CN113265413B

CN113265413B - 一种假病毒的制备方法

Info

Publication number: CN113265413B
Application number: CN202110669475.XA
Authority: CN
Inventors: 金鑫浩; 张泽云; 张明程; 高静; 张瑜; 贾欣月; 蔡亦梅; 任鲁风
Original assignee: Beijing Integrated Biosystems Co ltd
Current assignee: Beijing Integrated Biosystems Co ltd; Beijing Linke Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-17
Filing date: 2021-06-17
Publication date: 2022-05-20
Anticipated expiration: 2041-06-17
Also published as: CN113265413A

Abstract

本发明提供了一种假病毒的制备方法，对现有载体进行改造，改造载体中包括优化的大肠杆菌MS2噬菌体的衣壳蛋白基因的序列，所述的序列为SEQ IDNO.1‑6中的一种或多种，改造载体转化细菌并表达以获得具有更高包装效率的假病毒。本发明提供的假病毒长期保存稳定性有所增强，对假病毒进行冻干，可以在室温保存更长时间。

Description

一种假病毒的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种假病毒的制备方法。

背景技术

装甲RNA(Armored RNA)技术是一种新的RNA质控品制备技术，该技术解决了传统RNA质控品稳定性差，存在生物传染隐患，且达不到监测核酸提取及反转录过程的目的等问题。装甲RNA技术的原理是将特定RNA序列通过RNA病毒或其它生物技术包装在保护性蛋白或多聚分子外壳中，可以稳定并保护核酸免于核酸酶降解。常见实行方式多将包含有大肠杆菌MS2噬菌体的衣壳蛋白基因的序列及外源基因克隆到表达载体中，这一载体能够将外源基因转录成RNA，并利用载体上MS2的外壳蛋白编码基因组装的外壳蛋白将其装配成二十面体RNA病毒结构的RNA-蛋白质复合体，我们称之为装甲RNA假病毒颗粒。

首先，RNA-蛋白质复合体的结构与RNA病毒相似，即都是蛋白外壳包裹核酸，因此可以把内标与病毒材料放在一起，共同经历核酸提取、反转录和PCR扩增，从而对RNA病毒的检测进行全程监控，避免出现假阴性结果。其次，装甲RNA技术得到的病毒样颗粒无传染性，不会对实验人员造成伤害，因此生物安全性较好。最后，由于这种病毒样颗粒具有耐核糖核酸酶的特性，所以作为RNA病毒检测的内标稳定性良好，并且易于保存。

中国专利201510243427.9中公开了一种应用于生物医学临床体外诊断领域中的包含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒及其制备方法。该假病毒颗粒是由MS2噬菌体衣壳蛋白包裹丙型肝炎病毒RNA的一种RNA-蛋白复合体，且为二十面体；设计并人工合成引物通过重叠剪接PCR的方法得到目的基因MS2，将其连接到质粒pET-32a(+)上得到重组质粒pET-MS2，将所得重组质粒pET-MS2与HCV片段连接得到pET-MS2-HCV重组质粒，将所得pET-MS2-HCV重组质粒导入大肠杆菌进行原核表达，采用超声破碎法释放病毒样颗粒，所得病毒样颗粒即为含丙型肝炎病毒RNA片段的假病毒颗粒。

中国专利201810544017.1中公开了肠道病毒PCR质控品装甲RNA及制备方法，该装甲RNA的表达载体为pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒，该表达载体pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后，离心收集沉淀，获得肠道病毒PCR质控品装甲RNA的病毒样颗粒，其中该表达载体pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒中；该装甲RNA储存时不会受到RNase酶降解，是性能稳定的肠道病毒PCR质控品。

但是现有技术中使用装甲RNA的方法表达包装的假病毒包装效率不高，且假病毒纯化工艺复杂，纯度不高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种假病毒的制备方法，对现有载体进行改造，以获得具有更高包装效率和表达效率的假病毒，以及更简单高效的纯化工艺。本发明提供的假病毒长期保存稳定性有所增强，对假病毒进行冻干，可以在室温保存更长时间。

