CN105331613A - 一种靶向dna纳米探针及其制备和应用 - Google Patents

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何丹农
王萍
夏智伟
刘婷
金彩虹
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Abstract

本发明公开一种靶向DNA四面体纳米探针及其制备和应用，将标记有Cy5的DNA单链以及另外三条具有特定碱基序列的DNA链加入到Tris-MgCl2溶液中混合、反应，得DNA四面体即TDN；将上述DNA四面体溶液和一定浓度的肿瘤穿透肽溶液混合，利用click反应，合成靶向DNA四面体，即靶向TDN；步骤三、将上述靶向DNA四面体溶液加入到浓缩离心管，离心去除反应液中残存的小分子，再将沉淀物重悬在TM？buffer？（10mM？Tris？base、50mM？MgCl2、pH=8）中，即可得到DNA靶向纳米探针。将Cy5荧光分子修饰在DNA四面体上，同时连接靶向多肽，使得该探针具有靶向和体内近红外成像的功能。

Description

一种靶向DNA纳米探针及其制备和应用
技术领域
本发明提出一种靶向DNA四面体纳米探针的近红外成像的制备及应用，具体涉及将标记有特定荧光分子的DNA单链，自组装成DNA四面体，并进一步修饰上肿瘤穿透肽，从而实现具有脑肿瘤靶向性检测的DNA四面体纳米探针。
背景技术
目前所存在的针对肿瘤检测的纳米探针主要有以下几类：基于磁性材料的纳米探针，这类纳米探针主要以铁或铁的化合物为基体；基于纳米金及其复合物的检测探针；以及基于其他无机纳米材料，如碳纳米管及其复合物的纳米探针等。这类物质通常具有一定的生物毒性，组织相容性较差，代谢困难。因此，制备一种新型的安全的纳米检测探针就成为了当务之急。已有研究将DNA材料作为探针用于肿瘤检测，通过靶分子与肿瘤细胞表面的特异性受体相结合，提高纳米探针的灵敏度（中国发明专利：一种检测肿瘤纳米探针的制备方法，公开号：CN102234679A；中国发明专利：基于纳米探针直接检测肺癌样品中P53基因突变的方法，公开号：CN101392286A）。
将DNA四面体材料纳米探针用于靶向肿瘤的近红外检测，不仅生物相溶性好，无细胞毒性，而且荧光分子以及一些短肽类小分子能够很容易的修饰在DNA链上，这就为DNA靶向纳米探针的构建提供了理论基础。同时，由于碱基的精确配对，DNA材料能够自组装成具有一定结构尺寸的三维构型，通过调控纳米结构的尺寸以及肿瘤穿透肽的修饰，该纳米探针能够更加容易到达肿瘤部位并清晰成像，具有较高的研究意义和应用价值。
发明内容
针对现有技术在肿瘤检测中的不足，本发明的目的在于提供一种对脑肿瘤具有靶向作用的纳米探针的制备方法及其应用。该方法通过在DNA链上修饰能够被近红外激发的荧光分子，再设计特定的碱基序列，使DNA链能够在一定条件下自组装成DNA四面体，并进一步修饰肿瘤穿透肽，以增强其穿透性和靶向性。本发明采用DNA材料作为分子探针的基体，具有非常好的生物相容性，配合脑肿瘤穿透肽，能够有效地穿透肿瘤外围组织进入到肿瘤内部，在脑部肿瘤检测领域具有广阔的应用前景。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种靶向DNA纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将标记有Cy5的DNA单链以及另外三条具有特定碱基序列的DNA链加入到Tris-MgCl2溶液中混合、反应，得DNA四面体即TDN；
步骤二、将上述DNA四面体溶液和一定浓度的肿瘤穿透肽溶液混合，利用click反应，合成靶向DNA四面体，即靶向TDN；
步骤三、将上述靶向DNA四面体溶液加入到浓缩离心管，离心去除反应液中残存的小分子，再将沉淀物重悬在TMbuffer（10mMTrisbase、50mMMgCl2、pH=8）中，即可得到DNA靶向纳米探针。
步骤一中所述DNA单链为可通过碱基互补配对自组装成DNA四面体三维构型的DNA单链；所述DNA单链的浓度为50μM，序列包括如TDN-1、TDN-2、TDN-3、TDN-4所示的序列；所述序列TDN-3后续可以用Cy5等荧光标记，TDN-4后续可以用N3标记。
步骤一中所述Tris-MgCl2溶液含10mMTris、50mMMgCl2、pH=8的水溶液。
步骤一中所述反应具体为：在PCR仪中，反应温度为95℃，10分钟后快速冷却至4℃，继续反应30分钟。
步骤一中所述DNA四面体最终浓度为2μM。
步骤二中为保证click反应充分进行，所述DNA四面体溶液和靶肽溶液中靶肽的摩尔量大于DNA四面体；进一步地，所述DNA四面体和靶肽的摩尔比为1:2。
步骤二中所述反应溶液中，PBS溶液（磷酸缓冲溶液）的pH为7.3，0.1mM的CuSO4水溶液，TCEP（三(2-羧乙基)膦）溶液为0.1mM水溶液，TBTA（叔丁基三氯乙酰亚胺酯）溶液为含10μMTBTA的DMSO（二甲基亚砜）溶液。
