CN110628801A - 一种蛋白表达及纯化的方法 - Google Patents

一种蛋白表达及纯化的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110628801A
CN110628801A CN201910955181.6A CN201910955181A CN110628801A CN 110628801 A CN110628801 A CN 110628801A CN 201910955181 A CN201910955181 A CN 201910955181A CN 110628801 A CN110628801 A CN 110628801A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gfp
protein
gene
expression
expression vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910955181.6A
Other languages
English (en)
Inventor
崔格特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Booute Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Wuhan Booute Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Booute Biological Technology Co Ltd filed Critical Wuhan Booute Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201910955181.6A priority Critical patent/CN110628801A/zh
Publication of CN110628801A publication Critical patent/CN110628801A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种蛋白表达及纯化的方法，首先构建含有绿色荧光蛋白gfp基因的表达载体，将目的蛋白基因插入该表达载体中，再将含有绿色荧光蛋白GFP和目的蛋白融合基因的表达载体转入表达菌株中诱导表达，通过在荧光显微镜下观察表达菌株是否发出绿色荧光来判断融合蛋白是否被成功表达。表达出融合蛋白后，通过亲和层析纯化的方法获得纯融合蛋白，蛋白酶切除GFP蛋白，获得纯目的蛋白。该方法可以直观检测目的蛋白的表达情况，方便快捷，且纯化蛋白的效果好。

