JP2002238575A - 微量mRNA及びcDNAの増幅方法 - Google Patents

微量mRNA及びcDNAの増幅方法

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JP2002238575A JP2001041428A JP2001041428A JP2002238575A JP 2002238575 A JP2002238575 A JP 2002238575A JP 2001041428 A JP2001041428 A JP 2001041428A JP 2001041428 A JP2001041428 A JP 2001041428A JP 2002238575 A JP2002238575 A JP 2002238575A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 cDNAライブリーの作製、サブトラクショ
ンクローニング、マイクロアレイの作製・解析、遺伝子
発現解析への適用が可能である超微量のmRNAを10
8倍程度増幅する方法を提供すること。 【解決手段】 オリゴ(dt)結合磁気ビーズに試料中の
mRNAを吸着させた後、磁気ビーズ上で2重鎖cDN
Aを合成し、5′末端にT7プロモーター配列を有する
リンカーを付加後、アンチセンス鎖cDNA結合磁気ビ
ーズを除去し、上清中のセンス鎖cDNAを鋳型とし
て、SP6プロモーター配列を有するリンカーを付加し
たオリゴ(dt)プライマーを用いて、2重鎖cDNAを
再度合成し、この2重鎖cDNA両端のリンカー部分の
既知配列をプライマーとしてPCRを行ってcDNA混
成物を増幅する。また、かかるcDNA混成物を用い
て、T7やSP6ポリメラーゼにより、センス鎖・アン
チセンス鎖cRNAを合成する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中に存在する
微量のmRNAの増幅方法、より詳しくは、cDNAラ
イブラリーの作製、サブトラクションクローニング、マ
イクロアレイへの適用が可能である、PCR法を組み合
わせた、生体内で発現している超微量のmRNAを感度
よく増幅する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】マウス、ヒトなどの哺乳類のゲノムの全
遺伝子数は従来約10万個程度と予想されており、これ
に対応するmRNA/cDNAを網羅的にクローン化す
ることは、遺伝子のコードするタンパク質の配列予測、
遺伝子の構造予測、DNAマイクロアレイの構築等の観
点から、実用的にも基礎研究の上でも極めて重要であ
り、現在、米国、日本をはじめ世界的な取り組みがなさ
れている。例えば、マウスでは既に3万種類程度のcD
NAがクローン化されているが、これらは主に、成体あ
るいは胚に適当量以上存在するmRNAに由来するもの
であると考えられ、残されたcDNAの単離が今後の課
題であるといわれている。多細胞高等生物においては、
相当部分の遺伝子は、特化された一部の細胞に限局して
発現している可能性が考えられており、例えば、脳視床
下部における下垂体ホルモン放出因子遺伝子や、膵島細
胞における糖調節ホルモン遺伝子等は、極めて限られた
少数の細胞においてのみ、その発現が見られる。ある一
群の遺伝子は特定の発生段階の限局された領域でのみ発
現している可能性があり、また、他の一群の遺伝子は各
種ストレスや病原体の感染など環境要因の変動にさらさ
れた細胞でのみ誘導される可能性がある。そして、一般
に、より多くのcDNA種をクローン化するためには、
種々の発生段階にあるより多くの組織、細胞種について
環境条件を多様化させて調べることの有用性が指摘され
ている。
【0003】産業上有用な遺伝子は、その産物であるm
RNAあるいはタンパク質の解析や調製が容易なcDN
Aの形で単離されることが望ましく、cDNAの単離は
mRNAを出発材料とするが、上記のようにmRNA種
の多くは生体の極く限られた組織、細胞にのみ発現して
おり、得られるmRNAが微量なため、cDNAの調製
が困難な場合が多々あり、現在までに多くの微量mRN
A/cDNAの増幅法が提案されている(Dulac,C.&Axe
l,R. (1995)A novel family of genes encoding putati
ve pheromone receptors in mammals.Cell Vol.83,pp.1
95-206、Mackler S.A.,Brooks,B.P.&Eberwine,J.H. (19
92)Stimulus-induced coordinate changes in mRNA abu
ndance in single postsynaptic hippocampal CA1 nuer
ons. Neuron Vol.9,pp.539-548等)が、それぞれcDN
Aライブラリーの調製、ハイブリダイゼーションプロー
ブの調製に特化したものであり、汎用性を有しないもの
がほとんどである。
【0004】その他、迅速かつ簡便に被検試料中の特定
の核酸配列を検出する方法として、検出すべき配列に操
作可能に結合したプロモーターを含む2本鎖核酸の製造
方法であって、(a)オリゴヌクレオチドプロモーター
−プライマーを得;(b)プロモーター−プライマーと
検出すべき核酸配列とがハイブリダイズする条件下で、
該プロモーター−プライマーと該検出すべき配列を含有
する核酸とを接触させ、(c)プロモーター−プライマ
ーの3′末端から、検出すべき核酸配列に相補的な伸長
産物を製造させ;(d)工程(c)の産物を3′−5′エキ
ソヌクレアーゼ活性を有する物質と接触させ;(e)プロ
モーター−プライマーのプロモーターと相補的な伸長産
物を、検出すべき配列の3′末端から合成することから
なる方法(特開平11−89600号公報)や、センス
及びアンチセンスmRNAや一本鎖cDNAの合成を含
む遺伝子の保存等種々の方法に有用なポリヌクレオチド
固定化担体、そのポリヌクレオチド固定化担体を用いる
遺伝子の保存方法、並びに、ss−cDNA、ds−c
DNA、センスmRNAもしくはアンチセンスmRNA
の製造方法(WO93/15228)に関する技術が知
られている。上記WO93/15228に記載された方
法は、ポリヌクレオチド固定化担体を用いているもの
の、アダプターの付着や固定化担体からのcDNAの切
出しに制限酵素を用いており、また固定化担体上でのセ
ンス鎖cRNAの合成効率が不明であり、かかる方法で
は微量のmRNAから大量のセンス鎖cRNAやcDN
Aを遺失なく合成することができない。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】神経科学が対象とする
神経組織は限局された領域であることが多く、また発生
生物学が対象とする初期胚は細胞数が少なく、そこから
得られるmRNA等は極微量であり、分子生物学的解析
を困難にしている。現在、cDNA増幅法としてPCR
法が最も広く使われているが、各cDNAの含有率の代
表性に問題があり、PCRサイクル数は極力少なくする
べきである。一方、cDNA合成による線型増幅は、代
表性に優れているが、極微量の試料への適用には問題が
あった。本発明の課題は、cDNAライブリーの作製、
サブトラクションクローニング、マイクロアレイへの適
用が可能で、かつ汎用性のある、生体内で発現している
超微量のmRNAを増幅する方法を提供することにあ
る。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、今回、微
量全mRNAを増幅し、特定のmRNAの変動を定量化
すると共に、cDNAライブラリーを容易に構築できる
実験手技の開発を試みた。そして、オリゴ(dT)を結合
させた磁気ビーズに試料中のmRNAを吸着させた後、
磁気ビーズ上で2重鎖cDNAを合成し、5′末端にT
7プロモーター配列を有するリンカーを付加した後、ア