一方面，本发明提供了一种改造载体。

所述的改造载体中包括以下序列：

(1)优化后的表达衣壳蛋白的DNA序列，所述的DNA序列选自SEQ ID NO.1-6或其变体，优选为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2；

(2)表达成熟蛋白的DNA序列SEQ ID NO.7或其优化后的序列；

(3)包装识别位点SEQ ID NO.8；

(4)His标签SEQ ID NO.9；

(5)IPC靶序列。

优选地，所述的改造载体是在pET28a载体的基础上改造的。

优选地，表达成熟蛋白的DNA序列插入pET28a载体的酶切位点为Nco I/HindIII位点。

优选地，表达衣壳蛋白的DNA序列插入pET28a载体的酶切位点为HindIII/XhoI。

优选地，所述的表达衣壳蛋白的DNA序列包括SEQ ID NO.1-6或其变体中的2个以上的序列的串联。

优选地，所述的IPC靶序列为SEQ ID NO.10。

优选地，所述的改造载体上包括SEQ ID NO.11。

所述的载体中表达成熟蛋白的DNA、表达衣壳蛋白的DNA序列、靶序列的插入顺序无限制。

优选地，所述载体中靶序列、表达成熟蛋白的DNA、表达衣壳蛋白的DNA序列从上游到下游分别为表达成熟蛋白的DNA、表达衣壳蛋白的DNA、靶序列。

另一方面，本发明提供一种假病毒的制备方法。

所述的制备方法包括以下步骤：

(1)pET28a载体Nco I/Hind III位点插入表达成熟蛋白的DNA序列；

(2)步骤(1)得到的载体插入优化的表达衣壳蛋白的DNA序列、His标签、包装识别位点和IPC靶序列，获得改造pET28a载体；

(3)改造pET28a载体转化细菌后进行培养；

(4)培养完成后收获和裂解细菌、镍柱纯化得到假病毒。

具体地，所述的步骤(1)中的表达成熟蛋白的DNA序列不需要高表达，所述的表达成熟蛋白的DNA序列包括SEQ ID NO.7或其优化后序列。

优选地，所述的步骤(1)通过直接人工合成完成，表达成熟蛋白的DNA序列为SEQID NO.12，人工合成后的序列为SEQ ID NO.16。

具体地，所述的步骤(2)的表达衣壳蛋白的DNA序列选自SEQ ID NO.1-6或其变体；优选为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

优选地，所述的His标签为SEQ ID NO.9。

优选地，所述的包装识别位点为SEQ ID NO.8。

优选地，所述的IPC靶序列为SEQ ID NO.10。

优选地，所述的步骤(2)的插入位点为HindIII/XhoI位点。

优选地，所述的步骤(2)中优化的表达衣壳蛋白的DNA序列，His标签SEQ ID NO.9，包装识别位点SEQ ID NO.8，IPC靶序列在同一序列上，整体插入步骤(1)得到的载体。

进一步优选地，所述的所述的步骤(2)中优化的表达衣壳蛋白的DNA序列，His标签，包装识别位点，IPC靶序列在SEQ ID NO.13上，SEQ ID NO.13插入步骤(1)得到的载体的HindIII/XhoI位点。

