CN110408646A - 一种植物遗传转化筛选载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种植物遗传转化筛选载体及其应用，该载体利用包含水稻P450基因(CYP81A6)的表达盒作为筛选标记，以苯达松或苄嘧磺隆作为筛选剂在愈伤组织阶段进行筛选，所获得植株经检测为转基因阳性植株并具备对除草剂高抗性。本发明的植物遗传转化载体可作为转基因筛选载体附加其他功能元件使用，在转基因过程中利用水稻自身基因，不引入菌源等外源筛选标记基因，不仅丰富了植物转基因筛选方法，还可降低公众对转基因植物安全风险的担忧，有利于促进转基因植物的商业化应用，具备良好的市场价值和社会效益。

Description

一种植物遗传转化筛选载体及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种植物遗传转化筛选载体及其应用。

背景技术

转基因技术由于其诸多的优点如可拓宽可利用的基因资源，创造新种质资源；可对植物性状进行定向定点变异和选择；为培育高产、优质、高抗优良品种提供新途径等，其应用范围越来越广泛。转基因作物自1996年批准商业化种植起，21年间，全球累计批准23种转基因作物进行商业化生产，涉及包括抗虫、抗除草剂、抗病、育性改变、品质改良等在内的超过16类目标性状。据统计，2016年全球26个国家和地区种植以抗除草剂和抗虫为主的大豆、玉米、棉花、油菜等转基因作物，面积达1.85亿公顷。转基因作物的大面积推广，为全球农业生产做出了巨大贡献。

尽管人们对转基因产品的态度日趋客观和积极，但转基因产品自诞生之日起产生的争议，至今甚嚣尘上，其潜在安全风险问题仍受到普遍关切，因此，转基因产品仍需要加以严格的控制和监管。在转基因作物中争议关键之一是筛选标记可能带来的潜在风险，其转入植物后其对靶标生物抗性，所表达蛋白质致敏性，及对受体作物本身营养成分、天然毒素和抗营养物质含量等方面的影响是未知的。目前使用最多的是抗生素类和除草剂类筛选标记，如潮霉素-HPT筛选系统、卡纳霉素-NPTII筛选系统、草丁膦-Bar筛选系统等，绝大多数为细菌等来源的外源基因，这也是引起公众担忧的原因之一。如果能用植物内源的基因作为筛选标记重新转化植物可去除外源基因引起的风险和担忧。

苯达松(bentazon)是一种苯并噻二唑类除草剂，属杂环类选择性化学除草剂，多数阔叶类杂草和莎草科杂草对苯达松敏感，而包括水稻在内的禾本科和豆科植物则有较强的耐药性，其具有广谱，高效，低毒的特性。水稻对苯达松抗性由一个单隐性基因细胞色素P450(CYP81A6)控制，该基因位于水稻第3号染色体上，参与苯达松在植物体内的羟基化脱毒过程(Pan G,Zhang X,Liu K,Zhang J,Wu X,Zhu J,Tu J(2006)Map-based cloning ofa novel rice cytochrome P450gene CYP81A6that confers resistance to twodifferent classes of herbicides.Plant molecular biology 61:933-943)。

苄嘧磺隆又名农得时，是一种磺酰脲类除草剂，为选择性内吸传导型除草剂，可防除阔叶杂草和莎草科杂草。但对水稻生长几乎没有影响。水稻对苄嘧磺隆抗性与对苯达松抗性均源于水稻中的细胞色素P450(CYP81A6)基因(张集文(2010)水稻苯达松敏感突变研究进展.中国水稻科学24(5):551-558)。

发明内容

本发明的目的是为解决目前基因转化工作中所使用外源筛选标记存在安全风险的问题，提供一种利用植物内源基因作为筛选标记从而应用于植物遗传转化筛选的载体。

为达到上述目的，本发明首先提供一种植物转基因筛选表达盒，以植物内源基因作为筛选标记。

所述表达盒还包括位于上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及位于下游的终止子，

其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV35S启动子或Actin启动子；所述植物组织特异性启动子为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。

所述终止子包括：NOS终止子，Ubi终止子等在植物中可以终止基因转录的DNA序列。优选的，所述终止子为Ubi终止子。

进一步地，所述植物内源基因为水稻P450基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，本发明提供的植物转基因筛选表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基于上述表达盒，本发明提供一种植物遗传转化筛选载体，该载体含有上述的植物转基因筛选表达盒。

优选地，本发明的植物遗传转化筛选载体为植物双元表达载体，可通过克隆其他植物表达盒进入该载体进行遗传转化，所述其他植物表达盒是指除上述的植物转基因筛选表达盒外的植物表达盒，包括但不限于荧光蛋白表达盒、GUS报告基因表达盒、抗虫表达盒、抗除草剂表达盒。

更优选地，本发明的植物遗传转化筛选载体还包括一系列多克隆位点如BamHI、AvrII、PmlI、SnaBI、AloI、HindIII等以便后续克隆目的基因进入。

在本发明的一个优选实施例中，所制备的植物遗传转化筛选载体为pCBA6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

