PL200225B1 - Sposób rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu heterologicznego - Google Patents

Sposób rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu heterologicznego

Info

Publication number
PL200225B1
PL200225B1 PL353101A PL35310100A PL200225B1 PL 200225 B1 PL200225 B1 PL 200225B1 PL 353101 A PL353101 A PL 353101A PL 35310100 A PL35310100 A PL 35310100A PL 200225 B1 PL200225 B1 PL 200225B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
pro
polypeptide
fusion protein
leu
protein
Prior art date
Application number
PL353101A
Other languages
English (en)
Other versions
PL353101A1 (pl
Inventor
Gunter Stempfer
Jorg Windisch
Franz Knauseder
Original Assignee
Sandoz Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sandoz Ag filed Critical Sandoz Ag
Publication of PL353101A1 publication Critical patent/PL353101A1/pl
Publication of PL200225B1 publication Critical patent/PL200225B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • C12N9/506—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses derived from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

1. Sposób rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu heterologicznego, znamienny tym, ze obejmuje etapy, w których: (i) hoduje si e bakteryjn a komórk e gospodarza, która jest transformowana wektorem ekspresyj- nym, zawieraj acym cz asteczk e kwasu nukleinowego, koduj ac a bia lko fuzyjne, które zawiera polipep- tyd, maj acy autoproteolityczn a aktywno sc autoproteazy N pro pestiwirusa, i drugi polipeptyd, który jest polipeptydem heterologicznym, po laczonym z ko ncem C pierwszego polipeptydu, przy czym drugi polipeptyd odcina si e od bia lka fuzyjnego przez aktywno sc autoproteolityczn a pierwszego polipeptydu, oraz hodowl e prowadzi si e w warunkach, które powoduj a ekspresj e bia lka fuzyjnego i tworzenie si e odpowiednich cytoplazmatycznych cia lek inkluzyjnych, nast epnie (ii) wyodr ebnia si e cia lka inkluzyjne z komórki gospodarza, (iii) roztwarza si e wyodr ebnione cia lka inkluzyjne, (iv) rozcie ncza si e zawiesin e cia lek inkluzyjnych do roztworu reakcyjnego, w którym przeprowa- dzi si e odci ecie autoproteolityczne polipeptydu heterologicznego od bia lka fuzyjnego oraz (v) wyodr ebnia si e odci ety polipeptyd heterologiczny. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy sposobu rekombinacyjnego wytwarzania w komórce gospodarza bakteryjnego żądanego polipeptydu heterologicznego o ściśle określonym, jednorodnym końcu N, w którym otrzymane początkowe białko fuzyjne zawierające peptyd wykazujący aktywność autoproteolityczną autoproteazy Npro pestiwirusa oraz polipeptyd heterologiczny, uzyskuje się w komórce gospodarza w postaci cytoplazmatycznych ciał inkluzyjnych, nastę pnie wyodrę bnia się ciał a inkluzyjne i poddaje się je odpowiedniej obróbce, prowadzącej do wycięcia, w wyniku aktywności autoproteolitycznej autoproteazy Npro, z białka fuzyjnego żądanego polipeptydu heterologicznego.
Podczas wytwarzania w organizmach heterologicznych rekombinowanych białek, na przykład w wyniku ekspresji w komórkach bakterii ludzkich lub innych, eukariotycznych białek, często trudne jest uzyskanie ściśle określonego końca N, który wykazuje jednorodność możliwie najbliższą 100%. Dotyczy to w szczególności rekombinowanych białek stosowanych w farmacji, których sekwencja aminokwasowa powinna w większości przypadków być identyczna z sekwencją aminokwasową naturalnie występującą u ludzi/zwierząt.
W przypadku naturalnej ekspresji białek, na przykład u człowieka, wiele białek, które są stosowane w farmacji, jest transportowanych do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, a odcięcie sekwencji sygnałowej obecnej w białku prekursorowym umożliwiającym transport, prowadzi do uzyskania ściśle określonego końca N. Taki jednorodny koniec N nie zawsze jest łatwy do wytworzenia w laboratorium, na przykład w komórkach bakterii, z kilku powodów.
W celu otrzymywania na skalę przemysłową, wiele białek stosowanych w farmacji wytwarza się w cytoplazmie bakterii (na przykład w komórkach Escherichia coli), ponieważ możliwa jest ich akumulacja w odpowiedniej ilości, co więcej, często tworzą się nierozpuszczalne ciałka inkluzyjne (IB), które są bardzo pożądane przy obróbce i oczyszczaniu takiego białka. Dodatkowo, białko ulegające ekspresji w postaci IB jest chronione przed degradacją przez proteazy wewnątrzkomórkowe (R. Rudolph, w: Protein Engineering; Principles and Practices, red. Jeffrey L. Cleland i Charles S. Craik, John Wiley & Sons Inc. (1995), ISBN 0-471-10354-3).
Jednakże, wytwarzanie materiału w postaci IB wymaga ponownego zwinięcia in vitro białka uzyskanego w wyniku ekspresji. Proces ten może być w wielu przypadkach przeprowadzony sposobami znanymi w dziedzinie (R. Rudolph i wsp. (1996) w: Protein Function: A Practical Approach, red. Creighton, T.E., 1-39). Aby uzyskać zwijanie białek, białka z IB roztwarza się przez dodanie silnych środków denaturujących w warunkach redukujących, a następnie przywraca się białkom ich naturalną strukturę.
Tylko w rzadkich przypadkach wskazany jest eksport do peryplazmy bakterii, który uzyskuje się wykorzystując prokariotyczną lub eukariotyczną sekwencję sygnałową, gdyż na ogół możliwa jest akumulacja tylko bardzo niewielkich ilości produktu w peryplazmie ze względu na niską zdolność transportową bakteryjnego układu eksportującego.
Jednak środowisko cytoplazmy bakterii znacznie różni się od środowiska przestrzeni zewnątrzkomórkowej u eukariontów. Z jednej strony, w cytoplazmie bakteryjnej występują warunki redukujące, lecz z drugiej brak jest mechanizmów, prowadzących do wytworzenia dojrzałych białek, odcinania sekwencji literowych na końcu N. Synteza wszystkich białek cytoplazmatycznych rozpoczyna się od reszty metioniny, która jest kodowana przez kodon start (ATG = inicjacja translacji). Ta reszta metioninowa na końcu N ulega zachowaniu w wielu białkach, podczas gdy w innych jest odcinana przez aminopeptydazę metionionową (MAP) obecną w cytoplazmie i charakterystyczną dla gospodarza. Wydajność cięcia zależy od dwóch parametrów: 1. następnego aminokwasu i 2. położenia końca N w trójwymiarowej strukturze białka. Metionina na końcu N jest korzystnie usuwana, gdy kolejną resztą aminokwasową jest seryna, alanina, glicyna, metionina lub walina i gdy koniec N jest eksponowany tzn. nie jest „schowany” wewnątrz białka. Z drugiej strony, gdy kolejny aminokwas jest inny niż wymienione, w szczególności jest aminokwasem obdarzonym ładunkiem (aminokwasem takim jak kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, lizyna, arginina), lub jeśli koniec N jest położony wewnątrz białka, w wię kszoś ci przypadków nie zachodzi odcinanie reszty metioniny na N koń cu (Knippers, Rolf (1995) Molekulare Genetik, wydanie 6, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nowy Jork. ISBN 3-13-103916-7).
Nawet, jeśli aminokwas sprzyjający cięciu jest obecny w pozycji 2, cięcie rzadko jest całkowite. Zazwyczaj niemała część (1-50%) pozostaje nienaruszona przez MAP.
W począ tkach otrzymywania zrekombinowanych biał ek farmaceutycznych, w komórkach bakterii, procedura polegała po prostu na umieszczeniu kodonu start ATG, kodującego metioninę na początku otwartej ramki odczytu (ORF) dojrzałego białka (tzn. bez sekwencji sygnałowej lub innego
PL 200 225 B1 przedłużenia końca N). Białko ulegające ekspresji uzyskiwało wówczas sekwencję H2N-Met-docelowe białko. Tylko w kilku przypadkach było możliwe uzyskanie całkowitego odcięcia N-końcowej metioniny przez właściwą dla gospodarza MAP. Większość wytwarzanych w ten sposób białek albo jest niejednorodnych względem końca N (mieszanina formy Met i formy bez Met) albo wszystkie mają dodatkowy obcy aminokwas (Met) na końcu N (tylko forma Met).
Ta niejednorodność lub zmiana w naturalnej sekwencji jest jednak w wielu przypadkach nie do przyjęcia, ponieważ uzyskane produkty często wykazują odmienne właściwości immunologiczne (na przykład indukują tworzenie przeciwciał) i farmakologiczne (inny okres półtrwania, farmakokinetyka). Z tych powodów obecnie w większości przypadków konieczne jest otrzymanie produktu identycznego jak naturalny (jednorodny i bez obcych aminokwasów na końcu N). W przypadku ekspresji cytoplazmatycznej, rozwiązaniem w większości przypadków jest dodanie na końcu N docelowego białka, sekwencji umożliwiającej odcięcie (sekwencji liderowej) przez specyficzną endopeptydazę (na przykład czynnika Xa, enterokinazy, endopeptydaz KEX, proteazy IgA) lub aminopeptydazy (na przykład aminopeptydazy dipeptydylowej). Jednak konieczne jest wprowadzenie dodatkowego etapu, a zatem zwiększenia wydatków i materiałów potrzebnych do dalszej obróbki, tak zwanej obróbki posyntetycznej produktu. Dodatkowo, w obecności IB w wielu przypadkach obecność sekwencji liderowej stanowi przeszkodę lub nawet całkowite zapobiega zwijaniu się białka.
Istnieje więc potrzeba opracowania sposobu wytwarzania żądanego białka heterologicznego, które ulega ekspresji w komórkach bakterii w postaci ciałek inkluzyjnych, z których docelowe białko może być następnie uzyskane z jednorodnym, pożądanym końcem N. Taki sposób wytwarzania pożądanego białka z ciałek inkluzyjnych wykorzystujący wirusową autoproteazę Npro z pestiwirusów opracowano w niniejszym wynalazku.
Wirusy z rodzaju Pestivirus stanowią grupę patogenów, które powodują poważne straty ekonomiczne w hodowli świń i gryzoni na całym świecie. Jako patogen choroby zakaźnej, o której trzeba zawiadamiać, wirus klasycznego pomoru świń (CSFV) jest szczególnie ważny. Straty powodowane przez wirusa biegunki bydlęcej (BVDV) są także znaczne, szczególnie ze względu na występowanie regularnego zakażenia wewnątrzmacicznego płodów.
Pestiwirusy są małymi wirusami o genomie zamkniętym w otoczce, który ma bezpośrednią aktywność mRNA i ma wielkość 12,3 kilozasad i którego produkty genowe wirusa ulegają transkrypcji w cytoplazmie komórki gospodarza. Proces ten zachodzi w postaci pojedynczego polibiałka, które zawiera około 4000 aminokwasów i które jest rozkładane zarówno przez wirusowe, jak i komórkowe proteazy z utworzeniem 12 dojrzałych białek.