再一方面，本发明提供了前述改造载体在制备假病毒中的应用。

所述的改造载体通过转化工程菌，然后将菌液进行超声破碎裂解出病毒样颗粒物。

又一方面，本发明提供了一种假病毒。

所述的假病毒通过前述制备方法制备得到。

又一方面，本发明提供了前述改造载体和/或前述制备方法和/或前述假病毒在开发抗病毒药物和疫苗中的应用。

优选地，所述的应用为将前述假病毒作为质控品。

本发明的有益效果：

1、通过对载体进行改造，使假病毒表达效率提高；

2、通过对载体进行改造，使假病毒的包装效率提高；

3、通过对载体进行改造，使假病毒的纯化效率提高；

4、假病毒长期保存稳定性增强；

5、对假病毒进行冻干，可以在室温保存更长时间。

附图说明

图1为纯化后的假病毒衣壳蛋白二聚体进行SDS-PAGE电泳检测结果。

图2为IPC假病毒与IPC体外转录RNA稀释到相同拷贝数同时进行RT-qPCR的扩增曲线。

图3为测定假病毒中DNA含量反转录荧光定量PCR检测结果。

图4为假病毒的长期保存稳定性检测结果。

图5为假病毒的均一性测试结果。

图6为IPC冻干球37℃放置30天后与对照体系的扩增曲线对比。

图7为IPC冻干球37℃放置60天后与对照体系的扩增曲线对比。

需要特别说明的是，图2-7为分析软件直出图，坐标轴与曲线均保留了原始图片格式，其相关结果数据已在相关实施例中公开，不影响结果的判定。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1一种假病毒的制备方法

(1)pZSR-IPC载体构建

pET28a载体上Nco I/HindIII位点设计插入序列SEQ ID NO.12(包含成熟蛋白SEQID NO.7)，插入序列后具体载体序列如SEQ ID NO.16所示，该部分委托武汉金开瑞生物工程有限公司合成。SEQ ID NO.13(包括表达衣壳蛋白的DNA序列SEQ ID NO.2，His标签SEQID NO.9，包装识别位点SEQ ID NO.8以及靶序列SEQ ID NO.10)克隆到合成pET28a载体SEQID NO.16的HindIII/XhoI位点。按照下表配制酶切体系(50μL)：

37℃酶切过夜后，胶回收纯化。

将纯化后的载体与片段按如下体系进行配制：

试剂	体积(μL)
		T4缓冲液	2
载体80ng	2.5
		插入片段50ng	6.5
H<sub>2</sub>O至20μL	8
		T4连接酶	1

室温连接30min得到包含pZSR-IPC(SEQ ID NO.11)的改造载体。pZSR-IPC上包括SEQ ID NO.1所示的表达衣壳蛋白的DNA序列，其具体位置在SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13之间，被aagctt(HindIII位点)分成了两部分。

pZSR-IPC常规方法转化BL21(DE3)感受态细胞。

pZSR-IPC转化后挑取3个克隆进行PCR鉴定，体系如下：

其中克隆1(pZSR-IPC C1)和克隆2(pZSR-IPC C2)得到阳性扩增片段，表明连接成功。

(2)细胞表达

1.小量接种阳性克隆于培养基。

2.取部分菌液进行菌种冻存。

3.将剩余菌液加1mM的IPTG，37℃诱导培养4小时，收获细胞，裂解取上清，镍柱纯化后进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示，假病毒衣壳蛋白二聚体大小为28kD(MS2噬菌体衣壳蛋白分子量约13kD，串联二聚体加上标签后约为28kD)。

具体步骤如下：

1)收集的表达冻存菌用10mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl30mL悬浮；

2)超声裂解30min，50％功率，超声3秒，停顿9秒；

3)离心分离裂解上清，12000RPM，15min，4℃，留样；上清液中加入核酸酶(此步目的在于降解宿主核酸，由于蛋白包裹后对于目的RNA有保护作用，可避免目的RNA降解)，并在37℃孵育30min；

4)50％饱和硫酸铵沉淀，离心去上清；

5)沉淀用10mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，10mM咪唑30mL重溶；

6)离心分离重溶上清，12000RPM，15min，4℃，留样；

7)镍柱用10mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，10mM咪唑50mL平衡；

8)样品上10mL镍柱，流速2.5mL/min，穿液留样；

9)镍柱用10mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，10mM咪唑50mL洗涤；

10)镍柱用10mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，30mM咪唑100mL洗涤，流速2.5mL/min；

11)镍柱用10mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，300mM咪唑洗脱，流速2.5mL/min，分别接洗脱样品，留样；

