KR20220127844A - 바실러스 리체니포르미스에서 단백질 생산을 향상시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

바실러스 리체니포르미스에서 단백질 생산을 향상시키기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로, 향상된 단백질 생산 능력을 포함하는 B. 리체니포르미스 세포(예를 들어, 단백질 생산 숙주)를 구성 및/또는 획득하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 따라서, 특정 구현예는 증가된 양의 하나 이상의 관심 단백질을 생산하는 모체 바실러스 리체니포르미스 균주로부터 유래된 유전자 변형 바실러스 리체니포르미스 균주에 관한 것이다.

Description

바실러스 리체니포르미스에서 단백질 생산을 향상시키기 위한 조성물 및 방법
본 발명은 일반적으로 세균학, 미생물학, 유전학, 분자 생물학, 효소학, 및 산업 단백질 생산 등의 분야에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 특정 구현예는 단백질 생산 표현형이 향상된 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 세포/균주를 구성하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 1월 15일에 출원된 미국 가출원 62/961,234호의 이익을 주장하며, 그 전문은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
"NB41684-WO-PCT_SequenceListing.txt"라는 파일명의 서열 목록 텍스트 파일의 전자 제출 내용은 2021년 1월 7일에 생성되었으며 크기는 425 KB이고, 전체가 본원에 참조로 포함된다.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)와 같은 그람 양성 박테리아는 우수한 발효 특성 및 높은 수율(예를 들어, 배양액 1 리터당 최대 25 그램; 문헌[Van Dijl and Hecker, 2013])로 인해 산업 관련 단백질의 생산을 위한 미생물 공장으로 자주 사용된다. 예를 들어, B. 서브틸리스는 식품, 직물, 세탁, 의료 기기 세척, 제약 산업 등에 필요한 α-아밀라제(문헌[Jensen et al., 2000; Raul et al., 2014]) 및 프로테아제(문헌[Brode et al., 1996])를 생성하는 것으로 잘 알려져 있다(문헌[Westers et al., 2004]). 이러한 비병원성 그람 양성 박테리아의 경우 독성 부산물(예를 들어, 내독소로도 알려진 리포다당류; LPS)이 전혀 없는 단백질이 생산되기 때문에 유럽 식품 안전청(European Food Safety Authority)의 "공인된 안전성 추정"(QPS) 등급을 획득했으며, 많은 제품이 미국 식품의약국의 "GRAS(Generally Recognized As Safe)" 등급을 받았다(문헌[Olempska-Beer et al., 2006; Earl et al., 2008; Caspers et al., 2010]).
따라서, 미생물 숙주 세포에서 단백질(예를 들어, 효소, 항체, 수용체 등)을 생산하는 것은 생명공학 분야에서 특히 관심 대상이다. 마찬가지로, 하나 이상의 관심 단백질의 생산 및 분비에 대한 바실러스 숙주 세포의 최적화는 특히 산업 생명공학 환경에서 관련성이 높으며, 단백질 수율의 작은 개선은 단백질을 대규모의 산업적인 양으로 생산할 때 매우 중요하다. 보다 구체적으로, B. 리체니포르미스는 산업적으로 매우 중요한 바실러스 종 숙주 세포이므로, 단백질 발현/생산을 향상/증가시키기 위해 B. 리체니포르미스 숙주 세포를 변형 및 조작할 수 있음은 새로운 개선된 B. 리체니포르미스 생산 균주의 구성에 매우 바람직하다. 따라서, 본 발명은 단백질 생산 능력이 향상된 B. 리체니포르미스 세포(예를 들어, 단백질 생산 숙주 세포)를 획득하고 구성하기 위한 매우 바람직한 충족되지 않은 요구에 관한 것이다.
본 발명은 일반적으로, 향상된 단백질 생산 능력을 포함하는 B. 리체니포르미스 세포(예를 들어, 단백질 생산 숙주)를 획득하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 특정 구현예는 증가된 양의 하나 이상의 관심 단백질을 생산하는 이러한 변형된 B. 리체니포르미스 세포/균주를 구성하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 특정 구현예는 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포에서 증가된 양의 내인성 관심 단백질(POI)을 생산하는 방법으로서, (a) POI를 발현하는 모체 B. 리체니포르미스 세포를 수득하고, 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF)에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 모세포를 변형시키는 단계, 및 (b) 단계 (a)의 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건하에 발효시키는 단계를 포함하고, 변형된 세포는 동일한 조건하에 발효될 때 모세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하는, 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 특정 구현예에서, 단계 (a)의 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 100에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA 프로모터를 포함한다. 상기 방법의 다른 구현예에서, 단계 (a)의 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 101에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA ORF를 포함한다. 다른 구현예에서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 155에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA 단백질을 암호화한다. 바람직한 특정 구현예에서, 모세포는 천연 prsA 단백질을 암호화하는 내인성(야생형) prsA 유전자를 포함하고, 이에 따라 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 155에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 prsA 단백질의 제2 카피를 암호화한다. 다른 구현예에서, 단계 (a)의 도입된 폴리뉴클레오티드는 변형된 B. 리체니포르미스 세포의 게놈에 통합된다. 상기 방법의 또 다른 구현예에서, 관심 단백질(POI)은 프로테아제 또는 아밀라제이다. 다른 구현예에서, 변형된 세포는 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 변형된 세포는 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 변형된 세포는 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자 및 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명은 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포에서 증가된 양의 이종성 관심 단백질(POI)을 생산하는 방법으로서, (a) (i) POI를 암호화하는 발현 카세트 및 (ii) 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF)에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 모체 B. 리체니포르미스 세포에 도입하는 단계, 및 (b) 단계 (a)의 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건하에 발효시키는 단계를 포함하고, 변형된 세포는 동일한 조건하에 발효될 때 모세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하는, 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 특정 구현예에서, 단계 (a)(ii)의 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 100에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA 프로모터를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 단계 (a)(ii)의 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 101에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA ORF를 포함한다. 상기 방법의 또 다른 구현예에서, 내인성 prsA 유전자는 서열번호 155에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA 단백질을 암호화한다. 다른 특정 구현예에서, 단계 (a)(ii)의 도입된 폴리뉴클레오티드는 변형된 B. 리체니포르미스 세포의 게놈에 통합된다. 바람직한 특정 구현예에서, 모세포는 천연 prsA 단백질을 암호화하는 내인성(야생형) prsA 유전자를 포함하고, 이에 따라 단계 (a)(ii)의 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 155에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 prsA 단백질의 제2 카피를 암호화한다. 특정 구현예에서, 관심 단백질(POI)은 프로테아제 또는 아밀라제이다. 다른 구현예에서, 변형된 세포는 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 변형된 세포는 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 구현예에서, 변형된 세포는 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자 및 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예는 천연 prsA 단백질을 암호화하는 내인성 prsA 유전자를 포함하는 모체 B. 리체니포르미스 세포/균주로부터 유래된 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포/균주에 관한 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 B. 리체니포르미스 세포는 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF)에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터를 포함하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 100에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA 프로모터를 포함한다. 다른 구현예에서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 101에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA ORF를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 155에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA 단백질을 암호화한다. 다른 특정 구현예에서, 천연 prsA 단백질을 암호화하는 도입된 폴리뉴클레오티드는 변형된 B. 리체니포르미스 세포의 게놈에 통합된다. 다른 구현예에서, 변형된 세포는 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 변형된 세포는 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 변형된 세포는 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자 및 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 변형된 세포는 이종성 관심 단백질(POI)을 암호화하는 도입된 발현 구성체를 포함한다. 다른 구현예에서, 이종성 POI는 프로테아제 또는 아밀라제이다. 따라서, 본 발명의 특정 구현예는 본 발명의 변형된 B. 리체니포르미스 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 수득, 단리, 정제 등에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 특정 구현예는 변형이 유래된 모체 B. 리체니포르미스 세포에 비해 증가된 양의 관심 단백질(POI)을 생산하는 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포에 관한 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 모체 B. 리체니포르미스 세포에 비해 증가된 양의 관심 단백질(POI)을 생산하는 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포에 관한 것으로, 변형된 세포는 POI를 발현하는 모체 B. 리체니포르미스 세포로부터 유래되고, 변형된 세포는 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF)에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터를 포함하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 포함하고, 변형된 세포는 동일한 조건하에 발효될 때 모균주에 비해 증가된 양의 POI를 생산한다. 다른 구현예에서, 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포는 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 천연 prsA 프로모터는 서열번호 100에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 천연 prsA ORF는 서열번호 101에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함한다. 다른 구현예에서, 천연 prsA 단백질은 서열번호 155에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함한다. 특정 구현예에서, 관심 단백질(POI)은 프로테아제 또는 아밀라제이다. 따라서, 본 발명의 다른 특정 구현예는 변형된 B. 리체니포르미스 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 수득, 단리, 정제 등에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 모체 B. 리체니포르미스 세포에 비해 증가된 양의 관심 단백질(POI)을 생산하는 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포에 관한 것으로, 변형된 세포는 POI를 발현하는 모체 B. 리체니포르미스 세포로부터 유래되고, 변형된 세포는 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF)에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터를 포함하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자를 포함하고, 변형된 세포는 동일한 조건하에 발효될 때 모균주에 비해 증가된 양의 POI를 생산한다. 다른 구현예에서, 변형된 세포는 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 천연 prsA 프로모터는 서열번호 100에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 천연 prsA ORF는 서열번호 101에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함한다. 다른 구현예에서, 천연 prsA 단백질은 서열번호 155에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함한다. 특정 구현예에서, 관심 단백질(POI)은 프로테아제 또는 아밀라제이다. 따라서, 본 발명의 다른 특정 구현예는 변형된 B. 리체니포르미스 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 수득, 단리, 정제 등에 관한 것이다.
생물학적 서열의 간단한 설명
서열번호 1은 천연 S. 피오게네스 Cas9 단백질을 암호화하는 아미노산 서열이다.
서열번호 2는 서열번호 1의 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 바실러스 종 세포에서의 발현에 대해 코돈 최적화된 핵산 서열이다.
서열번호 3은 합성 N-말단 핵 국재화 신호(NLS)의 아미노산 서열이다.
서열번호 4는 합성 C-말단 핵 국재화 신호(NLS)의 아미노산 서열이다.
서열번호 5는 합성 데카-히스티딘 태그의 아미노산 서열이다.
서열번호 6은 B. 서브틸리스 aprE 프로모터 서열이다.
서열번호 7은 합성 종결자 핵산 서열이다.
서열번호 8은 정방향 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 9는 역방향 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 10은 합성 pKB320 백본 핵산 서열이다.
서열번호 11은 합성 pKB320 핵산 서열이다.
서열번호 12는 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 13은 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 14는 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 15는 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 16은 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 17은 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 18은 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 19는 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 20은 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 21은 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 22는 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 23은 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 24는 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 25는 합성 pRF694 핵산 서열이다.
서열번호 26은 합성 pRF801 핵산 서열이다.
서열번호 27은 합성 pRF806 핵산 서열이다.
서열번호 28은 B. 리체니포르미스 표적 부위 1(TS1) 핵산 서열이다.
서열번호 29는 B. 리체니포르미스 표적 부위 2(TS2) 핵산 서열이다.
서열번호 30은 B. 리체니포르미스 serA1 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열이다.
서열번호 31은 뉴클레오티드 "AGG"를 포함하는 표적 부위 1 PAM 서열이다.
서열번호 32는 가변 표적화 (VT) 부위 1을 암호화하는 핵산 서열이다.
서열번호 33은 CER 도메인을 암호화하는 합성 핵산 서열이다.
서열번호 34는 부위 1을 표적화하는 합성 가이드 RNA(gRNA) 서열이다.
서열번호 35는 합성 spac 프로모터 핵산 서열이다.
서열번호 36은 합성 t0 종결자 핵산 서열이다.
서열번호 37은 B. 리체니포르미스 serA1 상동성 아암 1 핵산 서열이다.
서열번호 38은 합성 serA1 상동성 아암 1 정방향 프라이머 서열이다.
서열번호 39는 합성 serA1 상동성 아암 1 역방향 프라이머 서열이다.
서열번호 40은 B. 리체니포르미스 serA1 상동성 아암 2 핵산 서열이다.
서열번호 41은 합성 serA1 상동성 아암 2 정방향 프라이머 서열이다.
서열번호 42는 합성 serA1 상동성 아암 2 정방향 프라이머 서열이다.
서열번호 43은 표적 부위 1(TS1) gRNA를 암호화하는 발현 카세트이다.
서열번호 44는 합성 serA1 결실 편집 주형이다.
서열번호 45는 B. 리체니포르미스 rghR1 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열이다.
서열번호 46은 뉴클레오티드 "CGG"를 포함하는 표적 부위 2 PAM 서열이다.
서열번호 47은 부위 2를 표적화하는 합성 가이드 RNA(gRNA) 서열이다.
서열번호 48은 B. 리체니포르미스 rghR1 상동성 아암 1 핵산 서열이다.
서열번호 49는 합성 rghR1 상동성 아암 1 정방향 프라이머 서열이다.
서열번호 50은 합성 rghR1 상동성 아암 1 역방향 프라이머 서열이다.
서열번호 51은 B. 리체니포르미스 rghR1 상동성 아암 2 핵산 서열이다.
서열번호 52는 합성 rghR1 상동성 아암 2 정방향 프라이머 서열이다.
서열번호 53은 합성 rghR1 상동성 아암 2 역방향 프라이머 서열이다.
서열번호 54는 표적 부위 2(TS2) gRNA를 암호화하는 발현 카세트이다.
서열번호 55는 합성 rghR1 결실 편집 주형이다.
서열번호 56은 Cas9(Y155H) 변이 단백질을 암호화하는 아미노산 서열이다.
서열번호 57은 합성 Y155H 정방향 프라이머 서열이다.
서열번호 58은 합성 Y155H 역방향 프라이머 서열이다.
서열번호 59는 합성 pRF827 핵산 서열이다.
서열번호 60은 서열번호 56의 변이 Cas9(Y155H) 단백질을 암호화하는 발현 카세트이다.
서열번호 61은 합성 pRF856 핵산 서열이다.
서열번호 62는 합성 pRF862 핵산 서열이다.
서열번호 63은 합성 Y155H 단편 서열이다.
서열번호 64는 합성 Y155H 단편 정방향 프라이머 서열이다.
서열번호 65는 합성 Y155H 단편 역방향 프라이머 서열이다.
서열번호 66은 합성 pRF694 단편 서열이다.
서열번호 67은 합성 pRF694 단편 정방향 프라이머 서열이다.
서열번호 68은 합성 pRF694 단편 역방향 프라이머 서열이다.
서열번호 69는 합성 pRF869 핵산 서열이다.
서열번호 70은 B. 리체니포르미스 rghR2 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열이다.
서열번호 71은 합성 rghR2 stop 단편이다.
서열번호 72는 합성 rghR2 stop 편집 주형이다.
서열번호 73은 rghR2 gRNA를 암호화하는 발현 카세트이다.
서열번호 74는 합성 단편 정방향 프라이머이다.
서열번호 75는 합성 단편 역방향 프라이머이다.
서열번호 76은 합성 pRF862 백본 정방향 프라이머이다.
서열번호 77은 합성 pRF862 백본 역방향 프라이머이다.
서열번호 78은 합성 pRF879 핵산 서열이다.
서열번호 79는 B. 리체니포르미스 pRF879 표적 부위 및 PAM 핵산 서열이다.
서열번호 80은 합성 pRF879 편집 주형 서열이다.
서열번호 81은 합성 pRF946 핵산 서열이다.
서열번호 82는 B. 리체니포르미스 pR946 표적 부위 및 PAM 핵산 서열이다.
서열번호 83은 합성 pR946 편집 주형 서열이다.
서열번호 84는 합성 pZM221 핵산 서열이다.
서열번호 85는 합성 pZM221 표적 부위 및 PAM 핵산 서열이다.
서열번호 86은 합성 pZM221 편집 주형 서열이다.
서열번호 87은 B. 리체니포르미스 lysA 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열이다.
서열번호 88은 합성 pBl.comK 핵산 서열이다.
서열번호 89는 합성 스펙티노마이신 마커 핵산 서열이다.
서열번호 90은 B. 서브틸리스 xylR 핵산 서열이다.
서열번호 91은 B. 서브틸리스 xylAp 핵산 서열이다.
서열번호 92는 합성 comK 핵산 서열이다.
서열번호 93은 합성 cat_prsA 핵산 서열이다.
서열번호 94는 B. 리체니포르미스 cat 업스트림 핵산 서열이다.
서열번호 95는 B. 리체니포르미스 cat 프로모터 핵산 서열이다.
서열번호 96은 B. 리체니포르미스 catH 핵산 서열이다.
서열번호 97은 합성 이중 종결자 핵산 서열이다.
서열번호 98은 B. 리체니포르미스 catH 종결자 핵산 서열이다.
서열번호 99는 B. 서브틸리스 spoVG 종결자 핵산 서열이다.
서열번호 100은 B. 리체니포르미스 prsA 프로모터 핵산 서열이다.
서열번호 101은 B. 리체니포르미스 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열이다.
서열번호 102는 B. 리체니포르미스 amyL 종결자 핵산 서열이다.
서열번호 103은 B. 리체니포르미스 cat 다운스트림 핵산 서열이다.
서열번호 104는 합성 정방향 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 105는 합성 역방향 프라이머 핵산 서열이다.
서열번호 106은 합성 prsA(제2 카피) 검증 핵산 서열이다.
서열번호 107은 합성 프라이머 서열이다.
서열번호 108은 합성 프라이머 서열이다.
서열번호 109는 합성 프라이머 서열이다.
서열번호 110은 B. 리체니포르미스 결실 catHP 및 catH 암호화 핵산 서열이다.
서열번호 111은 cat catH 결실에서의 합성 prsA(제2 카피) 발현 카세트이다.
서열번호 112는 합성 catH(제2 카피) 결실 검증 PCR 산물이다.
서열번호 113은 합성 정방향 프라이머 서열이다.
서열번호 114는 합성 역방향 프라이머 서열이다.
서열번호 115는 합성 dltA-2 검증 PCR 산물이다.
서열번호 116은 합성 dltA-2 모체 검증 PCR 산물이다.
서열번호 117은 합성 정방향 프라이머 서열이다.
서열번호 118은 합성 역방향 프라이머 서열이다.
서열번호 119는 합성 rghR2 결실 검증 PCR 산물이다.
서열번호 120은 B. 리체니포르미스 모체 rghR2 결실 검증 PCR 산물이다.
서열번호 121은 B. 리체니포르미스 모체 rghR2 유전자좌이다.
서열번호 122는 B. 리체니포르미스 모체 dltA 유전자좌이다.
서열번호 123은 B. 리체니포르미스 모체 cat 유전자좌이다.
서열번호 124는 합성 cat 2x prsA 유전자좌이다.
서열번호 125는 합성 dltA-2 유전자좌이다.
