CN118028429A - 一种形貌介导显微索引和流式分选的dna微球库的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库的制备方法。选用不同形貌的羧基化SiO2微球作为空间拓扑形貌载体，通过共价修饰和碱基互补方式在拓扑形貌载体表面负载不同类型的DNA，从而构建得到不同形貌的DNA微球；将不同形貌的DNA微球混合，得到形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库。基于DNA微球可分辨的空间拓扑形貌，在光学显微镜下可实现显微索引。同时，基于DNA微球的形貌差异所呈现差异的瑞利散射光信号，利用流式细胞分选仪的散射光通道对目标DNA微球进行随机分选。本发明通过显微索引和流式分选介导的DNA微球库的随机读取方法，为DNA微文库的构建、随机删除和索引提供思路，在DNA分析和筛选领域具有实际应用前景，尤其在解决传统DNA存储平台所遇到的制备复杂、随机索引和分选困难等问题上发挥着重要的指导作用。
Description
技术领域
本发明属于DNA合成生物学和生物技术领域，具体涉及一种形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库的制备方法。
背景技术
DNA作为重要的生物遗传物质，承载着重要的信息。DNA因其特异的碱基序列，高密度的存储能力、易便捷操作等能力被广泛应用于生物技术领域，如疾病诊断、DNA信息存储领域。现有技术中对特定DNA进行随机捕获和读取，存在效率低、索引困难和定位精度差等问题。此外，如何快速、准确地随机读取DNA库中的特定的DNA仍是一大挑战。目前为止，最常见随机读取DNA平台的常用方法是聚合酶链式反应(PCR)，每个DNA序列中均设计了一段特定的PCR引物互补链，当需要读取该DNA时，则将该序列对应引物链添加到DNA库中检索并扩增，最后测序读取数据信息。该方法需要复杂的实验步骤，且引物和目标DNA序列之间可能存在干扰，难以实现大规模数据存储高精度地随机访问，实时有效性也有待进一步提高。鉴于此，我们开发形貌介导的显微索引和流式分选的DNA微球的制备方法，并实现对混合DNA微球库中特定的DNA微球进行随机获取有望解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于开发一种形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库的制备方法。选用不同形貌的羧基化SiO2微球作为拓扑形貌载体，通过共价修饰和碱基互补方式在拓扑形貌载体表面负载不同类型的DNA，从而构建得到不同形貌的DNA微球；将不同形貌的DNA微球混合，得到形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库。基于DNA微球可分辨的拓扑形貌，在光学显微镜下可实现显微直读索引。同时，基于DNA微球的形貌差异所呈现的散射光信号差异，可利用流式细胞分选仪的散射光通道对目标DNA微球进行索引并随机分选，实现对DNA微球随机读取。DNA微球将不同形貌存储差异和散射光差异信号作为不同DNA微球的索引标志，借助普通光学显微镜和流式细胞分选仪能够高效、精准地实现对目标DNA微球的识别分选。该随机读取方法可避免传统方法中繁琐的PCR读取等步骤，并可有效降低其他DNA微球的用量，提高DNA微球库的使用次数。同时，允许自主删除所需DNA，而不会损坏DNA微球库中的其他DNA微球，有望为DNA存储的可行性和普及性提供了便捷可行的条件和路径选择。
本发明采用的技术方案如下：
一种形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库的制备方法，其是选用不同形貌的羧基化SiO2微球作为拓扑形貌载体，通过共价修饰和碱基互补方式在拓扑形貌载体表面负载不同类型的DNA，从而构建得到不同形貌的DNA微球；将不同形貌的DNA微球混合，得到形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库；
其中，所述不同形貌的羧基化SiO2微球为在普通光学显微镜下具有不同的结构和/或尺寸、且能够通过光学成像进行可视化区分的羧基化SiO2微球；
其中，所述DNA为单链DNA、双链DNA中的一种或多种，其带有粘性游离单链末端。
进一步的，上述一种形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库的制备方法，具体步骤如下：