12)洗脱样品用STE溶液透析；

13)样品保存。

(3)包装效率的测定

将IPC假病毒与IPC体外转录RNA稀释到相同拷贝数同时进行RT-qPCR扩增，观察假病毒与体外转录RNA的Ct值差别，结果如图2所示。

结果表明：相同实验条件下，pZSR-IPC假病毒与相同拷贝数的IPC体外转录RNA同时扩增的扩增曲线对比，假病毒的包装效率接近100％。

(4)假病毒中DNA污染的测定

将假病毒稀释到5×10⁷copies，进行一步法反转录荧光定量PCR检测，同时做不加反转录酶的对照，测定假病毒中DNA含量，结果如图3所示。

结果表明，DNA扩增曲线与RNA整体扩增曲线相差15个Ct，相差3.2×10⁴倍，对实际反应中影响较小，可以忽略。

实施例2假病毒的长期保存稳定性检测

选用实施例1获得的假病毒进行以下实验：

分别于37℃放置7d、14d、30d和60d，然后进行样品处理、一步法反转录荧光定量PCR检测，同时将对照假病毒放置于-20℃保存，比较两者Ct值的变化。

稳定性实验结果见图4：37℃放置不同时间后的Ct值变化趋势表明，制备的病毒样颗粒在37℃至少可以储存60天，稳定性良好。

实施例3假病毒的均一性测试

将假病毒分装到8管中，4℃放置7d后，同时做一步法反转录荧光定量PCR，结果见图5，得到的CV值如下表，说明假病毒均一性较好；

由上表可以看出，假病毒CV值为4.068％，均一性较好。

实施例4假病毒的冻干保存实验

对实施例1得到的假病毒进行冻干，步骤如下：

(1)配制冻干体系

按下表配制冻干体系：

(2)冻干实验

使用冻干机进行冻干，冻干程序如下：

对以上方法获得的假病毒进行以下实验：

分别于37℃放置30d和60d，然后进行样品处理、反转录和荧光定量PCR检测，比较其Ct值的变化，图6为IPC冻干球37℃放置30天后与对照体系的扩增曲线对比，图7为IPC冻干球37℃放置60天后与对照体系的扩增曲线对比，具体对比结果数据如下表：

实验结果表明：37℃放置不同时间后的Ct值变化趋势表明，制备的病毒样颗粒冻干品在37℃至少可以储存60天，稳定性良好。

序列表

<110> 北京中科生仪科技有限公司

<120> 一种假病毒的制备方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcttcta acttcactca gttcgttctg gtcgacaatg gtggcactgg tgatgtgacc 60

gtagcaccga gcaactttgc taatggtgtc gcagaatgga tcagctctaa ctcccgttct 120

caagcttaca aagtgacctg cagcgttcgt cagagctctg cgcagaatcg caaatacacc 180

atcaaagtcg aggttccgaa agtggcaacc cagactgttg gtggtgtaga actgccagtt 240

gctgcatggc gttcttactt gaacatggaa ctgaccattc cgatcttcgc tacgaactct 300

gactgcgaac tgattgtcaa ggcaatgcaa ggtcttctga aagatggcaa tccgattccg 360

tctgcgatcg cagccaactc tggcatctat gctaacttca ctcagtttgt tctcgtcgac 420

aatggtggta cc 432

<210> 2

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtaccggtg atgtgactgt cgcaccaagc aacttcgcga acggtgtcgc tgaatggatc 60

tcttccaact ctcgttctca ggcgtacaaa gtaacttgta gcgttcgtca gagctctgct 120

cagaatcgca agtacaccat caaagtcgaa gtaccgaaag tggcaaccca gaccgttggt 180

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gatggcaacc cgattccatc tgcaatcgca gctaactctg gtatctac 348

<210> 3

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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gtggccccca gcaacttcgc caacggcgtg gccgagtgga tcagcagcaa cagcaggagc 120