Description

一种蛋白表达及纯化的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蛋白表达及纯化的方法。
背景技术
绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)，由下村修等人1962年在水母中发现，其由gfp基因编码，该蛋白在蓝色波长光线激发下会发出绿色荧光，这使得绿色荧光蛋白GFP作为标签蛋白在生物技术领域被广泛使用。GFP介导的融合蛋白标签技术是20世纪末兴起的一种基于报告基因的重组DNA技术，此标签技术可应用于细胞内基因表达水平的检测、蛋白质的细胞内原位示踪与定位、目的蛋白的纯化以及增强重组蛋白的可溶性及稳定性等。
目的蛋白在原核系统中的表达和纯化是分子生物学研究和生物技术产业化发展过程中的重要工具，是对目的蛋白功能和性质研究的基础，更促进了现代生物学科迅猛发展。在各种版本的分子生物学实验指南中，目的蛋白的表达和纯化的基本流程是：1、将目的基因克隆到合适的表达载体上后导入原核细胞表达系统菌株；2、诱导表达菌株表达目的蛋白；3、通过目的蛋白所带的融合蛋白标签如GST、His等，选择不同性质的层析柱料将目的蛋白与其它蛋白分离，从而达到纯化目的蛋白的目的。
然而目前没有直观实时检测目的蛋白表达纯化情况的方法。根据目前常用的实验技术，无论是先少量诱导后检测目的蛋白是否表达，还是最后检测是否通过层析柱料得到了纯化的目的蛋白，都需要将蛋白样品通过十二烷基硫酸铵-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并对蛋白进行染色的方法来检测目的蛋白表达纯化情况。SDS-PAGE检测蛋白需要先将蛋白样品加上样缓冲液制样，配制聚丙烯酰胺凝胶，然后电泳大约1个小时，最后还需要将蛋白染色才能最终知道目的蛋白是否已经表达或者得到纯化，这些检测都需要花费很多的步骤和时间。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种蛋白表达及纯化的方法，便于直观检测目的蛋白表达纯化情况，操作简便快捷，正确率高，不需要进行反复的筛选验证，节约时间，节约成本。
本发明的技术方案是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种蛋白表达的方法，包括如下步骤：
S1、绿色荧光蛋白gfp基因的扩增，扩增上游引物设置有编码烟草蚀纹病毒蛋白酶识别位点的序列，gfp基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
S2、将步骤S1所述gfp基因连接到质粒pET-28a上，得到表达载体pET-28a-gfp；
S3、扩增编码目的蛋白X的基因x；
S4、将步骤S3所述基因x连接到表达载体pET-28a-gfp上，得到表达载体pET-28a-x-gfp；
S5、将表达载体pET-28a-x-gfp转入表达菌株中诱导表达融合蛋白X-GFP。
在以上技术方案的基础上，优选的，在构建所述表达载体pET-28a-gfp过程中，在gfp基因上带有限制性内切酶XhoI的酶切位点。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述表达载体pET-28a-gfp的完整核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
在以上技术方案的基础上，在所述表达载体pET-28a-gfp上，绿色荧光蛋白gfp基因上游有多克隆位点，用于插入目的基因，根据目的基因碱基数目插入到合适酶切位点之间，使得目的蛋白与GFP蛋白能融合表达。
在以上技术方案的基础上，所述编码目的蛋白X的基因x序列中不含翻译终止密码子，扩增所述gfp基因时在其3’端引入翻译终止密码子。
在以上技术方案的基础上，还包括步骤S6，通过在荧光显微镜下观察表达菌株是否发出绿色荧光来判断融合蛋白是否被成功表达。
第二方面，本发明提供了一种蛋白纯化的方法，包括以下步骤，
S7、对于本发明第一方面步骤S5得到的融合蛋白X-GFP，利用Ni离子亲和层析柱纯化；
S8、用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除GFP蛋白，得到纯目的蛋白X。
本发明的蛋白表达及纯化的方法相对于现有技术具有以下有益效果：
1.通过将目的蛋白与绿色荧光蛋白GFP的融合表达来直观检测目的蛋白的表达纯化情况，方便快捷，解决目前体外表达纯化的目的蛋白需要通过SDS-PAGE来检测、需要大量额外的时间来进行实验操作和其它实验试剂的配制，并且不能实时直观检测的技术问题；
2.通过在gfp基因上带限制性内切酶XhoI的酶切位点，使得载体pET-28a-gfp不能正常表达GFP蛋白，在没有插入目的基因时表达菌株不会发出绿色荧光，能作为阴性对照；
3.gfp基因上游的多克隆位点可用于插入各种目的蛋白基因，根据目的基因碱基数目插入到合适酶切位点之间，使得目的蛋白与GFP蛋白能融合表达，正常发出绿色荧光，不受载体pET-28a-gfp表达菌株的干扰；
4.限制性内切酶XhoI的酶切位点位于多克隆位点的末端，这使得gfp基因上游可插入的目的基因有更多选择性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1表达载体pET-28a-gfp的构建示意图；
图2为带pET-28a-gfp载体的表达菌株在荧光显微镜下的图片(A)白光视野，(B)为荧光视野；
图3为实施例2表达载体pET-28a-fleQ-gfp的图谱；
图4为实施例2带pET-28a-fleQ-gfp载体的表达菌株在荧光显微镜下的图片(A)白光视野，(B)为荧光视野；
图5为本发明实施例2纯化目的蛋白FleQ的SDS-PAGE检测图；1,2,3泳道为FleQ-GFP融合蛋白，4,5,6,7泳道为FleQ蛋白，M代表蛋白质Marker。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实验用的大肠杆菌菌株DH5α和BL21(DE3)购买于北京全式金公司，生长于常规的LB培养基，选择生长所用的抗生素浓度为：50μg/mL Kan。实验所用的原始质粒pBBR1-gfp和pET-28a均购买于生物技术公司，常见于市面。载体的克隆和蛋白的表达纯化步骤见分子克隆实验指南。
实施例1、整合载体的构建
S1、表达载体pET-28a-gfp的构建及阳性验证
表达载体pET-28a-gfp的构建示意图如图1所示，利用引物对P1/P2，gfp基因上游引物P1中含有编码烟草蚀纹病毒蛋白酶识别位点的序列，gfp基因下游引物P2序列中含有翻译终止密码子，以pBBR1-gfp质粒为模板，扩增出gfp基因；将商业化蛋白载体pET-28a和gfp基因均用限制性内切酶XhoI酶切；然后用Takara公司的T4DNA连接酶将酶切后的pET-28a和gfp片段连接在一起；测序验证，确定gfp基因按照正确的方向插入到pET-28a载体上，最终得到表达载体pET-28a-gfp。如图1所示的表达载体pET-28a-gfp中，T7promoter和lacI构成可诱导表达元件；6×His-Tag可以让目的蛋白基因表达的目的蛋白带上组氨酸标签；TEV protease表示烟草蚀纹病毒蛋白酶酶切位点，设计目的是用烟草蚀纹病毒蛋白酶将GFP和目的蛋白的融合蛋白切开，从而获得纯化的目的蛋白；BamHI和HindIII是多克隆位点，可以将目的基因通过这些酶切位点连入表达载体pET-28a-gfp，从而进行表达。
通过热激转化将pET-28a-gfp载体导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，培养至对数中期后，在16℃温度的条件下加0.5mM的IPTG诱导表达3h，取菌悬液在荧光显微镜下观察菌株有无荧光。因载体构建过程中选用XhoI酶切位点，从起始密码ATG到gfp基因的碱基数为163，表达载体pET-28a-gfp在表达菌株中无法正常翻译GFP蛋白，阳性表达菌株不会发荧光，如图2中的B所示。
S2、表达载体pET-28a-x-gfp的构建
将目的蛋白X的编码基因x连入pET-28a-gfp载体的BamHI和HindIII位点之间，形成目的蛋白X的表达载体pET-28a-x-gfp。
实施例2、利用FleQ蛋白作为目的蛋白来检测本发明的可行性
S1、表达载体pET-28a-fleQ-gfp的构建
表达载体pET-28a-fleQ-gfp的图谱如图3所示。FleQ是假单胞菌中的一种转录调节蛋白，对假单胞菌的生物被膜形成和游动性有重要影响，本发明用FleQ蛋白作为目的蛋白来检验本发明的可行性。以恶臭假单胞菌KT2440基因组总DNA为模板，利用引物对P3/P4扩增出fleQ基因，然后用BamHI和HindIII连入pET-28a-gfp载体，测序验证，确定fleQ基因插入到pET-28a-gfp载体上，最终得到表达载体pET-28a-fleQ-gfp。
S2、直观检测FleQ蛋白的表达
通过热激转化将pET-28a-fleQ-gfp载体导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，培养至对数中期后，在16℃温度的条件下加0.5mM的IPTG诱导表达3h，取菌悬液在荧光显微镜下观察菌株有无荧光。因BamHI和HindIII之间的碱基(19bp)替换成fleQ基因(1473bp)，理论上FleQ蛋白和GFP蛋白能够融合表达，菌株会发出绿色荧光。如图4中的B所示，表达载体在表达菌株中诱导表达后，在荧光显微镜下观察发出绿色荧光，可以判断目的蛋白已经得到表达。
S3、纯化目的蛋白
在确定目的蛋白已经成功表达后，收集菌液，破碎细胞，利用Ni离子亲和层析柱纯化FleQ-TEV-GFP融合蛋白，加入烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV protease)，室温孵育20min，继续洗脱，将切下来的GFP蛋白除掉。用250mM浓度咪唑将FleQ蛋白洗脱下来，从而获得纯净的目的蛋白。用SDS-PAGE方法进一步验证纯化的FleQ蛋白。