1)获取双链DNA，所述双链DNA的5'端带有粘性游离单链末端；
2)获取单链DNA link，所述单链DNA link可与步骤1)中双链DNA的粘性游离单链末端互补配对；
3)将不同尺寸的羧基化SiO2微球分别分散于MES缓冲液中，通过氨基和羧基的缩合反应分别与步骤2)中的单链DNAlink共价连接，得到不同尺寸的SiO2-ssDNA微球；
4)将步骤3)所得不同尺寸的SiO2-ssDNA微球分别与步骤1)中5'端带有粘性游离单链末端的双链DNA在盐离子缓冲液中杂交反应，得到不同尺寸的SiO2@dsDNA微球，即为不同形貌的DNA微球；
5)将步骤4)所得不同尺寸的SiO2@dsDNA微球混合，即得到形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库；
其中，所述双链DNA为人工合成或通过PCR扩增得到；
所述单链DNAlink为人工合成得到；
一种形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库，其是由上述的制备方法得到。
上述一种形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库在DNA分析和筛选领域中的应用；
所述应用为：将DNA微球库放置在载玻片上，在普通光学显微镜下进行观察，DNA微球库中不同形貌的DNA微球可因形貌差异而被区分开来，实现形貌差异的索引；用流式细胞分选仪对DNA微球库进行表征，DNA微球库中不同形貌的DNA微球可因形貌差异而在流式细胞分选仪上呈现出差异化的散射光信号，进而可通过流式细胞分选仪进行圈门分选，实现从DNA微球库中获取特定散射光信号的DNA微球。
本发明的显著优点在于：
本发明公开了一种形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库的制备方法，该制备方法简单、绿色，具有广泛的通用性，可避免传统方法中繁琐和长耗时的PCR扩增等步骤，克服引物扩增带来的DNA串扰、丢失问题，实现非破坏性和高效地随机检索目标DNA微球。同时，允许自主删除所需的DNA微球，而不损坏微文库中的其他DNA。本发明为基于DNA为介质的信息库实现非破坏性的随机读取提供了新的思路，尤其是在解决传统DNA存储平台所遇到的存储基元密度低、合成复杂、随机索引和分选困难等问题上发挥着重要的指导作用。
附图说明
图1为基于显微索引和流式分选的DNA微球随机读取示意图及其制备过程。
图2为不同尺寸的DNA微球的表征(TEM和荧光共聚焦图)。
图3为不同尺寸的DNA微球的普通光学显微镜成像图。
图4为显微索引和流式分选验证数据图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
本发明中使用的核酸序列如下：
dsDNA1：
正向序列：
5'-
TGGCTCATTTCACAATCGGTAACCCAACCAATACCACGTGTCGCACCGCACCTTGCACT
GAGGGTAGATACTTCGTTTGATGAAGACCTATTCAGCCTTGGAGCGGCTCGATGAACCACTATAAATGACCTGCCGTGCAA-3'，
反向序列：为与正向序列互补的核苷酸序列。
dsDNA2：
正向序列：
5'-
AAGCTTCCAAACTGTGTGGCAAAGGGAAGGACGAGGTCACCATGAATCCTGACAGTTA
GCTCCACTCTGTGTGTGAACTCAGAGGACTCACTAAGTACTAGCTTGAGCAACTCGACTCGCCTTAGCGGCTATGGCTACGA-3'，
反向序列：为与正向序列互补的核苷酸序列。
dsDNA3：
正向序列：
5'-
TTCGGTGTTCAGGTCCTGGCAACAAACCCAACCAAAGACGCCAACCCGAGATTATGCG
GGAGGGTTACGGCGGAATATAGAACCGACTGTCTCGCAGGGTAGCCAGAAATGAACCTACGTTCCCACCTACCTACAGAGCT-3'，
反向序列：为与正向序列互补的核苷酸序列。
dsDNA1-F：5'-CAGTTAGTATGCTTGGCTGA/iSp9/TGGCTCATTTCACAATCGGT-3'，dsDNA1-R：5'-TTGCACGGCAGGTCATTTAT-3'，
dsDNA1-R(Cy3)：5'Cy3-TTGCACGGCAGGTCATTTAT-3'。