Dotychczas w pestiwirusach zidentyfikowano dwie kodowane przez wirusa proteazy, autoproteazę Npro i proteazę serynową N33. N-końcowa proteaza Npro znajduje się na końcu N polibiałka i ma masę cząsteczkową 23 kDa. Enzym ten katalizuje cięcie, które zachodzi między jego własnym końcem C (Cys168) a końcem N (Ser169) białka C nukleokapsydu (R. Stark i wsp., J. Virol. 67 (1993), 7088-7095). W dodatku opisano duplikacje genu Npro w cytopatogennych wirusach BVDV. Wirusy te zawierają drugą kopię Npro na końcu N, podobnie zduplikowanej proteazy NS3. Autoproteolityczne cięcie białka Npro-NS3 obserwowano także w tym przypadku (R. Stark i wsp., patrz powyżej).
Npro jest autoproteazą o długości 168 aa i Mr około 20000 Da (in vivo). Jest pierwszym białkiem w polibiał ku pestiwirusów (takich jak CSFV, BDV (wirus choroby granicznej) lub BVDV) i podlega odcięciu autoproteolitycznemu od kolejnego białka nukleokapsydu C (M. Wiskerchen i wsp., J. Virol. 65 (1991), 4508-4514; Stark i wsp., J. Virol. 67 (1993), 7088-7095). To cięcie zachodzi po ostatnim aminokwasie w sekwencji Npro, Cys168.
Niespodziewanie obecnie stwierdzono w rozwiązaniu według wynalazku, że autoproteolityczna aktywność autoproteazy Npro może być wykorzystana do odcięcia heterologicznego polipeptydu od białka fuzyjnego, które ulega ekspresji w postaci ciałek inkluzyjnych w bakteryjnym systemie ekspresyjnym i które zawiera autoproteazę Npro pestiwirusa i polipeptyd heterologiczny. Rozwiązanie według wynalazku obejmuje białko fuzyjne niecięte Npro, wyodrębnione z ciałek inkluzyjnych, roztworzone ciałka inkluzyjne i rozpuszczone i cięte białko w trakcie ponownego zwijania.
Przedmiotem wynalazku jest sposób rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu heterologicznego obejmujący etapy, w których:
(i) hoduje się bakteryjną komórkę gospodarza, która jest transformowana wektorem ekspresyjnym, zawierającym cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą białko fuzyjne, które zawiera polipeptyd, mający autoproteolityczną aktywność autoproteazy Npro pestiwirusa, i drugi polipeptyd, który jest polipeptydem heterologicznym, połączonym z końcem C pierwszego polipeptydu, przy czym drugi
PL 200 225 B1 polipeptyd odcina się od białka fuzyjnego przez aktywność autoproteolityczną pierwszego polipeptydu, oraz hodowlę prowadzi się w warunkach, które powodują ekspresję białka fuzyjnego i tworzenie się odpowiednich cytoplazmatycznych ciałek inkluzyjnych, następnie (ii) wyodrębnia się ciałka inkluzyjne z komórki gospodarza, (iii) roztwarza się wyodrębnione ciałka inkluzyjne, (iv) rozcieńcza się zawiesinę ciałek inkluzyjnych do roztworu reakcyjnego, w którym przeprowadzi się odcięcie autoproteolityczne polipeptydu heterologicznego od białka fuzyjnego oraz (v) wyodrębnia się odcięty polipeptyd heterologiczny.
Korzystnie pestiwirus wybiera się z grupy obejmującej CSFV, BDV i BVDV, korzystniej jako pestiwirus stosuje się CSFV (patrz również baza EMBL, numer dostępu X87939) (reszty aminokwasowi od 1 do 168, patrząc w kierunku od końca N do końca C) a pierwszy polipeptyd obejmuje następującą sekwencję aminokwasową:
(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDL
PRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYH
IYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168), lub sekwencję aminokwasową będącą pochodną powyższej sekwencji, przy zachowaniu aktywności autoproteolitycznej.
W sposobie wedł ug wynalazku stosuje się korzystnie pierwszy polipeptyd obejmują cy sekwencję aminokwasową od Glu22 do Cys168 autoproteazy Npro CSFV lub jej pochodnej o aktywności autoproteolitycznej, który zawiera Met na końcu N, a polipeptyd heterologiczny jest bezpośrednio połączony z aminokwasem Cys168 autoproteazy Npro z CSFV.
W innym korzystnym rozwiązaniu stosuje się pierwszy polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów od Pro17 do Cys168 autoproteazy Npro z CSFV lub jej pochodnej o aktywności proteolitycznej, który zawiera Met na końcu N, a polipeptyd heterologiczny jest bezpośrednio połączony z aminokwasem Cys168 autoproteazy Npro z CSFV.
Korzystnie, jako cząsteczkę kwasu nukleinowego stosuje się DNA, a jako wektor ekspresyjny stosuje się plazmid.
Polipeptyd mający autoproteolityczną aktywność autoproteazy Npro pestiwirusa jest w szczególności autoproteazą Npro pestiwirusa, lub jego pochodną, której aktywność autoproteolityczna została zachowana.
W opisie wynalazku okreś lenie „polipeptyd heterologiczny” oznacza polipeptyd, który nie jest naturalnie odcinany przez autoproteazę Npro pestiwirusa z naturalnie występującego białka fuzyjnego lub polibiałka. Przykładem polipeptydów heterologicznych są enzymy stosowane w przemyśle (enzymy przemysłowe) lub polipeptydy mające aktywność farmaceutyków, w szczególności farmaceutyków przeznaczonych dla ludzi.
Przykładem korzystnych polipeptydów o aktywności farmaceutyków przeznaczonych dla ludzi są cytokiny takie jak interleukiny, na przykład IL-6, interferony takie jak interferony leukocytów, na przykład interferon a2B, czynniki wzrostu, w szczególności hematopoetyczne czynniki wzrostu lub czynniki wzrostu biorące udział w gojeniu ran, takie jak G-CSF, erytropoetyna, lub IGF, hormony takie jak ludzki hormon wzrostu (hGH), przeciwciała lub szczepionki.
Polipeptyd wykazujący autoproteolityczną aktywność autoproteazy Npro może też być pochodną autoproteazy Npro pestiwirusa uzyskaną w wyniku mutagenezy, w szczególności przez podstawienie, delecję, addycję i/lub wstawienie aminokwasu, o ile wymagana aktywność autoproteolityczna, w szczególności zapewniająca uzyskanie pożądanego białka z homogennym N-końcem jest utrzymana. Sposoby wytwarzania takich pochodnych za pomocą mutagenezy znane są specjalistom. Możliwa jest optymalizacja aktywności autoproteazy Npro za pomocą takich mutacji, na przykład w stosunku do różnych białek heterologicznych, które mają zostać odcięte od białka fuzyjnego. Po wytworzeniu kwasu nukleinowego kodującego białko fuzyjne, które, oprócz żądanego białka heterologicznego, zawiera pochodną autoproteazy Npro, mającą jedną lub więcej mutacji w porównaniu do naturalnie występującej autoproteazy Npro, ustala się czy wymagana aktywność występuje, stosując określenie autoproteolitycznej aktywności w układzie ekspresyjnym.
Aktywność autoproteolityczna może być wykryta na przykład przez wstępne roztworzenie wyodrębnionych/oczyszczonych IB w roztworze 7 M guanidyny/HCl, a następnie rozcieńczenie w roztworze reakcyjnym w stosunku 1:100. Po inkubacji przez około 24 godziny bada się metodą SDS-PAGE czy
PL 200 225 B1 nastąpiło cięcie. Aby określić stosunek białka, które uległo cięciu do białka, które nie uległo cięciu przeprowadza się analizę metodą Western blotting. Ilość materiału, która uległa cięciu ustala się analizując densytometrycznie wybarwiony barwnikiem Coomassie żel SDS-PAGE.
Korzystny sposób według wynalazku obejmuje wektor ekspresyjny, zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą białko fuzyjne mający N-końcowy region, z którego jeden lub więcej aminokwasów usunięto lub podstawiono resztami aminokwasów o długości 2 do 21 reszt, jeśli powstała pochodna nadal wykazuje autoproteolityczną aktywność autoproteazy Npro w pożądanym stopniu. Zgodnie z wynalazkiem, pochodne autoproteazy Npro, które są korzystne obecne w białku fuzyjnym zawierają, na przykład, sekwencję aminokwasową autoproteazy Npro z CSFV bez aminokwasów 2 do 16 lub 2 do 21. Jest też moż liwa, w wyniku podstawienia lub dodania aminokwasów, wymiana lub wprowadzenie sekwencji aminokwasowej, na przykład w celu wprowadzenia sekwencji aminokwasowej, która ułatwia oczyszczanie.
Wektor ekspresyjny w sposobie według wynalazku korzystnie zawiera przynajmniej jedną sekwencję kontroli ekspresji. Sekwencje kontroli ekspresji są w szczególności promotorami (takimi jak lac, tac, T3, T7, trp, gac, vhb, lambda pL lub phoA), miejscami wiązania rybosomu (na przykład naturalne miejsca wiązania rybosomu, które należą do powyżej wymienionych promotorów, cro lub syntetyczne miejsca wiązania rybosomów) lub terminatorami transkrypcji (na przykład rrnB T1T2 lub bla). Powyżej wymieniona komórka gospodarza jest korzystnie komórką bakterii z rodzaju Escherichia, w szczególnoś ci E. coli. Jednak jest też moż liwe stosowanie innych komórek bakterii (patrz poniż ej).
Komórka gospodarza bakteryjnego stosowana w sposobie według wynalazku może być wybrana na przykład z grupy następujących mikroorganizmów: bakterii Gram-ujemnych, takich jak Escherichia, na przykład E. coli, lub innych bakterii Gram-ujemnych, na przykład Pseudomonas sp., takich jak Pseudomonas aeruginosa, lub Caulobacter sp., takich jak Caulobacter crescentus, lub bakterii Gramdodatnich, takich jak Bacillus sp., w szczególności Bacillus subtilis. Szczególnie korzystna jako komórka gospodarza jest E. coli.
Komórkę gospodarza bakteryjnego tzn. szczep ekspresyjny hoduje się zgodnie ze znaną praktyką mikrobiologiczną. Szczep na ogół jest hodowany wychodząc z pojedynczej kolonii zaszczepionej na podłożu odżywczym, ale jest też możliwe stosowanie zamrożonych zawiesin komórek (banków komórek). Aby uzyskać dostateczną biomasę do dalszego użycia, szczep na ogół jest hodowany w procesie wieloetapowym.