서열번호 126은 B. 리체니포르미스 아밀라제 1 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 127은 합성 serA1 아밀라제 1 카세트이다.
서열번호 128은 합성 p3 프로모터 서열이다.
서열번호 129는 합성 변형된 aprE 5'-UTR 서열이다.
서열번호 130은 amyL 신호 서열을 암호화하는 B. 리체니포르미스 핵산 서열이다.
서열번호 131은 서열번호 126의 아밀라제 1 단백질을 암호화하는 B. 리체니포르미스 핵산 서열이다.
서열번호 132는 합성 lysA 아밀라제 1 카세트이다.
서열번호 133은 합성 lysA 모체 유전자좌 핵산 서열이다.
서열번호 134는 lysA를 암호화하는 B. 리체니포르미스 핵산 서열이다.
서열번호 135는 합성 p2 프로모터 서열이다.
서열번호 136은 아밀라제 2 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 137은 합성 serA1 아밀라제 2 카세트이다.
서열번호 138은 B. 서브틸리스 rrnI 프로모터 서열이다.
서열번호 139는 B. 서브틸리스 aprE 5'-UTR 서열이다.
서열번호 140은 서열번호 136의 아밀라제 2 단백질을 암호화하는 합성 핵산 서열이다.
서열번호 141은 합성 amyL 또는 lysA 아밀라제 2 카세트이다.
서열번호 142는 합성 amyL 모체 유전자좌이다.
서열번호 143은 아밀라제 3 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 144는 합성 serA1 아밀라제 3 카세트이다.
서열번호 145는 서열번호 143의 아밀라제 3 단백질을 암호화하는 합성 핵산 서열이다.
서열번호 146은 합성 lysA 아밀라제 3 카세트이다.
서열번호 147은 아밀라제 4 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 148은 합성 serA1 아밀라제 4 카세트이다.
서열번호 149는 서열번호 147의 아밀라제 4 단백질을 암호화하는 합성 핵산 서열이다.
서열번호 150은 합성 lysA Amylase 4 카세트이다.
서열번호 151은 아밀라제 5 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 152는 합성 serA1 아밀라제 5 카세트이다.
서열번호 153은 서열번호 151의 아밀라제 5 단백질을 암호화하는 합성 핵산 서열이다.
서열번호 154는 합성 lysA 아밀라제 5 카세트이다.
서열번호 155는 천연 B. 리체니포르미스 prsA 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 156은 천연 B. 리체니포르미스 RghR2 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 157은 변이 B. 리체니포르미스 RghR2 단백질의 아미노산 서열이다.
서열번호 158은 서열번호 157의 변이 RghR2 단백질을 암호화하는 변이 B. 리체니포르미스 rghR2 유전자의 핵산 서열이다.
본 발명은 일반적으로, 향상된 단백질 생산 능력을 포함하는 B. 리체니포르미스 세포(예를 들어, 단백질 생산 숙주)를 획득하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특정 구현예는 모체 B. 리체니포르미스 세포/균주로부터 유래된 유전자 변형 바실러스 리체니포르미스 세포/균주에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 특정 구현예는 증가된 양의 하나 이상의 관심 단백질을 생산하는 이러한 변형된 B. 리체니포르미스 세포/균주를 구성하는 방법에 관한 것이다.
예를 들어, 본 발명의 특정 구현예는 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포에서 증가된 양의 관심 단백질(POI)을 생산하는 방법으로서, (a) 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF)에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써, POI를 발현하는 모체 B. 리체니포르미스 세포를 변형시키는 단계 및 (b) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건하에 발효시키는 단계를 포함하고, 변형된 세포는 동일한 조건하에 발효될 때 모세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하는, 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 변형된 세포는 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자 및/또는 서열번호 121에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 관심 단백질(POI)은 효소이다. 특정 구현예에서, 효소는 프로테아제 또는 아밀라제이다.
본 발명의 다른 구현예는 천연 prsA 단백질을 암호화하는 내인성 prsA 유전자를 포함하는 모체 B. 리체니포르미스 세포/균주로부터 유래된 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포/균주에 관한 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 B. 리체니포르미스 세포는 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF)에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터를 포함하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 155에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA 단백질을 암호화한다. 다른 구현예에서, 변형된 세포는 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자 및/또는 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 포함한다.
따라서, 본 발명의 특정 구현예는 본 발명의 변형된 B. 리체니포르미스 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 수득, 단리, 정제 등에 관한 것이다.
I. 정의
본 발명의 변형된 B. 리체니포르미스 세포 및 본원에 기재된 이의 방법과 관련하여, 다음의 용어 및 어구가 정의된다. 본원에 정의되지 않은 용어는 당업계에서 사용되는 통상적인 의미를 따른다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명의 조성물 및 방법이 적용되는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 조성물 및 방법의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있지만, 대표적인 예시적 방법 및 재료가 이제 기술된다. 본원에 인용된 모든 간행물 및 특허는 그 전체가 참조로 포함된다.
또한, 임의의 선택적 요소를 제외하도록 청구범위가 작성될 수 있음에 유의한다. 따라서, 이러한 서술은 청구 요소의 설명과 관련하여 "전적으로", "단지", "~를 제외한", "~를 포함하지 않는" 등과 같은 배타적 용어를 사용하거나, "부정적" 제한이나 그 단서를 사용하기 위한 선행 근거로서의 역할을 하기 위한 것이다.
본원에 기재되고 예시된 개별 구현예 각각은 본원에 기재된 본 발명의 조성물 및 방법의 범위 또는 사상을 벗어나지 않으면서 임의의 다른 여러 구현예의 특징과 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 가지며, 이는 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백할 것이다. 임의의 언급된 방법은 언급된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "바실러스 속"은 B. 서브틸리스(subtilis), B. 리체니포르미스(licheniformis), B. 렌투스(lentus), B. 브레비스(brevis), B. 스테아로써모필루스(stearothermophilus), B. 알칼로필루스(alkalophilus), B. 아밀로리퀘파시엔스(amyloliquefaciens), B. 클라우시(clausii), B. 할로두란스(halodurans), B. 메가테리움(megaterium), B. 코아굴란스(coagulans), B. 서큘란스(circulans), B. 라우투스(lautus), 및 B. 투링기엔시스(thuringiensis)를 비롯해(이에 한정되지 않음), 당업계에 알려진 "바실러스" 속 내의 모든 종을 포함한다. 바실러스 속은 계속해서 분류학적 재편성을 거치는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 속은 현재 "지오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus)"로 명명된 B. 스테아로써모필루스와 같은 유기체를 비롯한(이에 한정되지 않음) 재분류된 종을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "모세포"는 "변형되지 않은 세포"(예를 들어, 변형되지 않은 B. 리체니포르미스 모세포와 같은 세포)를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변형된 세포" 또는 "딸세포"는 변형된("딸") 세포가 유래된 "모세포"에 존재하지 않는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함하는 재조합 B. 리체니포르미스 세포를 의미한다.
특정 구현예에서, "변형되지 않은" B. 리체니포르미스(모) 세포는, 특히 "변형된" B. 리체니포르미스(딸) 세포와 비교할 때 또는 이에 대해 상대적으로 "대조 세포"로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변형되지 않은"(모) 세포에서의 관심 단백질(POI)의 발현 및/또는 생산이 "변형된"(딸) 세포에서의 동일한 POI의 발현 및/또는 생산과 비교될 때, "변형된" 세포와 "변형되지 않은" 세포가 동일한 조건(예를 들어, 배지, 온도, pH 등이 동일한 조건)하에 성장/배양/발효된다는 것은 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "숙주 세포"는 새로 도입된 DNA 서열에 대한 숙주 또는 발현 비히클로서 작용하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 숙주 세포는 바실러스 종 또는 E. 콜라이(coli) 세포이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 "천연 B. 리체니포르미스 prsA 프로모터"는 서열번호 100에 대해 약 95%의 서열 동일성을 포함한다. 특정 구현예에서, 천연 B. 리체니포르미스 prsA 프로모터는 서열번호 100에 대해 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "천연 B. 리체니포르미스 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF)"은 서열번호 101에 대해 약 90% 이상의 서열 동일성을 포함한다. 특정 구현예에서, 천연 B. 리체니포르미스 prsA ORF는 서열번호 101에 대해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다.
바실러스 서브틸리스의 prsA 유전자는 문헌[Kontinen and Sarvas (1993) 및 PCT 공개 WO1994/019471호]에 설명된 바 있으며, 해당 문헌에서는 prsA 유전자가 단백질 분비에 관여(즉, 세포 분비 기구의 구성요소를 암호화)하고, prsA 유전자 산물이 막관련 지단백질이라는 것이 제시되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "천연 B. 리체니포르미스 prsA 단백질"은 서열번호 155에 대해 약 90% 이상의 서열 동일성을 포함하고 펩티딜-프롤릴-시스-트랜스-이소머라제 활성(EC 5.2.1.8)을 포함한다. 특정 구현예에서, 천연 B. 리체니포르미스 prsA 단백질은 서열번호 155에 대해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "모체 B. 리체니포르미스 세포는 천연 prsA 단백질을 암호화하는 내인성(야생형) prsA 유전자를 포함하며", 따라서, 서열번호 155에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 prsA 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 변형된 B. 리체니포르미스 세포에 도입되는 경우, 도입된 폴리뉴클레오티드는 본원에서 제2 prsA 카피로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 155에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 prsA 단백질을 암호화하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 변형된 B. 리체니포르미스 세포는 본원에서, 천연 prsA 단백질을 암호화하는 제1 내인성(야생형) prsA 유전자, 및 prsA 단백질을 암호화하는 제2 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 2개의 카피 prsA(변형된) B. 리체니포르미스 세포로 지칭될 수 있다.
B. 서브틸리스에서, dlt 오페론은 DltA, DltB, DltC, DltD, 및 DltE로 각각 명명된 단백질을 암호화하는 5개의 ORF(dltA, dltB, dltC, dltD, 및 dltE)를 포함한다(문헌[May et al., 2005]). 예를 들어, 문헌[May et al. (2005)]에 기재된 바와 같이, DltA 단백질은 D-Ala를 세포벽의 리포테이코산으로 통합하는 데 관여하는 D-알라닌:D-알라닐 운반 단백질 리가제이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "dltA 유전자"는 서열번호 122에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함한다. 특정 구현예에서, dltA 유전자는 서열번호 155에 대해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다.
B. 서브틸리스 rghR 유전자는 당해 분야에서 rapG, rapH의 억제인자로서 기술된 RghR이라는 전사 조절 단백질을 암호화한다(문헌[Ogura and Fujita, 2007]). 대조적으로, 최근 PCT 공개 WO2018/156705호에 기재된 바와 같이, B. 리체니포르미스는 RghR1 및 RghR2라는 2개의 RghR 전사 조절 단백질 상동체를 암호화한다. 이후에 설명되는 바와 같이, 본 발명의 특정 구현예는 변형된(예를 들어, 결실 또는 파괴된) rghr2 유전자를 포함하는 B. 리체니포르미스 세포에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에 기재된 유전자 변형에 적합한 "B. 리체니포르미스 rghR2 유전자"는 서열번호 156에 대해 약 90%의 서열 동일성(예를 들어, 서열번호 156에 대해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성)을 포함하는 천연 RhgR2 단백질을 암호화하는 야생형 B. 리체니포르미스 rghR2 유전자(서열번호 121)일 수 있거나, 서열번호 157에 대해 약 90%의 서열 동일성(예를 들어, 서열번호 156에 대해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성)을 포함하는 변이 RhgR2 단백질을 암호화하는 변이 B. 리체니포르미스 rghR2 유전자(서열번호 158)일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 157에 제시된 바와 같이, 변이 RhgR2 단백질은 서열번호 157의 아미노산 잔기 36~41에 "Ala-Ala-Ala-Ile-Ser-Arg"의 6개의 아미노산 잔기 반복을 포함하며, 이 6개의 아미노산 반복은 천연 RghR2 단백질(즉, 서열번호 156의 아미노산 잔기 1~134)에는 존재하지 않는다.
따라서, 다른 특정 구현예에서, rghR2 유전자, 또는 이의 오픈 리딩 프레임은 천연 rghR2 유전자에 대해 약 90%의 서열 동일성(예를 들어, 서열번호 121에 대해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성)을 포함하거나; 변이 rghR2 유전자에 대해 약 90%의 서열 동일성(예를 들어, 서열번호 158에 대해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "BF140" 또는 "BF140(ΔserA_ΔlysA)"로 명명된 모체 B. 리체니포르미스 균주는 serA 유전자 결실(ΔserA) 및 lysA 유전자 결실(ΔlysA)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "BF561" 또는 "BF561(제2 카피 prsA)"로 명명된 변형된 B. 리체니포르미스 균주는 모균주 BF140으로부터 유래되었고, 변형된 BF561 균주는 천연 prsA 단백질을 암호화하는 야생형 B. 리체니포르미스 prsA 유전자의 도입된 제2 카피를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "BF598" 또는 "BF598(ΔdltA_제2 카피 prsA)"로 명명된 변형된 B. 리체니포르미스 균주는 BF561 균주로부터 유래되었고, 변형된 BF598은 B. 리체니포르미스 dltA 유전자의 결실을 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "BF602" 또는 "BF602(ΔrghR2_제2 카피 prsA)"로 명명된 변형된 B. 리체니포르미스 균주는 BF561 균주로부터 유래되었고, 변형된 BF602는 B. 리체니포르미스 rghR2 유전자의 결실을 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "BF613" 또는 "BF613(ΔrghR2_ΔdltA_제2 카피 prsA)"로 명명된 변형된 B. 리체니포르미스 균주는 BF598(ΔdltA_제2 카피 prsA) 균주로부터 유래되었고, 변형된 BF613은 B. 리체니포르미스 rghR2 유전자의 결실을 추가로 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아밀라제 1"은 당업계에서 일반적으로 AmyL로 지칭되는 천연 B. 리체니포르미스 α-아밀라제이며, 서열번호 126의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아밀라제 2"는 국제 PCT 공개 WO2018/184004호(전체가 본원에 참조로 포함됨)에 일반적으로 기재된 바와 같은, 서열번호 136을 포함하는 변이 바실러스 종 α-아밀라제이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아밀라제 3"은 국제 PCT 공개 WO2014/164777호, WO2012/164800호, 및 WO2014/164834호(각각은 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 일반적으로 기재된 바와 같은, 서열번호 143을 포함하는 변이 사이토파가(Cytophaga) 종 α-아밀라제이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아밀라제 4"는 국제 PCT 공개 WO2014/164777호, WO2012/164800호, 및 WO2014/164834호(각각은 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 일반적으로 기재된 바와 같은, 서열번호 147을 포함하는 변이 사이토파가 종 α-아밀라제이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "아밀라제 5"는 국제 PCT 공개 WO2008/153805호 및 US 특허공개 US2014/0057324호(각각은 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 일반적으로 기재된 바와 같은, 서열번호 151을 포함하는 변이 바실러스 종 707 알칼리성 α-아밀라제이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "Cas9 Y155H"로 명명된 본원의 변이 Cas9 단백질은 PCT 공개 WO2019/118463호(전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "변형" 및 "유전자 변형"은 상호교환적으로 사용되며, 다음을 포함한다: (a) 유전자(또는 이의 ORF)에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 치환, 또는 제거, 또는 유전자 또는 이의 ORF의 전사 또는 번역에 필요한 조절 요소에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 치환, 또는 제거, (b) 유전자 파괴, (c) 유전자 전환, (d) 유전자 결실, (e) 유전자의 하향조절, (f) 특이적 돌연변이유발, 및/또는 (g) 본원에 개시된 임의의 하나 이상의 유전자의 무작위 돌연변이유발.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변형된 숙주 세포는 (변형되지 않은) 모체 숙주 세포에 비해 하나 이상의 관심 단백질의 '증가된 양을 발현/생산한다"와 같은 어구에서 사용될 때, "증가된 양"은 특히, 변형된 숙주 세포에서 발현/생산된 임의의 관심 단백질(POI)의 "증가된 양"을 나타내며, "증가된 양"은 항상, 동일한 POI를 발현/생산하는 (변형되지 않은) 모체 B. 리체니포르미스 세포에 대해 상대적인 것이고, 여기서 변형된 세포와 변형되지 않은 세포는 동일한 조건(예를 들어, 배지, 온도, pH 등이 동일한 조건)하에 성장/배양/발효된다. 예를 들어, 증가된 양의 POI는 내인성 바실러스 종 POI, 또는 본 발명의 변형된 바실러스 종 세포에서 발현된 이종성 POI일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단백질 생산의 "증가" 또는 "증가된" 단백질 생산은 증가된 양의 생산된 단백질(예를 들어, 관심 단백질)을 의미한다. 단백질은 숙주 세포 내에서 생산되거나, 배양 배지 내로 분비(또는 수송)될 수 있다. 특정 구현예에서, 관심 단백질은 배양 배지 내로 생산(분비)된다. 예를 들어, 단백질 생산의 증가는 예를 들어 모체 숙주 세포와 비교하여 더 높은 최대 수준의 단백질 또는 효소 활성(예를 들어, 프로테아제 활성, 아밀라제 활성, 셀룰라제 활성, 헤미셀룰라제 활성 등), 또는 생산된 총 세포외 단백질로서 검출될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 본 발명의 핵산 분자로부터 유래된 센스 RNA(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정적 축적을 나타낸다. 발현은 또한 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 나타낼 수 있다. 따라서, 용어 "발현"은 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 변형, 분비 등을 포함하는(이에 한정되지 않음), 폴리펩티드의 생산에 관여된 임의의 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산"은 뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이의 단편 또는 일부를 지칭할 뿐만 아니라, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥을 나타내는지와 상관없이, 이중가닥 또는 단일가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA, cDNA, 및 RNA를 지칭한다. 유전 암호의 축퇴로 인해 다수의 뉴클레오티드 서열이 주어진 단백질을 암호화할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
본원에 기술된 폴리뉴클레오티드(또는 핵산 분자)는 "유전자", "벡터", 및 "플라스미드"를 포함하는 것이 이해된다.