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gccgcctgga ggagctacag gaacatggag ctgaccatcc ccatcttcgc caccaacagc 300

gactgcgagc tgatcgtgaa ggccatgcag ggcctgctga aggacggcaa ccccatcccc 360

agcgccatcg ccgccaacag cggcatctac gccaacttca cccagttcgt gctggtggac 420

aacggcggca cc 432

<210> 4

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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gacggcaacc ccatccccag cgccatcgcc gccaacagcg gcatctac 348

<210> 5

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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aacggcggca cc 432

<210> 6

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 1173

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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tacgcggacg gtgagactga agataactca ttctctttaa aatatcgttc gaactggact 120

cccggtcgtt ttaactcgac tggggccaaa acgaaacagt ggcactaccc ctctccgtat 180

tcacgggggg cgttaagtgt cacatcgata gatcaaggtg cctacaagcg aagtgggtca 240

tcgtggggtc gcccgtacga ggagaaagcc ggtttcggct tctccctcga cgcacgctcc 300

tgctacagcc tcttccctgt aagccagaac ttgacttaca tcgaagtgcc gcagaacgtt 360

gcgaaccggg cgtcgaccga agtcctgcaa aaggtcaccc agggtaattt taaccttggt 420

gttgctttag cagaggccag gtcgacagcc tcacaactcg cgacgcaaac cattgcgctc 480

gtgaaggcgt acactgccgc tcgtcgcggt aattggcgcc aggcgctccg ctaccttgcc 540

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aatggccgtc tgtcgtatcc agctgcaaac ttccagacaa cgtgcaacat atcgcgacgt 780

atcgtgatat ggttttacat aaacgatgca cgtttggcat ggttgtcgtc tctaggtatc 840

ttgaacccac taggtatagt gtgggaaaag gtgcctttct cattcgttgt cgactggctc 900

ctacctgtag gtaacatgct cgaaggcctt acggcccccg tgggatgctc ctacatgtca 960

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caatccgtat ggccaacaac tggcgcgtac gtaaagtctc ctttctcgat ggtccatacc 1140

ttagatgcgt tagcattaat caggcaacgg ctc 1173

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acatgaggat cacccatgt 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

catcaccatc accatcac 18

<210> 10

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cacttatgac tcagataact taacagcaga gtctcgtcga 100

<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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cctcttccct gtaagccaga acttgactta catcgaagtg ccgcagaacg ttgcgaaccg 420

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gactgtcgca ccaagcaact tcgcgaacgg tgtcgctgaa tggatctctt ccaactctcg 1800

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caccatcaaa gtcgaagtac cgaaagtggc aacccagacc gttggtggcg tagaacttcc 1920

agtagctgca tggcgatctt acctgaatat ggaactgacc attccgatct tcgctaccaa 1980

ttctgactgc gagctgatcg tcaaagcaat gcaaggtcta ttgaaagatg gcaacccgat 2040

tccatctgca atcgcagcta actctggtat ctactaatag cgccggccag cggccgcata 2100

atgcttaagt cgaacagaaa gtaatcgtat tgtacacggc cgcataatcg aaattaatac 2160

gactcactat agggagacca caacggtttc cctctaggat cctctagaag ttgcagtgta 2220

accgtcatgt accagtaatc tgcgtcgcac gtgtgcacct agtctaatca cttatgactc 2280

agataactta acagcagagt ctcgtcgaac atgaggatca cccatgtact agttaatgat 2340

agctcgag 2348

<210> 12

<211> 1391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gagaacggga gttagagctg atccattctg cgacaccatt agcaaagttg ctcggtgcta 60