Na małą skalę hodowlę można prowadzić w kolbach, umieszczonych w wytrząsarce, w większości przypadków możliwe jest stosowanie pożywki złożonej (na przykład bulionu LB). Jednak jest też możliwe stosowanie zdefiniowanych podłoży (na przykład podłoża cytrynianowego). Do dalszej hodowli uzyskuje się hodowlę wstępną szczepu gospodarza w małej objętości (zaszczepionego pojedynczą kolonią lub zawiesiną komórek z zamrożonej hodowli), na ogół temperatura tej hodowli nie jest krytyczna dla późniejszego wyniku ekspresji, zatem możliwa jest rutynowa praca w stosunkowo wysokich temperaturach (na przykład 30°C lub 37°C). Główną hodowlę zakłada się w większej objętości (na przykład 500 ml), przy czym w szczególności konieczne zapewnienie dobrego napowietrzania (kolba o dużej pojemności mianowanej w porównaniu z zawartością, rotacja z wysoką częstością). Ponieważ celem jest uzyskanie produktów ekspresji w formie rozpuszczalnej, główna hodowla będzie przeprowadzana, w większości przypadków, w nieco niższej temperaturze (na przykład 22 lub 28°C). Aby wytworzyć białka rozpuszczalne odpowiednie są zarówno systemy indukowalne (na przykład z promotorem trp, lac, tac lub phoA) jak i konstytutywne. Po osiągnięciu późnej fazy logarytmicznej (zazwyczaj przy gęstości optycznej 0,5 do 1,0 w wytrząsanych kolbach) w systemach indukowalnych dodawana jest substancja indukująca (na przykład kwas indoloakrylowy, izo-propylo-p-D-tiogalaktopyranozyd = IPTG) i inkubacja kontynuowana jest przez 1 do 5 godzin. W tym czasie większość białka fuzyjnego Npro ulega zgromadzeniu w postaci ciałek inkluzyjnych w cytoplazmie bakterii. Uzyskane komórki mogą być zbierane i poddawane dalszej obróbce.
Na większą skalę system wieloetapowy składa się z szeregu bioreaktorów (fermentorów), w tym przypadku korzystne jest stosowanie podłoży o określonym składzie, aby mieć lepszą kontrolę nad procesem. Dodatkowo, jest możliwe duże zwiększenie tworzenia biomasy i produktu przez odmierzanie poszczególnych składników odżywczych (reaktor periodyczny). Poza tym, proces jest podobny do hodowli w kolbie umieszczonej w wytrząsarce. Na przykład, stosowany jest fermentor etapu wstępnego i fermentor etapu głównego, temperaturę hodowli wybiera się podobnie jak dla hodowli w wytrząsanej kolbie. Fermentor etapu wstępnego zaszczepia się tak zwanym inokulum, które jest na ogół, hodowane w kolbie umieszczonej w wytrząsarce z pojedynczej hodowli lub zamrożonej kultury. W fermentorze musi być także zapewnione dobre napowietrzanie i wystarczające stężenie induktora, szczególnie w etapie
PL 200 225 B1 głównym. Jednak w niektórych przypadkach faza indukcji musi być wyraźnie dłuższa w porównaniu do hodowli w wytrząsanej kolbie. Powstałe komórki są również przeznaczane do dalszej obróbki.
W sposobie według wynalazku ciałka inkluzyjne wyodrębnia się z komórki gospodarza w znany sposób, jak opisano na przykład w R. Rudolph i wsp. w: Creighton, T.E. (red) Protein Function: A Practical Approach, IRL Press (1996), 1-39; R. Rudolph w: H. Tschesche (red) Modern Methods in Protein and Nucleic Acid Research, De Gruyter, Berlin (1990), 1949-171; R. Rudolph w J. L. Cleland i C. S. Craik (red.) Protein Engineering: Principles and Practices, Wiley-Liss Inc. (1995), 283-298.
Na przykład po zakończeniu fermentacji komórki zbiera się za pomocą wirowania. Obecne, w komórkach, ciał ka inkluzyjne moż na uzyskać w wyniku zniszczenia komórek, na przykł ad za pomocą wysokiego ciśnienia, stosując proste wirowanie przy niskiej prędkości. Czystość żądanego białka docelowego może być następnie zwiększona przez wielokrotne zawieszanie ciałek inkuzyjnych w różnych buforach, na przykład w obecności NaCl (na przykład 0,1-1,0 M) i/lub detergentu (na przykład Triton X-100). To na ogół prowadzi do usunięcia z IB większości obcych białek. Ewentualne pozostałe obce białka na ogół nie przeszkadzają w cięciu autoproteolitycznym.
Roztworzenie na ogół prowadzi się rozpuszczając IB na przykład w buforze zawierającym guanidynę (na przykład 0,1 M Tris/HCl, 6,0 M guanidyna/HCl, 5 mM EDTA, 50 mM DTT (patrz na przykład R. Rudolph i wsp. (1996); R. Rudolph (1990), Rudolph (1995), powyżej). Po usunięciu nierozpuszczalnego materiału na przykład za pomocą wirowania, można przeprowadzić oznaczenie białka w supernatancie.
Autoproteolityczne odcienie polipeptydu heterologicznego z białka fuzyjnego można uzyskać w wyniku rozcieńczenia zawiesiny ciałek inkluzyjnych buforem do cięcia (na przykład 1 ml zawiesiny ciałek inkluzyjnych + 99 ml buforu do cięcia) na przykład buforem do cięcia zawierającym Tris, korzystne o stężeniu 0,8-1,0 M lub buforem do cięcia zawierającym argininę, korzystnie 0,4-0,6 M argininę, na przykład w obojętnym pH, korzystnie pH 7,0-7,5, i w temperaturze na przykład poniżej 30°C, korzystnie 10-20°C, w ten sposób tworząc roztwór reakcyjny (patrz też R. Rudolph (1996) powyżej). Roztwór do cięcia następnie inkubuje się przez określony okres na przykład przez 12 godz., po czym wydajność cięcia Npro może być analizowane metodą SDS-PAGE.
W korzystnym wykonaniu solubilizat rozcieńcza się buforem zawierają cym argininę tak, ż e koń cowe stężenie argininy jest niższe niż 1,0 M, korzystnie 0,4-0,6 M. Alternatywnie możliwe jest też rozcieńczenie zawiesiny roztworzonych ciał inkluzyjnych przez dializę wobec odpowiedniego buforu do cięcia zawierającego argininę.
Temperatura roztworu reakcyjnego do cięcia wynosi na przykład od 0 do 30°C. Korzystnie temperatura jest w zakresie 10-20°C.
pH roztworu reakcyjnego wynosi na przykład 5,0-9,0. Korzystnie pH wynosi 7,0-8,0 zwłaszcza 7,0-7,5.
Gdy jest to wskazane, roztwór reakcyjny zawiera DTT w stężeniu 0,5-100 mM. Stężenie DTT korzystnie wynosi około 5,5 mM.
Stężenie białka w roztworze reakcyjnym w czasie cięcia może być na przykład w granicach 20150 μg/ml. Stężenie białka korzystnie jest niższe niż 40 μg/ml.
Roztwór reakcyjny w czasie cięcia może zawierać Tris/HCl w stężeniu na przykład niższym niż 1,0 M. Stężenie Tris/HCl korzystnie wynosi od 0,8 do 1,0 M.
Możliwe są też inne systemy buforów zamiast buforów zawierających argininę i/lub Tris/HCl.
W szczególnie korzystnym wykonaniu pH buforu do cięcia wynosi 7-7,7, cięcie prowadzi się w temperaturze 10-20°C, stężenie białka nie przekracza 40-50 μg/ml i bufor zawiera około 5 mM DTT jako czynnik redukujący.
Na koniec heterologiczny polipeptyd, który został odcięty od białka fuzyjnego, jest wyodrębniany w znany sposób (patrz na przykład M.P. Deutscher, w: Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification, Academic Press Inc., (1990), 309-392).
Poniższe przykłady stanowią ilustrację wynalazku, nie ograniczając w jakikolwiek sposób jego zakresu.
Przykłady
P r z y k ł a d 1: Ekspresja i cięcie in vitro Npro-hGH (Npro-ludzkiego hormonu wzrostu)
Białka fuzyjne uzyskuje się przez ekspresję heterologiczną w Escherichia coli w układzie ekspresyjnym (wektor p160TPl z komórkami gospodarza W3110). Wszystkie elementy w tym układzie do konstrukcji wektora pochodzą z genomu E. coli.
P160TP1 jest wektorem pochodzącym z pBR322, w którym ekspresja zachodzi pod kontrolą modyfikowanego promotora trp E. coli z usuniętym atenuatorem. Jako miejsce wiązania rybosomu (RBS) stosowana jest sekwencja Shine-Dalgarno peptydu atenuatora z tego samego operonu. PoPL 200 225 B1 dwójny terminator T1T2 z genu rrnB z E. coli zapewnia razem z terminatorem genu bla, który pozostaje w konstrukcie, wydajne zakończenie transkrypcji. Kaseta ekspresyjna jest wstawiona od miejsca cięcia EcoRI pBR322 w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (tzn. przeciwnie do orientacji genu oporności na tetracyklinę). Gen kodujący β-laktamazę (bla) jest usunięty razem z promotorem. Geny strukturalne kodujące ulegające ekspresji białka heterologiczne wprowadzane są (na ogół jako fragment PCR cięty do odpowiedniej wielkości) w miejsce cięcia Xbal w pozycji 3506.
Plazmid ekspresyjny (NPH-pET) służy jako źródło genu strukturalnego Npro-hGH. Plazmid zawiera znany wektor ekspresyjny pET11a (F.W. Studier i wsp., Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-89). Najpierw do tego wektora ekspresyjnego wklonowano gen kodujący białko fuzyjne złożone z Npro i białka nukleokapsydu CSFV. To pociąga za sobą zastąpienie pierwszych 16 aminokwasów naturalnej sekwencji Npro (MELNHFELLYKTSKQK) przez 10 aminokwasową oligo-histydynową sekwencję wspomagającą czyszczenie (MASHHHHHHH). W pozycję pomiędzy genem kodującym Npro a białko nukleokapsydu wprowadzono miejsce cięcia Spel, co umożliwi delecje z wektora genu strukturalnego kodującego nukleokapsyd w wyniku trawienia Spel (na końcu 5') i Xhol (na końcu 3'). Odpowiadający mu wektor Npro-pET11a w formie liniowej usunięto za pomocą preparatywnej elektroforezy w żelu z fragmentu genu kodującego nukleokapsyd. Następnie możliwe było wprowadzenie genu strukturalnego hGH korzystając z „lepkich” końców Spel i Xhol.