ンチセンス鎖cDNAが結合した磁気ビーズを除去し、
上清中のセンス鎖cDNAを鋳型として、SP6プロモ
ーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(dT)プ
ライマーを用いて、2重鎖cDNAを再度合成し、この
2重鎖cDNA両端のリンカー部分の既知配列をプライ
マーとしてPCRを行ってcDNA混成物を増幅し、次
いでT7ポリメラーゼやSP6ポリメラーゼを用いるこ
とにより、試料中のmRNAを108倍程度増幅しうる
ことを見い出し、かかる微量mRNAの増幅法を用い
て、mRNAのレベルの定量、及びcDNAライブラリ
ーの構築が可能であることを確認し、本発明を完成する
に至った。
【0007】すなわち本発明は、以下の〜の工程を
含むことを特徴とする微量mRNAの増幅方法試料中
のmRNAを、オリゴ(dT)を結合させた担体に吸着さ
せる工程;担体上でアンチセンス鎖cDNA及びセン
ス鎖cDNAを合成する工程;得られる2重鎖cDN
Aの少なくともセンス鎖の5′末端に第1のプロモータ
ー配列を有するリンカーを付加する工程;2重鎖cD
NAを解離させ、担体に結合したアンチセンス鎖cDN
Aを担体と共に除去する工程;解離したセンス鎖cD
NAを鋳型として、第2のプロモーター配列を有するリ
ンカーを付加したオリゴ(dT)プライマーを用いて、2
重鎖cDNAを合成する工程;2重鎖cDNA両端の
リンカー部分の配列をプライマーとしてPCRを行い、
cDNA混成物を増幅する工程;(請求項1)や、以下
の〜の工程を含むことを特徴とする微量mRNAの
増幅方法試料中のmRNAを、オリゴ(dT)を結合さ
せた担体に吸着させる工程;担体上でアンチセンス鎖
cDNA及びセンス鎖cDNAを合成する工程;得ら
れる2重鎖cDNAの少なくともセンス鎖の5′末端に
第1のプロモーター配列を有するリンカーを付加する工
程;2重鎖cDNAを解離させ、担体に結合したアン
チセンス鎖cDNAを担体と共に除去する工程;解離
したセンス鎖cDNAを鋳型として、第2のプロモータ
ー配列を有するリンカーを付加したオリゴ(dT)プライ
マーを用いて、2重鎖cDNAを合成する工程;2重
鎖cDNA両端のリンカー部分の配列をプライマーとし
てPCRを行い、cDNA混成物を増幅する工程;前
記第1のプロモーター配列及び/又は第2のプロモータ
ー配列を利用して、インビトロ転写系によりセンス鎖c
RNA及び/又はアンチセンス鎖cRNAを合成する工
程;(請求項2)や、担体が磁気ビーズであることを特
徴とする請求項1又は2記載の微量mRNAの増幅方法
(請求項3)や、第1のプロモーター配列を有するリン
カーとして、その5′末端が非対合末端、3′末端が平
滑末端であるリンカーを使用することを特徴とする請求
項1〜3のいずれか記載の微量mRNAの増幅方法(請
求項4)や、第1のプロモーター配列を有するリンカー
及び/又は第2のプロモーター配列を有するリンカーと
して、該プロモーター配列の5′側及び/又は3′側に
制限酵素認識配列を有するリンカーを使用することを特
徴とする請求項1〜4のいずれか記載の微量mRNAの
増幅方法(請求項5)や、第1のプロモーター配列と第
2のプロモーター配列が異なることを特徴とする請求項
1〜5のいずれか記載の微量mRNAの増幅方法(請求
項6)や、第1のプロモーター及び/又は第2のプロモ
ーターが、該プロモーターを特異的に転写することがで
きるRNAポリメラーゼが存するプロモーターであるこ
とを特徴とする請求項1〜6のいずれか記載の微量mR
NAの増幅方法(請求項7)や、プロモーター特異的に
転写することができるRNAポリメラーゼが、T7プロ
モーター、SP6プロモーター、T3プロモーターから
選ばれることを特徴とする請求項7記載の微量mRNA
の増幅方法(請求項8)や、第1のプロモーター配列を
有するリンカーが、配列番号1及び2で表される塩基配
列からなることを特徴とする請求項1〜8のいずれか記
載の微量mRNAの増幅方法(請求項9)や、第2のプ
ロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(d
T)プライマーが、配列番号3で表される塩基配列から
なることを特徴とする請求項1〜9のいずれか記載の微
量mRNAの増幅方法(請求項10)に関する。
【0008】また本発明は、請求項1〜10のいずれか
記載の微量mRNAの増幅方法を用いることを特徴とす
る遺伝子のクローニング方法(請求項11)や、請求項
1〜10のいずれか記載の微量mRNAの増幅方法によ
り得られるセンス鎖cDNA、アンチセンス鎖cDN
A、センス鎖cRNA又はアンチセンス鎖cRNAの少
なくとも1つを標識化して用いることを特徴とするサブ
トラクションクローニング方法(請求項12)や、請求
項1〜10のいずれか記載の微量mRNAの増幅方法に
より得られるセンス鎖cDNA、アンチセンス鎖cDN
A、センス鎖cRNA又はアンチセンス鎖cRNAの少
なくとも1つを用いることを特徴とするマイクロアレイ
(請求項13)や、請求項1〜10のいずれか記載の微
量mRNAの増幅方法により得られるcDNAがベクタ
ーに導入されていることを特徴とするcDNAライブラ
リー(請求項14)や、オリゴ(dT)を結合させた担
体、第1のプロモーター配列を有するリンカー、前記第
1のプロモーター配列とは異なる第2のプロモーター配
列を有するリンカーを付加したオリゴ(dT)プライマー
を含むことを特徴とする微量mRNA増幅用キット(請
求項15)や、担体が磁気ビーズであることを特徴とす
る請求項15記載の微量mRNA増幅用キット(請求項
16)に関する。
【0009】
【発明の実施の形態】本発明の微量mRNAの増幅方法
としては、試料中のmRNAを、オリゴ(dT)を結合
させた担体に吸着させる工程;担体上でアンチセンス
鎖cDNA及びセンス鎖cDNAを合成する工程;得
られる2重鎖cDNAの少なくともセンス鎖の5′末端
に第1のプロモーター配列を有するリンカーを付加する
工程;2重鎖cDNAを解離させ、担体に結合したア
ンチセンス鎖cDNAを担体と共に除去する工程;解
離したセンス鎖cDNAを鋳型として、第2のプロモー
ター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(dT)プラ
イマーを用いて、2重鎖cDNAを合成する工程;2
重鎖cDNA両端のリンカー部分の配列をプライマーと
してPCRを行い、cDNA混成物を増幅する工程;を
含むことを特徴とする方法や、上記〜の工程に加え
て、前記第1のプロモーター配列及び/又は第2のプ
ロモーター配列を利用して、インビトロ転写系によりセ
ンス鎖cRNA及び/又はアンチセンス鎖cRNAを合
成する工程;をも含むことを特徴とする方法であれば特
に制限されるものではなく、その一例が図1に示されて
いる。
【0010】上記工程における試料としては、動物、
植物、微生物等の細胞・組織等のmRNAを含むもので
あれば特に制限されるものではなく、これら細胞溶解液
等のmRNAを含む液体サンプルの調製は常法により行
うことができるが、グアニジンチオシアネートの存在下
等のRNase活性が阻害された緩衝液中で行うことが
好ましい。本発明によると、例えば、細胞をグアニジン
チオシアネートを用いて溶解した後、細胞1個程度に含
まれる全RNA量0.1ng程度以上を単離すればよ
く、その中に増幅しようとする標的mRNAが5pg以
上程度含まれていればよい。また、工程において用い
られる担体としては、水不溶性の担体で、加熱変性時に
溶融しないものであればどのようなものでもよいが、ポ
リエチレンビーズ、プラスチックプレート、磁気ビーズ
等を好適に例示することができるが、これらの中でも工
程における担体に結合したアンチセンス鎖cDNAを
担体と共に除去する操作を簡便に実施することができる
磁気ビーズが特に好ましい。また、工程〜を磁気ビ
ーズ等の担体上で行うことにより、反応液の交換等が容