该植物遗传转化筛选载体通过以下方法制备得到，

(1)构建植物转基因筛选表达盒：将SEQ ID NO.1所示的CYP81A6基因置于玉米Ubi启动子驱动下表达，在其下游以水稻Ubi终止子终止表达，筛选标记表达盒序列如SEQ IDNO.2所示；

(2)将植物转基因筛选表达盒连入植物双元表达载体pC0308，获得植物遗传转化筛选载体。

本发明提供了所述的植物转基因筛选表达盒或所述的植物遗传转化筛选载体在制备转基因植物中的应用。

所述的应用具体为在植物转基因筛选表达盒或植物遗传转化筛选载体转入植物愈伤组织后，愈伤组织接种到添加苯达松或苄嘧磺隆的筛选培养基中，进行抗性筛选。所述筛选培养基中，苯达松浓度为200-500mg/L或苄嘧磺隆浓度为10-100mg/L。优选添加250-350mg/L苯达松，更优选的，添加300mg/L苯达松可获得良好的筛选效率。优选添加10-50mg/L苄嘧磺隆，更优选的，添加25-30mg/L苄嘧磺隆可获得良好的筛选效率。

本发明提供了所述的植物转基因筛选表达盒或所述的植物遗传转化筛选载体在植物遗传转化筛选中的应用。所述应用为用含有苯达松或苄嘧磺隆的筛选培养基进行抗性筛选。所述筛选培养基中，苯达松浓度为200-500mg/L或苄嘧磺隆浓度为10-100mg/L。

优选添加250-350mg/L苯达松，更优选的，添加300mg/L苯达松可获得良好的筛选效率。优选添加10-50mg/L苄嘧磺隆，更优选的，添加25-30mg/L苄嘧磺隆可获得良好的筛选效率。

优选的，所述植物为农作物。更优选地，所述农作物为水稻。

以水稻为例，其他植物转基因方法参考水稻：

1)诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织，27℃暗培养30-50天；

2)侵染：将步骤1)所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于已导入本发明所述植物遗传转化筛选载体的农杆菌悬浮液中侵染，室温静置30分钟，之后晾干待用；

3)共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，22℃暗培养3天，至愈伤组织表面出现菌体；

4)筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到添加苯达松或苄嘧磺隆的筛选培养基中，27℃暗培养30-50天，进行抗性筛选；

5)分化：将获得的抗性愈伤组织接种到分化培养基上，27℃光照培养25-40天至分化出幼苗；

6)生根：将幼苗接种到生根培养基上生根，30℃光照培养10-20天，并进行PCR检测，选择检测为阳性的植株种植；

所涉培养基的具体配方如下：

诱导培养基为N₆D培养基，其为以N₆培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为3mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L，pH值为5.9的培养基；

悬浮培养基为N₆-AA培养基，其为以N₆培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为2mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/L、蔗糖浓度为20g/L、葡萄糖浓度为10g/L、乙酰丁香酮(AS)浓度为100-200μM，pH值为5.4的培养基；

共培养基为N₆-AS培养基，其为以N₆培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为2mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.3-0.6g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.3-0.5g/L、蔗糖浓度为20g/L、葡萄糖浓度为10g/L、乙酰丁香酮(AS)浓度为100-200μM、琼脂粉(Agar)浓度为7g/L，pH值为5.6的培养基；

筛选培养基为N₆S培养基，其为以N₆培养基为基本培养基，所含2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)浓度为2-3mg/L、水解酪蛋白(CH)浓度为0.6-1g/L、脯氨酸(Pro)浓度为0.5-1.5g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L、头孢(Cn)浓度为500mg/L、苯达松浓度为200-500mg/L或苄嘧磺隆浓度为10-100mg/L，pH值为5.8的培养基；

分化培养基为MSRe培养基，其为以MS培养基为基本培养基，所含激动素(KT)浓度为1-2mg/L、α-萘乙酸(NAA)浓度为0.5-2mg/L、山梨醇浓度为20-40g/L、蔗糖浓度为30g/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L，pH值为5.9的培养基；

生根培养基为以1/2MS培养基为基本培养基，所含蔗糖浓度为20g/L、多效唑浓度为0.5-1mg/L、植物凝胶(Phytagel)浓度为3g/L，pH值为5.8的培养基。

本发明的植物遗传转化载体可作为转基因筛选载体附加其他功能元件使用，在转基因过程中利用水稻自身基因，不引入菌源等外源筛选标记基因，不仅丰富了植物转基因筛选方法，还可降低公众对转基因植物安全风险的担忧，有利于转基因植物的商业化应用，市场价值和社会效益均良好。

附图说明

图1为实施例1中pCBA6载体经ScaI酶切的电泳图；其中M为Marker，1为未酶切的pCBA6重组质粒，2-6为酶切的pCBA6重组质粒，可切出大小约为3.9kb片段。

图2为实施例2中转化后农杆菌PCR检测电泳结果；其中M为Marker，1为pCBA6重组质粒阳性对照，2-7为转pCBA6重组质粒农杆菌单克隆菌液样品。

图3为普通水稻苗期苯达松筛选压力测试比较图，其中苗盆左侧为ZH11，右侧为9311，喷施量100mL/m²。

图4为普通水稻苗期苄嘧磺隆筛选压力测试图，其中1×代表60mg/L，10×，200×，1000×分别为相应的倍数；其中苗盆左侧为9311，右侧为ZH11，喷施量100mL/m²。