表1本发明所用的引物序列
引物 DNA序列Sequence(5’-3’) 序列编号
P1 ccgctcgaggagaacctatacttccaaggtatgagtaaaggagaagaa SEQ ID No.3
P2 ccgctcgagctatttgtatagttcatc SEQ ID No.4
P3 cgcggatccatgtggcgtgaaaccaag SEQ ID No.5
P4 cccaagcttatcctccgcctggtcctc SEQ ID No.6
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉博欧特生物科技有限公司
<120> 一种蛋白表达及纯化的方法
<130> 2019-9-9
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 750
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
ctcgaggaga acctatactt ccaaggtatg agtaaaggag aagaactttt cactggagtt 60
gtcccaattc ttgttgaatt agatggtgat gttaatgggc acaaattttc tgtcagtgga 120
gagggtgaag gtgatgcaac atacggaaaa cttaccctta aatttatttg cactactgga 180
aaactacctg ttccatggcc aacacttgtc actactttcg gttatggtgt tcaatgcttt 240
gcgagatacc cagatcatat gaaacagcat gactttttca agagtgccat gcccgaaggt 300
tatgtacagg aaagaactat atttttcaaa gatgacggga actacaagac acgtgctgaa 360
gtcaagtttg aaggtgatac ccttgttaat agaatcgagt taaaaggtat tgattttaaa 420
gaagatggaa acattcttgg acacaaattg gaatacaact ataactcaca caatgtatac 480
atcatggcag acaaacaaaa gaatggaatc aaagttaact tcaaaattag acacaacatt 540
gaagatggaa gcgttcaact agcagaccat tatcaacaaa atactccaat tggcgatggc 600
cctgtccttt taccagacaa ccattacctg tccacacaat ctgccctttc gaaagatccc 660
aacgaaaaga gagaccacat ggtccttctt gagtttgtaa cagctgctgg gattacacat 720
ggcatggatg aactatacaa atagctcgag 750
<210> 2
<211> 6113
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagctatttg tatagttcat 180
ccatgccatg tgtaatccca gcagctgtta caaactcaag aaggaccatg tggtctctct 240
tttcgttggg atctttcgaa agggcagatt gtgtggacag gtaatggttg tctggtaaaa 300
ggacagggcc atcgccaatt ggagtatttt gttgataatg gtctgctagt tgaacgcttc 360
catcttcaat gttgtgtcta attttgaagt taactttgat tccattcttt tgtttgtctg 420
ccatgatgta tacattgtgt gagttatagt tgtattccaa tttgtgtcca agaatgtttc 480
catcttcttt aaaatcaata ccttttaact cgattctatt aacaagggta tcaccttcaa 540
acttgacttc agcacgtgtc ttgtagttcc cgtcatcttt gaaaaatata gttctttcct 600
gtacataacc ttcgggcatg gcactcttga aaaagtcatg ctgtttcata tgatctgggt 660
atctcgcaaa gcattgaaca ccataaccga aagtagtgac aagtgttggc catggaacag 720
gtagttttcc agtagtgcaa ataaatttaa gggtaagttt tccgtatgtt gcatcacctt 780
caccctctcc actgacagaa aatttgtgcc cattaacatc accatctaat tcaacaagaa 840
ttgggacaac tccagtgaaa agttcttctc ctttactcat accttggaag tataggttct 900
cctcgagtgc ggccgcaagc ttgtcgacgg agctcgaatt cggatccgcg acccatttgc 960
tgtccaccag tcatgctagc catatggctg ccgcgcggca ccaggccgct gctgtgatga 1020
tgatgatgat ggctgctgcc catggtatat ctccttctta aagttaaaca aaattatttc 1080
tagaggggaa ttgttatccg ctcacaattc ccctatagtg agtcgtatta atttcgcggg 1140
atcgagatct cgatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt 1200
gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc 1260
gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg 1320
ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac 1380
ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg agatcccgga 1440
caccatcgaa tggcgcaaaa cctttcgcgg tatggcatga tagcgcccgg aagagagtca 1500
attcagggtg gtgaatgtga aaccagtaac gttatacgat gtcgcagagt atgccggtgt 1560
ctcttatcag accgtttccc gcgtggtgaa ccaggccagc cacgtttctg cgaaaacgcg 1620
ggaaaaagtg gaagcggcga tggcggagct gaattacatt cccaaccgcg tggcacaaca 1680
actggcgggc aaacagtcgt tgctgattgg cgttgccacc tccagtctgg ccctgcacgc 1740
gccgtcgcaa attgtcgcgg cgattaaatc tcgcgccgat caactgggtg ccagcgtggt 1800
ggtgtcgatg gtagaacgaa gcggcgtcga agcctgtaaa gcggcggtgc acaatcttct 1860
cgcgcaacgc gtcagtgggc tgatcattaa ctatccgctg gatgaccagg atgccattgc 1920
tgtggaagct gcctgcacta atgttccggc gttatttctt gatgtctctg accagacacc 1980
catcaacagt attattttct cccatgaaga cggtacgcga ctgggcgtgg agcatctggt 2040
cgcattgggt caccagcaaa tcgcgctgtt agcgggccca ttaagttctg tctcggcgcg 2100
tctgcgtctg gctggctggc ataaatatct cactcgcaat caaattcagc cgatagcgga 2160
acgggaaggc gactggagtg ccatgtccgg ttttcaacaa accatgcaaa tgctgaatga 2220
gggcatcgtt cccactgcga tgctggttgc caacgatcag atggcgctgg gcgcaatgcg 2280
cgccattacc gagtccgggc tgcgcgttgg tgcggatatc tcggtagtgg gatacgacga 2340
taccgaagac agctcatgtt atatcccgcc gttaaccacc atcaaacagg attttcgcct 2400
gctggggcaa accagcgtgg accgcttgct gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg 2460
caatcagctg ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc accctggcgc ccaatacgca 2520
aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg 2580
actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtaag ttagctcact cattaggcac 2640