易となり、試料の逸失が少ない。
【0011】工程におけるオリゴ(dT)は常法により
合成されたものであればどのようなものでもよく、オリ
ゴ(dT)の重合度としてはmRNAのポリ(A)とハイブ
リダイズして、mRNAをオリゴ(dT)を結合させた担
体に吸着させうる重合度であれば特に制限されないが、
5〜200、特に10〜30程度が好ましい。また、オ
リゴ(dT)に代えてポリU等のmRNAのポリ(A)に相
補的な配列を含んでいるものも使用することができ、こ
れらの使用も本発明に含まれる。かかるオリゴ(dT)と
上記磁気ビーズ等の担体とを結合させる方法としては特
に制限されるものではなく、例えば、共有結合法、イオ
ン結合法、物理吸着法、ビオチン−アビジン系を用いる
方法等を例示することができる。
【0012】工程のオリゴ(dT)を結合させた担体に
試料中のmRNAを吸着させる反応は、オリゴ(dT)結
合担体とポリ(A)+RNA含有試料とを緩衝液中でイン
キュベーションし、担体に結合しているオリゴ(dT)と
mRNAのポリ(A)とをハイブリダイズすることにより
行うことができる。かかるハイブリダイゼーションのた
めのインキュベーションは、温度20〜25℃で5分程
度穏やかな攪拌下で行うことが好ましい。上記緩衝液と
しては、RNase活性が極力除去された緩衝液が好ま
しい。また、インキュベーション後、上記緩衝液等を用
いて、試料中の担体非結合成分を不溶性担体から洗浄・
除去することが好ましい。
【0013】上記工程で調製された担体結合オリゴ
(dT)−ポリ(A)+RNA複合体は、工程の磁気ビー
ズ等の担体上でのアンチセンス鎖cDNA及びセンス鎖
cDNAの合成に用いられる。アンチセンス鎖cDNA
の合成は、オリゴ(dT)をプライマーとし、mRNAを
鋳型として、デオキシヌクレオチドの存在下、逆転写酵
素を用いて反応させ、ポリ(A)+RNA−担体結合cD
NA複合体を担体上で調製することにより行うことがで
きる。センス鎖cDNAの合成は、ポリ(A)+RNA−
担体結合cDNA複合体を、RNase含有液で処理し
てポリ(A)+RNAを消化・除去するか、希NaOH溶
液を用いてポリ(A)+RNAを解離・除去し、次いであ
るいは並行して、担体結合アンチセンス鎖cDNAを鋳
型として、デオキシヌクレオチドの存在下、DNAポリ
メラーゼを反応させ、センス鎖cDNA−担体結合アン
チセンス鎖cDNA複合体を担体上で調製することによ
り行うことができるが、センス鎖cDNA断片の連結を
促進するため、DNAリガーゼを存在させておくことが
好ましい。また、得られる2重鎖cDNAの5′末端を
T4DNAポリメラーゼで処理することにより平滑化し
ておくことが好ましい。
【0014】次いで、上記工程で得られた担体結合2
重鎖cDNAの少なくともセンス鎖の5′末端に第1の
プロモーター配列を有するリンカーが工程において付
加される。かかる第1のプロモーター配列を有するリン
カーとしては、DNAリガーゼ等により担体結合2重鎖
cDNAの少なくともセンス鎖の5′末端に結合しうる
ものであれば、単鎖あるいは2重鎖のどちらでもよい
が、操作の簡便性からして2重鎖が好ましく、例えば、
その5′末端が非対合末端、3′末端が平滑末端である
リンカーを使用することもできる。また、上記第1のプ
ロモーター配列を有するリンカーとして、該プロモータ
ー配列の5′側及び/又は3′側に制限酵素認識部位
(配列)を有するリンカーを使用することが、cDNA
を解析するときなど好ましい場合が多いが、cDNA混
成物を増幅する工程までの間に、上記認識部位に相当
する制限酵素を使用することは、試料に由来するcDN
Aを消化・分解する可能性があるので好ましくない。そ
して、この工程においては、担体結合2重鎖cDNA
のアンチセンス鎖のオリゴ(dT)からなる5′末端は磁
気ビーズ等の担体上に固定されているため、この断端が
遮蔽されており、まずセンス鎖cDNAの5′末端に第
1のプロモーター配列を有するリンカーを確実に結合さ
せることができ、後の工程においてセンス鎖cDNA
の3′末端に第2のプロモーター配列を有するリンカー
を付加したオリゴ(dT)プライマーを特異的に連結でき
るよう工夫されている。さらに、上記第1のプロモータ
ー配列を有するリンカー構造を、事前にmRNAのキャ
ップ部位に直接連結するリンカーの構造に組み込むと、
完全長cDNAの増幅が容易となる。
【0015】上記第1のプロモーター配列としては、該
プロモーターを特異的に転写することができるRNAポ
リメラーゼが存するプロモーター配列であることが好ま
しく、特に第1のプロモーター配列と後述する第2のプ
ロモーター配列とが異なる場合、例えば、第1のプロモ
ーター配列としてT7プロモーター配列を、第2のプロ
モーター配列としてSP6プロモーター配列を用いる場
合、工程において、T7プロモーター配列を特異的に
転写することができるT7ポリメラーゼを用いることに
より、工程においてアンチセンス鎖cRNAを特異的
に増幅することができる。上記プロモーター特異的に転
写することができるRNAポリメラーゼが存するプロモ
ーター配列としては、T7プロモーター配列(5′−T
AATACGACTCACTATAGGGAGA−
3′;配列番号6)、SP6プロモーター配列(5′−
ATTTAGGTGACACTATAGAATAC−
3′;配列番号7)、T3プロモーター配列(5′−A
ATTAACCCTCACTAAAGGG−3′;配列
番号8)等を具体的に例示することができる。そして、
これら第1のプロモーター配列を有するリンカーは、D
NA合成装置を用いて常法により調製することができ
る。
【0016】上記5′末端に第1のプロモーター配列を
有するリンカーが付加された担体結合2重鎖cDNA
は、次の工程において、2重鎖が解離させられ、アン
チセンス鎖cDNAが担体と共に除去される。2重鎖c
DNAを解離する方法としては特に制限されるものでは
なく、例えば低塩濃度溶液中で90〜100℃にて約1
〜10分間加熱して2重鎖cDNAを熱変性することに
より行われる。かかる2重鎖cDNAを解離させた後の
アンチセンス鎖cDNA結合担体の除去は常法により行
うことができ、例えば、担体が磁気ビーズの場合は磁石
等の磁性体を用いて、また担体がポリエチレンビーズの
場合は遠心分離若しくは濾過等により除去することがで
きるが、溶液中に遊離状態で残存するセンス鎖cDNA
の逸失を最少限度に留めることができる点で、担体とし
て磁気ビーズを用いることが好ましい。
【0017】次の工程において、工程で解離したセ
ンス鎖cDNAを鋳型として、第2のプロモーター配列
を有するリンカーを付加したオリゴ(dT)プライマーを
用いて、2重鎖cDNAが再び合成される。上記工程
により得られる遊離状態のセンス鎖cDNAを含む溶液
に、第2のプロモーター配列を有するリンカーを付加し
たオリゴ(dT)プライマーが加えられ、センス鎖cDN
Aの3′端のポリ(A)部分に上記プライマーのオリゴ
(dT)をハイブリダイズさせ、センス鎖cDNAと前記
オリゴ(dT)プライマーとの複合体を作製する。上記第
2のプロモーター配列を有するリンカーを付加したオリ
ゴ(dT)プライマーにおける第2のプロモーター配列を
有するリンカーとしては、該プロモーター配列の5′側
及び/又は3′側に制限酵素認識配列を有するリンカー
を使用することが、cDNAを解析するときなど好まし
い場合が多いが、cDNA混成物を増幅する工程まで
の間に、制限酵素認識部位に相当する制限酵素を使用す
ることは試料に由来するcDNAを消化・分解する可能
性があるので好ましくない。上記第2のプロモーター配
列としては、T7プロモーター配列、SP6プロモータ
ー配列、T3プロモーター配列等の特異的に転写するこ
とができるRNAポリメラーゼが存するプロモーター配
列であることが好ましく、特に第2のプロモーター配列
と前述の第1のプロモーター配列とが異なる場合、例え
ば、第2のプロモーター配列としてSP6プロモーター
配列を、第1のプロモーター配列としてT7プロモータ