图5为实施例6中苯达松筛选培养基筛选愈伤组织40d结果。

图6为实施例14中苄嘧磺隆筛选培养基筛选愈伤组织40d结果。

图7为实施例20中转基因样品植株PCR检测电泳图；其中M为Marker，1为H₂O、2为ZH11非转基因植株，3为质粒对照，4-8为苯达松筛选获得的转基因植株，9-12为苄嘧磺隆筛选获得的转基因植株。

图8为T0转基因株系除草剂抗性测试结果。a、b：苯达松筛选株系移栽14天后，喷施30g/L苯达松；a：喷施前，b：喷施14天后；c-d：苄嘧磺隆筛选株系移栽14天后，喷施30g/L苯达松；c：喷施前，d：喷施14天后；图中白色箭头表示野生型对照ZH11，白色三角表示抗性最强植株。

图9为pC0308载体图谱。

图10为pCBA6载体图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1植物遗传转化筛选载体的构建

1、植物转基因筛选表达盒的制备

本发明的植物转基因筛选表达盒ZmUbiP-p450-OsUbiT的序列通过设计引物从本实验室已构建好的质粒pC1300-ZmUbiP-p450-OsUbiT中克隆获得。质粒pC1300-ZmUbiP-p450-OsUbiT通过Gibson Assembly方法，分别扩增启动子ZmUbiP片段；从水稻cDNA中扩增获得目的基因p450片段；从水稻基因组中扩增获得终止子OsUbiT片段。将3个扩增片段连接插入到pC1300载体EcoRI和BamHI双酶切位点间，其中上述片段的上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与载体相应连接位置重复，以便利用Gibson Assembly重组依次连接成为一个表达盒。重组连接到pC1300载体EcoRI和BamHI双酶切位点间，即为载体pC1300-ZmUbiP-p450-OsUbiT。

同样地，使用Gibson Assembly方法，以pC1300-ZmUbiP-p450-OsUbiT为模板，利用引物对0308-U450U-F、0308-U450U-Rv扩增P450表达盒，将扩增产物插入到pC0308载体(pC0308为发明人依托pCAMBIA1300载体骨架，经过改造获得，其中主要删除了其潮霉素筛选元件及相邻区域不必要区域，以使得T-Border内部除多克隆位点外不含其它菌源序列。因此，在T-Border中后续连入植物源序列，转入植物中时降低公众对转基因担忧，图谱见图9)AvrII和PstI双酶切位点间。其中上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与载体相应连接位置重复，以便利用Gibson Assembly重组连接。

引物序列：

0308-U450U-F:GGATATATTGTGGTGTAAACACTGCAaGAGCTCGTGCAGCGTGA(SEQ IDNO.4)

0308-U450U-Rv:CTGGTAAAAAATACGTACACGTGCctagggaattcgagctcacgcgtggatccGACAAATTTGTTTGTCAGATCAAATTTTTAAGC(SEQ ID NO.5)

扩增体系及程序如下：

PCR程序:预变性94℃3min，变性94℃30s，退火55-65℃40s，延伸68℃3min，35个循环，延伸68℃10min，16℃结束。

引物0308-U450U-F和0308-U450U-Rv扩增PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳回收大小为3840bp产物，即为植物转基因筛选表达盒，命名为ZmUbiP-p450-OsUbiT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、植物遗传转化筛选载体的构建

(1)用AvrII+PstI对载体质粒pC0308进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，利用E.Z.N.A.Extraction kit(Omega,下同)回收7kb左右大小条带，得到pC0308线性片段。

AvrII+PstI双酶切反应体系如下：

(2)2X Lightening Cloning Kit连接试剂盒连接ZmUbiP-p450-OsUbiT表达盒到pC0308载体上，连接体系如下：

连接程序：50℃30min。

转化：取上述连接产物2μl，加入到大肠杆菌感受态细胞中，轻微混匀，冰浴半小时；用电转仪1.8KV电击转化大肠杆菌感受态细胞；加入LB培养基1ml，37℃220rpm振荡培养1h，5000rpm离心30s,弃800μl上清，将剩余菌体与培养基混匀，涂布于含卡那霉素的LB平板上。37℃培养16h左右，挑取单菌落，用特异性引物(0308MCS-F1和0308MCS-R1)做菌落PCR验证，挑选阳性菌落，37℃220rpm摇菌过夜，利用高纯质粒小提试剂盒(中科瑞泰)提取质粒，酶切检测正确后(如图1)，保菌并送测序。命名为pCBA6，图谱见图10，测序得到其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

引物序列：

0308MCS-F1:GCTTAGTTGCCGTTCTTCCG(SEQ ID NO.6)