Aby przeprowadzić ten proces konieczne są następujące prace przygotowawcze. Gen strukturalny amplifikowano z banku cDNA z mózgu ludzkiego, który można poddawać obróbce (Clontech) za pomocą bardzo precyzyjnego PCR (na przykład system polimerazy Pwo z Roche Biochemicals, zgodnie z instrukcją producenta). Zastosowano następujące oligonukleotydy:
Oligonukleotyd 1 („N-końcowy”):
5'- ATAATTACTA GTTGTTTCCC AACCATTCCC TTATCCAGGC C -3'
Oligonukleotyd 2 (C-końcowy):
5'- ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTAGAAGCCA CAGCTGCCCT CCAC -3'
Stosując Oligonukleotyd wprowadzono miejsce cięcia Spel na końcu 5' i miejsce cięcia Xhol na końcu 3'. Dodatkowo wprowadzono podwójny kodon stop ochre (TAATAA) na końcu 3' genu strukturalnego, aby uzyskać skuteczne zakończenie translacji. Miejsce cięcia Spel na początku pozwala na ligację w ramce odczytu z opisanym powyżej wektorem Npro-pET11a. Miejsce cięcia Xhol, na końcu umożliwia klonowanie ukierunkowane. Powstały w ten sposób plazmid nazwano NPH-pET.
Plazmid NPH-pET, jak określono powyżej, jest stosowany jako źródło genu strukturalnego kodującego białko fuzyjne Npro-hGH. W tym celu ponownie zastosowano bardzo precyzyjny PCR z polimerazą Pwo stosując jako matrycę plazmid NPH-pET cięty Xhol. Aby uzyskać klonowany fragment stosowano następujące startery:
Początek (odpowiadający końcowi N białka) genu strukturalnego:
5'- AGGGTATCTA GAATTCTATG CCAGTGGGAG TGGAGGAACC G-3'
Koniec (odpowiadający końcowi C białka) genu strukturalnego:
5'- AGAATTAAGC TTCTAGATTA TTAGAAGCCA CAGCTGCCCT CCAC-3'
Miejsca cięcia Xbal stosowane następnie do klonowania (początek i koniec) są zaznaczone kursywą, a kodony start (ATG) i stop (TAATAA) są wyróżnione większą czcionką.
Dwa oligonukleotydy umożliwiają amplifikację genu strukturalnego z otwartą ramką odczytu (ORF) genu kodującego białko fuzyjne (FP), z której pomocną w oczyszczaniu His7 i poprzedzające ją aminokwasy (z wyjątkiem reszty metioniny potrzebnej do startu translacji) zostały całkowicie usunięte.
Sekwencja fragmentu PCR (1072 par zasad), który zawiera otwartą ramkę odczytu% genu kodującego białko fuzyjne Npro-hGH została przedstawiona poniżej. Kodon start i dwa kodony stop są wytłuszczone, a miejsca cięcia Xbal stosowane do klonowania zostały podkreślone.
51-AGGGTATCTAGAATTCTATGCCAGTGGGAGTGGAGGAACCGGTGTATGACACCGCGGGGAGACC
ACTATTTGGGAACCCAAGTGAGGTACACCCACAATCAACGCTGAAGCTGCCACACGACAGGGGGAGA
GGAGATATCAGAACAACACTGAGGGACCTACCCAGGAAAGGTGACTGTAGGAGTGGCAACCATCTAG
GCCCGGTTAGTGGGATATACATAAAGCCCGGCCCTGTCTACTATCAGGACTACACGGGCCCAGTCTA
TCACAGAGCTCCTTTAGAGTTCTTTGATGAGGCCCAGTTCTGCGAGGTGACTAAGAGAATAGGCAGG
PL 200 225 B1
GTCACGGGTAGTGATGGTAAGCTTTACCACATATATGTGTGCGTCGATGGTTGCATACTGCTGAAAT
TAGCCAAAAGGGGCACACCCAGAACCCTAAAGTGGATTAGGAACTTCACCAACTGTCCATTATGGGT
AACTAGTTGTTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCCTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCGT
CTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGAAGAAGCCTATATCCCAAAGGAACAGAAGT
ATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCGACACCCTCCAACAG
GGAGGAAACACAACAGAAATCCAACCTAGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGG
CTGGAGCCCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCA
ACGTCTATGACCTCCTAAAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGAGGTGGAAGATGG
CAGCCCCCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGAT
GACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACAT
TCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAATAATCTAGAAGCTTAAT
TCT-3'
Ta ORF koduje więc białko fuzyjne przedstawione poniżej, reszta proliny w pozycji drugiej odpowiada reszcie proliny w pozycji 17 w naturalnym białku Npro. Sekwencja białka fuzyjnego Npro-hGH (344 aminokwasy, z czego 153 Npro i 191 hGH) jest więc następująca (czytana w stronę od końca N do końca C) z proliną 17 (pozycja 2 białka fuzyjnego) z naturalnej sekwencji Npro przedstawioną kursywą, a sekwencją hGH wytłuszczoną:
MPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIY
IKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTP
RTLKWIRNFTNCPLWVTSCFPTIPLSRPFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNP
QTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLK
DLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQC
RSVEGSCGF
FP ma w stanie zredukowanym Mr 39316,92 Da, a Mr po ewentualnym cięciu wynosiłaby 17220,02 Da dla części Npro (zredukowanej) i 22114,88 Da dla części hGH (zredukowanej). Npro ma sześć cystein a hGH cztery. Jest prawdopodobne, że w cytoplazmie bakterii cysteiny są głównie w formie zredukowanej. W czasie następnej obróbki prawdopodobnie przynajmniej częściowo zachodzi tworzenie mostków disiarczkowych. Należy oczekiwać, że N-końcowa metionina białka fuzyjnego (lub części Npro) jest głównie cięta przez aminopeptydazę metioninową (MAP) właściwą dla gospodarza, co prowadziłoby do obniżenia Mr o około 131 Da, w każdym przypadku do odpowiednio 39186 Da (FP) i 17089 Da (Npro).
Fragment uzyskany w PCR, zawierający gen strukturalny, kodujący opisane FP oczyszczono i cięto Xbal i dwa szukane produkty cięcia usunięto z fragmentu docelowego. Ten fragment zligowano z wektorem ekspresyjnym p160TPl jak opisano powyżej.
W tym celu wektor najpierw zlinearyzowano tnąc Xbal i defosforylowano na końcu 5' cielęcą fosfatazą alkaliczną (CAP). Do ligacji stosowano ligazę T4 DNA. Zligowany DNA wprowadzono za pomocą elektroporacji do Escherichia coli K-12 DH10B i komórki wysiano na płytkach z agarowym bulionem Lurii (LB) z 15 mg/l tetracykliny. Z tej transformacji uzyskano liczne kolonie. Z kilku klonów wyodrębniono plazmidowy DNA i badano stosując analizę restrykcyjną pod kątem obecności wstawki o prawidłowej wielkości i orientacji. Wybrano jeden klon i poddano go szczegółowej charakterystyce za pomocą analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania DNA. We wszystkich badaniach plazmid zachowywał się zgodnie z wyliczeniami. Plazmid nazwano pNPH1 i stosowano w dalszej pracy.
Sekwencja plazmidu ekspresyjnego Npro-hGH pNPH1 (4840 par zasad) jest została przedstawiona poniżej. Kodon start i kodon stop białka fuzyjnego Npro-hGH zaznaczono podkreśleniem. Otwarta ramka odczytu biegnie w przeciwną stronę, jeśli jest przedstawiona w obecnej postaci.
PL 200 225 B1
5'-GAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAAT
TGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCA
CCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCA
TTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGC
GCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTG
GAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCAT
CGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGG
GAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCG
TGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGG
CCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCC
TTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTA
TGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGA
GGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCC
CTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCG
GCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCC
CATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAG
GTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCA
CTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGAT
TGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACC
TCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCA
ATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATC
TCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGC
TCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGAT
ACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTC
TTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGA
TCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCA
TTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGT
TCCAGTAACCGGGCATGTTGATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTA
TCATTACCCCCATGAACAGAAATTCCCCCTTACACGGAGGCATCAAGTGACCAAACAGGAAAAAACC
GCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGG
ACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTG
CCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCT
TGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTC
GGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCA
PL 200 225 B1
GAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAAT
ACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCG agcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaag
AACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCC
ATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGAC
AGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTG
CCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCT
GTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCA
GCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCG
CCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCT
TGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCC
AGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGT
TTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTT
CTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAA
AAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAG
TAAACTTGGTCTGACAGTTACCTCGAGGCCATCCGTCAGGATGGCCTTCTGCTTAATTTGATGCCTG
GCAGTTTATGGCGGGCGTCCTGCCCGCCACCCTCCGGGCCGTTGCTTCGCAACGTTCAAATCCGCTC
CCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTC
TTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTCTAGATTATTAGAAGCCACAGCTGCCCTCCACAGAGCGGCAC
TGCACGATGCGCAGGAATGTCTCGACCTTGTCCATGTCCTTCCTGAAGCAGTAGAGCAGCCCGTAGT
TCTTGAGTAGTGCGTCATCGTTGTGTGAGTTTGTGTCGAACTTGCTGTAGGTCTGCTTGAAGATCTG
CCCAGTCCGGGGGCTGCCATCTTCCAGCCTCCCCATCAGCGTTTGGATGCCTTCCTCTAGGTCCTTT
AGGAGGTCATAGACGTTGCTGTCAGAGGCGCCGTACACCAGGCTGTTGGCGAAGACACTCCTGAGGA
ACTGCACGGGCTCCAGCCACGACTGGATGAGCAGCAGGGAGATGCGGAGCAGCTCTAGGTTGGATTT
CTGTTGTGTTTCCTCCCTGTTGGAGGGTGTCGGAATAGACTCTGAGAAACAGAGGGAGGTCTGGGGG
TTCTGCAGGAATGAATACTTCTGTTCCTTTGGGATATAGGCTTCTTCAAACTCCTGGTAGGTGTCAA
AGGCCAGCTGGTGCAGACGATGGGCGCGGAGCATAGCGTTGTCAAAAGGCCTGGATAAGGGAATGGT
TGGGAAACAACTAGTTACCCATAATGGACAGTTGGTGAAGTTCCTAATCCACTTTAGGGTTCTGGGT
GTGCCCCTTTTGGCTAATTTCAGCAGTATGCAACCATCGACGCACACATATATGTGGTAAAGCTTAC
PL 200 225 B1
CATCACTACCCGTGACCCTGCCTATTCTCTTAGTCACCTCGCAGAACTGGGCCTCATCAAAGAACTC
TAAAGGAGCTCTGTGATAGACTGGGCCCGTGTAGTCCTGATAGTAGACAGGGCCGGGCTTTATGTAT
ATCCCACTAACCGGGCCTAGATGGTTGCCACTCCTACAGTCACCTTTCCTGGGTAGGTCCCTCAGTG
TTGTTCTGATATCTCCTCTCCCCCTGTCGTGTGGCAGCTTCAGCGTTGATTGTGGGTGTACCTCACT
TGGGTTCCCAAATAGTGGTCTCCCCGCGGTGTCATACACCGGTTCCTCCACTCCCACTGGCATAGAA
TTCTAGATACCCTTTTTACGTGAACTTGCGTACTAGTTAACTAGTTCGATGATTAATTGTCAACAGC
TCATTTCAGAATATTTGCCAGAACCGTTATGATGTCGGCGCAAAAAACATTATCCAGAACGGGAGTG
CGCCTTGAGCGACACGAATTATGCAGTGATTTACGACCTGCACAGCCATACCACAGCTTCCGATTGG
CTGCCTGACGCCAGAAGCATTGGTGCACCGTGCAGTCGAGATGCGCGTCGGCACCCTGGCGATCACC
GACCATGACACCACAGCAT-3'
Szczep gospodarza Escherichia coli, prowadzący ekspresję białka fuzyjnego Npro-hGH, wybrano na podstawie analizy produktywności i bezpieczeństwa biologicznego. Escherichia coli K-12 jest najlepiej scharakteryzowaną linią gatunku E. coli (BJ. Bachmann; w J. L. Ingraham i wsp. (red) Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1987a) str. 1191-1219; B.J. Bachmann 1987b; Barbara J. (1987b) Linkage map of Escherichia coli K-12, wydanie 7. W: Escherichia coli and Salmonella typhimurium, tom 2, red: F.C. Neidhard. Am. Soc. Microbiol, Washington DC (1987b), 807-876; K. F. Jensen, J. Bacteriol. 175 (1993), 3401-3407 i jego szczepy są na ogół uważane za bezpieczne.