dsDNA2-F：5'-GACTTCAGACTTAGGAATGT/iSp9/AAGCTTCCAAACTGTGTGGC-3'，
dsDNA2-R：5'-TCGTAGCCATAGCCGCTAAG-3'，
dsDNA2-R(Cy5)：5'Cy5-TCGTAGCCATAGCCGCTAAG-3'。
dsDNA3-F：5'-AGATTGAGAGTTTGAGTGAC/iSp9/TTCGGTGTTCAGGTCCTGGC-3'，
dsDNA3-R：5'-AGCTCTGTAGGTAGGTGGGA-3'，
dsDNA3-R(FAM)：5’FAM-AGCTCTGTAGGTAGGTGGGA-3'。
ssDNA1：5'-TCAGCCAAGCATACTAACTGT-NH2C6-3'。
ssDNA2：5'-ACATTCCTAAGTCTGAAGTCT-NH2C6-3'。
ssDNA3：5'-GTCACTCAAACTCTCAATCTT-NH2C6-3'。
本发明中模板DNA(即dsDNA1，dsDNA2，dsDNA3)由苏州金唯智生物科技有限公司通过化学方法人工合成并提供。其他序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司通过化学方法人工合成并提供。
本发明中MES缓冲液购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(CAS：4432-31-9)。
本发明中含12.5mM MgCl2的1×TAE缓冲液的配置方法为：用超纯水将50×TAE稀释到1×TAE，加入终浓度为12.5mM MgCl2。其中，50×TAE购于生工生物工程(上海)股份有限公司(货号：B548101)。
本发明羧基化SiO2微球购于江苏先丰纳米材料科技有限公司(CAS：7440-21-3)。
实施例1
图1为本发明基于显微索引和流式分选的DNA微球随机读取示意图及其制备过程。
本发明构建了三种不同尺寸的DNA微球，实现基于尺寸差异的显微直读和流式细胞分选仪来对混合的DNA微球进行选择性分选。具体步骤如下：
1)采用化学方法人工合成然后通过PCR技术大量扩增以获取3种不同序列的带粘性游离单链末端的双链DNA(dsDNA1、dsDNA2和dsDNA3)：
制备dsDNA1时，具体PCR反应体系为：1ng/μL人工合成的dsDNA1模板1μL，10μM的dsDNA1-F引物6μL、10μM的dsDNA1-R引物6μL、dNTP 5μL、PCR缓冲液5μL、DEPC水26.5μL、LA-Taq DNA聚合酶0.5μL；PCR反应程序为：95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃40s，30个循环。
制备dsDNA2时，具体PCR反应体系为：1ng/μL人工合成的dsDNA2模板1μL，10μM的dsDNA2-F引物6μL、10μM的dsDNA2-R引物6μL、dNTP 5μL、PCR缓冲液5μL、DEPC水26.5μL、LA-Taq DNA聚合酶0.5μL；PCR反应程序为：95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃40s，30个循环。
制备dsDNA3时，具体PCR反应体系为：1ng/μL人工合成的dsDNA3模板1μL，10μM的dsDNA3-F引物6μL、10μM的dsDNA3-R引物6μL、dNTP 5μL、PCR缓冲液5μL、DEPC水26.5μL、LA-Taq DNA聚合酶0.5μL；PCR反应程序为：95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃40s，30个循环。
2)设计并人工合成3种不同序列的NH2C6修饰的单链DNA link(ssDNA1、ssDNA2和ssDNA3)：
其中，ssDNA1可与dsDNA1中粘性游离单链末端互补配对，ssDNA2可与dsDNA2中粘性游离单链末端互补配对，ssDNA3可与dsDNA3中粘性游离单链末端互补配对。
3)配制双链DNA溶液和单链DNAlink溶液：
用DEPC水配制dsDNA1溶液(5μM)、dsDNA2溶液(5μM)和dsDNA3溶液(5μM)。
用DEPC水配制ssDNA1溶液(100μM)、ssDNA2溶液(100μM)和ssDNA3溶液(100μM)。
4)制备SiO2-ssDNA微球：