ー配列を用いる場合、工程において、SP6プロモー
ター配列を特異的に転写することができるSP6ポリメ
ラーゼを用いることにより、アンチセンスcRNAを特
異的に増幅することができる。そして、これら第2のプ
ロモーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(d
T)プライマーは、DNA合成装置を用いて常法により
合成することができる。
【0018】センス鎖cDNAと前記オリゴ(dT)プラ
イマーとの複合体を用い、センス鎖cDNAを鋳型とし
て、デオキシヌクレオチドの存在下、DNAポリメラー
ゼ又は逆転写酵素を反応させることにより、両5′端に
プロモーター配列を有するリンカー部分が付加された2
重鎖cDNAを合成することができる。工程では、こ
の2重鎖cDNA両端のリンカー部分の既知配列をプラ
イマーとしてPCRを行い、全cDNA混成物を増幅す
る。PCRはサーマルサイクラー(Perkin-Elmer社製)
等を用いて常法により行うことができる。工程までの
過程により10μg程度のcDNA混成物を得ることが
できる。このcDNA混成物を用いると、cDNAライ
ブラリーの構築が可能となる。また、全cDNA混成物
を数十分子種程度に希釈し、PCRを行い、このPCR
産物を電気泳動等により分離し、ゲルから切り出したc
DNAバンドから塩基配列を直接決定することもでき
る。
【0019】工程により大量に増幅された、両端にプ
ロモーター配列を有するリンカー部分が付加された2重
鎖cDNAにおける前記第1のプロモーター配列及び/
又は第2のプロモーター配列を利用して、RNAポリメ
ラーゼを用いるインビトロ転写系により、センス鎖cR
NA及び/又はアンチセンス鎖cRNAを大量に合成す
ることができる。前記のように、第1のプロモーター配
列と第2のプロモーター配列が異なる場合、センス鎖c
RNA又はアンチセンス鎖cRNAを個別に合成するこ
とができる。この工程により、工程までの過程によ
り得られた10μg程度のcDNA混成物を用いて、1
00μg程度のセンス鎖及びアンチセンス鎖cRNA混
成物を容易に調製することができる。この100μg程
度のRNA量は、通常の分子生物学的実験には十分な量
であり、例えば、センス鎖cRNA及びアンチセンス鎖
cRNA混成物を用いてサブトラクションクローニング
が可能となる。
【0020】上記のように、本発明の微量mRNAの増
幅方法を用いると、生体内で一過性に発現する超微量の
mRNAであっても、通常の分子生物学的実験に十分な
量まで増幅することができることから、本発明の微量m
RNAの増幅方法は、遺伝子の検出やクローニング、c
DNAライブラリーの作製、マイクロアレイの作製・解
析等に幅広く利用することができる。本発明の遺伝子の
クローニング方法としては、上記本発明の微量mRNA
の増幅方法を用いる方法であれば特に制限されるもので
はなく、かかる遺伝子のクローニング方法により、遺伝
子のクローニングの他、遺伝子の検出や遺伝子のスクリ
ーニングを行うことができる。より具体的には、本発明
の微量mRNAの増幅方法により増幅されたcDNA又
はcRNAを標識化し、これら標識化されたcDNA又
はcRNAを用いて、リバース−ノーザンハイブリダイ
ゼーション、サブトラクションクローニング、DNAア
レイ等の解析を行うことができる。また、本発明により
増幅されたcDNA又はcRNAに対して、通常のサザ
ンハイブリダイゼーションやノーザンハイブリダイゼー
ションを行うことも可能である。さらに、本発明の微量
mRNAの増幅方法により調製した完全長cDNAを用
いる場合には、インビトロ転写・翻訳によりタンパク質
を合成し、2次元電気泳動法等により解析することによ
り、発現量の変動する遺伝子数や発現産物の同定が可能
となる。
【0021】上記リバース−ノーザンハイブリダイゼー
ション方法としては、その一例が図7に示されているよ
うに、本発明の微量mRNAの増幅方法により得られる
増幅された混成2重鎖cDNAから、まずジゴキシゲニ
ン(Digoxigenin;DIG)等で標識された基質リボヌ
クレオチドの存在下にセンス鎖cRNA混成物をインビ
トロで合成する。他方、特定の遺伝子のクローン化cD
NAからアンチセンス鎖cRNAをインビトロで合成
し、これを変性アガロースゲル等を用いて電気泳動後、
ナイロンメンブランやニトロセルロース膜に写しとって
膜上に固定し、この膜上に固定されたアンチセンス鎖c
RNAに、前記DIG等で標識化されたセンス鎖cRN
A混成物を反応させ、次いでハイブリダイズしたcRN
Aを、例えばアルカリフォスファターゼ結合抗DIG抗
体と化学発光基質等を用いて検出することにより行うこ
とができる。かかるリバース−ノーザンハイブリダイゼ
ーションを、特定条件下の細胞由来のmRNAと対照細
胞由来のmRNAとに個別に行い、それらの結果を比較
することにより、発生過程において生体内で発現量の変
動する遺伝子や特定の薬剤の存在下で発現量の変動する
遺伝子等のmRNAレベルの変化を検出することができ
る。
【0022】本発明のサブトラクションクローニング方
法としては、上記本発明の微量mRNAの増幅方法によ
り得られるセンス鎖cDNA、アンチセンス鎖cDN
A、センス鎖cRNA又はアンチセンス鎖cRNAのう
ちの少なくとも1つを標識化して用いる方法であれば、
どのようなサブトラクションクローニング方法であって
も特に制限されるものではないが、以下に示すサブトラ
クションによるクローニングを例示することができる。
特定条件下の細胞由来のmRNAを、本発明の微量mR
NAの増幅方法により増幅し、大量のセンス鎖cRNA
混成物を調製する。一方、対照細胞由来のmRNAを、
本発明の微量mRNAの増幅方法により増幅し、大量の
アンチセンス鎖cRNA混成物を調製する。かかるアン
チセンス鎖cRNA混成物の調製に際して、ビオチン化
リボヌクレオチドを基質に用いて標識する。次に、前記
センス鎖cRNA混成物とビオチン標識アンチセンス鎖
cRNA混成物をハイブリダイゼーションさせ、続いて
アビジン結合磁気ビーズを反応せしめた後、磁性体等を
用いてハイブリダイズしていないアンチセンス鎖cRN
Aや、センス鎖cRNA−アンチセンス鎖cRNA複合
体を系外に除去し、特定条件下の細胞のみに発現してい
るmRNAに由来するハイブリダイズしていないセンス
鎖cRNAを得て、これを鋳型とし、アンチセンス鎖c
DNAを合成した後、PCRによりcDNAを増幅し、
次いで、このcDNAが挿入されたプラスミドを用いて
大腸菌を形質転換し、以後、常法によりディファレンシ
ャル・ハイブリダイゼーションを行う。かかるサブトラ
クションクローニング方法においては、例えば、1個の
マウスの初期胚、1匹のマウスの微小な脳神経核・組織
領域から出発することが可能である。
【0023】本発明のマイクロアレイとしては、上記本
発明の微量mRNAの増幅方法により得られるセンス鎖
cDNA、アンチセンス鎖cDNA、センス鎖cRNA
又はアンチセンス鎖cRNAのうちの少なくとも1つを
用いて作製されるマイクロアレイであればどのようなも
のでもよく、マイクロアレイの作製は、「DNAマイク
ロアレイと最新PCR法」(秀潤社2000年3月16
日発行)の26〜34頁に記載された方法など、従来公
知の方法により行うことができる。また、かかるマイク
ロアレイを用いたゲノム解析も、文献(Nature Vol.40
7, September 7(2000) Appendix 9-19)に記載された方
法など、従来公知の方法により行うことができる。
【0024】本発明のcDNAライブラリーとしては、
上記本発明の微量mRNAの増幅方法により得られるc
DNA混成物がベクターに導入されているものであれば
どのようなものでもよく、上記ベクターとしては、プラ
スミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター
など従来公知のライブラリー作製用のベクターを例示す
ることができる。本発明の微量mRNAの増幅方法によ
ると、工程〜により増幅cDNA混成物を調製する
まで制限酵素を使用する必要がないことから、一部のc
DNAの欠失を招くことがない。かかるcDNAライブ
ラリーの作製は、例えば、1個のマウスの初期胚、1匹
のマウスの微小な脳神経核・組織領域から出発すること
が可能である。また、cDNAライブラリー作製に用い
られるcDNA混成物として、工程で得られたcRN
A混成物から、さらに逆転写酵素を用いて合成したcD
NA混成物を用いることもできる。
【0025】また、先行技術(WO93/15228)
では、cDNAをプラスミドベクターに一方向性に挿入
するため、制限酵素消化による断端配列を利用してお
り、これにより一部のcDNAが失われることになる
が、本発明においては、制限酵素消化を用いることな
く、DNAポリメラーゼの3′→5′エキソヌクレアー
ゼ活性を利用して調製した、その両端に特異的な制限酵
素切断端配列を有するcDNA断片を利用してプラスミ
ドベクターに一方向性かつ1コピーの挿入を行うことが
可能となる。後述する実施例において詳しく説明されて
いるように、例えば、dATPとdTTPのみ含有し、
dCTPとdGTPを含まない反応液中で、T4 DN
Aポリメラーゼを作用させると、その3′→5′エキソ
ヌクレアーゼ活性により、3′端側からC及び/又はG
からなるヌクレオチド部分がA又はTが現出するところ
まで除去されて5′突出末端が形成され、制限酵素AV
aI及びAccI断端を有するcDNA断片等を調製す
ることができ、かかるcDNA断片を利用するとプラス
ミドベクターに一方向性かつ1コピーの挿入を行うこと
ができる。
【0026】本発明の微量mRNA増幅用キットとして
は、オリゴ(dT)を結合させた磁気ビーズ等の担体、第
1のプロモーター配列を有するリンカー、前記第1のプ
ロモーター配列とは異なる第2のプロモーター配列を有
するリンカーを付加したオリゴ(dT)プライマーを含む
ものであれば特に制限されるものではないが、前記工程
〜で使用する各種緩衝液等を含むものが好ましい。
本発明の微量mRNA増幅用キットを用いると、前記サ
ブトラクションクローニングや、マイクロアレイの作製
・解析や、cDNAライブラリーの構築を簡便に行うこ
とができる。
【0027】
【実施例】以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体
的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定
されるものではない。 実施例1[微量mRNA増幅法(MSMAP);図1参
照] [RNAサンプル液の調製]ラット初代培養肝細胞から
酸・グアニジンチオシアネート・フェノール・クロロホ
ルム抽出法(AGPC法)により全RNAを抽出し、1
μgの全RNAを含む10μlの水溶液を出発材料とし
た。これを滅菌水を用いて段階希釈し、RNA量(n
g)が102、10、1、10-1、10-2、10-3を含
む各サンプル液及びネガティブコントロールとしてRN
A量(ng)が0のサンプル液それぞれ10μlを調製
した。
【0028】[オリゴ(dT)磁気ビーズへのポリ(A)+
RNAの吸着(図1ステップ1)]上記RNA1μgを
含む水溶液10μlを65℃にて5分間保温後氷上で急
冷し、25μgのオリゴ(dT)磁気ビーズ(Dynal社製D
ynabeads Oligo(dT)25)を懸濁した10μlの2×結合
緩衝液[1×結合緩衝液の組成:10mMトリス塩酸
(pH7.5)、0.5M塩化ナトリウム、1mM E
DTA]に加え、室温で5分間インキュベートし、ポリ
(A)+RNAをオリゴ(dT)にアニールさせた。ポリ
(A)RNA吸着オリゴ(dT)ビーズを磁石(Dynal社製M
PC-E/E1)による吸引と分散を繰り返すことにより、5
0μlの0.3×結合緩衝液にて2回洗滌した。
【0029】[磁気ビーズ上での2重鎖cDNAの合成
(図1ステップ2)]上記ポリ(A)+RNA吸着オリゴ
(dT)磁気ビーズを、20mMトリス塩酸(pH8.
4)、50mM塩化カリウム、2.5mM塩化マグネシ
ウム、10mMDTT、1mM dNTP(dATP、
dCTP、dGTP、dTTP)、0.1mg/ml
BSA、M−MLV逆転写酵素(Gibco BRL社製SuperSc
riptII)200ユニットを含む20μlの反応混合液に
懸濁し、42℃にて50分間(10分ごとに攪拌しビー
ズを浮遊させながら)インキュベートして、アンチセン
ス鎖cDNAを合成した。0.5M EDTA(pH
8.0)0.8μlを加えて反応を停止し、mRNA/
cDNAビーズを10mMトリス塩酸(pH8.0)/
1mM EDTA(以下、TE溶液という)50μlに
て3回洗滌した。続いて、同ビーズを19mMトリス塩
酸(pH8.3)、91mM塩化カリウム、4.6mM
塩化マグネシウム、10mM硫酸アンモニウム、3.8
mM DTT、0.15mM NAD、1mM dNTP
(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、大腸菌
DNAポリメラーゼI(Gibco BRL社製)5ユニット、
大腸菌DNAリガーゼ(Gibco BRL社製)5ユニット、
大腸菌RNaseH(Gibco BRL社製)1ユニットを含
む20μlの反応混合液に懸濁し、16℃にて1時間イ
ンキュベートして、センス鎖cDNAを合成し、磁気ビ
ーズ固定2重鎖cDNAを得た。さらに、1ユニット/
μl T4 DNAポリメラーゼ(Roche Diagnostics社
製)0.5μlを追加し、16℃にて10分間インキュ
ベートして、5′末端の平滑化を徹底した。0.5M
EDTA(pH8.0)0.8μlを加えて反応を停止
し、2重鎖cDNAビーズをTE溶液50μlにて3回
洗滌した。
【0030】[cDNA5′末端へのプロモーター配列
の付加とセンス鎖cDNAの分取(図1ステップ3およ
び4)]配列番号1で表される52merの塩基配列か
らなるupper strandと、配列番号2で表される50me
rの塩基配列からなるlower strandのオリゴヌクレオチ
ドを、DNAシンセサイザーを用いて常法により合成し
た。lower strandの5′末端はT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ(宝酒造社製)を用いてリン酸化した。両鎖を常
法によりアニールし、2重鎖とし、図2に示したMSM
AP−5′−T7リンカーを得た。上記の2重鎖cDN
Aビーズを66mMトリス塩酸(pH7.5)、5mM
塩化マグネシウム、5mM DTT、1mM ATP、M
SMAP−5′−T7リンカー1μg、T4 DNAリ
ガーゼ(宝酒造社製)350ユニットを含む20μlの
反応混合液に懸濁し(最後に酵素液1μlを加えて反応
開始)、4℃にて1晩インキュベートし(ローテーター
にて持続的に撹拌)、MSMAP−5′−T7リンカー
を2重鎖cDNAの5′末端に連結した(図1ステップ
3)。0.5M EDTA(pH8.0)0.8μlを
加えて反応を停止し、リンカー連結2重鎖cDNAビー
ズをTE溶液50μlにて3回洗滌した。続いて、同ビ
ーズをTE溶液20μlに懸濁し、95℃にて5分間イ
ンキュベートして、熱融解によりセンス鎖cDNAを解
離させた。アンチセンス鎖cDNAビーズを磁石に吸引
し、センス鎖cDNAを含む上清を分取した(図1ステ
ップ4)。
【0031】[cDNA3′末端へのプロモーター配列
の付加とアンチセンス鎖cDNAの再合成(図1ステッ
プ5)]センス鎖cDNA溶液4μlに、配列番号3で
表される68merの塩基配列からなる、SP6プロモ
ーター配列を付加したオリゴ(dT)プライマーMSMA
P−3′−SP6プライマー50ngを加え、合計5μ
lとした。90℃にて3分間加熱した後、氷上にて急冷
し、これに各終濃度20mMトリス塩酸(PH8.