Escherichia coli K-12 W3110 (ATCC 27325) jest prototroficzną pochodną, która jest bardzo zbliżona do typu dzikiego Escherichia coli K-12 i jest często stosowana do ekspresji białek heterologicznych jako szczep gospodarza. Szczep został zdeponowany w American Type Culture Collection i ma nastę pują cy genotyp:
[F- mcr A mcrB 1N(rrnD-rrnE)1 lambda]
Szczep można nabyć w ATCC. Jego wzrost jest znakomity na w pełni syntetycznych podłożach bez złożonych źródeł azotu i w związku z tym jego kontrola na poziomie inżynierii procesowej jest możliwa w sposób bardzo skuteczny.
Szczep ekspresyjny W3110[pNPH1] uzyskuje się przez transformacją komórek W3110 plazmidem ekspresyjnym pNPH1 opisanym powyżej. Transformację przeprowadza się elektroporując w 10% glicerolu jako podłożu do zawieszania. 50 ng (1 μΙ) roztworu pNPHI w wodzie zmieszano z 30 μΐ zawiesiny komórek W3310 i poddawano pulsowi 1800 V w 1 mm kuwecie (Eppendorf elektroporator 2510). Komórki zawieszono ponownie w podłożu SOC, wytrząsano w 37°C przez 1 godz., a następnie wysiewano na szalkach z agarowym bulionem Lurii z 15 mg/l tetracykliny. W wyniku transformacji, po inkubacji w 37°C (przez noc), uzyskano liczne klony.
Wybrano kolonię średniej wielkości z wyraźnymi brzegami, która stanowiła podstawę uzyskania szczepu ekspresyjnego W3310[pNPH1]. Klon hodowano i przechowywano w ampułkach do zamrażania w -80°C (bank wyjściowy komórek MCB). Do użytku codziennego, szczep wysiewano na szalkach LB z tetracykliną.
Szczep W3110[pNPH1] wyhodowano z pojedynczej kolonii na płytce z agarem, z tej hodowli pobrano inokulum do zaszczepienia hodowli wstępnej w bulionie Lurii z 15 mg/l tetracykliny (200 ml w kolbie z przegrodami). Hodowlę wstępną wytrząsano z szybkością 250 obr./min. w 30°C przez 14 godz. do osiągnięcia OD600 około 1,0. Następnie 10 ml porcje hodowli wstępnej stosowano do zaszczepienia hodowli głównych (330 ml bulionu cytrynowego w każdej 1 l kolbie z przegrodami) (3% inokulum). Główne hodowle prowadzono w 37°C (250 obr./min.) do osiągnięcia OD600 do 0,8, a następnie indukowano wytwarzanie białka fuzyjnego za pomocą 50 ng kwasu indoloakrylowego na ml hodowli (stężenie końcowe; roztwór podstawowy 5 mg/ml w 100% EtOH jakości cz.d.a.). Hodowle prowadzono dalej w 37°C, przy 250 obr./min. przez 4 godz., do osiągnięcia OD600 około 1,5-3,0.
PL 200 225 B1
Hodowle przenoszono do sterylnych 500 ml butelek do wirowania i wirowano przy 10000 g przez 30 min. Supernatant z wirowania całkowicie odrzucano i osady zamrażano w -80°C do czasu dalszej obróbki.
Następnie około 12 g (mokrej masy) osadu komórek BL 12 l (DES) zawieszono w 30 ml 50 mM Tris/HCl, 5 mM benzamidyny, pH 5,0 i homogenizowano stosując Ultraturrax. Po dodaniu 0,5 mM EDTA i 0,1% (masa/obj.) lizozymu zawiesinę komórek inkubowano w łaźni lodowej przez 30 min. Następne traktowano ultradźwiękami (7 x 20 sek. z przerwą 20 sek. za każdym razem), co prowadziło do całkowitego rozbicia komórek. Do zawiesiny rozbitych komórek dodawano 10 mM MgCl2 i 0,006% (masa/obj.) DNAzy i inkubowano w 4°C przez 30 min. Nierozpuszczalne i rozpuszczalne składniki następnie rozdzielano za pomocą wirowania (JA 20; 7700 g). Osad ponownie zawieszano w 40 ml Mm Tris/HCl, 5 mM benzamidyny, 5 mM EDTA pH 8,0 i ponownie wirowano (JA 20; 7700 g). Ten etap powtórzono jeszcze dwa razy i powstałe osady zawieszono w 40 ml 20 mM Tris/HCl, pH 7,0. Do zawiesiny dodano 20 ml 1,5 M NaCl, 60 mM EDTA, pH 7,0, i inkubowano w łaźni lodowej przez 30 min. Na koniec przeprowadzono jeszcze jeden etap wirowania (JA 20; 7700 g) i płukania H2O. Powstały osad stanowi materiał Npro i-hGH IB (ciałka inkluzyjne).
Następnie zazwyczaj 100 mg materiału IB zawieszano w 2 ml 6,0 M chlorowodorku guanidyny, 0,1 M tris, 5 mM EDTA, 50 mM DTT, pH 9,0 w temperaturze pokojowej przez 30 min. Nierozpuszczalne składniki następnie usuwano za pomocą wirowania (10 min./30000 g). Przeprowadzano oznaczenie stężenia białka w tym supernatancie (stężenie białka około 25 mg/ml). W ten sposób wytworzona zawiesina jest, albo bezpośrednio stosowana w badaniu cięcia albo przechowywana w -20°C (maksymalnie 7 dni).
P r z y k ł a d 2. Cięcie w różnych warunkach reakcji białek fuzyjnych pochodzących z ciałek inkluzyjnych
Odcięcie części Npro możliwe jest zasadniczo w wyniku rozcieńczenia 1:100 lub większe roztworzonego materiału w buforze do cięcia (resztkowe stężenie chlorowodorku guanidyny < 0,06 M). Stężenie białka w tej reakcji wynosi zazwyczaj 20 μg/ml (jeśli było inne stężenie, zostało to podane poniżej).
Jest również możliwe uzyskanie odcięcia części Npro poprzez dializę (1:100) roztworzonego materiału w obecności buforu do cięcia.
Wydajność odcięcia części Npro można zmierzyć przez oznaczenie produktów cięcia metodą SDS-PAGE. Konieczne jest fotografowanie żeli poliakryloamidowych uzyskanych metodą SDS-PAGE i pomiar intensywności odpowiednich prążków. Odpowiednie prążki identyfikowano w testach wstępnych metodą Western blotting.
P r z y k ł a d 2.1. Cięcie in vitro Npro-hGH z użyciem argininy
Cięcie zachodzi w wyniku rozcieńczenia (1:100) roztworzonego materiału w buforze do cięcia (20 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7,0 i odpowiednich stężeniach argininy) w temperaturze pokojowej. Stężenie białka w mieszaninach do cięcia wynosi 20 μg/ml. Stopień cięcia mierzono po 24 godz., oznaczając produkty cięcia metodą SDS-PAGE.
Wykazano, że wydajność cięcia Npro może być wyraźnie zwiększona przez dodanie do buforu do cięcia argininy. Największa wydajność cięcia zachodzi przy stężeniu argininy w zakresie 0,4-0,6 M.
P r z y k ł a d 2.2. Cięcie in vitro Npro-hGH przez argininę w różnych temperaturach
Cięcie zachodzi w wyniku rozcieńczenia (1:100) roztworzonego materiału w buforze do cięcia (20 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7,0; 0-1,0 M arginina) w określonych temperaturach. Stężenie białka w mieszaninach do cięcia wynosi 20 μg/ml. Wydajność cięcia mierzono po 24 godz., oznaczając produkty cięcia metodą SDS-PAGE.
Wykazano, że najwyższą wydajność cięcia uzyskuje się w temperaturach między 10 a 20°C.
P r z y k ł a d 2.3. Wydajność odcinania Npro od Npro-hGH w zależności od pH w różnych temperaturach
Cięcie prowadzi się przez rozcieńczenie (1:100) roztworzonego materiału w buforze do cięcia (20 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,5 M arginina) w odpowiednich pH. Stężenie białka w mieszaninie do cięcia wynosi 20 μg/ml. Wydajność cięcia mierzono po 24 godz., oznaczając produkty cięcia metodą SDS-PAGE.
Przeprowadzono cięcie w buforze do cięcia przy różnych wartościach pH kolejno od pH 5,0 do 9,0. Przy stosowanym stężeniu argininy, optymalny pH do cięcia białka fuzyjnego Npro wynosi 7,0-7,5.
P r z y k ł a d 2.4. Wydajności odcinania Npro od Npro- hGH w różnych stężeniach DTT
Badano zależność wydajności cięcia od stężenia DTT.
PL 200 225 B1
Cięcie prowadzi się przez rozcieńczenie (1:100) roztworzonego materiału w buforze do cięcia (20 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, pH 7,0 , 0,5 M arginina, 0-100 mM DTT w 15°C). Ze względu na stężenie DTT w zawiesinie, pomimo, że roztworzony materiał znamionowo ma „0 mM DTT” nadal zawiera 0,5 mM DTT. Stężenie białka w mieszaninie do cięcia wynosi 20 μg/ml. Wydajność cięcia mierzono po 24 godz., oznaczając produkty cięcia metodą SDS-PAGE.
Maksymalne stężenie Npro osiągnięto przy stęż. DTT około 5,5 mM.