取0.25mg粒径5μm的羧基化SiO2微球，分散于200μL MES缓冲液中；加入20μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(0.3M)，于750rpm、27℃金属浴震荡30min；加入40μLN-羟基琥珀酰亚胺(0.3M)，于750rpm、27℃金属浴震荡30min；加入3μL ssDNA1溶液(100μM)，于750rpm、27℃金属浴震荡10h，固体产物水洗离心3次得到SiO2-ssDNA1微球，分散于200μL超纯水中制成悬液。
取0.25mg粒径8μm的羧基化SiO2微球，分散于200μL MES缓冲液中；加入20μL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(0.3M)，于750rpm、27℃金属浴震荡30min；加入40μLN-羟基琥珀酰亚胺(0.3M)，于750rpm、27℃金属浴震荡30min；加入3μL ssDNA2溶液(100μM)，于750rpm、27℃金属浴震荡10h，固体产物水洗离心3次得到SiO2-ssDNA2微球，分散于200μL超纯水中制成悬液。
取0.25mg粒径11μm的羧基化SiO2微球，分散于200μL MES缓冲液中；加入20μL1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(0.3M)，于750rpm、27℃金属浴震荡30min；加入40μLN-羟基琥珀酰亚胺(0.3M)，于750rpm、27℃金属浴震荡30min；加入3μL ssDNA3溶液(100μM)，于750rpm、27℃金属浴震荡10h，固体产物水洗离心3次得到SiO2-ssDNA3微球，分散于200μL超纯水中制成悬液。
5)制备SiO2@dsDNA微球：
将30μL SiO2-ssDNA1微球悬液加入至30μL含12.5mM MgCl2的1×TAE缓冲液中，加入5μL dsDNA1溶液(5μM)，于750rpm、37℃金属浴震荡3h以进行碱基互补配对杂交反应，固体产物水洗离心3次得到SiO2@dsDNA1微球，分散于200μL超纯水中制成悬液。
将30μL SiO2-ssDNA2微球悬液加入至30μL含12.5mM MgCl2的1×TAE缓冲液中，加入5μL dsDNA2溶液(5μM)，于750rpm、37℃金属浴震荡3h以进行碱基互补配对杂交反应，固体产物水洗离心3次得到SiO2@dsDNA2微球，分散于200μL超纯水中制成悬液。
将30μL SiO2-ssDNA3微球悬液加入至30μL含12.5mM MgCl2的1×TAE缓冲液中，加入5μL dsDNA3溶液(5μM)，于750rpm、37℃金属浴震荡3h以进行碱基互补配对杂交反应，固体产物水洗离心3次得到SiO2@dsDNA3微球，分散于200μL超纯水中制成悬液。
6)构建DNA微球库：
将SiO2@dsDNA1微球悬液、SiO2@dsDNA2微球悬液和SiO2@dsDNA3微球悬液按体积比10：4：1混合，得到DNA微球库。
7)DNA微球库的显微成像
取20μL DNA微球库放置在载玻片上，将载玻片置于普通光学显微镜下进行观察。
8)DNA微球库的表征
将DNA微球库用超纯水稀释10倍，然后用流式细胞分选仪进行表征。
图2为不同尺寸的DNA微球(SiO2@dsDNA1微球，SiO2@dsDNA2微球，SiO2@dsDNA3微球)的TEM和荧光共聚焦图。从图2A中TEM图可以观察到，5μm、8μm、11μm尺寸的DNA微球能够成功制备。从2B图中具有荧光信号的DNA微球库的荧光共聚焦图可以看出各个存储微球具有不同的荧光信号，也说明了成功的负载上dsNDA(具有荧光信号的DNA微球库的构建同上述步骤1)至步骤6)，不同之处在于将dsDNA1-R替换为dsDNA1-R(Cy3)、将dsDNA2-R替换为dsDNA2-R(Cy5)、将dsDNA3-R替换为dsDNA3-R(FAM))。
图3为不同尺寸的DNA微球(SiO2@dsDNA1微球，SiO2@dsDNA2微球，SiO2@dsDNA3微球)的普通光学显微镜成像图。从图中可以看出所构建的5μm、8μm和11μm尺寸的SiO2@dsDNA微球具有显著的差异，可以有效的区分DNA微球库中存在的DNA微球的种类，实现尺寸差异的索引。
图4为显微索引和流式分选验证数据图。从图4A中可以观察到，不同尺寸(5μm、8μm、11μm)的DNA微球在光学显微镜下具有显著的可区分的形貌，展现出明显的显微直读效果。从图4B中流式细胞仪器分析图可以观察到各尺寸的DNA微球呈现出不同的瑞利散射光信号(包括前向散射光FSC和侧向散射光SSC)；在流式细胞仪具有可区分的门，展现出明显的分选效果，可以通过适当圈门将目标信息精准识别，对其进行圈门后，利用仪器的分选功能对特定的门内的DNA微球进行分选，从而可实现从混合DNA微球库中获取特定散射光信号的DNA微球。