cgggatctcg accgatgccc ttgagagcct tcaacccagt cagctccttc cggtgggcgc 2700
ggggcatgac tatcgtcgcc gcacttatga ctgtcttctt tatcatgcaa ctcgtaggac 2760
aggtgccggc agcgctctgg gtcattttcg gcgaggaccg ctttcgctgg agcgcgacga 2820
tgatcggcct gtcgcttgcg gtattcggaa tcttgcacgc cctcgctcaa gccttcgtca 2880
ctggtcccgc caccaaacgt ttcggcgaga agcaggccat tatcgccggc atggcggccc 2940
cacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc 3000
ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac tgctgctgca 3060
aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc 3120
tggaaacgcg gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc gcaggatgct 3180
gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat tgaccctgag 3240
tgatttttct ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg tttaccctca caacgttcca 3300
gtaaccgggc atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag catcctctct cgtttcatcg 3360
gtatcattac ccccatgaac agaaatcccc cttacacgga ggcatcagtg accaaacagg 3420
aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg cttctggaga 3480
aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt cacgaccacg 3540
ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac 3600
acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag 3660
cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac 3720
gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 3780
agtgcaccat atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 3840
aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 3900
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 3960
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 4020
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 4080
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 4140
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 4200
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 4260
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 4320
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 4380
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 4440
tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 4500
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 4560
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 4620
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 4680
attttggtca tgaacaataa aactgtctgc ttacataaac agtaatacaa ggggtgttat 4740
gagccatatt caacgggaaa cgtcttgctc taggccgcga ttaaattcca acatggatgc 4800
tgatttatat gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta 4860
tcgattgtat gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt 4920
tgccaatgat gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct 4980
tccgaccatc aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat 5040
ccccgggaaa acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt 5100
tgatgcgctg gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt 5160
taacagcgat cgcgtatttc gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt 5220
tgatgcgagt gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga 5280
aatgcataaa cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact 5340
tgataacctt atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg 5400
aatcgcagac cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc 5460
ttcattacag aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt 5520
gcagtttcat ttgatgctcg atgagttttt ctaagaatta attcatgagc ggatacatat 5580
ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc 5640
cacctgaaat tgtaaacgtt aatattttgt taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca 5700
gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga 5760
ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg 5820
actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat 5880
caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag 5940
ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga 6000
agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa 6060
ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc gtcccattcg cca 6113
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
ccgctcgagg agaacctata cttccaaggt atgagtaaag gagaagaa 48
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
ccgctcgagc tatttgtata gttcatc 27
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
cgcggatcca tgtggcgtga aaccaag 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
cccaagctta tcctccgcct ggtcctc 27