따라서, 용어 "유전자"는 단백질 암호화 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산의 특정 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 나타내며, 예를 들어 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 프로모터 서열과 같은 조절(비전사) DNA 서열을 포함할 수 있다. 유전자의 전사 영역은 인트론, 5'-비번역 영역(UTR), 및 3'-UTR을 포함하는 비번역 영역(UTR)뿐만 아니라 암호화 서열도 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암호화 서열"은 (암호화된) 단백질 산물의 아미노산 서열을 직접 특정하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 암호화 서열의 경계는 일반적으로 오픈 리딩 프레임(이하, "ORF")에 의해 결정되며, 이는 대개 ATG 시작 코돈으로 시작된다. 암호화 서열은 일반적으로 DNA, cDNA, 및 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는 암호화 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 일반적으로, 암호화 서열은 프로모터 서열에 대해 3'(다운스트림)에 위치한다. 프로모터는 천연 유전자로부터 그 전체가 유래될 수 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래되는 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 핵산 절편을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터가 상이한 세포 유형에서, 또는 상이한 발달 단계에서, 또는 상이한 환경 조건 또는 생리적 조건에 응답하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 대부분의 세포 유형에서 대부분의 시점에 유전자가 발현되도록 하는 프로모터를 일반적으로 "항시성 프로모터"라고 한다. 또한, 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 길이가 다른 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있는 것으로 인정된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 하나의 기능이 다른 하나에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서 핵산 서열들이 결합된 것을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터가 암호화 서열(예를 들어, ORF)의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우(즉, 암호화 서열이 프로모터의 전사 제어하에 있는 경우) 해당 암호화 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 암호화 서열은 센스 배향 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
핵산이 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있도록 위치할 때 이 핵산은 "작동가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 분비 리더(즉, 신호 펩티드)를 암호화하는 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질(pre-protein)로서 발현되는 경우에 해당 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 미칠 경우 해당 서열에 작동가능하게 연결되거나; 리보솜 결합 부위가 번역을 촉진하도록 위치하는 경우 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열들이 인접해 있음을 의미하고, 분비 리더의 경우에는 인접해 있고 판독 단계에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해 있을 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관례에 따라 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "관심 유전자의 단백질 암호화 서열에 연결된 관심 유전자(또는 이의 오픈 리딩 프레임)의 발현을 제어하는 기능적 프로모터 서열"은, 바실러스에서 암호화 서열의 전사 및 번역을 제어하는 프로모터 서열을 지칭한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명은 5' 프로모터(또는 5' 프로모터 영역 또는 탠덤 5' 프로모터 등)를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 프로모터 영역은 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열(예를 들어, ORF)에 작동가능하게 연결된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "적합한 조절 서열"은 암호화 서열의 업스트림(5' 비암호화 서열), 암호화 서열 내, 또는 암호화 서열의 다운스트림(3' 비암호화 서열)에 위치하며 관련 암호화 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터 결합 부위, 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임(ORF), 또는 이의 유전자, 또는 이의 벡터를 "박테리아 세포 내로 도입" 또는 "B. 리체니포르미스 세포 내로 도입"과 같은 어구에서 사용되는 용어 "도입"은 원형질체 융합, 천연 또는 인공 형질전환(예: 염화칼슘, 전기천공), 형질도입, 형질감염, 접합 등을 포함하여(이에 한정되지 않음), 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하기 위한 당업계에 알려진 방법을 포함한다(예를 들어, 문헌[Ferrari et al., 1989]참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환"은 재조합 DNA 기술을 사용하여 세포가 형질전환되었음을 의미한다. 형질전환은 일반적으로 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 폴리뉴클레오티드, ORF, 또는 유전자)을 세포에 삽입함으로써 일어난다. 삽입된 뉴클레오티드 서열은 이종성 뉴클레오티드 서열(즉, 형질전환될 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 서열)일 수 있다. 따라서, 형질전환은 일반적으로 외인성 DNA를 숙주 세포에 도입하여 DNA가 염색체 통합체 또는 자가 복제성 염색체외 벡터로서 유지되도록 하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환 DNA", "형질전환 서열", 및 "DNA 구성체"는 서열을 숙주 세포 또는 유기체 내로 도입하는 데 사용되는 DNA를 지칭한다. 형질전환 DNA는 서열을 숙주 세포 또는 유기체 내로 도입하는 데 사용되는 DNA이다. 이러한 DNA는 PCR 또는 임의의 다른 적합한 기술에 의해 시험관내에서 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질전환 DNA는 유입 서열을 포함하는 반면, 다른 구현예에서는 상동성 박스에 의해 플랭킹된 유입 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 형질전환 DNA는 말단에 추가된 다른 비상동성 서열(즉, 스터퍼 서열 또는 플랭크)을 포함한다. 말단은 형질전환 DNA가 예를 들어 벡터 내 삽입과 같이 닫힌 원을 형성하도록 닫힐 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유전자의 파괴" 또는 "유전자 파괴"는 상호교환적으로 사용되며, 숙주 세포가 기능적 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 생산하는 것을 실질적으로 방지하는 임의의 유전자 변형을 광범위하게 지칭한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자 파괴는 프레임시프트 돌연변이, 조기 정지 코돈(즉, 기능적 단백질이 만들어지지 않음), 단백질의 활성을 제거하거나 감소시키는 치환, 내부 결실(즉, 기능적 단백질이 만들어지지 않음), 암호화 서열을 파괴하는 삽입, 전사에 필요한 천연 프로모터와 오픈 리딩 프레임 사이의 작동가능한 연결을 제거하는 돌연변이 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "유입 서열"은 바실러스 종 염색체 내로 도입되는 DNA 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, 유입 서열은 DNA 구성체의 일부이다. 다른 구현예에서, 유입 서열은 하나 이상의 관심 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, 유입 서열은 형질전환될 세포의 게놈에 이미 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 서열을 포함한다(즉, 상동성 서열이거나 이종성 서열일 수 있음). 일부 구현예에서, 유입 서열은 하나 이상의 관심 단백질, 유전자, 및/또는 돌연변이되었거나 변형된 유전자를 암호화한다. 대안적인 구현예에서, 유입 서열은 기능적 야생형 유전자 또는 오페론, 기능적 돌연변이 유전자 또는 오페론, 또는 비기능적 유전자 또는 오페론을 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전자의 기능을 파괴하기 위해 비기능적 서열이 유전자에 삽입될 수 있다. 다른 구현예에서, 유입 서열은 선택 마커를 포함한다. 추가 구현예에서, 유입 서열은 2개의 상동성 박스를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "상동성 박스"는 바실러스 염색체 내의 서열에 대해 상동성인 핵산 서열을 지칭한다. 보다 구체적으로, 상동성 박스는 본 발명에 따라 결실, 파괴, 비활성화, 하향조절 등이 될 유전자 또는 유전자의 일부의 인접 플랭킹 암호화 영역과 약 80% 내지 100%의 서열 동일성, 약 90% 내지 100%의 서열 동일성, 또는 약 95% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 업스트림 또는 다운스트림 영역이다. 이러한 서열은 DNA 구성체가 바실러스 염색체에서 어느 위치에 통합되는지를 지시하고, 바실러스 염색체의 어느 부분이 유입 서열에 의해 대체되는지를 지시한다. 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니지만, 상동성 박스는 약 1 염기쌍(bp) 내지 200 킬로염기(kb)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상동성 박스는 약 1 bp 내지 10.0 kb; 1 bp 내지 5.0 kb; 1 bp 내지 2.5 kb; 1 bp 내지 1.0 kb, 및 0.25 kb 내지 2.5 kb를 포함한다. 상동성 박스는 또한 약 10.0 kb, 5.0 kb, 2.5 kb, 2.0 kb, 1.5 kb, 1.0 kb, 0.5 kb, 0.25 kb, 및 0.1 kb를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 마커의 5' 및 3' 말단은 상동성 박스에 의해 플랭킹되고, 상동성 박스는 유전자의 암호화 영역을 바로 플랭킹하는 핵산 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "선별 마커 암호화 뉴클레오티드 서열"은 숙주 세포에서 발현할 수 있고 선별 마커의 발현이 발현된 유전자를 함유하는 세포에 상응하는 선택 제제의 존재 또는 필수 영양소의 결핍 하에 성장할 수 있는 능력을 부여하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "선별 마커" 및 "선택 마커"는 숙주 세포에서 발현이 가능한 핵산(예를 들어, 유전자)으로서, 벡터를 함유하는 숙주의 선택을 용이하게 하는 핵산을 지칭한다. 이러한 선별 마커의 예는 항미생물제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 따라서, 용어 "선별 마커"는 숙주 세포가 관심 유입 DNA를 흡수했거나 일부 다른 반응이 일어났다는 표시를 제공하는 유전자를 의미한다. 일반적으로, 선별 마커는 외인성 DNA를 함유하는 세포가 형질전환 동안 외인성 서열을 받지 않은 세포와 구별될 수 있도록 숙주 세포에 항균성 내성 또는 대사 이점을 부여하는 유전자이다.
"상주 선별 마커(residing selectable marker)"는 형질전환될 미생물의 염색체 상에 위치하는 것이다. 상주 선별 마커는 형질전환 DNA 구성체 상의 선별 마커와 상이한 유전자를 암호화한다. 선택 마커는 당업자에게 잘 알려져 있다. 위에서 나타낸 바와 같이, 마커는 항균성 내성 마커(예를 들어, ampR, phleoR, specR, kanR, eryR, tetR, cmpR, 및 neoR)일 수 있다(예를 들어, 문헌[Guerot-Fleury, 1995; Palmeros et al., 2000; 및 Trieu-Cuot et al., 1983] 참조). 일부 구현예에서, 본 발명은 클로람페니콜 내성 유전자(예를 들어, pC194에 존재하는 유전자, 및 바실러스 리체니포르미스 게놈에 존재하는 내성 유전자)를 제공한다. 이러한 내성 유전자는 본 발명에서, 뿐만 아니라 염색체 통합 카세트 및 통합형 플라스미드의 염색체 증폭과 관련된 구현예에서도 특히 유용하다(예를 들어, 문헌[Albertini and Galizzi, 1985; Stahl and Ferrari, 1984] 참조). 본 발명에 따른 유용한 다른 마커는 세린, 리신, 트립토판과 같은 영양요구성 마커; 및 β-갈락토시다제와 같은 검출 마커를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 숙주 세포 "게놈", 박테리아 (숙주) 세포 "게놈", 또는 바실러스 종 (숙주) 세포 "게놈"은 염색체 유전자 및 염색체외 유전자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "플라스미드", "벡터", 및 "카세트"는, 일반적으로 세포의 중심 대사의 일부가 아닌 보통 원형 이중가닥 DNA 분자의 형태인 대개 유전자를 운반하는 염색체외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 선택된 유전자 산물에 대한 DNA 서열 및 프로모터 단편을 적절한 3' 비번역 서열과 함께 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 구성체로 다수의 뉴클레오티드 서열이 연결되거나 재조합된, 임의의 공급원 유래의 단일가닥 또는 이중가닥 DNA 또는 RNA의 선형 또는 원형, 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "플라스미드"는 클로닝 벡터로서 사용되며 많은 박테리아 및 일부 진핵 생물에서 염색체외 자가 복제성 유전 요소를 형성하는 원형 이중가닥(ds) DNA 구성체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 숙주 세포의 게놈에 통합된다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 모세포에 존재하고 딸세포에서 소실된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환 카세트"는 유전자(또는 이의 ORF)를 포함하고 외래 유전자 이외에 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 요소를 갖는 특정 벡터를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"라는 용어는 세포에서 복제(증식)될 수 있고 새로운 유전자 또는 DNA 절편을 세포 내로 운반할 수 있는 임의의 핵산을 지칭한다. 따라서, 이 용어는 상이한 숙주 세포들 간의 전달을 위해 설계된 핵산 구성체를 지칭한다. 벡터는 바이러스, 박테리오파지, 프로-바이러스(pro-virus), 플라스미드, 파지미드(phagemid), 트랜스포존(transposon), 및 인공 염색체, 예컨대 YAC(효모 인공 염색체), BAC(박테리아 인공 염색체), PLAC(식물 인공 염색체) 등을 포함하는데, 이들은 "에피좀"이다(즉, 자율적으로 복제되거나 숙주 생물의 염색체 내에 통합될 수 있음).
"발현 벡터"는 세포에서 이종성 DNA를 통합하고 발현시키는 능력을 갖는 벡터를 지칭한다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 상업적으로 이용가능하고 당업자에게 알려져 있다. 적절한 발현 벡터를 선택하는 것은 당업자가 알고 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 카세트" 또는 "발현 벡터"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 가능케 하는 일련의 명시된 핵산 요소(즉, 전술한 바와 같은 벡터 또는 벡터 요소)를 사용해 재조합적으로 또는 합성에 의해 생성된 핵산 구성체를 지칭한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 색소체 DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편에 통합될 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열 중에서도 특히, 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, DNA 구성체는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 명시된 핵산 요소를 또한 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 DNA 구성체는 본원에 정의된 바와 같은 선택 마커 및 비활성화 염색체 또는 유전자 또는 DNA 절편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "표적화 벡터"는 표적화 벡터가 형질전환되는 숙주 세포의 염색체 내 영역에 대해 상동성이고, 그 영역에서 상동성 재조합을 유도할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터이다. 예를 들어, 표적화 벡터는 상동성 재조합을 통해 숙주 세포의 염색체에 돌연변이를 도입하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 표적화 벡터는 예를 들어 말단에 추가된 다른 비상동성 서열(즉, 스터퍼 서열 또는 플랭킹 서열)을 포함한다. 말단은 표적화 벡터가 예를 들어 벡터 내 삽입과 같이 닫힌 원을 형성하도록 닫힐 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 모체 B. 리체니포르미스 (숙주) 세포는 하나 이상의 "표적화 벡터"를 도입함으로써 변형(예를 들어, 형질전환)된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "관심 단백질" 또는 "POI"는 변형된 B. 리체니포르미스(딸) 숙주 세포에서 발현되기를 원하는 관심 폴리펩티드를 지칭하며, POI는 바람직하게는 증가된(즉, "변형되지 않은"(모) 세포에 비해 증가된) 수준으로 발현된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, POI는 효소, 기질-결합 단백질, 표면-활성 단백질, 구조 단백질, 수용체 단백질 등일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 세포는 모세포에 비해 증가된 양의 이종성 관심 단백질 또는 내인성 관심 단백질을 생산한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 세포에 의해 생산된 관심 단백질의 증가된 양은 모세포에 비해 0.5% 이상의 증가, 1.0% 이상의 증가, 5.0% 이상의 증가, 또는 5.0% 초과의 증가이다.
유사하게, 본원에서 정의되는 바와 같이, "관심 유전자" 또는 "GOI"는 POI를 암호화하는 핵산 서열(예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 유전자, 또는 ORF)을 지칭한다. "관심 단백질"을 암호화하는 "관심 유전자"는 자연 발생적 유전자, 돌연변이 유전자, 또는 합성 유전자일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 임의의 길이의 중합체를 지칭한다. 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1문자 또는 3문자 코드가 본원에서 사용된다. 폴리펩티드는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비아미노산이 개재될 수 있다. 폴리펩티드라는 용어는 자연적으로 변형되었거나, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대, 표지 성분과의 접합과 같은 개입에 의해 변형된 아미노산 중합체를 또한 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예컨대, 비천연 아미노산 등을 포함함)뿐만 아니라 당업계에 알려진 다른 변형을 포함하는 폴리펩티드도 정의에 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 유전자는 상업적으로 관련된 산업적 관심 단백질, 예컨대 효소(예를 들어, 아세틸 에스테라제, 아미노펩티다제, 아밀라제, 아라비나제, 아라비노푸라노시다제, 탄산무수화효소, 카복시펩티다제, 카탈라제, 셀룰라제, 키티나제, 키모신, 큐티나제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라제, 에스테라제, α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, α-글루카나제, 글루칸 라이사제, 엔도-β-글루카나제, 글루코아밀라제, 글루코스 옥시다제, α-글루코시다제, β-글루코시다제, 글루쿠로니다제, 글리코실 하이드롤라제, 헤미셀룰라제, 헥소스 옥시다제, 하이드롤라제, 인버타제, 이소머라제, 라카제, 리파제, 리아제, 만노시다제, 옥시다제, 옥시도리덕타제, 펙테이트 리아제, 펙틴 아세틸 에스테라제, 펙틴 데폴리머라제, 펙틴 메틸 에스테라제, 펙틴 분해 효소, 퍼하이드롤라제, 폴리올 옥시다제, 퍼옥시다제, 페놀옥시다제, 피타제, 폴리갈락투로나제, 프로테아제, 펩티다제, 람노-갈락투로나제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나제, 자일라나제, 헥소스 옥시다제, 및 이들의 조합)를 암호화한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변이체" 폴리펩티드는, 일반적으로 재조합 DNA 기술에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환, 추가, 또는 결실에 의해 모체(또는 기준) 폴리펩티드로부터 유래되는 폴리펩티드를 지칭한다. 변이체 폴리펩티드는 적은 수의 아미노산 잔기만큼 모체 폴리펩티드와 상이할 수 있으며, 모체(기준) 폴리펩티드와의 일차 아미노산 서열 상동성/동일성 수준에 의해 정의될 수 있다.
바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 모체(기준) 폴리펩티드 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "변이체" 폴리뉴클레오티드는 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, "변이체 폴리뉴클레오티드"는 모체 폴리뉴클레오티드와 명시된 정도의 서열 상동성/동일성을 갖거나, 엄격한 혼성화 조건하에 모체 폴리뉴클레오티드(또는 이의 상보체)와 혼성화된다. 바람직하게는, 변이체 폴리뉴클레오티드는 모체(기준) 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 심지어 적어도 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "돌연변이"는 핵산 서열에서의 임의의 변화 또는 변경을 나타낸다. 점 돌연변이, 결실 돌연변이, 침묵 돌연변이, 프레임 시프트 돌연변이, 스플라이싱 돌연변이 등을 포함하는 여러 가지 유형의 돌연변이가 존재한다. 돌연변이는 특이적으로(예를 들어, 부위 지정 돌연변이유발을 통해) 또는 무작위로(예를 들어, 화학작용제, 복구 결핍된 박테리아 균주를 통한 계대배양을 통해) 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드 또는 이의 서열의 맥락에서, 용어 "치환"은 하나의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체(즉, 치환)하는 것을 의미한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "내인성 유전자"는 유기체의 게놈 내의 자연적 위치에 있는 유전자를 지칭한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "이종성" 유전자, "비내인성" 유전자, 또는 "외래" 유전자는 숙주 유기체에서 정상적으로는 발견되지 않고 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입되는 유전자(또는 ORF)를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "외래" 유전자(들)는 비천연 유기체 내로 삽입된 천연 유전자(또는 ORF) 및/또는 천연 또는 비천연 유기체 내로 삽입된 키메라 유전자를 포함한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "이종성 제어 서열"은 자연에서는 관심 유전자의 발현을 조절하는(제어하는) 기능을 하지 않는 유전자 발현 제어 서열(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)을 나타낸다. 일반적으로, 이종성 핵산 서열은 이들이 존재하는 세포 또는 게놈의 일부에 대해 내인성이 아니며(천연이 아니며), 감염, 전달감염, 형질전환, 미세주입, 전기천공 등에 의해 세포에 부가되었다. "이종성" 핵산 구성체는 천연 숙주 세포에서 발견되는 조절 서열/DNA 암호화 서열의 조합과 동일하거나 이와는 상이한 조절 서열/DNA 암호화(ORF) 서열의 조합을 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "신호 서열" 및 "신호 펩티드"는 성숙한 단백질 또는 전구체 형태의 단백질의 분비 또는 직접 수송에 참여할 수 있는 아미노산 잔기의 서열을 지칭한다. 신호 서열은 일반적으로 전구체 또는 성숙 단백질 서열의 N-말단에 위치한다. 신호 서열은 내인성 또는 외인성일 수 있다. 신호 서열은 일반적으로 성숙 단백질에 존재하지 않는다. 신호 서열은 일반적으로 단백질이 수송된 후 신호 펩티다제에 의해 단백질로부터 절단된다.