cggtcacatc accagtgcca ccattgtcga ccagaacgaa ctgagtgaag ttagaagcca 120

taagtatatc tccttcttat acttaactaa tatactaaga tggctaacga gagagccgtt 180

gcctgattaa tgctaacgca tctaaggtat ggaccatcga gaaaggagac tttacgtacg 240

cgccagttgt tggccatacg gattgtaccc ctcgatgcat ggctgagatt tgggccttag 300

cagtgccctg tctctccaca gtccacccgt agggagcgtc aacgcttatg atggactcac 360

ccgttattac gtcagtaact gttcctgaca tgtaggagca tcccacgggg gccgtaaggc 420

cttcgagcat gttacctaca ggtaggagcc agtcgacaac gaatgagaaa ggcacctttt 480

cccacactat acctagtggg ttcaagatac ctagagacga caaccatgcc aaacgtgcat 540

cgtttatgta aaaccatatc acgatacgtc gcgatatgtt gcacgttgtc tggaagtttg 600

cagctggata cgacagacgg ccatttaact tgatgttagt accgacctga cgtacggctc 660

tcataggaag aaactcttga aggtgaacct tcgtaagcat ctcataggca ccctggatat 720

cactcattag tggtaaccaa ccgaactgca actccaacca cctgccggcc acgtgttttg 780

atcgaaactt tcgatcttcg tttagggcaa ggtagcggag cgcctggcgc caattaccgc 840

gacgagcggc agtgtacgcc ttcacgagcg caatggtttg cgtcgcgagt tgtgaggctg 900

tcgacctggc ctctgctaaa gcaacaccaa ggttaaaatt accctgggtg accttttgca 960

ggacttcggt cgacgcccgg ttcgcaacgt tctgcggcac ttcgatgtaa gtcaagttct 1020

ggcttacagg gaagaggctg tagcaggagc gtgcgtcgag ggagaagccg aaaccggctt 1080

tctcctcgta cgggcgaccc cacgatgacc cacttcgctt gtaggcacct tgatctatcg 1140

atgtgacact taacgccccc cgtgaatacg gagaggggta gtgccactgt ttcgttttgg 1200

ccccagtcga gttaaaacga ccgggagtcc agttcgaacg atattttaaa gagaatgagt 1260

tatcttcagt ctcaccgtcc gcgtaaacgc gaacggaggg gacgaaggtc tcgttctccc 1320

tatcaagggt actaaaagct cgcacaggtc aaacctccta ggaatggaat tccggctacc 1380

tacagcgata g 1391

<210> 13

<211> 951

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aagcttacaa agtgacctgc agcgttcgtc agagctctgc gcagaatcgc aaatacacca 60

tcaaagtcga ggttccgaaa gtggcaaccc agactgttgg tggtgtagaa ctgccagttg 120

ctgcatggcg ttcttacttg aacatggaac tgaccattcc gatcttcgct acgaactctg 180

actgcgaact gattgtcaag gcaatgcaag gtcttctgaa agatggcaat ccgattccgt 240

ctgcgatcgc agccaactct ggcatctatg ctaacttcac tcagtttgtt ctcgtcgaca 300

atggtggtac ccatcaccat caccatcacg gtaccggtga tgtgactgtc gcaccaagca 360

acttcgcgaa cggtgtcgct gaatggatct cttccaactc tcgttctcag gcgtacaaag 420

taacttgtag cgttcgtcag agctctgctc agaatcgcaa gtacaccatc aaagtcgaag 480

taccgaaagt ggcaacccag accgttggtg gcgtagaact tccagtagct gcatggcgtt 540

cttacctgaa tatggaactg accattccga tcttcgctac caattctgac tgcgagctga 600

tcgtcaaagc aatgcaaggt ctgttgaaag atggcaaccc gattccatct gcaatcgcag 660

ctaactctgg tatctactaa tagcgccggc cagcggccgc ataatgctta agtcgaacag 720

aaagtaatcg tattgtacac ggccgcataa tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 780

ccacaacggt ttccctctag gatcctctag aagttgcagt gtaaccgtca tgtaccagta 840

atctgcgtcg cacgtgtgca cctagtctaa tcacttatga ctcagataac ttaacagcag 900

agtctcgtcg aacatgagga tcacccatgt actagttaat gatagctcga g 951

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agttgcagtg taaccgtcat gta 23