0308MCS-R1:TTGTTCATGGCGTAATGTCTCC(SEQ ID NO.7)。

实施例2农杆菌转化及鉴定

取-70℃保存的农杆菌EHA105于含利福平(25μg/ml)+链霉素(50μg/ml)YEP平板划线，28℃培养。挑取单菌落接种于5ml含上述抗生素的YEP液体培养基中，220rpm，28℃振荡培养12-16hr。取2ml菌液转接于100ml含上述抗生素YEP液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600＝0.5。冰上预冷10分钟，4℃，5000rpm离心10min(冷冻离心机预冷到4℃)。无菌去离子水洗2次(每次10ml)，10％无菌甘油洗1次，4℃，5000rpm离心10min，菌体重悬于3ml10％无菌甘油中。取100μl感受态细胞加1μl实施例1中得到的测序正确pCBA6质粒，1.8KV电击转化。涂布于含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上，28℃培养48小时左右，挑取单菌落摇菌过夜，用实施例1中的特异性引物(0308MCS-F1和0308MCS-R1)菌液PCR验证(如图2)，挑选阳性克隆，摇菌36-48h，保存菌液用于侵染。

实施例3普通水稻苗期苯达松及苄嘧磺隆筛选压力测试

苯达松及苄嘧磺隆是稻田用除草剂，普通水稻对二者均具有抗性，因此在水稻上喷施药剂规定浓度的除草剂不会对水稻造成伤害，多数喷施安全浓度在1-3g/L苯达松及30-40mg/L苄嘧磺隆(张集文(2010)水稻苯达松敏感突变研究进展.中国水稻科学24(5):551-558)。本实施例研究水稻对苯达松及苄嘧磺隆抗性上限，通过实验测试，结果如图3和4所示。对于苯达松，无论是粳稻中花11(ZH11)还是籼稻9311，苗期均可以抗10g/L，籼稻9311抗性更是超过20g/L；对于苄嘧磺隆，无论是ZH11还是9311均可以抗1200mg/L以上。这些结果表明普通水稻对上述两种除草剂是高抗的，仅以此判断，这两种除草剂不适合作为筛选剂用于转基因筛选的。然而本申请实验发现，选用本发明实施例1构建的植物遗传转化筛选载体可以采用这两种除草剂作为筛选剂用于水稻转基因筛选，并且所用的筛选压远远低于常规用量。

实施例4苯达松筛选遗传转化(1)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含苯达松抗性筛选培养基(N₆+2.4-D 2mg/L+CH0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+苯达松250mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤，抗性愈伤经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例5苯达松筛选遗传转化(2)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含苯达松抗性筛选培养基(N₆+2.4-D 2mg/L+CH0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+苯达松300mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤(如图5)，抗性愈伤经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例6苯达松筛选遗传转化(3)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含苯达松抗性筛选培养基(N₆+2.4-D 2mg/L+CH0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+苯达松350mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤，抗性愈伤经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例7苯达松筛选遗传转化(4)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含苯达松抗性筛选培养基(N₆+2.4-D 2mg/L+CH0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+苯达松400mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤，抗性愈伤经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例8苯达松筛选遗传转化(5)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含苯达松抗性筛选培养基(N₆+2.4-D 2mg/L+CH0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+苯达松500mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤，抗性愈伤经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例9苯达松筛选遗传转化6

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含苯达松抗性筛选培养基(N₆+2.4-D 2mg/L+CH0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+苯达松1000mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤，抗性愈伤经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例10苯达松筛选遗传转化统计

通过实施例4-9中不同浓度的苯达松筛选阳性率比较发现(见表1)，筛选培养基中添加250-400mg/L苯达松，均可得到超过20％的阳性愈伤。而500mg/L的苯达松筛选浓度会使的阳性愈伤率略有降低，1000mg/L的苯达松筛选浓度几乎得不到阳性愈伤，推测是由于随苯达松浓度升高导致完全被抑制而无法获得阳性愈伤。因此在筛选培养基中优选添加250-350mg/L苯达松，更优选的，添加300mg/L苯达松可获得良好的筛选效率。

表1不同浓度苯达松筛选结果统计

实施例11苄嘧磺隆筛选遗传转化(1)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含苄嘧磺隆抗性筛选培养基(N₆+2.4-D2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn500mg/L+苄嘧磺隆10mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤，抗性愈伤经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例12苄嘧磺隆筛选遗传转化(2)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含苄嘧磺隆抗性筛选培养基(N₆+2.4-D2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn500mg/L+苄嘧磺隆20mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤，抗性愈伤经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例13苄嘧磺隆筛选遗传转化(3)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含苄嘧磺隆抗性筛选培养基(N₆+2.4-D2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn500mg/L+苄嘧磺隆25mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤，抗性愈伤经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例14苄嘧磺隆筛选遗传转化(4)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含苄嘧磺隆抗性筛选培养基(N₆+2.4-D2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn500mg/L+苄嘧磺隆30mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤(如图6)，抗性愈伤经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例15苄嘧磺隆筛选遗传转化(5)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含苄嘧磺隆抗性筛选培养基(N₆+2.4-D2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn500mg/L+苄嘧磺隆40mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤，抗性愈伤经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例16苄嘧磺隆筛选遗传转化(6)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含苄嘧磺隆抗性筛选培养基(N₆+2.4-D2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn500mg/L+苄嘧磺隆50mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤，抗性愈伤经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例17苄嘧磺隆筛选遗传转化(7)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含苄嘧磺隆抗性筛选培养基(N₆+2.4-D2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn500mg/L+苄嘧磺隆100mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤，抗性愈伤经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例18苄嘧磺隆筛选遗传转化(8)