용어 "유래된"은 용어 "기인된", "수득된", "수득 가능한" 및 "생성된"을 포함하며, 일반적으로 하나의 명시된 물질 또는 조성물의 기원이 또 다른 명시된 물질 또는 조성물에서 발견되거나, 또 다른 명시된 물질 또는 조성물을 참조하여 기술될 수 있는 특징을 가진다는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상동성"은 상동 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 관련된다. 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 둘 이상의 폴리펩티드가 상동성일 경우, 이는 상동 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 한층 더 바람직하게는 적어도 85%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 및 가장 바람직하게는 적어도 98%의 "동일성 정도"를 갖는 것을 의미한다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 본원에서 정의된 바와 같이 상동성이 되기에 충분히 높은 정도의 동일성을 갖는지 여부는 본 기술 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 GCG 프로그램 패키지로 제공되는 "GAP"(Program Manual for the Wisconsin Package, 버전 8, 1994년 8월, [53711] 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group))을 사용하여 두 서열을 정렬함으로써 적절히 조사할 수 있다(문헌[Needleman and Wunsch, (1970)]). DNA 서열 비교를 위하여 하기 설정을 갖는 GAP를 사용한다: 5.0의 GAP 생성 페널티 및 0.3의 GAP 연장 페널티.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동일성 백분율(%)"은, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열들 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열들을 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬할 때, 이들 사이의 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 동일성 수준을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비생산성(specific productivity)"은 주어진 기간에 걸쳐 시간당 세포당 생산된 단백질의 총량이다.
본원에서 정의되는 바와 같이, "정제된", "단리된" 또는 "풍부화된"이라는 용어는, 생체분자(예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)가 자연에서 이들과 결합되어 있는 자연 발생 구성 성분 중 일부 또는 전부로부터 분리됨으로써 이의 자연 상태로부터 변경되는 것을 의미한다. 이러한 단리 또는 정제는 최종 조성물에서 바람직하지 않은 전체 세포, 세포 잔여물, 불순물, 외부 단백질, 또는 효소를 제거하기 위한 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 분리, 투석, 프로테아제 처리, 황산암모늄 침전 또는 기타 단백질 염 침전, 원심분리, 크기 배제 크로마토그래피, 여과, 미세여과, 겔 전기영동 또는 구배에 의한 분리와 같은 본 기술 분야에서 인정된 분리 기술에 의해 달성될 수 있다. 이후, 추가 이득을 제공하는 구성 성분, 예를 들어 활성화제, 항저해제, 바람직한 이온, pH를 제어하기 위한 화합물 또는 기타 효소 또는 화학물질을 정제되거나 단리된 생체분자 조성물에 첨가하는 것이 추가로 가능하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "ComK 폴리펩티드"는, 재조합에서 DNA-결합과 흡수에 관여하는 후기 유능성 유전자(late competence gene)의 발현 활성화와 관련하여, 유능성 발생 이전에 최종 자동-조절 제어 스위치로서 작용하는 전사 인자인 comK 유전자의 산물로서 정의된다(문헌[Liu and Zuber, 1998, Hamoen et al., 1998]). 예시적인 ComK 핵산은 서열번호 92에 제시되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합"은 이종성 핵산 서열의 도입에 의해 변형되었거나, 그렇게 변형된 세포로부터 세포가 유래되는, 세포 또는 벡터에 대한 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연(비재조합) 형태 내에서는 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 의도적인 인간의 개입으로 인해 달리 비정상적으로 발현되었거나, 덜 발현되었거나, 전혀 발현되지 않은 천연 유전자를 발현한다. "재조합" 또는 "재조합된" 핵산을 생성하는 것은 일반적으로 2개 이상의 핵산 단편을 조립하는 것이며, 조립을 통해 키메라 유전자가 생성된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "플랭킹 서열"은 논의 중인 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 있는 임의의 서열을 지칭한다(예를 들어, 유전자 A-B-C의 경우, 유전자 B는 A 및 C 유전자 서열에 의해 플랭킹됨). 특정 구현예에서, 유입 서열은 각 측의 상동성 박스에 의해 플랭킹된다. 다른 구현예에서, 유입 서열 및 상동성 박스는 각 측의 스터퍼 서열에 의해 플랭킹되는 단위를 포함한다. 일부 구현예에서, 플랭킹 서열은 일 측(3' 또는 5')에만 존재하지만, 바람직한 구현예에서는, 플랭킹되는 서열의 각 측에 존재한다. 각각의 상동성 박스의 서열은 바실러스 염색체 내의 서열에 대해 상동성이다. 이러한 서열은 새로운 구성체가 바실러스 염색체에서 어느 위치에 통합되는지를 지시하고, 바실러스 염색체의 어느 부분이 유입 서열에 의해 대체되는지를 지시한다. 다른 구현예에서, 선택 마커의 5' 및 3' 말단은 비활성화 염색체 절편의 섹션을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 구현예에서, 플랭킹 서열은 일 측(3' 또는 5')에만 존재하는 반면, 다른 구현예에서는, 플랭킹되는 서열의 각 측에 존재한다.
II. 향상된 단백질 생산 표현형을 포함하는 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포
하기 실시예 섹션에 일반적으로 기술된 바와 같이, 본 출원인은 일련의 숙주 변형을 구성하여 모체 B. 리체니포르미스 균주에 도입하였다. 보다 구체적으로, 하기 실시예에 제시된 바와 같이(예를 들어, 표 18 참조), 본 실시예에 사용된 모체 B. 리체니포르미스 균주는 serA1 유전자(서열번호 30) 및 lysA 유전자(서열번호 87)의 결실을 포함하고, BF140(ΔserA_ΔlysA)로 명명되었다. 본 출원인은 후속적으로 (1) 천연 prsA 단백질을 암호화하는 야생형 B. 리체니포르미스 prsA 유전자의 제2 카피의 도입(BF561로 명명; 제2 카피 prsA), (2) B. 리체니포르미스 dltA 유전자의 결실(BF598로 명명; ΔdltA_제2 카피 prsA), (3) B. 리체니포르미스 rghR2 유전자의 결실(BF602로 명명; ΔrghR2_제2 카피 prsA), 및 (4) B. 리체니포르미스 rghR2 유전자 및 dltA 유전자의 조합된 결실(BF613로 명명; ΔrghR2_ΔdltA_제2 카피 prsA)을 비롯한 특정 유전자 변형을 모체 B. 리체니포르미스 균주(BF140)에 도입하였다.
상기 변형된 균주의 구성 후, 일련의 α-아밀라제 발현 카세트를 변형된 B. 리체니포르미스 균주(BF561, BF598, BF602, 및 BF613) 및 모체 B. 리체니포르미스 균주(BF140)에 도입하였다. 보다 구체적으로, 하기 실시예 4에 제시된 바와 같이, 5개의 상이한 α-아밀라제 발현 카세트(즉, "아밀라제 1", "아밀라제 2", "아밀라제 3", "아밀라제 4", 및 "아밀라제 5")의 2개의 카피를 B. 리체니포르미스 균주에 도입하였다.
하기 실시예 5에서 추가로 설명되는 바와 같이, 아밀라제 1~5에 대한 발현 카세트의 2개의 카피를 포함하는 모체(BF140) 및 변형된(BF561, BF598, BF602, 및 BF613) B. 리체니포르미스 균주를 아밀라제의 생성에 대해 분석하였다(예를 들어, 표 19 참조). 예를 들어, 다양한 α-아밀라제 그룹에서 시험된 5가지 아밀라제 모두는 변형되지 않은 모체 숙주 BF140과 비교하여, 결실된 dltA-2(ΔdltA-2) 대립유전자(서열번호 125), 결실된 rghR2(ΔrghR2) 대립유전자(서열번호 80), 및 천연 prsA 프로모터에 의해 제어되는 천연 prsA 유전자의 제2 카피(서열번호 124)의 삽입을 포함하는 BF613 변형 백그라운드(ΔrghR2_ ΔdltA_제2 카피 prsA)에서 α-아밀라제 생성의 개선을 보여준다. 아밀라제 2 및 아밀라제 3의 경우, 결실된 rghR2(ΔrghR2) 대립유전자(서열번호 80) 및 천연 prsA 프로모터에 의해 제어되는 천연 prsA 유전자의 제2 카피(서열번호 124)를 포함하는 BF602 변형 백그라운드(ΔrghR2_제2 카피 prsA)에서 α-아밀라제 생성의 개선은 BF613 변형 숙주에서 관찰되는 생산성 개선과 거의 같은 정도로 우수하다. 이러한 관찰은 일부 아밀라제의 경우 생산성 개선이 이러한 2개의 대립유전자(즉, ΔrghR2_제2 카피 prsA)의 존재만을 필요로 하며 ΔdltA-2 대립유전자의 존재가 이러한 개선에 해롭지 않음을 시사한다.
III. 분자 생물학
상기에 일반적으로 기재된 바와 같이, 본 발명의 특정 구현예는 모체 B. 리체니포르미스 세포로부터 유래된 변형된 바실러스 리체니포르미스(딸) 세포에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 특정 구현예는 증가된 단백질 생산 능력, 증가된 2차 대사산물 생산 능력 등을 갖는 변형된 바실러스(숙주) 세포(예를 들어, 단백질 생산 숙주 세포, 세포 공장)를 생산하고 구성하기 위한 변형된 바실러스(딸) 세포 및 이의 방법에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 B. 리체니포르미스 세포는 천연 prsA 단백질을 암호화하는 유전자 또는 ORF의 도입된 제2 카피를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 변형된 B. 리체니포르미스 세포는 결실된 dltA 유전자를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 B. 리체니포르미스 세포는 천연 prsA 단백질을 암호화하는 유전자 또는 ORF의 도입된 제2 카피 및 결실된 dltA 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 변형된 B. 리체니포르미스 세포는 결실된 rghR2 유전자를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 B. 리체니포르미스 세포는 천연 prsA 단백질을 암호화하는 유전자 또는 ORF의 도입된 제2 카피 및 결실된 rghR2 유전자를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 변형된 B. 리체니포르미스 세포는 결실된 dltA 유전자 및 결실된 rghR2 유전자를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 B. 리체니포르미스 세포는 천연 prsA 단백질을 암호화하는 유전자 또는 ORF의 도입된 제2 카피, 결실된 dltA 유전자, 및 결실된 rghR2 유전자를 포함한다.
따라서, 본 발명의 특정 구현예는 본 발명의 모체 바실러스 세포를 유전자 변형(변경)시켜 이의 변형된 바실러스 세포, 보다 구체적으로는 (변형되지 않은) 모체 B. 리체니포르미스 세포에 비해 증가된 양의 내인성 및/또는 이종성 관심 단백질을 생산하는 변형된 바실러스 세포를 생성하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 특정 구현예는 바실러스 세포를 유전자 변형시키는 방법에 관한 것이며, 변형은 (a) 유전자(또는 이의 ORF)에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 치환, 또는 제거, 또는 유전자 또는 이의 ORF의 전사 또는 번역에 필요한 조절 요소에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 치환, 또는 제거, (b) 유전자 파괴, (c) 유전자 전환, (d) 유전자 결실, (e) 유전자 하향조절, (f) 부위특이적 돌연변이유발, 및/또는 (g) 무작위 돌연변이유발을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 바실러스 세포는 상기 제시된 유전자의 발현을 당업계에 잘 알려진 방법(예를 들어, 삽입, 파괴, 대체, 또는 결실)을 사용하여 감소시키거나 제거함으로써 구성된다. 변형 또는 비활성화 대상인 유전자 부분은 예를 들어 암호화 영역이거나 암호화 영역의 발현에 필요한 조절 요소일 수 있다.
이러한 조절 또는 제어 서열의 예는 프로모터 서열 또는 이의 기능적 부분(즉, 핵산 서열의 발현에 영향을 미치기에 충분한 부분)일 수 있다. 변형을 위한 다른 제어 서열은 리더 서열, 프로-펩티드 서열, 신호 서열, 전사 종결자, 전사 활성자 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
다른 특정 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 본 발명의 상기 언급된 유전자 중 적어도 하나의 발현을 제거하거나 감소시키기 위한 유전자 결실에 의해 구성된다. 유전자 결실 기술은 유전자(들)를 부분적으로 또는 완전하게 제거하여, 이들의 발현이 제거되거나 비기능적(또는 활성이 감소된) 단백질 산물이 발현되도록 할 수 있다. 이러한 방법에서, 유전자(들)의 결실은 유전자를 플랭킹하는 5' 및 3' 영역을 인접하여 포함하도록 구성된 플라스미드를 사용하는 상동성 재조합에 의해 달성될 수 있다. 인접한 5' 및 3' 영역은 예를 들어 pE194와 같은 온도 감수성 플라스미드 상에서, 플라스미드가 세포에서 확립될 수 있게 하는 허용 온도에서 제2 선별 마커와 함께 바실러스 세포에 도입될 수 있다. 그런 다음, 플라스미드를 상동성 플랭킹 영역 중 하나에서 염색체에 통합시키는 세포를 선택하기 위해 허용되지 않는 온도로 세포를 이동시킨다. 플라스미드의 통합에 대한 선택은 제2 선별 마커에 대한 선택에 의해 수행된다. 통합 후, 선택 없이 여러 세대 동안 허용 온도로 세포를 이동시킴으로써 제2 상동성 플랭킹 영역에서의 재조합 이벤트가 자극된다. 세포를 플레이팅하여 단일 콜로니를 수득하고, 두 선별 마커의 손실에 대해 콜로니를 검사한다(예를 들어, 문헌[Perego, 1993] 참조). 따라서, 당업자는 전체 또는 부분 결실에 적합한 유전자의 암호화 서열 및/또는 유전자의 비암호화 서열의 뉴클레오티드 영역을 쉽게 확인할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 변형된 바실러스 세포는 유전자 또는 이의 전사 또는 번역에 필요한 조절 요소에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 치환, 또는 제거에 의해 구성된다. 예를 들어, 정지 코돈의 도입, 시작 코돈의 제거, 또는 오픈 리딩 프레임의 프레임 이동을 일으키도록 뉴클레오티드를 삽입하거나 제거할 수 있다. 이러한 변형은 당업계에 알려진 방법에 따라 부위 지정 돌연변이유발 또는 PCR 생성 돌연변이유발에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Botstein and Shortle, 1985; Lo et al., 1985; Higuchi et al., 1988; Shimada, 1996; Ho et al., 1989; Horton et al., 1989; 및 Sarkar and Sommer, 1990] 참조). 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 유전자는 완전 또는 부분 결실에 의해 비활성화된다.
다른 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 유전자 전환의 프로세스에 의해 구성된다(예를 들어, 문헌[Iglesias and Trautner, 1983] 참조). 예를 들어, 유전자 전환 방법에서, 유전자(들)에 상응하는 핵산 서열을 시험관내 돌연변이화하여 결함 있는 핵산 서열을 생성한 후, 이를 모체 바실러스 세포로 형질전환시켜 결함 있는 유전자를 생성한다. 상동성 재조합에 의해, 결함 있는 핵산 서열이 내인성 유전자를 대체한다. 결함 있는 유전자 또는 유전자 단편이 결함 있는 유전자를 함유하는 형질전환체의 선택에 사용될 수 있는 마커를 또한 암호화하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 결함 있는 유전자는 선별 마커와 함께 비복제 또는 온도 감수성 플라스미드 상에 도입될 수 있다. 플라스미드의 통합에 대한 선택은 플라스미드 복제를 허용하지 않는 조건하에 마커에 대한 선택에 의해 수행된다. 유전자 대체로 이어지는 제2 재조합 이벤트에 대한 선택은 선별 마커의 손실 및 돌연변이된 유전자의 획득에 대한 콜로니 검사에 의해 수행된다(문헌[Perego, 1993]). 대안적으로, 결함 있는 핵산 서열은 후술하는 바와 같이, 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 치환, 또는 결실을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 유전자의 핵산 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 사용하는 확립된 안티센스 기술에 의해 구성된다(문헌[Parish and Stoker, 1997]). 보다 구체적으로, 바실러스 세포에 의한 유전자의 발현은 세포에서 전사될 수 있고 세포에서 생성된 mRNA에 혼성화될 수 있는, 유전자의 핵산 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 도입함으로써 감소(하향조절)되거나 제거될 수 있다. 따라서, 상보적인 안티센스 뉴클레오티드 서열이 mRNA에 혼성화될 수 있는 조건하에서, 번역된 단백질의 양은 감소되거나 제거된다. 이러한 안티센스 방법은 RNA 간섭(RNAi), 소간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드 등을 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이들 모두는 당업자에게 잘 알려져 있다.
다른 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 CRISPR-Cas9 편집을 통해 생산/구성된다. 예를 들어, 관심 단백질을 암호화하는 유전자는, DNA 상의 표적 서열에 엔도뉴클레아제를 보충하는 가이드 RNA(예: Cas9) 및 Cpf1 또는 가이드 DNA(예: NgAgo)에 결합함으로써 표적 DNA를 찾아내는 핵산 가이드된 엔도뉴클레아제에 의해 편집 또는 파괴(또는 결실 또는 하향조절)될 수 있고, 엔도뉴클레아제는 DNA에서 단일가닥 또는 이중가닥 절단을 생성할 수 있다. 이러한 표적화된 DNA 절단은 DNA 복구를 위한 기질이 되며, 제공된 편집 주형과 재조합하여 유전자를 파괴하거나 결실시킬 수 있다. 예를 들어, 핵산 가이드된 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자(이 목적의 경우, S. 피오게네스로부터의 Cas9) 또는 Cas9 뉴클레아제를 암호화하는 코돈 최적화된 유전자는 바실러스 세포에서 활성이 있는 프로모터 및 바실러스 세포에서 활성이 있는 종결자에 작동가능하게 연결됨으로써, 바실러스 Cas9 발현 카세트를 생성한다. 마찬가지로, 관심 유전자에 대해 고유한 하나 이상의 표적 부위가 당업자에 의해 쉽게 확인된다. 예를 들어, 관심 유전자 내의 표적 부위로 지시된 gRNA를 암호화하는 DNA 구성체를 구성하기 위해, 가변 표적화 도메인(VT)은 프로토-스페이서 인접 모티프(PAM)의 5'인 표적 부위의 뉴클레오티드(TGG)를 포함할 것이며, 이 뉴클레오티드는 S. 피오게네스 Cas9에 대한 Cas9 엔도뉴클레아제 인식 도메인(CER)을 암호화하는 DNA에 융합된다. VT 도메인을 암호화하는 DNA와 CER 도메인을 암호화하는 DNA의 조합은 이에 따라 gRNA를 암호화하는 DNA를 생성한다. 따라서, gRNA를 암호화하는 DNA를 바실러스 세포에서 활성이 있는 프로모터 및 바실러스 세포에서 활성이 있는 종결자에 작동가능하게 연결함으로써 gRNA에 대한 바실러스 발현 카세트가 생성된다.