Claims (7)

1.一种蛋白表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、绿色荧光蛋白gfp基因的扩增，扩增上游引物设置有编码烟草蚀纹病毒蛋白酶识别位点的序列，gfp基因核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
S2、将步骤S1所述gfp基因连接到质粒pET-28a上，得到表达载体pET-28a-gfp；
S3、扩增编码目的蛋白X的基因x；
S4、将步骤S3所述基因x连接到表达载体pET-28a-gfp上，得到表达载体pET-28a-x-gfp；
S5、将表达载体pET-28a-x-gfp转入表达菌株中诱导表达融合蛋白X-GFP。
2.如权利要求1所述的蛋白表达的方法，其特征在于：在构建所述表达载体pET-28a-gfp过程中，在gfp基因上带有限制性内切酶XhoI的酶切位点。
3.如权利要求1所述的蛋白表达的方法，其特征在于：所述表达载体pET-28a-gfp的完整核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.如权利要求1所述的蛋白表达的方法，其特征在于：所述表达载体pET-28a-gfp中gfp基因上游有多克隆位点。
5.如权利要求1所述的蛋白表达的方法，其特征在于：所述编码目的蛋白X的基因x序列中不含翻译终止密码子，扩增所述gfp基因时在其3’端引入翻译终止密码子。
6.如权利要求1所述的蛋白表达的方法，其特征在于：还包括步骤S6，通过在荧光显微镜下观察表达菌株是否发出绿色荧光来判断融合蛋白是否被成功表达。
7.一种蛋白纯化的方法，其特征在于：包括以下步骤，
S7、对于权利要求1步骤S5得到的融合蛋白X-GFP，利用Ni离子亲和层析柱纯化；
S8、用烟草蚀纹病毒蛋白酶切除GFP蛋白，得到纯目的蛋白X。
CN201910955181.6A 2019-10-09 2019-10-09 一种蛋白表达及纯化的方法 Pending CN110628801A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910955181.6A CN110628801A (zh) 2019-10-09 2019-10-09 一种蛋白表达及纯化的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910955181.6A CN110628801A (zh) 2019-10-09 2019-10-09 一种蛋白表达及纯化的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110628801A true CN110628801A (zh) 2019-12-31

Family

ID=68975929

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910955181.6A Pending CN110628801A (zh) 2019-10-09 2019-10-09 一种蛋白表达及纯化的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110628801A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004092211A1 (de) * 2003-04-17 2004-10-28 Axaron Bioscience Ag Nicht fluoreszierende, durch proteolyse zur fluoreszenz aktivierbare reporterproteine und ihre verwendung zur detektion protease-abhängiger ereignisse
CN103436557A (zh) * 2013-07-17 2013-12-11 江苏大学 一种可视化跟踪的家蚕生物反应器快速表达ns1蛋白的方法
CN104619726A (zh) * 2012-03-23 2015-05-13 苏州鲲鹏生物技术有限公司 由超折叠绿色荧光蛋白构成的融合蛋白及其用途
US20160281069A1 (en) * 2015-03-27 2016-09-29 China Medical University Nucleic acid sequence segment for enhancing protein expression