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcgacgagac tctgctgtta a 21

<210> 16

<211> 6643

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttga 180

gaacgggagt tagagctgat ccattctgcg acaccattag caaagttgct cggtgctacg 240

gtcacatcac cagtgccacc attgtcgacc agaacgaact gagtgaagtt agaagccata 300

agtatatctc cttcttatac ttaactaata tactaagatg gctaacgaga gagccgttgc 360

ctgattaatg ctaacgcatc taaggtatgg accatcgaga aaggagactt tacgtacgcg 420

ccagttgttg gccatacgga ttgtacccct cgatgcatgg ctgagatttg ggccttagca 480

gtgccctgtc tctccacagt ccacccgtag ggagcgtcaa cgcttatgat ggactcaccc 540

gttattacgt cagtaactgt tcctgacatg taggagcatc ccacgggggc cgtaaggcct 600

tcgagcatgt tacctacagg taggagccag tcgacaacga atgagaaagg caccttttcc 660

cacactatac ctagtgggtt caagatacct agagacgaca accatgccaa acgtgcatcg 720

tttatgtaaa accatatcac gatacgtcgc gatatgttgc acgttgtctg gaagtttgca 780

gctggatacg acagacggcc atttaacttg atgttagtac cgacctgacg tacggctctc 840

ataggaagaa actcttgaag gtgaaccttc gtaagcatct cataggcacc ctggatatca 900

ctcattagtg gtaaccaacc gaactgcaac tccaaccacc tgccggccac gtgttttgat 960

cgaaactttc gatcttcgtt tagggcaagg tagcggagcg cctggcgcca attaccgcga 1020

cgagcggcag tgtacgcctt cacgagcgca atggtttgcg tcgcgagttg tgaggctgtc 1080

gacctggcct ctgctaaagc aacaccaagg ttaaaattac cctgggtgac cttttgcagg 1140

acttcggtcg acgcccggtt cgcaacgttc tgcggcactt cgatgtaagt caagttctgg 1200

cttacaggga agaggctgta gcaggagcgt gcgtcgaggg agaagccgaa accggctttc 1260

tcctcgtacg ggcgacccca cgatgaccca cttcgcttgt aggcaccttg atctatcgat 1320

gtgacactta acgccccccg tgaatacgga gaggggtagt gccactgttt cgttttggcc 1380

ccagtcgagt taaaacgacc gggagtccag ttcgaacgat attttaaaga gaatgagtta 1440

tcttcagtct caccgtccgc gtaaacgcga acggagggga cgaaggtctc gttctcccta 1500

tcaagggtac taaaagctcg cacaggtcaa acctcctagg aatggaattc cggctaccta 1560

cagcgatagc catggtatat ctccttctta aagttaaaca aaattatttc tagaggggaa 1620

ttgttatccg ctcacaattc ccctatagtg agtcgtatta atttcgcggg atcgagatct 1680

cgatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg 1740

gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga 1800

gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca 1860

tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg 1920

gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg agatcccgga caccatcgaa 1980