以水稻为例，将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻中花11(ZH11)愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含苄嘧磺隆抗性筛选培养基(N₆+2.4-D2mg/L+CH 0.6g/L+Pro 0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn500mg/L+苄嘧磺隆200mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤，抗性愈伤经分化、生根获得阳性转基因植株。

实施例19苄嘧磺隆筛选遗传转化统计

通过实施例11-18中不同浓度的苄嘧磺隆筛选阳性率比较发现(见表2)，筛选培养基中添加10-100mg/L苄嘧磺隆，均可得到超过10％的阳性愈伤。其中添加10-50mg/L苄嘧磺隆所得的筛选率介于17-25％之间，较为理想，而100mg/L的苄嘧磺隆筛选浓度会使的阳性愈伤率降低，但仍可获得阳性愈伤，200mg/L的苄嘧磺隆筛选浓度几乎得不到阳性愈伤，推测是由于随苄嘧磺隆浓度升高导致完全被抑制而无法获得阳性愈伤。因此在筛选培养基中优选添加10-100mg/L苄嘧磺隆，更优选的，添加10-50mg/L苄嘧磺隆，更优选的，添加25-30mg/L苄嘧磺隆可获得良好的筛选效率。

表2不同浓度苄嘧磺隆筛选结果统计

实施例20转基因株系鉴定

为了鉴定获得的株系是否为转基因株系，本实施例对上述实施例4-18获得的阳性转基因植株进行PCR验证，首先提取样品DNA。DNA提取步骤如下：取约2cm长的水稻叶片置于2ml离心管中；在研钵中加入800μl 1.5X CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min颠倒混匀1次；12000rpm离心10min；吸取400μl上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的无水乙醇，-20℃冰置20min；12000rpm离心10min；弃上清，加入500μl75％乙醇，颠倒漂洗，8000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μlddH₂O溶解DNA。

为了区分水稻内源基因，申请人设计了一对跨内含子的引物对转基因株系基因组DNA样品进行PCR扩增检测，该引物对以内源水稻基因组为模板扩增获得片段大小为1286bp，以实施例1制得的转基因表达盒为模板扩增获得片段大小为561bp。

引物序列为：P450-F：AGGGACGCGTTCCTTCG(SEQ ID NO.8)

P450-R：CATCCCGAACGGCATCAA(SEQ ID NO.9)

以实施例1的质粒pCBA6的DNA作为阳性对照，水稻ZH11基因组DNA作为阴性对照。PCR反应程序和体系如下：

程序：94℃预变性5min，94℃变性45s，55-65℃退火45s；72℃延伸1.5min；30-35个循环；72℃再延伸10min；16℃结束。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如图7所示。电泳结果表明大部分转基因样品中含有561bp的转基因条带，与载体对照大小相同，符合苯达松CDS预期扩增长度；而所有水稻样品中均含有1286bp的条带，与阴性对照ZH11中大小相同，该条带为水稻苯达松内源基因组序列。

实施例21抗性表型鉴定

苯达松筛选共获得转基因株系21株，苄嘧磺隆筛选共获得转基因株系29株。生根材料移栽14天后(3-5叶期左右)，喷施30g/L苯达松(图8的a，b图)。1天后，野生型及敏感株系出现叶尖开始黄化。7天后，野生型对照ZH11已枯黄致死，转基因株系多数植株叶尖或黄化严重。14天后，野生型对照ZH11及转基因敏感株系已完全死亡，存活株系为苯达松抗性株系(图8的c，d图)。上述结果表明，通过苯达松或苄嘧磺隆筛选获得的转基因株系具备高抗苯达松抗性，同时，所获株系也具备高抗苄嘧磺隆抗性

上述结果表明本申请已成功建立苯达松/苄嘧磺隆-CYP81A6筛选标记系统，可用于转基因筛选流程。

本发明获得的pCBA6(图谱见图10)作为植物双元表达载体，可以通过克隆其他表达盒进入该载体，进行遗传转化，获得相应的性状。如：将荧光蛋白表达盒、GUS报告基因表达盒、抗虫表达盒、抗除草剂表达盒等。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 一种植物遗传转化筛选载体及其应用

<130> KHP181110818.9

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1542

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggataacg cctacattat tgccattctc tctgtagcta tcctcttctt gctccactac 60