步骤二中，所述恒温反应的条件具体为：37℃、175rpm震荡5小时；步骤三中所述离心采用的转速为6000rpm，采用的离心管为超滤管（OD010C35,10k,PALL,USA），离心的目的是去除反应液中的残存的小分子。
一种靶向DNA纳米探针，其特征在于，根据上述任一所述方法制备得到。
一种靶向DNA纳米探针作为脑肿瘤靶向DNA纳米探针在近红外成像的应用。
由于DNA四面体的小尺寸和较好的生物相容性，本发明在肿瘤检测领域有较大的应用前景。与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明采用DNA材料，通过设计不同的碱基序列，可以实现多种DNA三维结构，并能精确调控该纳米探针的尺寸和构型。
2、本发明将靶向性小分子与荧光分子同时引入DNA材料中，使得纳米探针能够兼具寻靶能力和成像的能力。
3、本发明使用的DNA材料，具有非常好的生物相容性，避免了因为纳米探针聚集可能造成的脑部功能区的损害。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为DNA靶向纳米探针电泳图（L2为单链DNA，L3为双链DNA，L4为修饰前的DNA四面体，L5~L8为修饰上不同肿瘤穿透肽的DNA四面体）；
图2为DNA靶向纳米探针粒度图（Ds为双链DNA，TDN为靶肽修饰前的DNA四面体，p-TDN为肿瘤穿透肽修饰的DNA四面体）；
图3为DNA靶向纳米探针体外细胞激光共聚焦图；
图4为DNA材料活体成像图（从左往右以此是对照组，DNA双链组，DNA四面体组，靶向性DNA四面体组）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1：
步骤一：各取2μL单链DNA（50μM）TDN-1、TDN-2、Cy5-TDN-3、N3-TDN-4加入到42μLTris-MgCl2（Tris10mM,MgCl250mM,pH8）溶液中。将混合溶液置于PCR仪中，反应温度为95℃，10分钟后快速冷却至4℃，继续反应30分钟。DNA单链即可通过碱基互补配对自组装成DNA四面体三维构型。
步骤二：取180μL的PBS溶液（pH7.3），40μL的CuSO4水溶液（0.1mM），40μL的TCEP水溶液（0.1mM）以及40μL的TBTA溶液（10μM，DMSO溶解）配成反应液。取100μL制备好的TDN溶液（2μM）和200μL氨基酸序列为RGERPPR的靶肽溶液（2μM）加入到上述反应液中，37℃恒温175rpm震荡5小时后，反应完成。
步骤三：将上述反应液加入到超滤管（OD010C35,10k,PALL,USA）中，6000rpm离心去除游离的离子，并将离心后的沉淀物重悬于100μL的TMbuffer中，重悬后，该DNA靶向纳米探针的浓度为2μM。反应产物的电泳和粒度数据分别见图1和图2。图3为体外细胞激光共聚焦实验，验证了该纳米探针具有良好的靶向性。
实施例2：
步骤一：各取2μL单链DNA（50μM）TDN-1、TDN-2、Cy5-TDN-3、N3-TDN-4加入到42μLTris-MgCl2（Tris10mM,MgCl250mM,pH8）溶液中。将混合溶液置于PCR仪中，反应温度为95℃，10分钟后快速冷却至4℃，继续反应30分钟。DNA单链即可通过碱基互补配对自组装成DNA四面体三维构型。
步骤二：取180μL的PBS溶液（pH7.3），40μL的CuSO4水溶液（0.1mM），40μL的TCEP水溶液（0.1mM）以及40μL的TBTA溶液（10μM，DMSO溶解）配成反应液。取100μL制备好的TDN溶液（2μM）和200μL氨基酸序列为RPAKPAR的靶肽溶液（2μM）加入到上述反应液中，37℃恒温175rpm震荡5小时后，反应完成。
步骤三：将上述反应液加入到超滤管（OD010C35,10k,PALL,USA）中，6000rpm离心去除游离的离子，并将离心后的沉淀物重悬于100μL的TMbuffer中，重悬后，该DNA靶向纳米探针的浓度为2μM。反应产物的电泳和粒度数据分别见图1和图2。图3为体外细胞激光共聚焦实验，验证了该纳米探针具有良好的靶向性。
实施例3：
步骤一：取2μL单链DNA（50μM）Cy5-TDN-3、N3-Comp.-TDN-3(TDN-3链的互补链)加入到46μLTris-MgCl（Tris10mM,MgCl250mM,pH8）溶液中。将混合溶液置于PCR仪中，反应温度为95℃，10分钟后快速冷却至4℃，继续反应30分钟。DNA单链即可通过碱基互补配对自组装成DNA双链。
步骤二：取180μL的PBS溶液（pH7.3），40μL的CuSO4水溶液（0.1mM），40μL的TCEP水溶液（0.1mM）以及40μL的TBTA溶液（10μM，DMSO溶解）配成反应液。取100μL制备好的TDN溶液（2μM）和200μL氨基酸序列为RGERPPR的靶肽溶液（2μM）加入到上述反应液中，37℃恒温175rpm震荡5小时后，反应完成。