P r z y k ł a d 2.5. Wpływ zmiany pH roztworzonego materiału na cięcie Npro-hGH
Cięcie zachodzi w wyniku rozcieńczenia (1:100) roztworzonego materiału o różnych wartościach pH (pH 6,0, pH 7,0, pH 8,0, pH 9,0) w buforze do cięcia (20mM Tris/HCI, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7,0; 0-0,8 M arginina w 15°C). Wartości pH uzyskiwano miareczkując bufor do roztwarzania do odpowiedniego pH przed zmieszaniem z IB. Stężenie białka w mieszaninach do cięcia wynosiło 20 μg/ml. Wydajność cięcia mierzono po 24 godz., oznaczając produkty cięcia metodą SDS-PAGE.
Wykazano, że optymalny jest roztworzony materiał w pH 7,0-8,0.
P r z y k ł a d 2.6. Kinetyka odcinania Npro od Npro-hGH
Odzyskanie właściwości denaturowanego Npro-hGH rozpoczyna się w wyniku rozcieńczenia (1:100) w 20 mM Tris/HCl, 0,5 M argininie, 2 mM EDTA, 10 mM DTT, pH 7,0 w 15°C.
Stwierdzono, że proces cięcia kończy się po około 24 godz.
P r z y k ł a d 2.7. Odcinanie Npro od Npro-hGH w wyniku rozcieńczenia przy różnych stężeniach białka.
Cięcie zachodzi w wyniku rozcieńczenia roztworzonego materiału (1:100) w buforze do cięcia (20 mM Tris/HCl, 0,5 M arginina, 2 mM EDTA, 10 mM DTT, pH 7,0 w 15°C). Wynik cięcia sprawdzano po około 24 godz. oznaczając produkty cięcia metodą SDS-PAGE.
Wykazano, że stężenia białka >40 μg/ml prowadzą do wyraźnego obniżenia wydajności cięcia. Dalsze testy wykazały, że optymalne stężenia białka wynosi 20-40 μg/ml.
P r z y k ł a d 2.8. Odcinanie Npro od Npro-hGH, z wykorzystaniem dializy, w zależności od stężenia białka.
Z roztworzonego materiału Npro-hGH usuwano chlorowodorek guanidyny za pomocą dializy (1:100) wobec 20 mM Tris/HCl, 0,5 M arginina, 2 mM EDTA, 10 mM DTT, pH 7,0 w 4°C, i w ten sposób inicjowano cięcie. Po około 24 godz. stosowano SDS-PAGE aby sprawdzić czy nastąpiło cięcie Npro. Wykazano, że odcinanie części Npro można uzyskać nie tylko w wyniku rozcieńczenia, ale także przez dializę roztworzonego materiału.
P r z y k ł a d 2.9. Wydajność odcinania Npro od Npro-hGH jako funkcja stężenia Tris/HCl
Cięcie prowadzono rozcieńczając (1:100) roztworzony materiał w buforze do cięcia (2 mM EDTA, 20 mM DTT, pH 7,0, 0,1-01,0 M \ris/HCl w 15°C). Wydajność cięcia sprawdzano po około 24 godz. oznaczając produkty cięcia metodą SDS-PAGE.
Wykazano, że zwiększenie w buforze stężenia Tris/HCl do około 0,8 M zwiększa wydajność cięcia białka fuzyjnego Npro. Dalsze zwiększenie nie powoduje mierzalnego zwiększenia ciecia Npro. Zatem reakcja, powinna korzystnie odbywać się przy stężeniach Tris/HCl 0,8-1,0 M.
P r z y k ł a d 3. Ekspresja i odcinanie in vitro Npro od Npro-pGH (hormon wzrostu świni)
Wytwarzanie wektora ekspresyjnego Npro-pGH rozpoczęto od pNPH1 (patrz przykład 1). Plazmid przeprowadzano w postać liniową tnąc BgIII i amplifikowano za pomocą PCR. Objęto cały plazmid poza regionem genu strukturalnego hGH (od kodonu kodującego Phel do kodonu kodującego Phe 191) amplifikowanego za pomocą polimerazy Pwo i starterów bez 5' fosforanu. Oczyszczony fragment PCR zastosowano jako wektor do ligacji z genem strukturalnym pGH. Usunięcie 5'-fosforanów (na przykład stosując fosfatazę z jelita cielęcia, fosfatazę alkaliczną z krewetki arktycznej) zapobiega zamknięciu fragmentu w pętlę w wyniku autoligacji.
Gen strukturalny pGH także uzyskano za pomocą amplifikacji PCR. Stosowaną matrycą był bank cDNA świni (na przykład biblioteka DNA 5'-stretch od Clontech lub bank cDNA mózgu lub przysadki świni). Do amplifikacji stosowano następujące startery, z których wszystkie zawierały fosforan 5' w czasie syntezy:
Początek (odpowiadający końcowi N białka) genu strukturalnego (Phe 1 do Ser 7):
5'- TTC CCA GCC ATG CCC TTG TCC -3'
Koniec (odpowiadający końcowi C białka) genu strukturalnego (Phe 190 do Val 184):
5'- GAA GGC ACA GCT GCT CTC CAC -3'
Fragment PCR zawiera wyłącznie ORF (gen strukturalny) dojrzałego pGH. Ligacja (ligaza T4 DNA) daje ORF Npro-pGH, który jest analogiczny do ORF pNPH1. Białko fuzyjne opisane poniżej jest
PL 200 225 B1 kodowane przez tą ORF. Zligowany DNA wprowadzono za pomocą elektroporacji do Escherichia coli
K-12 DH10B (komórki elektrokompetentne dostarczone przez Life Technologies, genotyp Escherichia coli K-12 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC; Φ80^ΖΔΜ15 A/acX74 deoR recA1 endA1 araD139 Δ (ara, leu) 7697 galU galKk- rpsL nupG) i wysiano na płytkach z agarowym bulionem Lurii (LB) z 15 mg/l tetracykliny. W wyniku transformacji uzyskano liczne kolonie. Z kilku klonów wyodrębniono plazmidowy DNA i badano stosując analizę restrykcyjną pod kątem obecności wstawki o prawidłowej wielkości i orientacji. Wybrano jeden klon i poddano szczegółowej charakterystyce za pomocą analizy restrykcyjnej i sekwencjonowania DNA. We wszystkich badaniach plazmid zachowuje się zgodnie z wyliczeniami. Plazmid nazwano pNPP1 i stosowano w dalszej pracy.
W poniższej sekwencji aminokwasowej (czytanej w stronę od końca N do końca C) białka fuzyjnego Npro-pGH (342 aminokwasy, z czego 153 są w Npra i 189 w pGH), prolina 17 (pozycja 2 białka fuzyjnego) z naturalnej sekwencji Npro jest podana kursywą a sekwencja pGH jest wytłuszczona.
MPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIY
IKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTP
RTLKWIRNFTNCPLWVTSCFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYIPEGQRYSIQNAQ
AAFCFSETIPAPTGKDEAQQRSVELLRFSLLLIQSWLGPVQFLSRVFTNSLVFGTSDRVYEKLKDLE
EGIQALMRELEDGSPRAGQILKQTYDKFDTNLRSDDALLKNYGLLSCFKKDLHKAETYLRVMKCRRF
VESSCAF
FP w stanie zredukowanym ma Mr 38819,82 Da, która po ewentualnym odcięciu części Mr wyniosłaby 17220,02 Da dla części Npro (zredukowanej) i 21617,79 Da dla części pGH (zredukowanej). Npro ma sześć cystein a pGH cztery. Jest prawdopodobne, że w cytoplazmie bakterii cysteiny są głównie w formie zredukowanej. W czasie następującej obróbki prawdopodobnie zachodzi przynajmniej częściowo tworzenie mostków disiarczkowych. Należy oczekiwać, że metionina na N końcu białka fuzyjnego (lub w części Npro) będzie cięta głównie przez aminopeptydazę metioninową (MAP) właściwą dla gospodarza, co prowadziłoby do obniżenia Mr o około 131 Da w każdym przypadku, odpowiednio do 38689 Da (FP) i 17089 Da (Npro).
Szczep ekspresyjny W3110[pNPP1] otrzymano jak opisano w przykładzie 1 przez transformację (elektroporację) Escherichia coli K-12 W3110 plazmidem ekspresyjnym pNPP1. Także w tym przypadku szczegółowa charakterystyka nie wykazała odchyleń od oczekiwanej mapy restrykcyjnej.
Wybrano kolonię średniej wielkości z wyraźnymi brzegami, która stanowiła kolonię wyjściową szczepu ekspresyjnego W3110[pNPP1]. Klon hodowano i przechowywano w fiolkach do zamrażania w -80°C (bank wyjściowy komórek - MCB). Do typowego użycia szczep wysiewano na płytkach z agarem LB i tetracykliną.
Ekspresję białka fuzyjnego Npro-pGH prowadzi się jak opisano w przykładzie 1 dla białka fuzyjnego Npra-hGH.
Uzyskanie IB z Npro-pGH prowadzi się jak opisano w przykładzie 1 dla białka fuzyjnego Npro-hGH.
P r z y k ł a d 4: Wycięcie in vitro Npro z Npro-pGH
Roztworzenie i badanie przywrócenia białka do jego naturalnej formy takie jak opisano powyżej dla Npro-hGH, przeprowadzono dla białka fuzyjnego Npro-pGH. Po zmianie parametrów opisanych wcześniej (patrz powyżej) wykazano, że odcięcie in vitro części Npro jest możliwe po roztworzeniu i przywróceniu białka do naturalnej formy także w przypadku białka fuzyjnego Npro-pGH.
PL 200 225 B1
LISTA SEKWENCJI <110> Biochemie Gesellschaft m.b.H.
<120> Wytwarzanie protein <130> G-31110/A/BCK <140> PCT/EPO0/07643 <141> 2000-08-07 <160> 13 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 168 <212> PRT <213> Pestiwirus sp.
<400> 1
Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 1 5 10 15
Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30
Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45
His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60
Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80
Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95
PL 200 225 B1
Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys 100 105 110
Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125
Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 130 135 140
Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn 145 150 155 160
Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys 165 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Pestiwirus sp.
