja) * | 2006-05-30 | 2012-11-14 | 株式会社日立製作所 | 単一細胞の遺伝子発現定量方法 |
| CN102797044B (zh) * | 2012-08-16 | 2017-11-03 | 北京诺兰信生化科技有限责任公司 | 一种快速高效的均一化全长cDNA文库构建方法 |
| JP2022543668A (ja) | 2019-08-09 | 2022-10-13 | ナットクラッカー セラピューティクス， インコーポレイテッド | マイクロ流体装置およびその使用方法 |
| GB2621159A (en) * | 2022-08-04 | 2024-02-07 | Wobble Genomics Ltd | Methods of preparing processed nucleic acid samples and detecting nucleic acids and devices therefor |
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|---|---|---|---|---|
| DE68908054T2 (de) * | 1988-01-21 | 1994-03-10 | Genentech Inc | Verstärkung und nachweis von nukleinsäuresequenzen. |
| JPH08500722A (ja) * | 1992-01-29 | 1996-01-30 | 日立化成工業株式会社 | ポリヌクレオチド固定化担体 |
| US5932451A (en) * | 1997-11-19 | 1999-08-03 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Method for unbiased mRNA amplification |
| US6794138B1 (en) * | 1999-12-16 | 2004-09-21 | Affymetrix, Inc. | Methods of small sample amplification |
-
2001
- 2001-02-19 JP JP2001041428A patent/JP3853161B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-02-18 EP EP02712417A patent/EP1362912A4/en not_active Withdrawn
- 2002-02-18 US US10/468,510 patent/US20040086906A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-18 WO PCT/JP2002/001360 patent/WO2002066632A1/ja active Application Filing
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|---|---|---|---|---|
| JPWO2005118791A1 (ja) * | 2004-06-03 | 2008-04-03 | 独立行政法人放射線医学総合研究所 | 微量試料を用いる網羅的遺伝子発現プロフィール解析法 |
| JP2007181453A (ja) * | 2005-12-08 | 2007-07-19 | Keio Gijuku | 配列データの取得方法ならびにそれを利用したターゲット遺伝子の抽出方法及び蛋白質の設計方法 |
| WO2008032574A1 (fr) | 2006-09-11 | 2008-03-20 | Osaka University | Procédé d'amplification d'arnm à l'état de trace et son utilisation |
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| JP5078038B2 (ja) * | 2006-09-11 | 2012-11-21 | 国立大学法人大阪大学 | 微量ｍＲＮＡの増幅方法およびその利用 |
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