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004092211A1 (de) * 2003-04-17 2004-10-28 Axaron Bioscience Ag Nicht fluoreszierende, durch proteolyse zur fluoreszenz aktivierbare reporterproteine und ihre verwendung zur detektion protease-abhängiger ereignisse
CN104619726A (zh) * 2012-03-23 2015-05-13 苏州鲲鹏生物技术有限公司 由超折叠绿色荧光蛋白构成的融合蛋白及其用途
CN103436557A (zh) * 2013-07-17 2013-12-11 江苏大学 一种可视化跟踪的家蚕生物反应器快速表达ns1蛋白的方法
US20160281069A1 (en) * 2015-03-27 2016-09-29 China Medical University Nucleic acid sequence segment for enhancing protein expression
TWI554608B (zh) * 2015-03-27 2016-10-21 Univ China Medical A nucleic acid sequence segment for enhancing protein expression, an expression vector comprising a sequence segment thereof, and a kit comprising its expression vector

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANTING LIU等: "《A simple and efficient expression and purification system using two newly constructed vectors》", 《PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION》 *
PRIMAVESI,L.F等: "《Chimeric preFed3-GFP protein, partial [synthetic construct]》", 《GENBANK: CAK02784.1》 *
傅本重等: "《转录激活因子F leQxoo原核表达及其与鞭毛基体基因fliExoo 启动子的结合》", 《植物病理学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2205618T3 (en) SYNTHETIC 5 &#39;NON-TRANSLATED REGIONS, EXPRESSION VECTORS AND PROCEDURES FOR INCREASING TRANSGENIC EXPRESSION
JP4229469B2 (ja) ヒト化グリーン蛍光タンパク質遺伝子および方法
CN101240277B (zh) 转基因水稻品系Bt汕优63的PCR检测方法
CN113265413B (zh) 一种假病毒的制备方法
CN109706185B (zh) 基于碱基编辑系统突变起始密码子实现基因敲除的方法及应用
CN108085287B (zh) 一种重组谷氨酸棒状杆菌、其制备方法及其应用
CA2379571C (en) Process for the production of a heterologous peptide by autoproteolytic cleavage in vitro
CN110885868B (zh) 一种利用细胞色素P450酶合成2α-羟基化类固醇化合物的方法
MXPA02001425A (es) Produccion de proteinas mediante disociacion autoproteolitica.
CN110628801A (zh) 一种蛋白表达及纯化的方法
CN101985631B (zh) 一种棒状杆菌启动子探测载体及其构建方法和应用
CN110408646A (zh) 一种植物遗传转化筛选载体及其应用
KR102009273B1 (ko) 구제역 taw97 주의 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스
CN111996206B (zh) 光控无细胞蛋白质合成方法、该方法使用的质粒以及使用该方法的产品
CN110835631B (zh) 一种改造的sgRNA及其在提高碱基编辑效率中的应用
CN110835630B (zh) 一种高效的sgRNA及其在基因编辑中的应用
CN110878321B (zh) 一种用于肺炎克雷伯菌基因编辑的表达载体
CN111187787A (zh) 一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用
KR20220097422A (ko) 치쿤구니야 바이러스 유사 입자 백신 및 이의 사용 방법
CN112251440A (zh) 一种CRISPR/Cas9基因载体、其制备方法及应用
RU2730663C2 (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген Cas9 для гетерологичной экспрессии этого целевого гена в клетках человека и животных при реализации различных методов геномного редактирования, способ получения и применения генотерапевтического ДНК-вектора, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-Cas9, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
KR20170017115A (ko) 단백질분해효소억제제, 역전사효소억제제 및 통합효소억제제 내성도 동시 예측을 위한 유전형 및 표현형검사법
CN115584354A (zh) 一种简便快捷的植物表达t载体及其应用
CN108588100B (zh) 一种抑制素b双基因片段联合表达载体及其应用
KR101618235B1 (ko) Ｌｕｃ 2의 ＯＲＦ에 제한 효소 절단위치가 삽입된, Ｌｕｃ 2 레포터 벡터

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191231