<400> 2
Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Określenie syntetycznej sekwencji: oligo-histydynowy pomocnik oczyszczania <400> 3
Met Ala Ser His His His His His His His 15 10
PL 200 225 B1 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220> <223> Określenie syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400 4 ataattacta gttgtttccc aaccattccc ttatccaggc c 41 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Określenie syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400 5 ataattggat cctcgagtta ttagaagcca cagctgccct ccac 44 <210 6 <211> 41 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220 <223> Określenie syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd <400 6 agggtatcta gaattctatg ccagtgggag tggaggaacc g 41 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220 <223> Określenie syntetycznej sekwencji: oligonukleotyd
PL 200 225 B1 <400> 7 agaattaagc ttctagatta ttagaagcca cagctgccct ccac 44 <210> 8 <211> 1072 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Określenie syntetycznej sekwencji: sekwencja pestiwirusa kombinowana z sekwencją Homo sapiens <400> 8 agggtatcta gaattctatg ccagtgggag tggaggaacc ggtgtatgac accgcgggga 60 gaccactatt tgggaaccca agtgaggtac acccacaatc aacgctgaag ctgccacacg 120 acagggggag aggagatatc agaacaacac tgagggacct acccaggaaa ggtgactgta 180 ggagtggcaa ccatctaggc ccggttagtg ggatatacat aaagcccggc cctgtctact 240 atcaggacta cacgggccca gtctatcaca gagctccttt agagttcttt gatgaggccc 300 agttctgcga ggtgactaag agaataggca gggtcacggg tagtgatggt aagctttacc 360 acatatatgt gtgcgtcgat ggttgcatac tgctgaaatt agccaaaagg ggcacaccca 420 gaaccctaaa gtggattagg aacttcacca actgtccatt atgggtaact agttgtttcc 480 caaccattcc cttatccagg ccttttgaca acgctatgct ccgcgcccat cgtctgcacc 540 agctggcctt tgacacctac caggagtttg aagaagccta tatcccaaag gaacagaagt 600 attcattcct gcagaacccc cagacctccc tctgtttctc agagtctatt ccgacaccct 660 ccaacaggga ggaaacacaa cagaaatcca acctagagct gctccgcatc tccctgctgc 720 tcatccagtc gtggctggag cccgtgcagt tcctcaggag tgtcttcgcc aacagcctgg 780 tgtacggcgc ctctgacagc aacgtctatg acctcctaaa ggacctagag gaaggcatcc 840 aaacgctgat ggggaggctg gaagatggca gcccccggac tgggcagatc ttcaagcaga 900 cctacagcaa gttcgacaca aactcacaca acgatgacgc actactcaag aactacgggc 960 tgctctactg cttcaggaag gacatggaca aggtcgagac attcctgcgc atcgtgcagt 1020 gccgctctgt ggagggcagc tgtggcttct aataatctag aagcttaatt ct 1072 <210> 9 <211> 344 <212> PRT <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Określenie syntetycznej sekwencji: sekwencja pestiwirusa kombinowana z sekwencją Homo sapiens
PL 200 225 B1 <400> 9
Met Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro 15 10 15
Leu Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu 20 25 30
Pro His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu ' 35 40 45
Pro Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser
55 60
Gly Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly 65 70 75 80
Pro Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe 85 90 95
Cys Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys 100 105 110
Leu Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu 115 120 125
Ala Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr 130 135 140
Asn Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser
145 150 155 160
Arg Pro Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gin Leu
165 170 175
Ala Phe Asp Thr Tyr Gin Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu 180 185 190
Gin Lys Tyr Ser Phe Leu Gin Asn Pro Gin Thr Ser Leu Cys Phe Ser 195 200 205
PL 200 225 B1
Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gin Gin Lys Ser 210 215 220
Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gin Ser Trp Leu
225 230 235 240
Glu Pro Val Gin Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr
245 250 255
Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu 260 265 270
Gly Ile Gin Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr 275 280 285
Gly Gin Ile Phe Lys Gin Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His 290 295 300
Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg
305 310 315 320
Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gin Cys Arg
325 330 335
Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 340 <210> 10 <211> 4840 <212> DMA <213> Syntetyczna sekwencja <220 <223> Określenie syntetycznej sekwencji: sekwencja plazmidu ekspresji zawierająca sekwencję pestiwirusa i sekwencję Homo sapiens <400> 10 gaattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt tatcacagtt 60 aaattgctaa cgcagtcagg caccgtgtat gaaatctaac aatgcgctca tcgtcatcct 120
PL 200 225 B1 cggcaccgtc accctggatg ctgtaggcat aggcttggtt atgccggtac tgccgggcct 180 cttgcgggat atcgtccatt ccgacagcat cgccagtcac tatggcgtgc tgctagcgct 240 atatgcgttg atgcaatttc tatgcgcacc cgttctcgga gcactgtccg accgctttgg 300 ccgccgccca gtcctgctcg cttcgctact tggagccact atcgactacg cgatcatggc 360 gaccacaccc gtcctgtgga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc 420 cacaggtącg gttgctggcg cctatatcgc cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg 480 ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg 540 gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg 600 cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag agcgtcgacc 660 gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat 720 cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc 780 gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc 840 gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac 900 caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccgacg cgctgggcta 960 cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc cccattatga ttcttctcgc 1020 ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg tccaggcagg tagatgacga 1080 ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc agcctaactt cgatcactgg 1140 accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc acatggaacg ggttggcatg 1200 gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg ttgcgtcgcg gtgcatggag 1260 ccgggccacc tcgacctgaa tggaagccgg cggcacctcg ctaacggatt caccactcca 1320 agaattggag ccaatcaatt cttgcggaga actgtgaatg cgcaaaccaa cccttggcag 1380 aacatateca tcgcgtccgc catctccagc agccgcacgc ggcgcatctc gggcagcgtt 1440 gggtcctggc cacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg 1500 cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac 1560 tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt 1620 tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc 1680 gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat 1740 cgaccctgag tgatttttct ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg tttaccctca 1800 caacgttcca gtaaccgggc atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag catcctctct 1860 cgtttcatcg gtatcattac ccccatgaac agaaattccc ccttacacgg aggcatcaag 1920 tgaccaaaca ggaaaaaacc gcccttaaca tggcccgctt tatcagaagc cagacattaa 1930 cgcttctgga gaaactcaac gagctggacg cggatgaaca ggcagacatc tgtgaatcgc 2040 ttcacgacca cgctgatgag ctttaccgca gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg 2100 aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg 2160 ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca 2220 tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca 2280 gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 2340 ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 2400 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 2460 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 2520 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 2580
PL 200 225 B1
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 2640
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 2700
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 2760
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 2820
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 2880
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 2940
gtt cttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 3000
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 3060
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 3120
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 3180
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 3240
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 3300
cctcgaggcc atccgtcagg atggccttct gcttaatttg atgcctggca gtttatggcg 3360
ggcgtcctgc ccgccaccct ccgggccgtt gcttcgcaac gttcaaatcc gctcccggcg 3420
gatttgtcct actcaggaga gcgttcaccg acaaacaaca gataaaacga aaggcccagt 3480
ctttcgactg agcctttcgt tttattctag attattagaa gccacagctg ccctccacag 3540
agcggcactg cacgatgcgc aggaatgtct cgaccttgtc catgtccttc ctgaagcagt 3600
agagcagccc gtagttcttg agtagtgcgt catcgttgtg tgagtttgtg tcgaacttgc 3660
tgtaggtctg cttgaagatc tgcccagtcc gggggctgcc atcttccagc ctccccatca 3720
gcgtttggat gccttcctct aggtccttta ggaggtcata gacgttgctg tcagaggcgc 3780
cgtacaccag gctgttggcg aagacactcc tgaggaactg cacgggctcc agccacgact 3840
ggatgagcag cagggagatg cggagcagct ctaggttgga tttctgttgt gtttcctccc 3900
tgttggaggg tgtcggaata gactctgaga aacagaggga ggtctggggg ttctgcagga 3960
atgaatactt ctgttccttt gggatatagg cttcttcaaa ctcctggtag gtgtcaaagg 4020
ccagctggtg cagacgatgg gcgcggagca tagcgttgtc aaaaggcctg gataagggaa 4080
tggttgggaa acaactagtt acccataatg gacagttggt gaagttccta atccacttta 4140
gggttctggg tgtgcccctt ttggctaatt tcagcagtat gcaaccatcg acgcacacat 4200
atatgtggta aagcttacca tcactacccg tgaccctgcc tattctctta gtcacctcgc 4260
agaactgggc ctcatcaaag aactctaaag gagctctgtg atagactggg cccgtgtagt 4320
cctgatagta gacagggccg ggctttatgt atatcccact aaccgggcct agatggttgc 4380
cactcctaca gtcacctttc ctgggtaggt ccctcagtgt tgttctgata tctcctctcc 4440
ccctgtcgtg tggcagcttc agcgttgatt gtgggtgtac ctcacttggg ttcccaaata 4500
gtggtctccc cgcggtgtca tacaccggtt cctccactcc cactggcata gaattctaga 4560
tacccttttt acgtgaactt gcgtactagt taactagttc gatgattaat tgtcaacagc 4620
tcatttcaga atatttgcca gaaccgttat gatgtcggcg caaaaaacat tatccagaac 4680
gggagtgcgc cttgagcgac acgaattatg cagtgattta cgacctgcac agccatacca 4740
cagcttccga ttggctgcct gacgccagaa gcattggtgc accgtgcagt cgagatgcgc 4800
gtcggcaccc tggcgatcac cgaccatgac accacagcat 4840
PL 200 225 B1 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220
<223> Określenie syntetycznej sekwencj i: oligonukleotyd
<400> 11 ttcccagcca tgcccttgtc c 21
<210 12 <211> 21 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja
<220> <223> Określenie syntetycznej sekwencj i: oligonukleotyd
<400> 12 gaaggcacag ctgctctcca c 21
<210 13 <211> 342 <212> PRT <213> Syntetyczna sekwencja
<220> <223> Określenie syntetycznej sekwencj i: sekwencja
pestiwirusa kombinowana z sekwencją świni <400 13
Met 1 Pro Val Gly Val 5 Glu Glu Pro Val Tyr 10 Asp Thr Ala Gly Arg 15 Pro
Leu Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu
20 25 30
Pro His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu
35 40 45
PL 200 225 B1
Pro Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser 50 55
Gly Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro 65 10
Pro Val Tyr His Arg Ala Pro Leu 85
Cys Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly 100
Leu Tyr His Ile Tyr Val Cys Val 115 120
Ala Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr 130 135
Asn Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser 145 150
Ser Leu Phe Ala Asn Ala Val Leu
165
Ala Ala Asp Thr Tyr Lys Glu Phe 180
Gin Arg Tyr Ser Ile Gin Asn Ala 195 200
Thr Ile Pro Ala Pro Thr Gly Lys 210 215
Glu Leu Leu Arg Phe Ser Leu Leu 225 230
Val Gin Phe Leu Ser Arg Val Phe 245
Ser Asp Arg Val Tyr Glu Lys Leu 260
Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser 60
Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly 75 80
Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe 90 95
Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys 105 110
Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu 125
Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr 140
Cys Phe Pro Ala Met Pro Leu Ser 155 160
Arg Ala Gin His Leu His Gin Leu 170 175
Glu Arg Ala Tyr Ile Pro Glu Gly 185 190
Gin Ala Ala Phe Cys Phe Ser Glu 205
Asp Glu Ala Gin Gin Arg Ser Val 220
Leu Ile Gin Ser Trp Leu Gly Pro 235 240
Thr Asn Ser Leu Val Phe Gly Thr 250 255
Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gin 265 270
PL 200 225 B1
Ala Leu Met Arg Glu 275 Leu Glu Asp Gly Ser 280 Pro Arg Al a 285 Gly Gin Ile
Leu Lys Gin Thr Tyr Asp Lys Phe Asp Thr Asn Leu Arg Ser Asp Asp
290 295 300
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr dy Leu Leu Ser Cys Phe Lys Lys Asp Leu
305 310 315 320
His Lys Ala Glu Thr Tyr Leu Arg Val Met Lys Cys Arg Arg Phe Val
325 330 335
Glu Ser Ser Cys Ala Phe

Claims (9)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu heterologicznego, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których:
    (i) hoduje się bakteryjną komórkę gospodarza, która jest transformowana wektorem ekspresyjnym, zawierającym cząsteczkę kwasu nukleinowego, kodującą białko fuzyjne, które zawiera polipeptyd, mający autoproteolityczną aktywność autoproteazy Npro pestiwirusa, i drugi polipeptyd, który jest polipeptydem heterologicznym, połączonym z końcem C pierwszego polipeptydu, przy czym drugi polipeptyd odcina się od białka fuzyjnego przez aktywność autoproteolityczną pierwszego polipeptydu, oraz hodowlę prowadzi się w warunkach, które powodują ekspresję białka fuzyjnego i tworzenie się odpowiednich cytoplazmatycznych ciałek inkluzyjnych, następnie (ii) wyodrębnia się ciałka inkluzyjne z komórki gospodarza, (iii) roztwarza się wyodrębnione ciałka inkluzyjne, (iv) rozcieńcza się zawiesinę ciałek inkluzyjnych do roztworu reakcyjnego, w którym przeprowadzi się odcięcie autoproteolityczne polipeptydu heterologicznego od białka fuzyjnego oraz (v) wyodrębnia się odcięty polipeptyd heterologiczny.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pestiwirus wybiera się z grupy obejmującej CSFV, BDV i BVDV.