4)、50mM塩化カリウム、2.5mM塩化マグネシ
ウム、10mM DTT、1mM dNTP(dATP、
dCTP、dGTP、dTTP)、0.1mg/ml
BSAを加え、42℃にて5分間プレインキュベートし
た後、さらにM−MLV逆転写酵素(Gibco BRL社製Sup
erScriptII)200ユニット(1μl)を加え20μl
の反応混合液とした。42℃にて1時間インキュベート
して、アンチセンス鎖cDNAを合成し、2重鎖cDN
Aとした。反応終了後、ドライアイス上にて凍結させ、
−25℃に保管した。この状態で少なくとも1年間保存
することができた。
【0032】[cDNA混成物の増幅(図1ステップ
6)]2段階のPCRにより、cDNA混成物の増幅を
行なった。プライマーとしては、2重鎖cDNA両端の
リンカー部分の既知配列、すなわち配列番号4で表され
る20merの塩基配列からなる5′PCRプライマー
(図2)と、配列番号5で表される20merの塩基配
列からなる3′PCRプライマー(図2)を用いた。第
1段階のPCRは、20mMトリス塩酸(pH8.
2)、10mM塩化カリウム、6mM硫酸アンモニウ
ム、2mM塩化マグネシウム、0.1% Triton X-10
0、0.2mM dNTP(dATP、dCTP、dGT
P、dTTP)、10μg/ml BSA、上記2重鎖
cDNA溶液2μl、5′PCRプライマー0.1nm
ol、3′PCRプライマー0.1nmol、熱耐性D
NAポリメラーゼ(Stratagene社製Pfu DNAポリメラー
ゼ)3ユニットを含む100μlの反応混合液中で行な
った。なお、PCRの条件は、94℃にて1分間熱変
性、57℃にて2分間アニーリング、72℃にて2分間
伸長反応させるというサイクルを15回繰り返すという
条件で行なった。第2段階のPCRは、第1段階のPC
R産物混合液5μlずつを5本のチューブに分注し、各
チューブの他の組成は第1段階と同様の100μlの反
応混合液中で行なった。なお、PCRの条件は、上記第
1段階と同様の条件で行なった。5本の産物混合液(全
RNA1μgの1/200に相当)を1本に集め、0.
5M EDTA(pH8.0)10μlと10% SDS
10μlとを加えて反応を停止した。TE飽和フェノー
ル500μlによる抽出2回、TE飽和フェノール/ク
ロロフォルム(50:50)500μlによる抽出2
回、クロロフォルム500μlによる抽出2回の後、残
された約450μlの産物混合液に、キャリアーとして
グリコーゲン(Roche Diagnostics社製)20μg(1
μl)を加え、さらに5M酢酸アンモニウム2/3容
(300μl)、エタノール2容(1.5ml)を加
え、氷上に1時間保管後、遠心により産物を回収した。
沈殿を70%エタノール1mlにて洗滌した後、風乾
し、TE溶液20μlに溶解した。以上の方法により、
全RNA1μgの1/200相当量を第2段階のPCR
に適用した場合、通常、約10μgの増幅cDNA混成
物が得られることがわかった。図3に示すように、第2
段階のPCRの各サイクルにおける増幅cDNA混成物
を1%アガロースゲルにて電気泳動後、エチジウムブロ
マイドにて蛍光染色すると、12サイクル以上で約40
00bpの長さに及ぶcDNAの増幅が認められた。上
記のように、通常、第2段階のPCRのサイクル数とし
ては、合成量が飽和していない15サイクル程度を用い
た。また、図4に示すように、出発材料の全RNAは
0.1ngまで少量化が可能であった。これに含まれる
mRNAを2pgと仮定し、この全量を増幅した場合、
理論上2mgの増幅cDNAが得られることになり、こ
の段階までで109倍の増幅が可能であることが明らか
になった。
【0033】[cRNA混成物の合成(図1ステップ
7)]上記増幅cDNA混成物を鋳型として、センス鎖
およびアンチセンス鎖cRNAをそれぞれT7およびS
P6 RNAポリメラーゼを用いて以下のように特異的
に合成した。40mMトリス塩酸(pH8.0)、6m
M塩化マグネシウム、10mM DTT、2mMスペル
ミジン、1mM NTP(ATP、CTP、GTP、U
TP)、RNaseインヒビター(Roche Diagnostics
社製)4ユニット、増幅cDNA混成物0.3μg、T
7 RNAポリメラーゼ(Roche Diagnostics社製)また
はSP6 RNAポリメラーゼ(Roche Diagnostics社
製)40ユニットを含む20μlの反応混合液を37℃
にて2時間インキュベートして、cRNAを合成した。
続いて、RNase活性を含まないDNaseI(10
ユニット/μl Roche Diagnostics社製)2μlを加
え、さらに37℃にて15分間インキュベートすること
により鋳型cDNAを分解し、最後に0.5M EDT
A(pH8.0)0.8μlを加えて反応を停止した。
続いて5M酢酸アンモニウム2/3容(15.2μ
l)、エタノール2容(76μl)を加え、氷上に10
分間保管後、遠心により産物を回収した。回収した産物
(沈殿物)を70%エタノール0.1mlにて洗滌した
後、風乾し、滅菌水10μlに溶解した。なお、上記の
結果、増幅cDNA混成物0.3μgから、通常、約1
0μgの増幅cRNA混成物が得られることがわかっ
た。以上のことから、出発材料の1μgの全RNA(約
20ng mRNA)から起算してルーチンに108倍、
0.1ngの全RNAから出発した場合理論上最大で1
12倍の増幅が可能であると計算された。図5に示すよ
うに、増幅cRNA混成物を1%アガロース/MOPS
酢酸/ホルムアルデヒドゲルにて電気泳動後、エチジウ
ムブロマイドにて蛍光染色すると、約2000bの長さ
に及ぶcRNAの合成が認められた。
【0034】[増幅cRNA混成物のノーザンハイブリ
ダイゼーション解析(図6)]ラット初代培養肝細胞に
由来する全RNA2μg、およびその増幅センス鎖cR
NA混成物0.3μgを1%アガロース/MOPS酢酸
/ホルムアルデヒドゲルにて電気泳動後、RNA蛍光バ
ンドを検出し、さらに常法によりナイロンメンブレンに
ブロットした。アルギナーゼcDNAを鋳型にしてRoch
e Diagnostics社製のキットを用いてDIG標識したア
ンチセンス鎖cRNAを合成し、これをプローブに用い
てハイブリダイゼーションを行なった。同社のプロトコ
ルに従い、アルカリフォスファターゼ結合抗DIG抗体
と化学発光基質CDP-Starを用い、発光シグナルをX線フ
ィルムに検出した。約1.6kbのアルギナーゼmRN
Aおよびセンス鎖cRNAが検出された。
【0035】[標識cRNA混成物を用いたリバース−
ノーザンハイブリダイゼーション解析(図7,8)]ク
ローン化遺伝子由来のcRNAをフィルターに固定し、
これに、検体試料に由来する標識反対鎖cRNA混成物
をハイブリダイズさせ、特定のmRNAのレベルを測定
することを可能にする方法の原理を図7に、実験例を図
8に示した。β−アクチン、グリセルアルデヒド−3−
リン酸デヒドロゲナーゼ(G3PDH)、およびアルギ
ナーゼのcDNAを鋳型として、インビトロ転写系によ
りアンチセンス鎖cRNAを合成した。各cRNA0.