tacctcctcg gccgcggcaa tggcggggcg gcgcggctgc cgccgggtcc accggccgtc 120

ccgatcctgg gacacctcca cctcgtcaag aagccgatgc acgccaccat gtcccgcctc 180

gccgagcggt acgggccggt gttctcgctg cgcctcgggt cgcggcgcgc cgtggtggtg 240

tcgtcgccgg ggtgcgccag ggagtgcttc accgagcacg acgtgacctt cgcgaaccgg 300

cccaggttcg agtcgcagct gctggtctcg ttcaacggcg ccgcgctcgc cacggcgagc 360

tacggcgcgc actggcgcaa cctccgccgg atcgtcgccg tgcagctgct ctccgcgcac 420

cgcgtcggcc tcatgtcggg gctcatcgcc ggcgaggtcc gcgccatggt gcggaggatg 480

taccgcgccg cggccgcgtc ccccgccggc gccgcgcgca tccagctgaa gcggaggctg 540

ttcgaggtct ccctcagcgt gctcatggag accatcgccc acaccaaggc gacccgcccc 600

gagacggacc cggacaccga catgtccgtg gaagcccagg agtttaagca ggtcgtcgac 660

gagatcatcc cgcacatcgg cgcggccaac ctgtgggact acttgccggc gctccggtgg 720

ttcgacgtgt tcggcgtcag gaggaagatc ctcgccgctg taagccggag ggacgcgttc 780

cttcgccgcc tgatcgacgc ggagcggcgg aggctggacg acggcgacga gggcgagaag 840

aagagcatga tcgccgtgct gctcactctg cagaagacag agccggaggt gtacaccgat 900

aacatgatca cagctctaac ggcgaacttg ttcggagcag gaacagagac aacctcgacg 960

acatcagaat gggcgatgtc gctactgctg aaccaccccg acacactcaa gaaagcgcaa 1020

gccgagatcg acgcatccgt cggcaactct cgcctgatca ccgccgacga cgtgactcgc 1080

ctcggctacc tccagtgcat cgtcagggag acgctccgcc tgtaccccgc cgcgccgatg 1140

ctcctcccgc acgagtcctc cgccgactgc aaggtcggcg gctacaacat cccgcgcggg 1200

tcgatgttgc tcatcaacgc gtacgccatc caccgtgacc cggcggtgtg ggaggagccg 1260

gagaagttca tgccggagag gttcgaggac ggcgggtgcg acggcaatct cttgatgccg 1320

ttcgggatgg ggaggcggag gtgccccggc gagacgctgg cgctgcgcac agtggggttg 1380

gtgctgggca cgctgatcca gtgcttcgac tgggagaggg tcgacggcgt ggaggtcgac 1440

atgactgaag gtggcgggct caccatcccc aaggtcgtgc cgttggaggc catgtgcagg 1500

ccgcgcgacg ccatgggtgg tgttcttcgc gagctcgtct ga 1542

<210> 2

<211> 3834

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta 60

taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt 120

atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca 180

gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt 240

ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg 300

caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta 360

gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct 420

ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaataattt agatataaaa 480

tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta 540

aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt 600

ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca 660

cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg 720

ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag 780

gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc 840

ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctctttccc 900

caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa atccacccgt 960

cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccccccctct ctaccttctc 1020

tagatcggcg ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt catgtttgtg 1080

ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat gcgacctgta 1140

cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat cctgggatgg 1200

ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt tgcatagggt 1260

ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc gggtcatctt 1320

ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt cgttctagat 1380

cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat ctgtatgtgt 1440

gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc gatctaggat 1500

aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt ttgttcgctt 1560

ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg gagtagaata 1620

ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt gtcatacatc 1680

ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga 1740

tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca tatgctctaa 1800

ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt gatcttgata 1860

tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct gccttcatac 1920

gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt ttggtgttac 1980

ttatggataa cgcctacatt attgccattc tctctgtagc tatcctcttc ttgctccact 2040

actacctcct cggccgcggc aatggcgggg cggcgcggct gccgccgggt ccaccggccg 2100

tcccgatcct gggacacctc cacctcgtca agaagccgat gcacgccacc atgtcccgcc 2160

tcgccgagcg gtacgggccg gtgttctcgc tgcgcctcgg gtcgcggcgc gccgtggtgg 2220

tgtcgtcgcc ggggtgcgcc agggagtgct tcaccgagca cgacgtgacc ttcgcgaacc 2280

ggcccaggtt cgagtcgcag ctgctggtct cgttcaacgg cgccgcgctc gccacggcga 2340

gctacggcgc gcactggcgc aacctccgcc ggatcgtcgc cgtgcagctg ctctccgcgc 2400

accgcgtcgg cctcatgtcg gggctcatcg ccggcgaggt ccgcgccatg gtgcggagga 2460

tgtaccgcgc cgcggccgcg tcccccgccg gcgccgcgcg catccagctg aagcggaggc 2520

tgttcgaggt ctccctcagc gtgctcatgg agaccatcgc ccacaccaag gcgacccgcc 2580

ccgagacgga cccggacacc gacatgtccg tggaagccca ggagtttaag caggtcgtcg 2640

acgagatcat cccgcacatc ggcgcggcca acctgtggga ctacttgccg gcgctccggt 2700

ggttcgacgt gttcggcgtc aggaggaaga tcctcgccgc tgtaagccgg agggacgcgt 2760

tccttcgccg cctgatcgac gcggagcggc ggaggctgga cgacggcgac gagggcgaga 2820

agaagagcat gatcgccgtg ctgctcactc tgcagaagac agagccggag gtgtacaccg 2880

ataacatgat cacagctcta acggcgaact tgttcggagc aggaacagag acaacctcga 2940

cgacatcaga atgggcgatg tcgctactgc tgaaccaccc cgacacactc aagaaagcgc 3000

aagccgagat cgacgcatcc gtcggcaact ctcgcctgat caccgccgac gacgtgactc 3060

gcctcggcta cctccagtgc atcgtcaggg agacgctccg cctgtacccc gccgcgccga 3120

tgctcctccc gcacgagtcc tccgccgact gcaaggtcgg cggctacaac atcccgcgcg 3180

ggtcgatgtt gctcatcaac gcgtacgcca tccaccgtga cccggcggtg tgggaggagc 3240

cggagaagtt catgccggag aggttcgagg acggcgggtg cgacggcaat ctcttgatgc 3300

cgttcgggat ggggaggcgg aggtgccccg gcgagacgct ggcgctgcgc acagtggggt 3360

tggtgctggg cacgctgatc cagtgcttcg actgggagag ggtcgacggc gtggaggtcg 3420

acatgactga aggtggcggg ctcaccatcc ccaaggtcgt gccgttggag gccatgtgca 3480

ggccgcgcga cgccatgggt ggtgttcttc gcgagctcgt ctgagtcctc agccatagag 3540

ctgctgctgt tctagggttc acaagtctgc ctatttgtct tccccaatgg agctatggtt 3600

gtctggtctg gtccttggtc gtgtcccgtt tcattgtgta ctatttacct gtaatgtgta 3660

tccttaagtc tggtttgatg gtgtctgaaa cgttttgctg tggtagagca gcatggaaga 3720

actataatga ataagtgatc cctaatcatt gtgtccaaat tttgcttctg ctataccctt 3780

ttgtgctgtt tcttatgttt tgcttaaaaa tttgatctga caaacaaatt tgtc 3834

<210> 3

<211> 10218

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgcaagagc tcgtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct ctagagataa tgagcattgc 60

atgtctaagt tataaaaaat taccacatat tttttttgtc acacttgttt gaagtgcagt 120

ttatctatct ttatacatat atttaaactt tactctacga ataatataat ctatagtact 180

acaataatat cagtgtttta gagaatcata taaatgaaca gttagacatg gtctaaagga 240

caattgagta ttttgacaac aggactctac agttttatct ttttagtgtg catgtgttct 300

cctttttttt tgcaaatagc ttcacctata taatacttca tccattttat tagtacatcc 360

atttagggtt tagggttaat ggtttttata gactaatttt tttagtacat ctattttatt 420

ctattttagc ctctaaatta agaaaactaa aactctattt tagttttttt atttaataat 480

ttagatataa aatagaataa aataaagtga ctaaaaatta aacaaatacc ctttaagaaa 540

ttaaaaaaac taaggaaaca tttttcttgt ttcgagtaga taatgccagc ctgttaaacg 600

ccgtcgacga gtctaacgga caccaaccag cgaaccagca gcgtcgcgtc gggccaagcg 660

aagcagacgg cacggcatct ctgtcgctgc ctctggaccc ctctcgagag ttccgctcca 720

ccgttggact tgctccgctg tcggcatcca gaaattgcgt ggcggagcgg cagacgtgag 780

ccggcacggc aggcggcctc ctcctcctct cacggcaccg gcagctacgg gggattcctt 840

tcccaccgct ccttcgcttt cccttcctcg cccgccgtaa taaatagaca ccccctccac 900

accctctttc cccaacctcg tgttgttcgg agcgcacaca cacacaacca gatctccccc 960

aaatccaccc gtcggcacct ccgcttcaag gtacgccgct cgtcctcccc ccccccccct 1020

ctctaccttc tctagatcgg cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg 1080

ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg 1140

atgcgacctg tacgtcagac acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga 1200

atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc 1260

gttgcatagg gtttggtttg cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg 1320

tcgggtcatc ttttcatgct tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg 1380

gtcgttctag atcggagtag aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg 1440

atctgtatgt gtgtgccata catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata 1500

tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct 1560

ttttgttcgc ttggttgtga tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat 1620

cggagtagaa tactgtttca aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt 1680

gtgtcataca tcttcatagt tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg 1740

tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt 1800

catatgctct aaccttgagt acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt 1860

ttgatcttga tatacttgga tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc 1920

ctgccttcat acgctattta tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt 1980