步骤三：将上述反应液加入到超滤管（OD010C35,10k,PALL,USA）中，6000rpm离心去除游离的离子，并将离心后的沉淀物重悬于100μL的TMbuffer中，重悬后，该DNA靶向纳米探针的浓度为2μM。反应产物的电泳和粒度数据分别见图1和图2。图3为体外细胞激光共聚焦实验，验证了该纳米探针具有良好的靶向性。
实施例4：
步骤一：各取2μL单链DNA（50μM）TDN-1、TDN-2、Cy5-TDN-3、N3-TDN-4加入到42μLTris-MgCl2（Tris10mM,MgCl250mM,pH8）溶液中。将混合溶液置于PCR仪中，反应温度为95℃，10分钟后快速冷却至4℃，继续反应30分钟。DNA单链即可通过碱基互补配对自组装成DNA四面体三维构型。
步骤二：取180μL的PBS溶液（pH7.3），40μL的CuSO4水溶液（0.1mM），40μL的TCEP水溶液（0.1mM）以及40μL的TBTA溶液（10μM，DMSO溶解）配成反应液。取100μL制备好的TDN溶液（2μM）和200μL氨基酸序列为RPARPAR的靶肽溶液（2μM）加入到上述反应液中，37℃恒温175rpm震荡12小时后，反应完成。
步骤三：将上述反应液加入到超滤管（OD010C35,10k,PALL,USA）中，6000rpm离心去除游离的离子，并将离心后的沉淀物重悬于100μL的TMbuffer中，重悬后，该DNA靶向纳米探针的浓度为2μM。反应产物的电泳和粒度数据分别见图1和图2。图3为体外细胞激光共聚焦实验，验证了该纳米探针具有良好的靶向性。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种靶向DNA纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将标记有Cy5的DNA单链以及另外三条具有特定碱基序列的DNA链加入到Tris-MgCl2溶液中混合、反应，得DNA四面体即TDN；
步骤二、将上述DNA四面体溶液和一定浓度的肿瘤穿透肽溶液混合，利用click反应，合成靶向DNA四面体，即靶向TDN；
步骤三、将上述靶向DNA四面体溶液加入到浓缩离心管，离心去除反应液中残存的小分子，再将沉淀物重悬在TMbuffer（10mMTrisbase、50mMMgCl2、pH=8）中，即可得到DNA靶向纳米探针。
2.根据权利要求1所述一种靶向DNA纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤一中所述DNA单链为可通过碱基互补配对自组装成DNA四面体三维构型的DNA单链；所述DNA单链的浓度为50μM，序列包括如TDN-1、TDN-2、TDN-3、TDN-4所示的序列；所述序列TDN-3后续可以用Cy5等荧光标记，TDN-4后续可以用N3标记。
3.根据权利要求1所述一种靶向DNA纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤一中所述Tris-MgCl2溶液含10mMTris、50mMMgCl2、pH=8的水溶液。
4.根据权利要求1所述一种靶向DNA纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤一中所述反应具体为：在PCR仪中，反应温度为95℃，10分钟后快速冷却至4℃，继续反应30分钟。
5.根据权利要求1所述一种靶向DNA纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤一中所述DNA四面体最终浓度为2μM。
6.根据权利要求1所述一种靶向DNA纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤二中为保证click反应充分进行，所述DNA四面体溶液和靶肽溶液中靶肽的摩尔量大于DNA四面体；进一步地，所述DNA四面体和靶肽的摩尔比为1:2。
7.根据权利要求1所述一种靶向DNA纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤二中所述反应溶液中，PBS溶液（磷酸缓冲溶液）的pH为7.3，0.1mM的CuSO4水溶液，TCEP（三(2-羧乙基)膦）溶液为0.1mM水溶液，TBTA（叔丁基三氯乙酰亚胺酯）溶液为含10μMTBTA的DMSO（二甲基亚砜）溶液。
8.根据权利要求1所述一种靶向DNA纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述恒温反应的条件具体为：37℃、175rpm震荡5小时；步骤三中所述离心采用的转速为6000rpm，采用的离心管为超滤管（OD010C35,10k,PALL,USA），离心的目的是去除反应液中的残存的小分子。
9.一种靶向DNA纳米探针，其特征在于，根据上述任一权利要求所述方法制备得到。
10.根据权利要求9所述的靶向DNA纳米探针作为脑肿瘤靶向DNA纳米探针在近红外成像的应用。
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