특정 구현예에서, 엔도뉴클레아제에 의해 유도된 DNA 절단은 유입 서열로 복구/대체된다. 예를 들어, 상기 Cas9 발현 카세트 및 gRNA 발현 카세트에 의해 생성된 DNA 절단을 정확하게 복구하기 위해, 세포의 DNA 복구 기구가 편집 주형을 이용할 수 있도록 뉴클레오티드 편집 주형이 제공된다. 예를 들어, 표적화된 유전자의 5’에 있는 약 500 bp가 표적화된 유전자의 3’에 있는 약 500 bp에 융합되어 편집 주형을 생성할 수 있고, 이 주형은 바실러스 숙주의 기구에 의해 사용되어 RGEN에 의해 생성된 DNA 절단을 복구한다.
Cas9 발현 카세트, gRNA 발현 카세트, 및 편집 주형은 다양한 방법(예를 들어, 원형질체 융합, 전기천공, 자연적 능력, 또는 유도된 능력)을 사용하여 사상 진균 세포에 공동으로 전달될 수 있다. 형질전환된 세포는 정방향 및 역방향 프라이머로 유전자좌를 증폭시켜 표적 유전자좌를 PCR 증폭함으로써 스크리닝된다. 이러한 프라이머는 야생형 유전자좌 또는 RGEN에 의해 편집된 변형된 유전자좌를 증폭시킬 수 있다. 이후 시퀀싱 프라이머를 사용하여 이들 단편을 시퀀싱하여, 편집된 콜로니를 식별한다.
또 다른 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 당업계에 잘 알려진 방법(화학적 돌연변이유발(예를 들어, 문헌[Hopwood, 1970] 참조) 및 전위(예를 들어, 문헌[Youngman et al., 1983] 참조)를 포함하나 이에 한정되지 않음)을 사용하여 무작위 또는 특이적 돌연변이유발에 의해 구성된다. 유전자의 변형은 모세포에 대한 돌연변이유발 및 유전자의 발현이 감소 또는 제거된 돌연변이 세포에 대한 스크리닝에 의해 수행될 수 있다. 특이적 또는 무작위적일 수 있는 돌연변이유발은 예를 들어 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발제의 사용, 적합한 올리고뉴클레오티드의 사용, 또는 DNA 서열에 대한 PCR 생성 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다. 또한, 돌연변이유발은 이들 돌연변이유발 방법의 임의의 조합을 사용하여 수행될 수 있다.
본 목적에 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이 유발제의 예는 자외선(UV) 조사, 하이드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), N-메틸-N'-니트로소구아니딘(NTG), O-메틸 하이드록실아민, 아질산, 에틸 메탄 설포네이트(EMS), 아황산수소나트륨, 포름산, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 이러한 제제가 사용되는 경우, 돌연변이 유발은 일반적으로, 돌연변이 대상 모세포를 적합한 조건에서 선택 돌연변이 유발제의 존재하에 인큐베이션하고, 유전자의 발현이 감소되거나 나타나지 않는 돌연변이 세포를 선택함으로써 수행된다.
다른 특정 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 내인성 유전자의 결실을 포함한다. 다른 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 내인성 유전자의 파괴를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 파괴 카세트는 마커 유전자를 포함한다.
다른 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 하향조절된 내인성 유전자를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 상기 제시된 하나 이상의 유전자의 하향조절은 유전자의 업스트림 또는 다운스트림 조절 요소의 결실 또는 파괴를 포함한다.
PCT 공개 WO2003/083125호는 E. 콜라이를 우회하는 PCR 융합을 사용한 바실러스 결실 균주 및 DNA 구성체의 생성과 같은 바실러스 세포의 변형 방법을 개시한다.
PCT 공개 WO2002/14490호는 (1) 통합 플라스미드(pComK)의 구성 및 형질전환, (2) 암호화 서열, 신호 서열, 및 프로펩티드 서열의 무작위 돌연변이유발, (3) 상동성 재조합, (4) 형질전환 DNA에 대한 비상동성 플랭크의 추가에 의한 형질전환 효율 증대, (5) 이중 교차(cross-over) 통합의 최적화, (6) 부위 지정 돌연변이유발, 및 (7) 마커가 없는(marker-less) 결실을 포함하는, 바실러스 세포의 변형 방법을 개시한다.
당업자는 폴리뉴클레오티드 서열을 박테리아 세포(예를 들어, E. 콜라이 및 바실러스 종)에 도입하기 위한 적합한 방법을 잘 알고 있다(예를 들어, 문헌[Ferrari et al., 1989; Saunders et al., 1984; Hoch et al., 1967; Mann et al., 1986; Holubova, 1985; Chang et al., 1979; Vorobjeva et al., 1980; Smith et al., 1986; Fisher et. al., 1981; 및 McDonald, 1984]). 실제로, 원형질체 형질전환과 응축(congression)을 포함하는 형질전환, 형질도입, 및 원형질체 융합과 같은 방법이 알려져 있으며 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 본 발명의 DNA 구성체를 숙주 세포에 도입하는 데 형질전환 방법이 특히 바람직하다.
일반적으로 사용되는 방법에 추가적으로, 일부 구현예에서, 숙주 세포는 직접 형질전환된다(즉, 숙주 세포에 도입되기 전에 DNA 구성체의 증폭 또는 다른 처리를 위해 중간 세포가 사용되지 않음). DNA 구성체를 숙주 세포에 도입하는 것은 DNA를 플라스미드 또는 벡터 내 삽입 없이 숙주 세포에 도입하기 위한, 당업계에 알려진 물리적 및 화학적 방법을 포함한다. 이러한 방법은 염화칼슘 침전, 전기천공, 네이키드 DNA, 리포솜 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가 구현예에서, DNA 구성체는 플라스미드 내 삽입 없이 플라스미드와 공동으로 형질전환된다. 다른 구현예에서, 변형된 바실러스 균주로부터 선별 마커가 당업계에 알려진 방법에 의해 결실되거나 실질적으로 절단된다(예를 들어, 문헌[Stahl et al., 1984 및 Palmeros et al., 2000]). 일부 구현예에서, 숙주 염색체로부터 벡터를 분해하면 고유 염색체 영역이 제거되면서 염색체에 플랭킹 영역을 남긴다.
바실러스 세포에서 유전자, 이의 오픈 리딩 프레임(ORF), 및/또는 이의 변이체 서열의 발현에 사용하기 위한 프로모터 및 프로모터 서열 영역은 일반적으로 당업자에게 알려져 있다. 본 발명의 프로모터 서열은 일반적으로 바실러스 세포(예를 들어, B. 리체니포르미스 세포, B. 서브틸리스 세포 등)에서 기능하도록 선택된다. 특정 예시적인 바실러스 프로모터 서열은 표 6에 제시되어 있다. 마찬가지로, 바실러스 세포에서 유전자 발현을 유도하는 데 유용한 프로모터는 B. 서브틸리스 알칼리성 프로테아제(aprE) 프로모터(Stahl et al., 1984), B. 서브틸리스의 α-아밀라제 프로모터(Yang et al., 1983), B. 아밀로리퀘파시엔스의 α-아밀라제 프로모터(Tarkinen et al., 1983), B. 서브틸리스로부터의 중성 프로테아제(nprE) 프로모터(Yang et al., 1984), 돌연변이 aprE 프로모터(PCT 공개 WO2001/51643호), 또는 B 리체니포르미스 또는 기타 관련 바실러스로부터의 임의의 다른 프로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 특정 구현예에서, 프로모터는 미국 특허 공개 2014/0329309호에 개시된 리보솜 단백질 프로모터 또는 리보솜 RNA 프로모터(예: rrnI 프로모터)이다. 바실러스 세포에서 다양한 활성(프로모터 강도)을 갖는 프로모터 라이브러리를 스크리닝하고 생성하는 방법은 PCT 공개 WO2003/089604호에 기재되어 있다.
IV. 관심 단백질의 생산을 위한 바실러스 세포의 배양
다른 구현예에서, 본 발명은 변형되지 않은 (모) 세포와 비교하여(즉, 이에 비해) 변형된 박테리아 세포의 단백질 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 관심 단백질(POI)의 생산 방법으로서, 변형된 박테리아 세포를 발효/배양하는 단계를 포함하고, 변형된 세포는 POI를 배양 배지 내로 분비하는, 방법에 관한 것이다. 당업계에 잘 알려진 발효 방법을 적용하여 본 발명의 변형된 바실러스 세포 및 변형되지 않은 바실러스 세포를 발효시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 회분식 또는 연속식 발효 조건하에 배양된다. 전형적인 회분식 발효는 배지의 조성이 발효 시작시 설정되어 발효 중에 변경되지 않는 폐쇄 시스템이다. 발효 시작시, 배지에 목적하는 유기체(들)를 접종한다. 이 방법에서는, 시스템에 어떤 구성요소도 첨가하지 않고 발효가 일어날 수 있다. 일반적으로, 회분식 발효는 탄소원의 추가와 관련하여 "회분식"으로 간주되며, pH 및 산소 농도와 같은 인자를 제어하려는 시도가 종종 이루어진다. 회분식 시스템의 대사산물 및 바이오매스의 조성은 발효가 중단되는 시점까지 지속적으로 변화한다. 일반적인 회분식 배양물 내에서, 세포는 정적 지체기를 거쳐 고성장 대수기로 진행하고, 최종적으로 성장 속도가 감소하거나 성장이 멈추는 정지기로 진행할 수 있다. 정지기의 세포는 처치되지 않으면 결국 사멸한다. 일반적으로, 대수기의 세포가 대부분의 제품 생산을 담당한다.
표준 회분식 시스템에 대한 적절한 변형은 "유가식 발효(fed-batch fermentation)" 시스템이다. 일반적인 회분식 시스템의 이러한 변형에서는, 발효가 진행됨에 따라 기질이 증분으로 추가된다. 유가식 시스템은 이화대사물 억제가 세포의 대사를 억제할 가능성이 있는 경우 및 배지에 제한된 양의 기질이 있는 것이 바람직한 경우에 유용하다. 유가식 시스템에서 실제 기질 농도는 측정이 어렵기 때문에, pH, 용존 산소량, 및 CO2와 같은 폐가스의 분압과 같은 측정가능한 인자의 변화에 기초하여 추정된다. 회분식 및 유가식 발효는 일반적이며 당업계에 알려져 있다.
연속식 발효는 규정 발효 배지가 생물 반응기에 연속적으로 첨가되고 동량의 조정된(conditioned) 배지가 프로세싱을 위해 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속식 발효는 일반적으로, 세포가 주로 대수기 성장 중인 배양물을 일정한 고밀도로 유지한다. 연속식 발효는 세포 성장 및/또는 생성물 농도에 영향을 미치는 하나 이상의 인자의 조절이 가능하다. 예를 들어, 일 구현예에서, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소가 고정 비율로 유지되고 다른 모든 파라미터는 조절될 수 있다. 다른 시스템에서, 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 반면, 성장에 영향을 미치는 여러 인자는 계속 변경될 수 있다. 연속식 시스템은 정상 상태 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 배지의 배출로 인한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도와 균형을 이루어야 한다. 연속식 발효 공정을 위한 영양소 및 성장 인자를 조절하는 방법뿐만 아니라, 생성물 형성 속도를 최대화하는 기술은 산업 미생물학 분야에 잘 알려져 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 형질전환된(변형된) 숙주 세포에 의해 생산된 POI는 원심분리 또는 여과에 의해 배지로부터 숙주 세포를 분리하는 것, 또는 필요한 경우 세포를 파괴하는 것, 및 세포 분획 및 잔사로부터 상청액을 제거하는 것을 포함하는 통상적인 절차에 의해 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 일반적으로, 청징 후, 상청액 또는 여과액의 단백질 성분은 염(예: 황산암모늄)에 의해 침천된다. 침전된 단백질은 이후 가용화되고 다양한 크로마토그래피 절차, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과에 의해 정제될 수 있다.
V. 변형된 (숙주) 세포에 의해 생산된 관심 단백질
본 발명의 관심 단백질(POI)은 임의의 내인성 또는 이종성 단백질일 수 있으며, 이는 이러한 POI의 변이체일 수 있다. 단백질은 하나 이상의 이황화 브리지를 함유할 수 있거나, 기능적 형태가 단량체 또는 다량체인 단백질이다. 즉, 단백질은 4차 구조를 가지며, 복수의 동일한(상동성) 또는 동일하지 않은(이종성) 서브유닛으로 구성되고, POI 또는 이의 변이체 POI는 바람직하게는 관심 특성을 갖는 것이다.
예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명의 변형된 바실러스 세포는 증가된 양의 내인성 및/또는 이종성 관심 단백질을 생산한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 세포는 내인성 POI, 이종성 POI, 또는 하나 이상의 이러한 POI의 조합을 발현한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 바실러스(딸) 세포는 모체 바실러스 세포에 비해 증가된 양의 내인성 POI를 생산한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 변형된 바실러스(딸) 세포는 모체 바실러스 세포에 비해 증가된 양의 이종성 POI를 생산한다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 바실러스(딸) 세포는 모체 바실러스(대조군) 세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하고, POI의 증가된 양은 적어도 약 0.01%의 증가, 적어도 약 0.10%의 증가, 적어도 약 0.50%의 증가, 적어도 약 1.0%의 증가, 적어도 약 2.0%의 증가, 적어도 약 3.0%의 증가, 적어도 약 4.0%의 증가, 적어도 약 5.0%의 증가, 또는 5.0% 초과의 증가이다. 특정 구현예에서, POI의 증가된 양은 효소 활성 분석 및/또는 이의 비생산성(Qp) 분석/정량화에 의해 결정된다. 마찬가지로, 당업자는 하나 이상의 관심 단백질의 발현 또는 생산의 검출, 분석, 측정 등을 위한 당업계에 알려진 다른 통상적인 방법 및 기술을 이용할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 바실러스 세포는 (변형되지 않은) 모체 바실러스 세포에 비해 증가된 POI 비생산성(Qp)을 나타낸다. 예를 들어, 비생산성(Qp)의 검출은 단백질 생산을 평가하는 데 적합한 방법이다. 비생산성(Qp)은 다음 식을 사용하여 결정될 수 있다:
"Qp = gP/gDCW
Figure pct00001
hr"
여기서, "gP"는 탱크에서 생산된 단백질의 그램이고, "gDCW"는 탱크 내 건조 세포 중량(DCW)의 그램이고, "hr"은 접종 시점으로부터의 발효 시간(h)으로서, 생산 시간과 성장 시간이 포함된다.
따라서, 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 바실러스 세포는 변형되지 않은 (모) 세포와 비교하여 적어도 약 0.1%, 적어도 약 1%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 또는 적어도 약 10% 이상의 비생산성(Qp) 증가를 포함한다.
특정 구현예에서, POI 또는 이의 변이체 POI는 아세틸 에스테라제, 아미노펩티다제, 아밀라제, 아라비나제, 아라비노푸라노시다제, 탄산무수화효소, 카복시펩티다제, 카탈라제, 셀룰라제, 키티나제, 키모신, 큐티나제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라제, 에스테라제, α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, α-글루카나제, 글루칸 라이사제, 엔도-β-글루카나제, 글루코아밀라제, 글루코스 옥시다제, α-글루코시다제, β-글루코시다제, 글루쿠로니다제, 글리코실 하이드롤라제, 헤미셀룰라제, 헥소스 옥시다제, 하이드롤라제, 인버타제, 이소머라제, 라카제, 리가제, 리파제, 리아제, 만노시다제, 옥시다제, 옥시도리덕타제, 펙테이트 리아제, 펙틴 아세틸 에스테라제, 펙틴 해중합효소, 펙틴 메틸 에스테라제, 펙틴분해 효소, 퍼하이드롤라제, 폴리올 옥시다제, 퍼옥시다제, 페놀옥시다제, 피타제, 폴리갈락투로나제, 프로테아제, 펩티다제, 람노-갈락투로나제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라제, 수송 단백질, 트랜스글루타미나제, 자일라나제, 헥소스 옥시다제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
따라서, 특정 구현예에서, POI 또는 이의 변이체 POI는 효소 위원회(EC) 번호 EC 1, EC 2, EC 3, EC 4, EC 5, 또는 EC 6으로부터 선택된 효소이다.
예를 들어, 특정 구현예에서, POI는 EC 1.10.3.2(예: 라카제), EC 1.10.3.3(예: L-아스코르브산 옥시다제), EC 1.1.1.1(예: 알코올 탈수소효소), EC 1.11.1.10(예: 클로라이드 퍼옥시다제), EC 1.11.1.17(예: 퍼옥시다제), EC 1.1.1.27(예: L-락테이트 탈수소효소), EC 1.1.1.47(예: 글루코스 1-탈수소효소), EC 1.1.3.X(예: 글루코스 옥시다제), EC 1.1.3.10(예: 피라노스 옥시다제), EC 1.13.11.X(예: 이산소화효소), EC 1.13.11.12(예: 리네올레이트 13S-리폭시게나제), EC 1.1.3.13(예: 알코올 옥시다제), EC 1.14.14.1(예: 일산소화효소), EC 1.14.18.1(예: 모노페놀 일산소화효소) EC 1.15.1.1(예: 수퍼옥사이드 디스무타제), EC 1.1.5.9 (이전 명칭 EC 1.1.99.10, 예: 글루코스 탈수소효소), EC 1.1.99.18(예: 셀로비오스 탈수소효소), EC 1.1.99.29(예: 피라노스 탈수소효소), EC 1.2.1.X(예: 지방산 환원효소), EC 1.2.1.10(예: 아세트알데히드 탈수소효소), EC 1.5.3.X(예: 프룩토실 아민 환원효소), EC 1.8.1.X(예: 디설파이드 환원효소), 및 EC 1.8.3.2(예: 티올 옥시다제)로부터 선택된 EC 1(옥시도리덕타제) 효소를 포함하는(이에 한정되지 않음) 옥시도리덕타제 효소이다.