5μgを1%アガロース/MOPS酢酸/ホルムアルデ
ヒドゲルにて電気泳動後、常法によりナイロンメンブレ
ンにブロットした。一方、10-6Mデキサメサゾンおよ
び3×10-8Mグルカゴンにて2時間処理あるいは無処
理のラット初代培養肝細胞の全RNAに由来する増幅c
DNA混成物を鋳型として、Roche Diagnostics社製の
キットを用いてDIG標識したセンス鎖cRNA混成物
を合成した。同社のプロトコルに従い、アンチセンス鎖
cRNAブロットに対して、0.5μg/mlのDIG
標識センス鎖cRNA混成物を68℃にて1晩反応さ
せ、ハイブリダイズしたRNAに由来するシグナルを化
学発光としてX線フィルムに検出した。その結果、β−
アクチン、G3PDHのmRNAレベルに変化が認めら
れないのに対し、デキサメサゾンおよびグルカゴン処理
によりアルギナーゼmRNAレベルが上昇するのが確認
できた。
【0036】[cDNA混成物よりのcDNAライブラ
リーの作製(図9)]PCRによる増幅前あるいは増幅
後のcDNA混成物は、その両端に構築された特殊な配
列を利用して、pUC18/19、pGEM-3Zf(+)/(-)等のプラス
ミドベクターに一方向性に、かつ1コピーのみ挿入する
ことが可能である。cDNA混成物の5′末端の配列 5′−CCGGA・・・・・−3′ 3′−GGCCT・・・・・−5′ に対して、dATPとdTTPのみが存在し、dCTP
とdGTPが存在しない反応液中で、T4 DNAポリ
メラーゼを作用させると、その3′→5′エキソヌクレ
アーゼ活性により、 5′−CCGGA・・・・・−3′ 3′−T・・・・・−5′ の5′突出末端を形成できる。この末端は、pUC18/19、
pGEM-3Zf(+)/(-)等のポリリンカー部位をAvaIにて
消化した際形成される5′突出末端と相補的である。同
様にして、cDNA混成物の3′末端の配列 5′−CGA・・・・・−3′ 3′−GCT・・・・・−5′ に対して、 5′−CGA・・・・・−3′ 3′−T・・・・・−5′ の5′突出末端を形成できる。この末端は、pUC18/19、
pGEM-3Zf(+)/(-)等のポリリンカー部位をAccIにて
消化した際形成される5′突出末端と相補的である。こ
の特質を利用して、各cDNAを一方向性にプラスミド
のAvaI−AccI部位に挿入できる。また、各cD
NAの両端はリン酸化されていないため、cDNA同士
の連結がおこらず、1コピーのみ挿入される。
【0037】以下に、前記増幅cDNA混成物をpUC19
に挿入し、cDNAライブラリーを構築した実験例を示
す。50mMトリス塩酸(pH8.8)、7mM塩化マ
グネシウム、15mM硫酸アンモニウム、0.1mM
EDTA、10mMメルカプトエタノール、0.2mg
/ml BSA、0.1mM dATP、0.1mMdT
TP、増幅cDNA混成物1.2μg、T4 DNAポ
リメラーゼ(Roche Diagnostics社製)2.5ユニット
を含む100μlの反応混合液を37℃にて5分間イン
キュベートして、3′→5′エキソヌクレアーゼ活性に
よりcDNAの両3′端よりCおよびGヌクレオチド残
基を除去した。0.5M EDTA(pH8.0)4μ
lを加えて反応を停止した。キャリアーとしてグリコー
ゲン(Roche Diagnostics社製)20μg(1μl)を
加え、TE飽和フェノール100μlによる抽出2回、
TE飽和フェノール/クロロフォルム(50:50)1
00μlによる抽出2回、クロロフォルム100μlに
よる抽出2回の後、産物混合液に5M酢酸アンモニウム
2/3容(67ml)、エタノール2容(334ml)
を加え、氷上に10分間保管後、遠心により産物を回収
した。回収した産物(沈殿物)を70%エタノール0.
5mlにて洗滌した後、風乾し、TE溶液20μlに溶
解した。一方、pUC19をAvaIおよびAccIにより
消化し、アガロース電気泳動後、ベクター部分のバンド
を含むゲルを切り出し、DNAをGlassmilk(Bio 101社
製)を用いて精製した。AvaI/AccI末端構成c
DNA混成物約5ngとAvaI/AccI消化pUC19
約5ngを、T4 DNAリガーゼを用いて連結し、常
法により大腸菌JM109コンピテントセルをトランス
フォームした。約200コロニーのトランスフォーマン
トが得られ、そのうち無作為に選んだ12クローンにつ
いて液体培養後プラスミドを抽出した。これをClaI
およびHindIIIにて消化し、1%アガロース電気泳
動にて解析した。その結果を図9に示す。このことか
ら、11クローンにcDNA由来と考えられるインサー
トが確認され、その長さは約200〜1000bpであ
ることがわかった。以上のことから、cDNA混成物1
μgを用いると、約4万クローンからなるcDNAライ
ブラリーを、プラスミドをベクターに用いて容易に構築
することが可能であることが明らかになった。
【0038】
【発明の効果】本発明の微量mRNAの増幅方法は、ヒ
トなど高等生物の限局された細胞、組織に由来する微量
のmRNA/cDNAを増幅することが可能な汎用性を
有する方法であり、本発明によると、磁気ビーズ上での
cDNA合成、PCRによるcDNAの増幅と、それに
続くインビトロRNA合成を組み合わせることにより、
mRNAの一億倍程度の増幅が容易にでき、cDNAの
増幅のみでも、単一細胞からのライブラリー調製が十分
可能となり、限局された細胞からの各種cDNAの単離
にきわめて有用である。また、cDNAの両端に連結し
たT7及びSP6のプロモーター配列を利用し、センス
鎖及びアンチセンス鎖両方のcRNAを特異的に合成す
ることができ、サブトラクションクローニングや各鎖特
異的標識プローブを調製することができる。かかる各鎖
特異的標識プローブは、DNAマイクロアレイ等の高感
度解析に極めて有用である。さらに、特異的に合成され
たセンス鎖cRNAを用いてタンパク質のインビトロ合
成も可能となる。そして、cDNA各端の潜在的制限酵
素認識部位構成配列により、プラスミドへの一方向かつ
1コピーの挿入が可能であり、クローン化後の解析が容
易となる。このように本発明は、微量試料に由来するc
DNAの単離とその遺伝子発現解析に汎用性が高く、遺
伝子資源の発見、開発に極めて有用である。
【0039】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY CORPORATION <120> Amplification method of a very small quantity mRNA <130> 12-259 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MSMAP-5'-T7 linker upper strand <400> 1 ccggaatcga ttaatacgac tcactatagg gagatgtcta gaatctcgag tc 52 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MSMAP-5'-T7 linker lower strand <400> 2 gactcgagat tctagacatc tccctatagt gagtcgtatt aatcgattcc 50 <210> 3 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:MSMAP-3'-SP6 primer <400> 3 cgataccatg gatttaggtg acactataga ataccggata tcgcggatcc tttttttttt 60 tttttttt 68 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:5' PCR primer <400> 4 ccggaatcga ttaatacgac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:3' PCR primer <400> 5 cgataccatg gatttaggtg 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:T7 promoter sequence <400> 6 taatacgact cactataggg aga 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:SP6 promoter sequence <400> 7 atttaggtga cactatagaa tac 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:T3 promoter sequence <400> 8 aattaaccct cactaaaggg 20