tggcgcaaaa cctttcgcgg tatggcatga tagcgcccgg aagagagtca attcagggtg 2040

gtgaatgtga aaccagtaac gttatacgat gtcgcagagt atgccggtgt ctcttatcag 2100

accgtttccc gcgtggtgaa ccaggccagc cacgtttctg cgaaaacgcg ggaaaaagtg 2160

gaagcggcga tggcggagct gaattacatt cccaaccgcg tggcacaaca actggcgggc 2220

aaacagtcgt tgctgattgg cgttgccacc tccagtctgg ccctgcacgc gccgtcgcaa 2280

attgtcgcgg cgattaaatc tcgcgccgat caactgggtg ccagcgtggt ggtgtcgatg 2340

gtagaacgaa gcggcgtcga agcctgtaaa gcggcggtgc acaatcttct cgcgcaacgc 2400

gtcagtgggc tgatcattaa ctatccgctg gatgaccagg atgccattgc tgtggaagct 2460

gcctgcacta atgttccggc gttatttctt gatgtctctg accagacacc catcaacagt 2520

attattttct cccatgaaga cggtacgcga ctgggcgtgg agcatctggt cgcattgggt 2580

caccagcaaa tcgcgctgtt agcgggccca ttaagttctg tctcggcgcg tctgcgtctg 2640

gctggctggc ataaatatct cactcgcaat caaattcagc cgatagcgga acgggaaggc 2700

gactggagtg ccatgtccgg ttttcaacaa accatgcaaa tgctgaatga gggcatcgtt 2760

cccactgcga tgctggttgc caacgatcag atggcgctgg gcgcaatgcg cgccattacc 2820

gagtccgggc tgcgcgttgg tgcggatatc tcggtagtgg gatacgacga taccgaagac 2880

agctcatgtt atatcccgcc gttaaccacc atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa 2940

accagcgtgg accgcttgct gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg 3000

ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc accctggcgc ccaatacgca aaccgcctct 3060

ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc 3120

gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtaag ttagctcact cattaggcac cgggatctcg 3180

accgatgccc ttgagagcct tcaacccagt cagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac 3240

tatcgtcgcc gcacttatga ctgtcttctt tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgccggc 3300

agcgctctgg gtcattttcg gcgaggaccg ctttcgctgg agcgcgacga tgatcggcct 3360

gtcgcttgcg gtattcggaa tcttgcacgc cctcgctcaa gccttcgtca ctggtcccgc 3420

caccaaacgt ttcggcgaga agcaggccat tatcgccggc atggcggccc cacgggtgcg 3480

catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta 3540

gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc 3600

gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg 3660

gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc gcaggatgct gctggctacc 3720

ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat tgaccctgag tgatttttct 3780

ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg tttaccctca caacgttcca gtaaccgggc 3840

atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag catcctctct cgtttcatcg gtatcattac 3900

ccccatgaac agaaatcccc cttacacgga ggcatcagtg accaaacagg aaaaaaccgc 3960

ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg cttctggaga aactcaacga 4020

gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt cacgaccacg ctgatgagct 4080

ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 4140

cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 4200

cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag 4260

cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 4320

atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt 4380

ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 4440

ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 4500

tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 4560

tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 4620

gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 4680

ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 4740

tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 4800

agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 4860

atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 4920

acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 4980

actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 5040

tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 5100

tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 5160

tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 5220

tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat gagccatatt 5280

caacgggaaa cgtcttgctc taggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat 5340

gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat 5400

gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat 5460

gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc 5520

aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccgggaaa 5580

acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg 5640

gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat 5700

cgcgtatttc gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt 5760

gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataaa 5820

cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt 5880

atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac 5940

cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag 6000

aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat 6060

ttgatgctcg atgagttttt ctaagaatta attcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 6120

ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgaaat 6180

tgtaaacgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt 6240

taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg 6300

gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt 6360

caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc 6420

aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg 6480

atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa 6540

aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc 6600

cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg cca 6643

Claims

1.一种改造载体，其特征在于，所述的改造载体中包括序列SEQ ID NO.11。

2.一种假病毒的制备方法，其特征在于，所述的制备方法中采用权利要求1所述的改造载体转化细菌后制备。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）pET28a载体Nco I/Hind III位点插入表达成熟蛋白的DNA序列；

（2）步骤（1）得到的载体HindIII/XhoI位点插入优化的表达衣壳蛋白的DNA序列、His标签、包装识别位点和IPC靶序列，获得改造pET28a载体；

（3）改造pET28a载体转化细菌后进行培养；

（4）培养完成后收获和裂解细菌、镍柱纯化得到假病毒。

4.权利要求1所述的改造载体在制备假病毒中的应用。

5.一种假病毒，其特征在于，所述的假病毒通过权利要求2-3任一项所述的制备方法制备得到。

6.权利要求1所述的改造载体和/或权利要求5所述的假病毒在制备抗病毒药物和疫苗中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用为将权利要求5所述的假病毒作为质控品。