특정 구현예에서, POI는 EC 2.3.2.13(예: 트랜스글루타미나제), EC 2.4.1.X(예: 헥소실트랜스퍼라제), EC 2.4.1.40(예: 알터나수크라제), EC 2.4.1.18(예: 1,4 알파-글루칸 분지화 효소), EC 2.4.1.19(예: 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라제), EC 2.4.1.2(예: 덱스트린 덱스트라나제), EC 2.4.1.20(예: 셀로비오스 포스포릴라제), EC 2.4.1.25(예: 4-알파-글루카노트랜스퍼라제), EC 2.4.1.333(예: 1,2-베타-올리고글루칸 포스포 트랜스퍼라제), EC 2.4.1.4(예: 아밀로수크라제), EC 2.4.1.5(예: 덱스트란수크라제), EC 2.4.1.69(예: 갈락토시드 2-알파-L-푸코실 트랜스퍼라제), EC 2.4.1.9(예: 이눌로수크라제), EC 2.7.1.17(예: 자일룰로키나제), EC 2.7.7.89 (이전 명칭 EC 3.1.4.15, 예: [글루타민 합성효소]-아데닐릴-L-티로신 포스포릴라제), EC 2.7.9.4(예: 알파 글루칸 키나제), 및 EC 2.7.9.5(예: 포스포글루칸 키나제)로부터 선택된 EC 2(트랜스퍼라제) 효소를 포함하는(이에 한정되지 않음) 트랜스퍼라제 효소이다.
다른 구현예에서, POI는 EC 3.1.X.X(예: 에스테라제), EC 3.1.1.1(예: 펙티나제), EC 3.1.1.14(예: 클로로필라제), EC 3.1.1.20(예: 탄나제), EC 3.1.1.23(예: 글리세롤-에스테르 아실하이드롤라제), EC 3.1.1.26(예: 갈락토리파제), EC 3.1.1.32(예: 포스포리파제 A1), EC 3.1.1.4(예: 포스포리파제 A2), EC 3.1.1.6(예: 아세틸에스테라제), EC 3.1.1.72(예: 아세틸자일란 에스테라제), EC 3.1.1.73(예: 페룰로일 에스테라제), EC 3.1.1.74(예: 큐티나제), EC 3.1.1.86(예: 람노갈락투로난 아세틸에스테라제), EC 3.1.1.87(예: 푸모신 B1 에스테라제), EC 3.1.26.5(예: 리보뉴클레아제 P), EC 3.1.3.X(예: 인산 모노에스테르 하이드롤라제), EC 3.1.30.1(예: 아스페르길루스 뉴클레아제 S1), EC 3.1.30.2(예: 세라티아 마르세센스 뉴클레아제), EC 3.1.3.1(예: 알칼리성 포스파타제), EC 3.1.3.2(예: 산 포스파타제), EC 3.1.3.8(예: 3-피타제), EC 3.1.4.1(예: 포스포디에스테라제 I), EC 3.1.4.11(예: 포스포이노시티드 포스포리파제 C), EC 3.1.4.3(예: 포스포리파제 C), EC 3.1.4.4(예: 포스포리파제 D), EC 3.1.6.1(예: 아릴수파타제), EC 3.1.8.2(예: 디이소프로필-플루오로포스파타제), EC 3.2.1.10(예: 올리고-1,6-글루코시다제), EC 3.2.1.101(예: 만난 엔도-1,6-알파-만노시다제), EC 3.2.1.11(예: 알파-1,6-글루칸-6-글루카노하이드롤라제), EC 3.2.1.131(예: 자일란 알파-1,2-글루쿠로노시다제), EC 3.2.1.132(예: 키토산 N-아세틸글루코사미노하이드롤라제), EC 3.2.1.139(예: 알파-글루쿠로니다제), EC 3.2.1.14(예: 키티나제), EC 3.2.1.151(예: 자일로글루칸-특이적 엔도-베타-1,4-글루카나제), EC 3.2.1.155(예: 자일로글루칸-특이적 엑소-베타-1,4-글루카나제), EC 3.2.1.164(예: 갈락탄 엔도-1,6-베타-갈락토시다제), EC 3.2.1.17(예: 리소자임), EC 3.2.1.171(예: 람노갈락투로난 하이드롤라제), EC 3.2.1.174(예: 람노갈락투로난 람노하이드롤라제), EC 3.2.1.2(예: 베타-아밀라제), EC 3.2.1.20(예: 알파-글루코시다제), EC 3.2.1.22(예: 알파-갈락토시다제), EC 3.2.1.25(예: 베타-만노시다제), EC 3.2.1.26(예: 베타-프룩토푸라노시다제), EC 3.2.1.37(예: 자일란 1,4-베타-자일로시다제), EC 3.2.1.39(예: 글루칸 엔도-1,3-베타-D-글루코시다제), EC 3.2.1.40(예: 알파-L-람노시다제), EC 3.2.1.51(예: 알파-L-푸코시다제), EC 3.2.1.52(예: 베타-N-아세틸헥소스아미니다제), EC 3.2.1.55(예: 알파-N-아라비노푸라노시다제), EC 3.2.1.58(예: 글루칸 1,3-베타-글루코시다제), EC 3.2.1.59(예: 글루칸 엔도-1,3-알파-글루코시다제), EC 3.2.1.67(예: 갈락투란 1,4-알파-갈락투로니다제), EC 3.2.1.68(예: 이소아밀라제), EC 3.2.1.7(예: 1-베타-D-프룩탄 프룩타노하이드롤라제), EC 3.2.1.74(예: 글루칸 1,4-β-글루코시다제), EC 3.2.1.75(예: 글루칸 엔도-1,6-베타-글루코시다제), EC 3.2.1.77(예: 만난 1,2-(1,3)-알파-만노시다제), EC 3.2.1.80(예: 프룩탄 베타-프룩토시다제), EC 3.2.1.82(예: 엑소-폴리-알파-갈락투로노시다제), EC 3.2.1.83(예: 카파-카라기나제), EC 3.2.1.89(예: 아라비노갈락탄 엔도-1,4-베타-갈락토시다제), EC 3.2.1.91(예: 셀룰로스 1,4-베타-셀룰로비오시다제), EC 3.2.1.96(예: 만노실-당단백질 엔도-베타-N-아세틸글루코사미니다제), EC 3.2.1.99(예: 아라비난 엔도-1,5-알파-L-아라비나나제), EC 3.4.X.X(예: 펩티다제), EC 3.4.11.X(예: 아미노펩티다제), EC 3.4.11.1(예: 류실 아미노펩티다제), EC 3.4.11.18(예: 메티오닐 아미노펩티다제), EC 3.4.13.9(예: Xaa-Pro 디펩티다제), EC 3.4.14.5(예: 디펩티딜-펩티다제 IV), EC 3.4.16.X(예: 세린-타입 카복시펩티다제), EC 3.4.16.5(예: 카복시펩티다제 C), EC 3.4.19.3(예: 피로글루타밀-펩티다제 I), EC 3.4.21.X(예: 세린 엔도펩티다제), EC 3.4.21.1(예: 키모트립신), EC 3.4.21.19(예: 글루타밀 엔도펩티다제), EC 3.4.21.26(예: 프로릴 올리고펩티다제), EC 3.4.21.4(예: 트립신), EC 3.4.21.5(예: 트롬빈), EC 3.4.21.63(예: 오리진), EC 3.4.21.65(예: 써모마이콜린), EC 3.4.21.80(예: 스트렙토그리신 A), EC 3.4.22.X(예: 시스테인 엔도펩티다제), EC 3.4.22.14(예: 악티니다인), EC 3.4.22.2(예: 파파인), EC 3.4.22.3(예: 피카인), EC 3.4.22.32(예: 줄기 브로멜라인), EC 3.4.22.33(예: 과일 브로멜라인), EC 3.4.22.6(예: 키모파파인), EC 3.4.23.1(예: 펩신 A), EC 3.4.23.2(예: 펩신 B), EC 3.4.23.22(예: 엔도티아펩신), EC 3.4.23.23(예: 무코펩신), EC 3.4.23.3(예: 가스트릭신), EC 3.4.24.X(예: 메탈로엔도펩티다제), EC 3.4.24.39(예: 듀테로리신), EC 3.4.24.40(예: 세랄리신), EC 3.5.1.1(예: 아스파라기나제), EC 3.5.1.11(예: 페니실린 아미다제), EC 3.5.1.14(예: N-아실-알리파트-L아미노산 아미도하이드롤라제), EC 3.5.1.2(예: L-글루타민 아미도하이드롤라제), EC 3.5.1.28(예: N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제), EC 3.5.1.4(예: 아미다제), EC 3.5.1.44(예: 단백질-L-글루타민 아미도하이드롤라제), EC 3.5.1.5(예: 우레아제), EC 3.5.1.52(예: 펩티드-N(4)-(N-아세틸-베타-글루코사미닐)아스파라긴 아미다제), EC 3.5.1.81(예: N-아실-D-아미노산 데아실라제), EC 3.5.4.6(예: AMP 데아미나제), 및 EC 3.5.5.1(예: 니트릴라제)로부터 선택되는 EC 3(하이드롤라제) 효소를 포함하는(이에 한정되지 않음) 하이드롤라제 효소이다.
다른 구현예에서, POI는 EC 4.1.2.10(예: 만델로니트릴 리아제), EC 4.1.3.3(예: N-아세틸뉴라미네이트 리아제), EC 4.2.1.1(예: 탄산탈수효소), EC 4.2.2.-(예: 람노갈락투로난 리아제), EC 4.2.2.10(예: 펙틴 리아제), EC 4.2.2.22(예: 펙테이트 트리사카라이드-리아제), EC 4.2.2.23(예: 람노갈락투로난 엔도리아제), 및 EC 4.2.2.3(예: 만누로네이트-특이적 알기네이트 리아제)로부터 선택된 EC 4(리아제) 효소를 포함하는(이에 한정되지 않음) 리아제 효소이다.
다른 특정 구현예에서, POI는 EC 5.1.3.3(예: 알도스 1-에피머라제), EC 5.1.3.30(예: D-사이코스 3-에피머라제), EC 5.4.99.11(예: 이소말툴로스 신타제), 및 EC 5.4.99.15(예: (1→4)-α-D-글루칸 1-α-D-글로코실무타제)로부터 선택된 EC 5(이소머라제) 효소를 포함하는(이에 한정되지 않음) 이소머라제 효소이다.
또 다른 구현예에서, POI는 EC 6.2.1.12(예: 4-쿠마레이트:코엔자임 A 리가제) 및 EC 6.3.2.28(예: L-아미노산 알파-리가제)로부터 선택된 EC 6(리가제) 효소를 포함하는(이에 한정되지 않음) 리가제 효소이다.
따라서, 특정 구현예에서, 산업용 프로테아제 생산 바실러스 숙주 세포는 특히 바람직한 발현 숙주를 제공한다. 마찬가지로, 다른 특정 구현예에서, 산업용 아밀라제 생산 바실러스 숙주 세포는 특히 바람직한 발현 숙주를 제공한다.
예를 들어, 일반적으로 바실러스 종에 의해 분비되는 2가지 일반적인 유형의 프로테아제, 즉 중성(또는 "메탈로프로테아제") 및 알칼리성(또는 "세린") 프로테아제가 있다. 예를 들어, 바실러스 서브틸리신 단백질(효소)은 본 발명에 사용하기 위한 예시적인 세린 프로테아제이다. 서브틸리신 168, 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 칼스버그, 서브틸리신 DY, 서브틸리신 147, 및 서브틸리신 309와 같은 매우 다양한 바실러스 서브틸리신이 확인되었고 시퀀싱되었다(예를 들어, WO 1989/06279 및 문헌[Stahl et al., 1984]). 본 발명의 일부 구현예에서, 변형된 바실러스 세포는 돌연변이(즉, 변이체) 프로테아제를 생산한다. PCT 공개 번호 WO1999/20770; WO1999/20726; WO1999/20769; WO1989/06279; US RE34,606; US Patent Nos. 4,914,031; 4,980,288; 5,208,158; 5,310,675; 5,336,611; 5,399,283; 5,441,882; 5,482,849; 5,631,217; 5,665,587; 5,700,676; 5,741 ,694; 5,858,757; 5,880,080; 6,197,567; 및 6,218,165와 같은 많은 참고문헌에서 변이체 프로테아제의 예를 제공한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 바실러스 세포는 프로테아제를 암호화하는 발현 구성체를 포함한다.
다른 특정 구현예에서, 본 발명의 변형된 바실러스 세포는 아밀라제를 암호화하는 발현 구성체를 포함한다. 매우 다양한 아밀라제 효소 및 이의 변이체가 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO2006/037484 및 WO 2006/037483에는 용매 안정성이 개선된 변이체 α-아밀라제가 기재되어 있고, 공개 번호 WO1994/18314에는 산화 안정성 α-아밀라제 변이체가 개시되어 있고, 공개 번호 WO1999/19467, WO2000/29560, 및 WO2000/60059에는 터마밀 유사 α-아밀라제 변이체가 개시되어 있고, 공개 번호 WO2008/112459에는 바실러스 종 707번으로부터 유래된 α-아밀라제 변이체가 개시되어 있고, 공개 번호 WO1999/43794에는 말토겐 α-아밀라제 변이체가 개시되어 있고, 공개 번호 WO1990/11352에는 초내열성 α-아밀라제 변이체가 개시되어 있고, 공개 번호 WO2006/089107에는 과립 전분 가수분해 활성을 갖는 α-아밀라제 변이체가 개시되어 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 변형된 세포에서 발현되고 생산된 POI 또는 변이체 POI는 펩티드, 펩티드 호르몬, 성장 인자, 응고 인자, 케모카인, 사이토카인, 림포카인, 항체, 수용체, 부착 분자, 미생물 항원(예를 들어, HBV 표면 항원, HPV E7 등), 이들의 변이체, 이들의 단편 등이다. 다른 유형의 관심 단백질(또는 이의 변이체)은 식품 또는 작물에 영양가를 제공할 수 있는 것일 수 있다. 비제한적인 예는 항영양 인자의 형성을 억제할 수 있는 식물성 단백질, 및 더 바람직한 아미노산 조성(예를 들어, 비형질전환 식물보다 높은 라이신 함량)을 갖는 식물성 단백질을 포함한다.
세포내 및 세포외 발현 단백질의 활성을 검출하고 측정하기 위한 다양한 분석법이 당업자에 알려져 있다. 특히, 프로테아제의 경우, Folin 방법을 사용하여 280 nm에서의 흡광도 또는 비색법으로 측정되는 카제인 또는 헤모글로빈으로부터 산-가용성 펩티드의 방출에 기초한 분석법이 있다(예를 들어, 문헌[Bergmeyer et al., 1984]). 다른 분석법은 발색 기질의 가용화를 포함한다(예를 들어, 문헌[Ward, 1983] 참조). 다른 예시적인 분석법은 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-파라-니트로아닐리드 분석법(SAAPFpNA) 및 2,4,6-트리니트로벤젠 설포네이트 나트륨 염 분석법(TNBS 분석법)을 포함한다. 당업자에게 알려진 많은 추가 참고문헌은 적합한 방법을 제공한다(예를 들어, 문헌[Wells et al., 1983; Christianson et al., 1994; 및 Hsia et al., 1999] 참조).
국제 PCT 공개 WO2014/164777호에는 본원에 기재된 아밀라제 활성에 유용한 Ceralpha α-아밀라제 활성 분석법이 개시되어 있다.
숙주 세포 내 관심 단백질의 분비 수준의 결정 수단 및 발현된 단백질의 검출 수단은 단백질에 특이적인 다클론 또는 단클론 항체를 이용한 면역분석법의 사용을 포함한다. 예는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사면역분석법(RIA), 형광 면역분석법(FIA), 및 형광 활성화 세포 분류법(FACS)을 포함한다.
VI. 예시적 구현예
본 발명의 비제한적 구현예는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
1. 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포에서 증가된 양의 관심 단백질(POI)을 생산하는 방법으로서, (a) 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써, POI를 발현하는 모체 B. 리체니포르미스 세포를 변형시키는 단계, 및 (b) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건하에 발효시키는 단계를 포함하고, 변형된 세포는 동일한 조건하에 발효될 때 모세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하는, 방법.
2. 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포에서 증가된 양의 관심 단백질(POI)을 생산하는 방법으로서, (a) (i) POI를 암호화하는 발현 카세트 및 (ii) 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써, 모체 B. 리체니포르미스 세포를 변형시키는 단계, 및 (b) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건하에 발효시키는 단계를 포함하고, 변형된 세포는 동일한 조건하에 발효될 때 모세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하는, 방법.
3. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 100에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA 프로모터 서열을 포함하는, 방법.
4. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 101에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA ORF를 포함하는, 방법.
5. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 모세포는 천연 prsA 단백질을 암호화하는 내인성 prsA 유전자를 포함하는, 방법.
6. 구현예 5에 있어서, 내인성 prsA 유전자는 서열번호 155에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA 단백질을 암호화하는, 방법.
7. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 변형된 B. 리체니포르미스 세포의 게놈에 통합되는, 방법.
8. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 변형된 세포는 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
9. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 변형된 세포는 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
10. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, 변형된 세포는 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자 및 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
11. 구현예 1 또는 구현예 2에 있어서, POI는 효소인, 방법.
12. 구현예 11에 있어서, 효소는 프로테아제 또는 아밀라제인, 방법.
13. 모체 B. 리체니포르미스 세포로부터 유래된 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포로서, 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터 서열을 포함하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변형된 세포.
14. 천연 prsA 단백질을 암호화하는 내인성 prsA 유전자를 포함하는 모체 B. 리체니포르미스로부터 유래된 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포로서, 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터 서열을 포함하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변형된 세포.
15. 구현예 13 또는 구현예 14에 있어서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 100에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA 프로모터를 포함하는, 변형된 세포.
16. 구현예 13 또는 구현예 14에 있어서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 101에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA ORF를 포함하는, 변형된 세포.
17. 구현예 13 또는 구현예 14에 있어서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 155에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA 단백질을 암호화하는, 변형된 세포.
18. 구현예 13 또는 구현예 14에 있어서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 변형된 B. 리체니포르미스 세포의 게놈에 통합되는, 변형된 세포.
19. 구현예 13 또는 구현예 14에 있어서, 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자를 포함하는 변형된 세포.
20. 구현예 13 또는 구현예 14에 있어서, 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 포함하는 변형된 세포.
21. 구현예 13 또는 구현예 14에 있어서, 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자 및 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 포함하는 변형된 세포.
22. 구현예 13 또는 구현예 14에 있어서, 이종성 관심 단백질(POI)을 암호화하는 도입된 발현 카세트를 포함하는 변형된 세포.
23. 구현예 22에 있어서, POI는 효소인, 변형된 세포.
24. 구현예 13 또는 구현예 14에 있어서, 모세포는 내인성 POI를 발현하는, 변형된 세포.
25. 구현예 22 또는 구현예 24의 변형된 세포에 의해 생산된 관심 단백질.
26. 모체 B. 리체니포르미스 세포에 비해 증가된 양의 관심 단백질(POI)을 생산하는 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포로서, POI를 발현하는 모체 B. 리체니포르미스 세포로부터 유래되고; 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터 서열을 포함하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 포함하고; 동일한 조건하에 발효될 때 모균주에 비해 증가된 양의 POI를 생산하는 변형된 세포.
27. 구현예 26에 있어서, 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자를 추가로 포함하는 변형된 세포.