  3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako pestiwirus stosuje się CSFV.
  4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że pierwszy polipeptyd obejmuje następującą sekwencję aminokwasową:
    (1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDL
    PRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYH
    IYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168), lub sekwencję aminokwasową będącą pochodną powyższej sekwencji, przy zachowaniu aktywności autoproteolitycznej.
  5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się pierwszy polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową od Glu22 do Cys168 autoproteazy Npro CSFV lub jej pochodnej o aktywności autoproteolitycznej, który zawiera Met na końcu N, a polipeptyd heterologiczny jest bezpośrednio połączony z aminokwasem Cys168 autoproteazy Npro z CSFV.
  6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się pierwszy polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów od Pro17 do Cys168 autoproteazy Npro z CSFV lub jej pochodnej o aktywno26
    PL 200 225 B1 ści proteolitycznej, który zawiera Met na końcu N, a polipeptyd heterologiczny jest bezpośrednio połączony z aminokwasem Cys168 autoproteazy Npro z CSFV.
  7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako cząsteczkę kwasu nukleinowego stosuje się DNA.
  8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wektor ekspresyjny stosuje się plazmid.
  9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórkę gospodarza stosuje się E. coli.
PL353101A 1999-08-09 2000-08-07 Sposób rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu heterologicznego PL200225B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT136799 1999-08-09
PCT/EP2000/007643 WO2001011057A1 (en) 1999-08-09 2000-08-07 Production of proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL353101A1 PL353101A1 (pl) 2003-10-20
PL200225B1 true PL200225B1 (pl) 2008-12-31

Family

ID=3512357

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL353101A PL200225B1 (pl) 1999-08-09 2000-08-07 Sposób rekombinacyjnego wytwarzania polipeptydu heterologicznego

Country Status (21)

Country Link
US (2) US6936455B1 (pl)
EP (1) EP1200604B1 (pl)
JP (1) JP4820512B2 (pl)
KR (1) KR20020026366A (pl)
CN (1) CN1230543C (pl)
AT (1) ATE335826T1 (pl)
AU (1) AU775662B2 (pl)
CA (1) CA2379571C (pl)
CZ (1) CZ302366B6 (pl)
DE (1) DE60029968T2 (pl)
ES (1) ES2269173T3 (pl)
HK (1) HK1047128B (pl)
HU (1) HU230231B1 (pl)
IL (1) IL147456A0 (pl)
MX (1) MXPA02001424A (pl)
NO (1) NO328339B1 (pl)
NZ (1) NZ516869A (pl)
PL (1) PL200225B1 (pl)
SK (1) SK287488B6 (pl)
TR (1) TR200200253T2 (pl)
WO (1) WO2001011057A1 (pl)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL203708B1 (pl) * 1999-08-09 2009-11-30 Sandoz Ag Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko fuzyjne, wektor ekspresyjny zawierający tę cząsteczkę oraz komórka gospodarza bakteryjnego zawierająca ten wektor
ES2453048T3 (es) 2004-03-30 2014-04-03 Relypsa, Inc. Polímeros de unión de ión y usos de los mismos
WO2006113958A2 (en) * 2005-04-26 2006-11-02 Sandoz Ag Affinity ligands
GB0508435D0 (en) * 2005-04-26 2005-06-01 Sandoz Ag Organic compounds
GB0508434D0 (en) * 2005-04-26 2005-06-01 Sandoz Ag Organic compounds
AU2011253661B2 (en) * 2005-04-26 2013-06-13 Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg Production of recombinant proteins by autoproteolytic cleavage of a fusion protein
JP5985394B2 (ja) * 2010-08-31 2016-09-06 天野エンザイム株式会社 酵素を用いた卵殻膜の可溶化方法
EP2684951A1 (en) 2012-07-13 2014-01-15 Sandoz Ag Method for producing a recombinant protein of interest
EP2746391A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Sandoz Ag Method for producing a recombinant protein of interest
EP2746390A1 (en) * 2012-12-19 2014-06-25 Sandoz Ag Method for producing a recombinant protein of interest
UY35874A (es) 2013-12-12 2015-07-31 Novartis Ag Un proceso para la preparación de una composición de proteínas pegiladas
RU2619217C1 (ru) * 2015-12-04 2017-05-12 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика") Температурочувствительный мутантный интеин для нерастворимой экспрессии предшественника целевого белка
CN114539425B (zh) * 2022-02-25 2023-04-28 湖南中晟全肽生化有限公司 一种提高线性多肽生物表达的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4743679A (en) 1986-02-24 1988-05-10 Creative Biomolecules, Inc. Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
EP0321973B1 (de) * 1987-12-23 1993-11-03 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Expression der viral kodierten Protease P2A des HRV2
DE69836075T2 (de) 1997-04-25 2007-06-06 SemBioSys Genetics, Inc., Calgary Verfahren zur spaltung von fusionproteinen
WO1999010483A2 (de) 1997-08-22 1999-03-04 Roche Diagnostics Gmbh Autokatalytisch aktivierbare vorstufen von proteasen und deren verwendung
AU9260598A (en) * 1997-08-22 1999-03-16 Boehringer Mannheim Gmbh Zymogenic protease precursors that can be autocatalytically activated and their use

Also Published As

Publication number Publication date
PL353101A1 (pl) 2003-10-20
SK287488B6 (sk) 2010-11-08
IL147456A0 (en) 2002-08-14
HUP0202519A3 (en) 2004-07-28
CN1230543C (zh) 2005-12-07
ES2269173T3 (es) 2007-04-01
ATE335826T1 (de) 2006-09-15
HK1047128B (zh) 2007-06-08
NO20020633L (no) 2002-04-05
CZ302366B6 (cs) 2011-04-13
NO328339B1 (no) 2010-02-01
KR20020026366A (ko) 2002-04-09
US20050186564A1 (en) 2005-08-25
JP2003506093A (ja) 2003-02-18
NZ516869A (en) 2004-01-30
CA2379571C (en) 2011-03-29
CA2379571A1 (en) 2001-02-15
DE60029968D1 (de) 2006-09-21
MXPA02001424A (es) 2002-08-12
AU775662B2 (en) 2004-08-12
CZ2002481A3 (cs) 2002-05-15
EP1200604B1 (en) 2006-08-09
US6936455B1 (en) 2005-08-30
JP4820512B2 (ja) 2011-11-24
DE60029968T2 (de) 2006-12-21
CN1369014A (zh) 2002-09-11
HU230231B1 (hu) 2015-10-28
WO2001011057A1 (en) 2001-02-15
NO20020633D0 (no) 2002-02-08
EP1200604A1 (en) 2002-05-02
HK1047128A1 (en) 2003-02-07
SK1852002A3 (en) 2002-07-02
HUP0202519A2 (en) 2002-10-28
TR200200253T2 (tr) 2002-05-21
AU6993300A (en) 2001-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mizuuchi et al. Efficient Mu transposition requires interaction of transposase with a DNA sequence at the Mu operator: implications for regulation
US20050186564A1 (en) Production of proteins
DK172480B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af moden human insulinlignende vækstfaktor (IGF-I) eller et human IGF-I-fusionsprotein, eksp
US7544512B2 (en) Method of producing insulinotropic GLP-1 (7-36) polypeptide and/or GLP-1 analogs
JPH0776599A (ja) ウシ成長ホルモンを生産し得る微生物
CZ203197A3 (cs) Způsob produkce rekombinantního humánního inzulinu
MXPA02001425A (es) Produccion de proteinas mediante disociacion autoproteolitica.
AU3758700A (en) Improved methods for recombinant peptide production
CN108085287B (zh) 一种重组谷氨酸棒状杆菌、其制备方法及其应用
JPH04504953A (ja) ヒトリラキシンの単離のための方法および組成物
CN113509542A (zh) 一种基于mRNA的表达白介素12针对肿瘤的药物及其制备方法
CN113265413B (zh) 一种假病毒的制备方法
CA2159079C (en) Methods and dna expression systems for over-expression of proteins in host cells
SK281946B6 (sk) Spôsob extrakcie periplazmatických proteínov z prokaryotických mikroorganizmov
CN110835631B (zh) 一种改造的sgRNA及其在提高碱基编辑效率中的应用
CN101985631B (zh) 一种棒状杆菌启动子探测载体及其构建方法和应用
CN110835630B (zh) 一种高效的sgRNA及其在基因编辑中的应用
EP0534705A2 (en) Expression of low molecular weight recombinant polypeptides
CN111996206A (zh) 光控无细胞蛋白质合成方法、该方法使用的质粒以及使用该方法的产品
RU2337964C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pAS-2, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ПРОИНСУЛИНА Aspart ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BAS2 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ПРОИНСУЛИНА Aspart
RU2730663C2 (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген Cas9 для гетерологичной экспрессии этого целевого гена в клетках человека и животных при реализации различных методов геномного редактирования, способ получения и применения генотерапевтического ДНК-вектора, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-Cas9, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
CN110628801A (zh) 一种蛋白表达及纯化的方法
CN114262682A (zh) 一种高效表达磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因工程菌株及其构建方法与应用
LT4034B (en) Process for enzymatic decomposition of recombinant proteins by means of iga-protease, fused protein, recombinant dna, cell
JPH07289270A (ja) ペプチド類の製造用ベクター