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の微量mRNA増幅法により、cDNA
混成物やcRNA混成物を合成する、各工程別の概略を
示す図である。
【図2】本発明の微量mRNAの増幅方法に用いられる
リンカーやプライマーの構造を示す図である。
【図3】本発明の微量mRNAの増幅方法により、全R
NAからcDNA混成物を増幅した結果を示す図であ
る。第1段階のPCR産物混合液5μlを用いて、第2
段階のPCRを100μlの反応混合液中で行った。各
サイクル数の反応の後10μlを抜取り、アガロース電
気泳動を行なってcDNA混成物の増幅を解析した。レ
ーンMはDNA分子量マーカーを泳動した。
【図4】本発明の微量mRNAの増幅方法により、段階
希釈した全RNAからcDNA混成物を増幅した結果を
示す図である。用いた全RNA量に相当する細胞の概数
も示した。PCRは1段階のみで、40サイクル行なっ
た。レーンMはDNA分子量マーカーを泳動した。
【図5】本発明の微量mRNAの増幅方法により増幅し
たcDNA混成物から、センス鎖およびアンチセンス鎖
cRNA混成物を合成した結果を示す図である。レーン
Mは分子量マーカーとして全RNAを泳動した。
【図6】全RNAおよび増幅cRNA混成物のノーザン
ハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。レ
ーン1および2は、ラット初代培養肝細胞由来の全RN
Aおよびその増幅センス鎖cRNA混成物を電気泳動
後、蛍光染色した結果を示す。これらをブロット後、ア
ルギナーゼmRNAおよびcRNAを検出した(レーン
3および4)。
【図7】本発明におけるリバース−ノーザンハイブリダ
イゼーション解析の概要を示す図である。
【図8】リバース−ノーザンハイブリダイゼーション解
析の結果を示す図である。
【図9】増幅cDNA混成物を用いて、cDNAライブ
ラリーを作製し、各クローンのインサートの長さを検定
した結果である。レーン12を除く全てのクローンにイ
ンサートが認められた。レーンMはDNA分子量マーカ
ーを泳動した。

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 以下の〜の工程を含むことを特徴と
    する微量mRNAの増幅方法。 試料中のmRNAを、オリゴ(dT)を結合させた担体
    に吸着させる工程; 担体上でアンチセンス鎖cDNA及びセンス鎖cDN
    Aを合成する工程; 得られる2重鎖cDNAの少なくともセンス鎖の5′
    末端に第1のプロモーター配列を有するリンカーを付加
    する工程; 2重鎖cDNAを解離させ、担体に結合したアンチセ
    ンス鎖cDNAを担体と共に除去する工程; 解離したセンス鎖cDNAを鋳型として、第2のプロ
    モーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(dT)
    プライマーを用いて、2重鎖cDNAを合成する工程; 2重鎖cDNA両端のリンカー部分の配列をプライマ
    ーとしてPCRを行い、cDNA混成物を増幅する工
    程;
  2. 【請求項2】 以下の〜の工程を含むことを特徴と
    する微量mRNAの増幅方法。 試料中のmRNAを、オリゴ(dT)を結合させた担体
    に吸着させる工程; 担体上でアンチセンス鎖cDNA及びセンス鎖cDN
    Aを合成する工程; 得られる2重鎖cDNAの少なくともセンス鎖の5′
    末端に第1のプロモーター配列を有するリンカーを付加
    する工程; 2重鎖cDNAを解離させ、担体に結合したアンチセ
    ンス鎖cDNAを担体と共に除去する工程; 解離したセンス鎖cDNAを鋳型として、第2のプロ
    モーター配列を有するリンカーを付加したオリゴ(dT)
    プライマーを用いて、2重鎖cDNAを合成する工程; 2重鎖cDNA両端のリンカー部分の配列をプライマ
    ーとしてPCRを行い、cDNA混成物を増幅する工
    程; 前記第1のプロモーター配列及び/又は第2のプロモ
    ーター配列を利用して、インビトロ転写系によりセンス
    鎖cRNA及び/又はアンチセンス鎖cRNAを合成す
    る工程;
  3. 【請求項3】 担体が磁気ビーズであることを特徴とす
    る請求項1又は2記載の微量mRNAの増幅方法。
  4. 【請求項4】 第1のプロモーター配列を有するリンカ
    ーとして、その5′末端が非対合末端、3′末端が平滑
    末端であるリンカーを使用することを特徴とする請求項
    1〜3のいずれか記載の微量mRNAの増幅方法。
  5. 【請求項5】 第1のプロモーター配列を有するリンカ
    ー及び/又は第2のプロモーター配列を有するリンカー
    として、該プロモーター配列の5′側及び/又は3′側
    に制限酵素認識配列を有するリンカーを使用することを
    特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の微量mRNA
    の増幅方法。
  6. 【請求項6】 第1のプロモーター配列と第2のプロモ
    ーター配列が異なることを特徴とする請求項1〜5のい
    ずれか記載の微量mRNAの増幅方法。
  7. 【請求項7】 第1のプロモーター及び/又は第2のプ
    ロモーターが、該プロモーターを特異的に転写すること
    ができるRNAポリメラーゼが存するプロモーターであ
    ることを特徴とする請求項1〜6のいずれか記載の微量
    mRNAの増幅方法。
  8. 【請求項8】 プロモーター特異的に転写することがで
    きるRNAポリメラーゼが、T7プロモーター、SP6
    プロモーター、T3プロモーターから選ばれることを特
    徴とする請求項7記載の微量mRNAの増幅方法。
  9. 【請求項9】 第1のプロモーター配列を有するリンカ
    ーが、配列番号1及び2で表される塩基配列からなるこ
    とを特徴とする請求項1〜8のいずれか記載の微量mR
    NAの増幅方法。
  10. 【請求項10】 第2のプロモーター配列を有するリン
    カーを付加したオリゴ(dT)プライマーが、配列番号3
    で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項1
    〜9のいずれか記載の微量mRNAの増幅方法。
  11. 【請求項11】 請求項1〜10のいずれか記載の微量
    mRNAの増幅方法を用いることを特徴とする遺伝子の
    クローニング方法。
  12. 【請求項12】 請求項1〜10のいずれか記載の微量
    mRNAの増幅方法により得られるセンス鎖cDNA、
    アンチセンス鎖cDNA、センス鎖cRNA又はアンチ
    センス鎖cRNAの少なくとも1つを標識化して用いる
    ことを特徴とするサブトラクションクローニング方法。
  13. 【請求項13】 請求項1〜10のいずれか記載の微量
    mRNAの増幅方法により得られるセンス鎖cDNA、
    アンチセンス鎖cDNA、センス鎖cRNA又はアンチ
    センス鎖cRNAの少なくとも1つを用いることを特徴
    とするマイクロアレイ。
  14. 【請求項14】 請求項1〜10のいずれか記載の微量
    mRNAの増幅方法により得られるcDNAがベクター
    に導入されていることを特徴とするcDNAライブラリ
    ー。
  15. 【請求項15】 オリゴ(dT)を結合させた担体、第1
    のプロモーター配列を有するリンカー、前記第1のプロ
    モーター配列とは異なる第2のプロモーター配列を有す
    るリンカーを付加したオリゴ(dT)プライマーを含むこ
    とを特徴とする微量mRNA増幅用キット。
  16. 【請求項16】 担体が磁気ビーズであることを特徴と
    する請求項15記載の微量mRNA増幅用キット。
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