28. 모체 B. 리체니포르미스 세포에 비해 증가된 양의 관심 단백질(POI)을 생산하는 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포로서, POI를 발현하는 모체 B. 리체니포르미스 세포로부터 유래되고; 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF)에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터를 포함하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자를 포함하고; 동일한 조건하에 발효될 때 모균주에 비해 증가된 양의 POI를 생산하는 변형된 세포.
29. 구현예 28에 있어서, 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 추가로 포함하는 변형된 세포.
30. 구현예 26 또는 구현예 28에 있어서, 천연 prsA 프로모터는 서열번호 100에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는, 변형된 세포.
31. 구현예 26 또는 구현예 28에 있어서, 천연 prsA ORF는 서열번호 101에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는, 변형된 세포.
32. 구현예 26 또는 구현예 28에 있어서, 천연 prsA 단백질은 서열번호 155에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함하는, 변형된 세포.
33. 구현예 26 또는 구현예 28에 있어서, POI는 효소인, 변형된 세포.
34. 구현예 33에 있어서, 효소는 프로테아제 또는 아밀라제인, 변형된 세포.
35. 구현예 26 또는 구현예 28의 변형된 세포에 의해 생산된 관심 단백질.
실시예
본 발명의 특정 양태는 하기 실시예를 고려하여 추가로 이해될 수 있으며, 이는 제한적인 것으로 해석되어서는 안 된다. 재료 및 방법의 변형은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 1
RGHR2 경로 유전자를 표적화하는 CAS9 벡터의 구성
S. 피오게네스로부터의 Cas9 단백질(서열번호 1)을 N-말단 핵 국재화 서열(NLS; "APKKKRKV"; 서열번호 3), C-말단 NLS("KKKKLK"; 서열번호 4), deca-히스티딘 태그("HHHHHHHHHH"; 서열번호 5), B. 서브틸리스로부터의 aprE 프로모터(서열번호 6), 및 종결자 서열(서열번호 7)을 첨가하여 바실러스에 대해 코돈 최적화하고(서열번호 2), 아래 표 1에 기재된 정방향(서열번호 8) 및 역방향(서열번호 9) 프라이머 쌍을 이용해 제조사의 지침에 따라 Q5 DNA 중합효소(NEB)를 사용하여 증폭시켰다.
Figure pct00002
플라스미드 pKB320(서열번호 11)의 백본(서열번호 10)을 아래 표 2에 기재된 정방향(서열번호 12) 및 역방향(서열번호 13) 프라이머 쌍을 이용해 제조사의 지침에 따라 Q5 DNA 중합효소(NEB)를 사용하여 증폭시켰다.
Figure pct00003
제조사의 지침에 따라 Zymo clean and concentrate 5 컬럼을 사용하여 PCR 산물을 정제하였다. 이후, Q5 중합효소(NEB)로 2개의 단편을 등몰비로 혼합하며 연장된 중첩 확장 PCR(POE-PCR)을 사용하여 PCR 산물을 조립하였다. POE-PCR 반응을 다음과 같이 사이클링하였다: 30회 사이클에 대해 5초 동안 98℃, 10초 동안 64℃, 4분 15초 동안 72℃. 제조사의 지침에 따라 5 μl의 POE-PCR(DNA)을 Top10 E. coli (Invitrogen)로 형질전환시키고, 50 μg/ml의 카나마이신 설페이트를 함유하는 용원성(L) 배양액(Miller 레시피; 1%(w/v) 트립톤, 0.5% 효모 추출물(w/v), 1% NaCl(w/v)) 상에서 선택하고 1.5% 한천으로 고화시켰다. 콜로니를 37℃에서 18시간 동안 성장시켰다. 콜로니를 선별하고, 제조사의 지침에 따라 Qiaprep DNA miniprep 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하고, 55 μl의 ddH2O에 용리시켰다. 정확한 조립을 검증하기 위해 아래 표 3에 기재된 시퀀싱 프라이머를 사용하여 플라스미드 DNA의 Sanger 시퀀싱을 수행하였다.
Figure pct00004
정확히 조립된 플라스미드, pRF694(서열번호 25)를 사용하여 하기 기재된 바와 같은 표적 부위 1(TS1; 서열번호 28) 및 표적 부위 2(TS2; 서열번호 29)에서 B. 리체니포르미스 게놈을 편집하기 위한 플라스미드 pRF801(서열번호 26) 및 pRF806(서열번호 27)을 구성하였다.
B. 리체니포르미스의 serA1 오픈 리딩 프레임(서열번호 30)은 고유한 표적 부위, 표적 부위 1(TS1; 서열번호 28)을 역방향으로 포함한다. 표적 부위는 프로토스페이서 인접 모티프(서열번호 31)에 역방향으로 인접해 있다. 표적 부위는 가변 표적화 도메인을 암호화하는 DNA(서열번호 32)로 전환될 수 있다.
VT 도메인을 암호화하는 DNA 서열(서열번호 32)은 박테리아 세포의 RNA 중합효소에 의해 전사될 때 표적 부위 1을 표적화하는 기능적 gRNA(서열번호 34)를 생성하도록, Cas9 엔도뉴클레아제 인식 도메인을 암호화하는 DNA 서열(CER, 서열번호 33)에 작동가능하게 융합된다. gRNA를 암호화하는 DNA를, 바실러스 종 세포에서 작동가능한 프로모터(예를 들어, spac 프로모터; 서열번호 35) 및 바실러스 종 세포에서 작동가능한 종결자(예를 들어, 파지 람다의 t0 종결자; 서열번호 36)에, gRNA를 암호화하는 DNA(서열번호 33)의 업스트림(5')에 프로모터가 위치하고 gRNA를 암호화하는 DNA(서열번호 33)의 다운스트림(3')에 종결자가 위치하도록, 작동가능하게 연결하였다.
Cas9/gRNA 절단에 반응하여 serA1 유전자를 결실시키는 편집 주형을 B. 리체니포르미스 게놈 DNA(gDNA)의 2개의 상동성 아암의 증폭을 통해 생성하였다. 제1 단편은 serA1 오픈 리딩 프레임의 바로 업스트림에 있는 500 bp에 해당한다(서열번호 37). 제조사의 지침에 따른 Q5 DNA 중합효소 및 아래 표 4에 기재된 정방향(서열번호 38) 및 역방향(서열번호 39) 프라이머를 사용하여 이 단편을 증폭시켰다. 프라이머는 제2 단편의 5' 말단에 상동성인 18 bp를 제1 단편의 3' 말단에 도입하고 pRF694에 상동성인 20 bp를 제1 단편의 5' 말단에 도입한다.
Figure pct00005
제2 단편은 serA1 오픈 리딩 프레임의 3' 말단의 바로 다운스트림에 있는 500 bp에 해당한다(서열번호 40). 제조사의 지침에 따른 Q5 DNA 중합효소 및 아래 표 5에 기재된 정방향(서열번호 41) 및 역방향(서열번호 42) 프라이머를 사용하여 이 단편을 증폭시켰다. 프라이머는 제1 단편의 3' 말단에 상동성인 28 bp를 제2 단편의 5' 말단에 도입하고 pRF694에 상동성인 21 bp를 제2 단편의 3' 말단에 도입한다.
Figure pct00006
Cas9 발현 카세트(서열번호 2), serA1 오픈 리딩 프레임 내 표적 부위 1을 표적화하는 gRNA를 암호화하는 gRNA 발현 카세트(서열번호 43), 및 제1 상동성 아암(서열번호 37)과 제2 상동성 아암(서열번호 40)으로 구성된 편집 주형(서열번호 44)을 함유하는 E. 콜라이-B. 리체니포르미스 셔틀 플라스미드, pRF801(서열번호 26)을 생성하는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 표적 부위 1 gRNA을 암호화하는 DNA 발현 카세트(서열번호 43), 제1 상동성 아암(서열번호 37), 및 제2 상동성 아암(서열번호 40)을 pRF694(서열번호 25)로 조립하였다. 표 3에 기재된 올리고를 사용하여 Sanger 시퀀싱에 의해 플라스미드를 검증하였다.
B. 리체니포르미스의 rghR1 오픈 리딩 프레임(서열번호 45)은 역 가닥 상의 고유한 표적 부위, 표적 부위 2(TS2; 서열번호 29)를 함유한다. 표적 부위는 역 가당 상의 프로토스페이서 인접 모티프(서열번호 46)에 인접해 있다. 표적 부위(서열번호 29)를 암호화하는 DNA 서열은 박테리아 세포의 RNA 중합효소에 의해 전사될 때 표적 부위 2를 표적화하는 기능적 gRNA(서열번호 47)를 생성하도록, Cas9 엔도뉴클레아제 인식 도메인을 암호화하는 DNA 서열(CER, 서열번호 33)에 작동가능하게 융합된다. gRNA를 암호화하는 DNA를, 바실러스 종 세포에서 작동가능한 프로모터(예를 들어, B. 서브틸리스로부터의 spac 프로모터; 서열번호 35) 및 바실러스 종 세포에서 작동가능한 종결자(예를 들어, 파지 람다의 t0 종결자; 서열번호 36)에, gRNA를 암호화하는 DNA(서열번호 47)의 5'에 프로모터가 위치하고 gRNA를 암호화하는 DNA(서열번호 47)의 3'에 종결자가 위치하도록, 작동가능하게 연결하였다.
Cas9/gRNA 절단에 반응하여 rghR1 유전자를 변형시키는 편집 주형을 B. 리체니포르미스 게놈 DNA(gDNA)의 2개의 상동성 아암의 증폭을 통해 생성하였다. 제1 단편은 rghR1 오픈 리딩 프레임의 바로 업스트림에 있는 500 bp에 해당한다(서열번호 48). 제조사의 지침에 따른 Q5 DNA 중합효소 및 아래 표 6에 기재된 프라이머를 사용하여 이 단편을 증폭시켰다. 프라이머는 제2 단편의 5' 말단에 상동성인 23 bp를 제1 단편의 3' 말단에 도입하고 pRF694에 상동성인 20 bp를 제1 단편의 5' 말단에 도입한다.
Figure pct00007
제2 단편은 rghR1 오픈 리딩 프레임의 3' 말단의 바로 다운스트림에 있는 500 bp에 해당한다(서열번호 51). 제조사의 지침에 따른 Q5 DNA 중합효소 및 아래 표 7에 기재된 프라이머를 사용하여 이 단편을 증폭시켰다. 프라이머는 제1 단편의 3' 말단에 상동성인 20 bp를 제2 단편의 5' 말단에 도입하고 pRF694에 상동성인 21 bp를 제2 단편의 3' 말단에 도입한다.
Figure pct00008
Cas9 발현 카세트(서열번호 2), rghR1 오픈 리딩 프레임 내 표적 부위 2를 표적화하는 gRNA를 암호화하는 gRNA 발현 카세트(서열번호 54), 및 제1 상동성 아암(서열번호 48)과 제2 상동성 아암(서열번호 51)으로 구성된 편집 주형(서열번호 55)을 함유하는 E. 콜라이-B. 리체니포르미스 셔틀 플라스미드, pRF806(서열번호 27)을 생성하는 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 표적 부위 2 gRNA를 암호화하는 DNA 발현 카세트(서열번호 54), 제1 상동성 아암(서열번호 48), 및 제2 상동성 아암(서열번호 51)을 pRF694(서열번호 25)로 조립하였다. 표 3에 기재된 올리고를 사용하여 Sanger 서열로 플라스미드를 검증하였다.
실시예 2
CAS9 Y155H 변이체 및 관련 표적화 플라스미드의 구성
본 실시예에서는, pRF801(서열번호 26) 및 pRF806 플라스미드(서열번호 27)에서 S. 피오게네스 Cas9의 Y155H 변이체(서열번호 56)를 구성한다. pRF801 플라스미드(서열번호 26) 또는 pRF806 플라스미드(서열번호 27)에서 Y155H 변이체를 도입하기 위해, 주형 DNA로서 pRF801(서열번호 26) 또는 pRF806(서열번호 27)을 사용하고 제조사의 지침에 따른 Quikchange 돌연변이유발 키트 및 아래 표 8의 올리고를 사용하여 부위 지정 돌연변이유발을 수행하였다.
Figure pct00009
반응의 생성 산물인, pRF827(서열번호 59)은 Cas9 Y155H 변이체 발현 카세트(서열번호 60), serA1 오픈 리딩 프레임 내 표적 부위 1을 표적화하는 gRNA를 암호화하는 gRNA 발현 카세트(서열번호 43), 및 제1 상동성 아암(서열번호 37)과 제2 상동성 아암(서열번호 40)으로 구성된 편집 주형(서열번호 44)을 함유하거나, pRF856(서열번호 61)은 Cas9 Y155H 변이체 발현 카세트(서열번호 60), rghR1 오픈 리딩 프레임 내 표적 부위 2를 표적화하는 gRNA 발현 카세트(서열번호 54), 및 제1 상동성 아암(서열번호 48)과 제2 상동성 아암(서열번호 51)으로 구성된 편집 주형(서열번호 55)을 함유하였다. 정확한 조립을 검증하기 위해 표 3에 기재된 시퀀싱 프라이머를 사용하여 플라스미드 DNA의 Sanger 시퀀싱을 수행하였다.
플라스미드 pRF862의 구성
pRF827(서열번호 59)로부터 Y155H 치환을 함유하는 Cas9 오픈 리딩 프레임의 단편(서열번호 63)을 이동시켜 플라스미드 pRF862(서열번호 62)를 구성하고, 표 9에 기재된 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.
Figure pct00010
상기 pRF827 단편(서열번호 63)에 포함된 단편을 제외한 전체 플라스미드를 포함하도록 pRF694(서열번호 25)로부터 제2 단편(서열번호 66)을 증폭시켰다. 이 단편은 조립을 위해 pRF827 단편(서열번호 60)의 5' 및 3' 말단과 상동성을 공유했고, 표 10에 기재된 프라이머를 사용하여 증폭되었다.
Figure pct00011
제조사의 지침에 따라 NEBuilder를 사용하여 2개의 단편을 조립하고 E. 콜라이 적격 세포로 형질전환시켰다. 표 3에 기재된 바와 같이 Sanger 방법에 의해 플라스미드 서열을 검증하였다. 서열 검증된 단리물은 플라스미드 pRF862(서열번호 62)로 저장되었다.
rghR2 ORF(서열번호 70)를 표적화하고 3개의 인-프레임 정지 코돈을 삽입하는 플라스미드, pRF869(서열번호 69)를 2개의 부분을 사용하여 구성하였다. rghR2 ORF(서열번호 70)를 변형하기 위한 편집 주형(서열번호 72), 및 rghR2 ORF(서열번호 70)를 표적화하는 gRNA 발현 카세트(서열번호 73)를 함유하는 제1 부분(서열번호 71)을 IDT에 의해 합성하고, 표 11에 기재된 프라이머를 사용하여 조립을 위해 증폭시켰다.
Figure pct00012
표 12에 기재된 프라이머를 사용하여 pRF862를 증폭시켜 합성 단편을 pRF862(서열번호 62)에 삽입하였다.
Figure pct00013
제조사의 지침에 따라 NEBuilder를 사용하여 2개의 부분을 조립하고 E. 콜라이로 형질전환시켰다. 표 3에 기재된 바와 같이 Sanger 방법에 의해 플라스미드 서열을 검증하였다. 서열 검증된 단리물은 pRF869(서열번호 69)로 저장되었다.
몇몇 추가 Cas9 플라스미드를 실시예 1 및 2에서 전술한 바와 같이 조립하였다. 이들 플라스미드는 표적 부위 서열 및 편집 주형 효과와 함께 표 13에 기재되어 있다.
Figure pct00014
모든 플라스미드에 대해, RCA(롤링-서클 증폭)를 사용하여 플라스미드를 증폭시키고, TruPrime RCA 키트(Sygnis)를 사용하여 형질전환에 적합한 기질로 만들었다.
실시예 3
변형된 숙주 균주의 구성
본 실시예에서는, 일련의 숙주 변형을 모체 B. 리체니포르미스 균주에 도입하였다. 모체 B. 리체니포르미스 균주는 serA1(서열번호 30) 및 lysA 유전자(서열번호 87)의 결실을 포함하며 BF140으로 명명된다.
스펙티노마이신 마커(서열번호 89), XylR 억제인자를 암호화하는 DNA(서열번호 90), 및 B. 리체니포르미스 ComK 단백질을 암호화하는 DNA(서열번호 92)에 작동가능하게 연결된 B. 서브틸리스의 xylA 프로모터(서열번호 91)를 함유하는 pBl.comK 플라스미드(서열번호 88)를 포함하는 BF140의 버전(문헌[Liu and Zuber, 1998, Hamoen et al., 1998])을 B. 리체니포르미스의 prsA 유전자의 제2 카피(서열번호 93)의 통합을 위해 catH 유전자좌를 표적화하는 선형 PCR 산물로 형질전환시켰다. 구성체는 catH 프로모터(서열번호 95)에 작동가능하게 연결된 catH 유전자좌에 대한 업스트림 상동성 아암(서열번호 94), B. 서브틸리스의 spoVG 종결자(서열번호 99)에 작동가능하게 연결된 catH 종결자(서열번호 98)로 구성된 이중 종결자(서열번호 97)에 작동가능하게 연결된 CatH 단백질을 암호화하는 DNA(서열번호 96)를 함유한다.
이어서, 구성체는 catH 유전자좌에 대한 다운스트림 상동성 아암(서열번호 103)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스의 amyL 유전자의 종결자(서열번호 102)에 작동가능하게 연결된 prsA 암호화 서열(서열번호 101)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스의 prsA 프로모터(서열번호 100)를 함유한다. 요컨대, BF140/pBl.comK 적격 세포가 생성되었다. BF140/pBl.comK 균주를 100 ppm의 스펙티노마이신을 함유하는 37℃의 L 배양액에서 250 RPM으로 진탕하면서 밤새 성장시켰다. 다음 날 배양물을 100 ppm의 스펙티노마이신을 함유하는 신선한 L 배양액(OD600=0.7)으로 희석하였다. 이 새로운 배양물을 37℃에서 250 RPM으로 진탕하면서 1시간 동안 성장시켰다. D-자일로스를 0.1% w·v-1로 첨가하였다. 배양물을 37℃에서 250 RPM으로 진탕하면서 추가로 4시간 동안 성장시켰다. 1700 g로 7분 동안 세포를 채취하였다. 10%v·v-1 DMSO를 함유하는 사용된 배양 배지의 1/4 부피에 세포를 재현탁시켰다. 100 μl의 세포를 10 μl의 catH::[catH prsAp-prsA] 통합 단편(서열번호 94)과 혼합하였다. 세포/DNA 혼합물을 37℃에서 1400 RPM으로 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 혼합물을 10 ppm의 클로람페니콜을 함유하는 L 한천 플레이트에 플레이팅하였다. 접종된 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
10 ppm의 클로람페니콜을 함유하는 L 한천에서 형성된 콜로니를 콜로니 PCR을 사용해 스크리닝하여 표 14에 기재된 프라이머 및 표준 PCR 기술을 사용해 catH 유전자좌의 변형을 확인하였다.