综上所述，本发明提供了一种形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库的制备方法。通过选用尺寸差异的SiO2微球作为拓扑形貌载体；其次，通过共价修饰和碱基互补方式负载不同类型的DNA，从而构建不同尺寸的DNA微球；将不同尺寸的DNA微球混合，得到形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库。基于DNA微球可分辨的拓扑形貌，在光学显微镜下可实现显微直读索引。同时，基于DNA微球的形貌差异所呈现的散射光信号差异利用流式细胞分选仪对目标DNA微球进行索引并随机分选，实现对DNA微球随机读取。本发明为可高通量操作DNA基元库提供了新的思路，尤其为DNA存储的可行性和普及性提供了一个方便快捷的条件和路径选择。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (9)
1.一种形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库的制备方法，其特征在于：选用不同形貌的羧基化SiO2微球作为拓扑形貌载体，通过共价修饰和碱基互补方式在拓扑形貌载体表面负载不同类型的DNA，从而构建得到不同形貌的DNA微球；将不同形貌的DNA微球混合，得到形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述不同形貌的羧基化SiO2微球为在普通光学显微镜下具有不同的结构和/或尺寸、且能够通过光学成像进行可视化区分的羧基化SiO2微球。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述DNA为单链DNA、双链DNA中的一种或多种，其带有粘性游离单链末端。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
1）获取双链DNA，所述双链DNA的5'端带有粘性游离单链末端；
2）获取单链DNA link，所述单链DNA link可与步骤1）中双链DNA的粘性游离单链末端互补配对；
3）将不同尺寸的羧基化SiO2微球分别分散于MES缓冲液中，通过氨基和羧基的缩合反应分别与步骤2）中的单链DNA link共价连接，得到不同尺寸的SiO2-ssDNA微球；
4）将步骤3）所得不同尺寸的SiO2-ssDNA微球分别与步骤1）中5'端带有粘性游离单链末端的双链DNA在盐离子缓冲液中杂交反应，得到不同尺寸的SiO2@dsDNA微球，即为不同形貌的DNA微球；
5）将步骤4）所得不同尺寸的SiO2@dsDNA微球混合，即得到形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述双链DNA为人工合成或通过PCR扩增得到。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述单链DNA link为人工合成得到。
7.一种形貌介导显微索引和流式分选的DNA微球库，其特征在于：由权利要求1所述的制备方法得到。
8.如权利要求7所述的DNA微球库在DNA分析和筛选领域中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：将DNA微球库放置在载玻片上，在普通光学显微镜下进行观察，DNA微球库中不同形貌的DNA微球可因形貌差异而被区分开来，实现形貌差异的索引；用流式细胞分选仪对DNA微球库进行表征，DNA微球库中不同形貌的DNA微球可因形貌差异而在流式细胞分选仪上呈现出差异化的散射光信号，进而可通过流式细胞分选仪进行圈门分选，实现从DNA微球库中获取特定散射光信号的DNA微球。
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| CN202410266692.8A CN118028429A (zh) | 2024-03-08 | 2024-03-08 | 一种形貌介导显微索引和流式分选的dna微球库的制备方法 |
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