Figure pct00015
이 PCR 산물, 2676 bp 단편(서열번호 106)을 Sanger 방법 및 표 15에 기재된 프라이머를 사용하여 시퀀싱하였다.
Figure pct00016
정확한 catH::[catH prsAp-prsA] 통합(서열번호 93)이 있는 단리물은 균주 BF547로 저장되었다.
pBl.comK 플라스미드(서열번호 88)를 함유하는 BF547의 버전을 전술한 바와 같이 적격으로 만들었다. 100 μl의 적격 세포를 5 μl의 pRF946(서열번호 81) RCA와 혼합하고, 37℃에서 1400 RPM으로 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플라스미드 형질전환을 위한 선택을 위해 혼합물을 20 ppm의 카나마이신을 함유하는 L 한천 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
20 ppm의 카나마이신을 함유하는 L 한천에서 형성된 콜로니를 콜로니 PCR에 대해 스크리닝하여, 표준 PCR 기술 및 표 14에 기재된 프라이머를 사용하여 catH::[prsAp-prsA] 카세트(서열번호 111)를 유지하면서, catH 프로모터의 3' 말단을 암호화하는 DNA 및 CatH 단백질을 암호화하는 DNA(서열번호 110)의 결실을 확인하였다.
2676 bp 길이의 PCR 산물(서열번호 106)을 생성한 catH::[catH prsAp-prsA] 카세트(서열번호 93)를 함유하는 모체 콜로니와 대조적으로, catH::[prsAp-prsA] 카세트(서열번호 111)를 함유하는 정확한 콜로니는 1990 bp의 PCR 산물(서열번호 112)을 생성하였다. 표준 겔 전기영동 기술을 사용하여 차이를 시각적으로 평가하였다. 정확한 크기의 PCR 산물이 있는 단리물을 상기 표 15의 프라이머 1915(서열번호 107) 및 프라이머 1916(서열번호 108)을 사용하여 시퀀싱하였다.
catH::[prsAp-prsA] 카세트(서열번호 111)를 함유한 서열 검증된 단리물은 클로람페니콜(10 ppm)에 표현형적으로 민감하였고 BF561로 저장되었다.
pBl.comK 플라스미드(서열번호 88)를 함유하는 BF561의 버전을 전술한 바와 같이 적격으로 만들었다. 100 μl의 적격 세포를 5 μl의 pZM221(서열번호 84) 또는 pRF879(서열번호 78) RCA와 혼합하고, 37℃에서 1400 RPM으로 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플라스미드로 형질전환된 세포를 선택하기 위해 혼합물을 20 ppm의 카나마이신을 함유하는 L 한천 플레이트에 플레이팅하였다.
20 ppm의 카나마이신을 함유하는 L 한천 플레이트에서 콜로니를 형성한 pZM221(서열번호 84)로 형질전환된 세포의 경우, 표준 PCR 기술 및 표 16의 프라이머를 사용하여 ΔdltA-2 대립유전자(서열번호 86), dltA 암호화 서열의 700 bp의 결실에 대해 스크리닝하였다.
Figure pct00017
ΔdltA-2 대립유전자를 갖는 콜로니는 표 16의 프라이머를 사용하여 2067 bp의 PCR 산물(서열번호 115)을 생성하는 반면, 온전한 dltA 유전자를 함유하는 모세포는 2767 bp의 PCR 산물(서열번호 116)을 생성한다. 이는 표준 전기영동 기술을 사용하여 구별할 수 있다. dltA의 700 bp 내부 결실(서열번호 86)을 함유하는 콜로니는 BF598로 저장되었다.
20 ppm의 카나마이신을 함유하는 L 한천 플레이트에서 콜로니를 형성한 pRF879(서열번호 78)로 형질전환된 세포의 경우, 표준 PCR 기술 및 아래 표 17의 프라이머를 사용하여, ΔrghR2 대립유전자(서열번호 80), 처음 9 bp 및 마지막 9 bp를 제외한 rghR2 암호화 서열의 결실에 대해 스크리닝하였다.
Figure pct00018
ΔrghR2 대립유전자(서열번호 80)를 갖는 콜로니는 표 17의 프라이머를 사용하여 1523 bp의 PCR 산물(서열번호 119)을 생성하는 반면, 온전한 rghR2 유전자를 함유하는 모세포는 1922 bp의 PCR 산물(서열번호 120)을 생성한다. 이들 두 산물 간의 차이는 표준 전기영동 기술을 사용하여 구별할 수 있다. rghR2 유전자의 결실(서열번호 84)을 함유하는 콜로니는 BF602로 저장되었다.
pBl.comK 플라스미드(서열번호 88)를 함유하는 BF598의 버전을 전술한 바와 같이 적격으로 만들었다. 100 μl의 적격 세포를 5 μl의 pRF879(서열번호 78) RCA와 혼합하고, 37℃에서 1400 RPM으로 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플라스미드로 형질전환된 세포를 선택하기 위해 혼합물을 20 ppm의 카나마이신을 함유하는 L 한천 플레이트에 플레이팅하였다.
20 ppm의 카나마이신을 함유하는 L 한천 플레이트에서 콜로니를 형성한 pRF879(서열번호 78)로 형질전환된 세포의 경우, 표준 PCR 기술 및 상기 표 17의 프라이머를 사용하여, ΔrghR2 대립유전자(서열번호 80), 처음 9 bp 및 마지막 9 bp를 제외한 rghR2 암호화 서열의 결실에 대해 스크리닝하였다.
ΔrghR2 대립유전자(서열번호 80)를 갖는 콜로니는 표 17의 프라이머를 사용하여 1523 bp의 PCR 산물(서열번호 119)을 생성하는 반면, 온전한 rghR2 유전자를 함유하는 모세포는 1922 bp의 PCR 산물(서열번호 120)을 생성한다. 이들 두 산물 간의 차이는 표준 전기영동 기술을 사용하여 구별할 수 있다. rghR2 유전자의 결실(서열번호 80)을 함유하는 콜로니는 BF613로 저장되었다. 표 18은 본 실시예에서 생성된 변형된 숙주 균주를 실시예의 3개의 변형된 유전자좌에 대한 서열번호와 함께 나타낸다.
Figure pct00019
실시예 4
변형된 숙주 균주에서 아밀라제 발현 균주의 구성
본 실시예에서는, 일련의 아밀라제 및 아밀라제 변이체 발현 카세트를 실시예 2, 상기 표 18에 기재된 균주 계통에 도입하였다.
아밀라제 1
아밀라제 1(서열번호 126)은 B. 리체니포르미스의 천연 알파 아밀라제로서, 일반적으로 AmyL이라고 한다. 아밀라제 1의 제1 카세트(서열번호 127)는 serA1 유전자좌(서열번호 44)에 통합되었고, B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자(서열번호 102)에 작동가능하게 연결된 아밀라제 1을 암호화하는 DNA(서열번호 131)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 서열을 암호화하는 DNA(서열번호 130)에 작동가능하게 연결된 변형된 B. 서브틸리스 aprE 5' UTR을 암호화하는 DNA(서열번호 129)에 작동가능하게 연결된 합성 p3 프로모터(서열번호 128) 및 serA1 ORF(서열번호 30)를 함유한다. lysA 유전자좌(서열번호 133)에 통합된 아밀라제 1의 제2 카세트(서열번호 132)는 B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자(서열번호 102)에 작동가능하게 연결된 아밀라제 1을 암호화하는 DNA(서열번호 131)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 서열을 암호화하는 DNA(서열번호 130)에 작동가능하게 연결된 변형된 B. 서브틸리스 aprE 5' UTR을 암호화하는 DNA(서열번호 129)에 작동가능하게 연결된 합성 p2 프로모터(서열번호 135) 및 LysA를 암호화하는 DNA(서열번호 134)를 함유한다.
아밀라제 2
아밀라제 2(서열번호 136)는 PCT 공개 WO2018/184004호(전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 변이체 바실러스 종 α-아밀라제이다. 아밀라제 2의 제1 카세트(서열번호 137)는 serA1 유전자좌(서열번호 44)에 통합되었고, B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자(서열번호 102)에 작동가능하게 연결된 아밀라제 2를 암호화하는 DNA(서열번호 140)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 서열을 암호화하는 DNA(서열번호 130)에 작동가능하게 연결된 B. 서브틸리스 aprE 5' UTR을 암호화하는 DNA(서열번호 139)에 작동가능하게 연결된 B. 서브틸리스 rrnI 프로모터(서열번호 138) 및 serA1 ORF(서열번호 30)를 함유한다. lysA 유전자좌(서열번호 133) 또는 amyL 유전자좌(서열번호 142)에 통합된 아밀라제 2의 제2 카세트(서열번호 141)는 B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자(서열번호 102)에 작동가능하게 연결된 아밀라제 2를 암호화하는 DNA(서열번호 140)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 서열을 암호화하는 DNA(서열번호 130)에 작동가능하게 연결된 B. 서브틸리스 aprE 5' UTR을 암호화하는 DNA(서열번호 139)에 작동가능하게 연결된 합성 p3 프로모터(서열번호 128) 및 LysA를 암호화하는 DNA(서열번호 134)를 함유한다.
아밀라제 3
아밀라제 3(서열번호 143)은 변이체 사이토파가 종α-아밀라제이다(예를 들어, PCT 공개 WO2014/164777호; WO2012/164800호; 및 WO2014/16483호 참조, 각각은 전체가 본원에 참조로 포함됨). 아밀라제 3의 제1 카세트(서열번호 144)는 serA1 유전자좌(서열번호 44)에 통합되었고, B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자(서열번호 102)에 작동가능하게 연결된 아밀라제 3을 암호화하는 DNA(서열번호 145)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 서열을 암호화하는 DNA(서열번호 130)에 작동가능하게 연결된 변형된 B. 서브틸리스 aprE 5' UTR을 암호화하는 DNA(서열번호 129)에 작동가능하게 연결된 합성 p3 프로모터(서열번호 128) 및 serA1 ORF(서열번호 30)를 함유한다. lysA 유전자좌(서열번호 133)에 통합된 아밀라제 3의 제2 카세트(서열번호 146)는 B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자(서열번호 102)에 작동가능하게 연결된 아밀라제 3을 암호화하는 DNA(서열번호 145)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 서열을 암호화하는 DNA(서열번호 130)에 작동가능하게 연결된 변형된 B. 서브틸리스 aprE 5' UTR을 암호화하는 DNA(서열번호 129)에 작동가능하게 연결된 합성 p2 프로모터(서열번호 135) 및 LysA를 암호화하는 DNA(서열번호 134)를 함유한다.
아밀라제 4
아밀라제 4(서열번호 147)는 변이체 사이토파가 종α-아밀라제이다(예를 들어, PCT 공개 WO2014/164777호; WO2012/164800호; 및 WO2014/16483호 참조, 각각은 전체가 본원에 참조로 포함됨). 아밀라제 4의 제1 카세트(서열번호 148)는 serA1 유전자좌(서열번호 44)에 통합되었고, B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자(서열번호 129)에 작동가능하게 연결된 아밀라제 4를 암호화하는 DNA(서열번호 149)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 서열을 암호화하는 DNA(서열번호 130)에 작동가능하게 연결된 B. 서브틸리스 aprE 5' UTR을 암호화하는 DNA(서열번호 139)에 작동가능하게 연결된 합성 p3 프로모터(서열번호 128) 및 serA1 ORF(서열번호 30)를 함유한다. lysA 유전자좌(서열번호 133)에 통합된 아밀라제 4의 제2 카세트(서열번호 150)는 B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자(서열번호 102)에 작동가능하게 연결된 아밀라제 4를 암호화하는 DNA(서열번호 149)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 서열을 암호화하는 DNA(서열번호 130)에 작동가능하게 연결된 B. 서브틸리스 aprE 5' UTR을 암호화하는 DNA(서열번호 139)에 작동가능하게 연결된 합성 p2 프로모터(서열번호 135) 및 LysA를 암호화하는 DNA(서열번호 134)를 함유한다.
아밀라제 5
아밀라제 5(서열번호 151)는 변이체 바실러스 종 707 α-아밀라제이다(PCT 공개 WO2008/153805호 및 미국 특허 공개 US2014/0057324호 참조). 아밀라제 5의 제1 카세트(서열번호 152)는 serA1 유전자좌(서열번호 44)에 통합되었고, B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자(서열번호 102)에 작동가능하게 연결된 아밀라제 5를 암호화하는 DNA(서열번호 153)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 서열을 암호화하는 DNA(서열번호 130)에 작동가능하게 연결된 B. 서브틸리스 aprE 5' UTR을 암호화하는 DNA(서열번호 139)에 작동가능하게 연결된 합성 p3 프로모터(서열번호 128) 및 serA1 ORF(서열번호 30)를 함유한다. lysA 유전자좌(서열번호 133)에 통합된 아밀라제 5의 제2 카세트(서열번호 154)는 B. 리체니포르미스 amyL 전사 종결자(서열번호 102)에 작동가능하게 연결된 아밀라제 5를 암호화하는 DNA(서열번호 153)에 작동가능하게 연결된 B. 리체니포르미스 AmyL 신호 서열을 암호화하는 DNA(서열번호 130)에 작동가능하게 연결된 B. 서브틸리스 aprE 5' UTR을 암호화하는 DNA(서열번호 139)에 작동가능하게 연결된 합성 p2 프로모터(서열번호 135) 및 LysA를 암호화하는 DNA(서열번호 134)를 함유한다.
PCT 공개 WO2019/040412호(전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법을 사용하여 모든 아밀라제 발현 카세트를 변형된 숙주 균주로 형질전환시켰다.
실시예 5
아밀라제 생성에 대한 변형된 숙주 백그라운드의 영향
본 실시예에서는, 아밀라제 1 내지 5(실시예 4)에 대한 발현 카세트의 2개 카피를 함유하는 변형된 숙주 균주(즉, 표 19; BF140, BF561, BF598, BF602, 및 BF613)를 표준 소규모 또는 실험실 규모 발효 조건을 사용하여 α-아밀라제 생성에 대해 분석하였다(PCT 공개 WO2018/156705호 및 WO2019/055261호에 기재된 바와 같고, 각각은 본원에 참조로 포함됨). Bradford 또는 Ceralpha 분석법을 사용하여 알파-아밀라제 생성을 정량화했다. 아밀라제 생성의 상대적 개선은 하기 표 19에 제시된 동일한 α-아밀라제 발현 카세트를 포함하는 변형되지 않은 숙주와 비교된다.
Figure pct00020
따라서, 다양한 α-아밀라제 그룹에서 시험된 5가지 아밀라제 모두는 변형되지 않은 숙주 BF140과 비교하여, 결실된 dltA-2(ΔdltA-2) 대립유전자(서열번호 125), 결실된 rghR2 (ΔrghR2) 대립유전자(서열번호 80), 및 천연 prsA 프로모터에 의해 제어되는 천연 prsA 유전자의 제2 카피(서열번호 124)의 삽입을 포함하는 BF613 변형 백그라운드에서 α-아밀라제 생성의 개선을 보여준다.
아밀라제 2 및 아밀라제 3의 경우, 결실된 rghR2(ΔrghR2) 대립유전자(서열번호 80) 및 천연 prsA 프로모터에 의해 제어되는 천연 prsA 유전자의 제2 카피(서열번호 124)를 포함하는 BF602 변형 백그라운드에서 α-아밀라제 생성의 개선은 BF613 변형 숙주에서 관찰되는 개선과 거의 같은 정도로 우수하며, 이는 일부 아밀라제의 경우 개선이 이러한 2개의 대립유전자의 존재만을 필요로 할 뿐만 아니라 ΔdltA-2 대립유전자의 존재가 이러한 개선에 해롭지 않음을 시사한다.
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Figure pct00021
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Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys 1010 1015 1020 Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser 1025 1030 1035 1040 Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu 1045 1050 1055 Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile 1060 1065 1070 Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser 1075 1080 1085 Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly 1090 1095 1100 Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1105 1110 1115 1120 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser 1125 1130 1135 Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly 1140 1145 1150 Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile 1155 1160 1165 Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala 1170 1175 1180 Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys 1185 1190 1195 1200 Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser 1205 1210 1215 Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr 1220 1225 1230 Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His 1250 1255 1260 Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val 1265 1270 1275 1280 Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys 1285 1290 1295 His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu 1300 1305 1310 Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp 1315 1320 1325 Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp 1330 1335 1340 Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1345 1350 1355 1360 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp 1365 <210> 2 <211> 4188 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 gtggccccaa aaaagaaacg caaggttatg gataaaaaat acagcattgg 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Claims (16)

  1. 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포에서 증가된 양의 관심 단백질(POI)을 생산하는 방법으로서,
    (a) 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF)에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써, POI를 발현하는 모체 B. 리체니포르미스 세포를 변형시키는 단계, 및
    (b) 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건하에 발효시키는 단계를 포함하고,
    변형된 세포는 동일한 조건하에 발효될 때 모세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하는, 방법.
  2. 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포에서 증가된 양의 관심 단백질(POI)을 생산하는 방법으로서,
    (a) (i) POI를 암호화하는 발현 카세트, 및 (ii) 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF)에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 모체 B. 리체니포르미스 세포에 도입하는 단계, 및
    (b) 단계 (a)의 변형된 세포를 POI의 생산에 적합한 조건하에 발효시키는 단계를 포함하고,
    변형된 세포는 동일한 조건하에 발효될 때 모세포에 비해 증가된 양의 POI를 생산하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 100에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA 프로모터 서열을 포함하는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 101에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA ORF 서열을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 모세포는 천연 prsA 단백질을 암호화하는 내인성 prsA 유전자를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 변형된 세포의 게놈에 통합되는, 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형된 세포는 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자 및/또는 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, POI는 효소인, 방법.
  9. 모체 B. 리체니포르미스 세포로부터 유래된 변형된 바실러스 리체니포르미스 세포로서, 천연 prsA 오픈 리딩 프레임(ORF)에 작동가능하게 연결된 천연 prsA 프로모터를 포함하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변형된 세포.
  10. 제9항에 있어서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 100에 대해 적어도 95%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA 프로모터를 포함하는, 변형된 세포.
  11. 제9항에 있어서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 101에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA ORF를 포함하는, 변형된 세포.
  12. 제9항에 있어서, 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 155에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 천연 prsA 단백질을 암호화하는, 변형된 세포.
  13. 제9항에 있어서, 서열번호 122에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 dltA 유전자 및/또는 서열번호 121 또는 서열번호 158에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 결실 또는 파괴된 rghR2 유전자를 포함하는 변형된 세포.
  14. 제9항에 있어서, 이종성 관심 단백질(POI)을 암호화하는 도입된 발현 구성체를 포함하는 변형된 세포.
  15. 제14항에 있어서, POI는 효소인, 변형된 세포.
  16. 제14항의 변형된 세포에 의해 생산된 관심 단백질.
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