gtttggtgtt acttatggat aacgcctaca ttattgccat tctctctgta gctatcctct 2040

tcttgctcca ctactacctc ctcggccgcg gcaatggcgg ggcggcgcgg ctgccgccgg 2100

gtccaccggc cgtcccgatc ctgggacacc tccacctcgt caagaagccg atgcacgcca 2160

ccatgtcccg cctcgccgag cggtacgggc cggtgttctc gctgcgcctc gggtcgcggc 2220

gcgccgtggt ggtgtcgtcg ccggggtgcg ccagggagtg cttcaccgag cacgacgtga 2280

ccttcgcgaa ccggcccagg ttcgagtcgc agctgctggt ctcgttcaac ggcgccgcgc 2340

tcgccacggc gagctacggc gcgcactggc gcaacctccg ccggatcgtc gccgtgcagc 2400

tgctctccgc gcaccgcgtc ggcctcatgt cggggctcat cgccggcgag gtccgcgcca 2460

tggtgcggag gatgtaccgc gccgcggccg cgtcccccgc cggcgccgcg cgcatccagc 2520

tgaagcggag gctgttcgag gtctccctca gcgtgctcat ggagaccatc gcccacacca 2580

aggcgacccg ccccgagacg gacccggaca ccgacatgtc cgtggaagcc caggagttta 2640

agcaggtcgt cgacgagatc atcccgcaca tcggcgcggc caacctgtgg gactacttgc 2700

cggcgctccg gtggttcgac gtgttcggcg tcaggaggaa gatcctcgcc gctgtaagcc 2760

ggagggacgc gttccttcgc cgcctgatcg acgcggagcg gcggaggctg gacgacggcg 2820

acgagggcga gaagaagagc atgatcgccg tgctgctcac tctgcagaag acagagccgg 2880

aggtgtacac cgataacatg atcacagctc taacggcgaa cttgttcgga gcaggaacag 2940

agacaacctc gacgacatca gaatgggcga tgtcgctact gctgaaccac cccgacacac 3000

tcaagaaagc gcaagccgag atcgacgcat ccgtcggcaa ctctcgcctg atcaccgccg 3060

acgacgtgac tcgcctcggc tacctccagt gcatcgtcag ggagacgctc cgcctgtacc 3120

ccgccgcgcc gatgctcctc ccgcacgagt cctccgccga ctgcaaggtc ggcggctaca 3180

acatcccgcg cgggtcgatg ttgctcatca acgcgtacgc catccaccgt gacccggcgg 3240

tgtgggagga gccggagaag ttcatgccgg agaggttcga ggacggcggg tgcgacggca 3300

atctcttgat gccgttcggg atggggaggc ggaggtgccc cggcgagacg ctggcgctgc 3360

gcacagtggg gttggtgctg ggcacgctga tccagtgctt cgactgggag agggtcgacg 3420

gcgtggaggt cgacatgact gaaggtggcg ggctcaccat ccccaaggtc gtgccgttgg 3480

aggccatgtg caggccgcgc gacgccatgg gtggtgttct tcgcgagctc gtctgagtcc 3540

tcagccatag agctgctgct gttctagggt tcacaagtct gcctatttgt cttccccaat 3600

ggagctatgg ttgtctggtc tggtccttgg tcgtgtcccg tttcattgtg tactatttac 3660

ctgtaatgtg tatccttaag tctggtttga tggtgtctga aacgttttgc tgtggtagag 3720

cagcatggaa gaactataat gaataagtga tccctaatca ttgtgtccaa attttgcttc 3780

tgctataccc ttttgtgctg tttcttatgt tttgcttaaa aatttgatct gacaaacaaa 3840

tttgtcggat ccacgcgtga gctcgaattc cctaggcacg tgtacgtatt ttttaccagg 3900

tgaactccaa gtcctggacc cttttttaag cttgtaaacc taagagaaaa gagcgtttat 3960

tagaataacg gatatttaaa agggcgtgaa aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg 4020

catgccaacc acagggttcc cctcgggatc aaagtacttt gatccaaccc ctccgctgct 4080

atagtgcagt cggcttctga cgttcagtgc agccgtcttc tgaaaacgac atgtcgcaca 4140

agtcctaagt tacgcgacag gctgccgccc tgcccttttc ctggcgtttt cttgtcgcgt 4200

gttttagtcg cataaagtag aatacttgcg actagaaccg gagacattac gccatgaaca 4260

agagcgccgc cgctggcctg ctgggctatg cccgcgtcag caccgacgac caggacttga 4320

ccaaccaacg ggccgaactg cacgcggccg gctgcaccaa gctgttttcc gagaagatca 4380

ccggcaccag gcgcgaccgc ccggagctgg ccaggatgct tgaccaccta cgccctggcg 4440

acgttgtgac agtgaccagg ctagaccgcc tggcccgcag cacccgcgac ctactggaca 4500

ttgccgagcg catccaggag gccggcgcgg gcctgcgtag cctggcagag ccgtgggccg 4560

acaccaccac gccggccggc cgcatggtgt tgaccgtgtt cgccggcatt gccgagttcg 4620

agcgttccct aatcatcgac cgcacccgga gcgggcgcga ggccgccaag gcccgaggcg 4680

tgaagtttgg cccccgccct accctcaccc cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga 4740

tcgaccagga aggccgcacc gtgaaagagg cggctgcact gcttggcgtg catcgctcga 4800

ccctgtaccg cgcacttgag cgcagcgagg aagtgacgcc caccgaggcc aggcggcgcg 4860

gtgccttccg tgaggacgca ttgaccgagg ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac 4920

gccaagagga acaagcatga aaccgcacca ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac 4980

cgaagagatc gaggcggaga tgatcgcggc cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt 5040

ctcaaccgtg cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg 5100

gccggccagc ttggccgctg aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt 5160

tgagtaaaac agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca 5220

aatacgcaag gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc 5280

aagacgacca tcgcaaccca tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg 5340

ttagtcgatt ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa 5400

ccgctaaccg ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc 5460

cggcgcgact tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg 5520

atcaaggcag ccgacttcgt gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc 5580

accgccgacc tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa 5640

gcggcctttg tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag 5700

gcgctggccg ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac 5760

ccaggcactg ccgccgccgg cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc 5820

cgcgaggtcc aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta 5880

aagagaaaat gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca 5940

gcaaggctgc aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc 6000

agttgccggc ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca 6060

ttaccgagct gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa 6120

atgagtagat gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc 6180

accgacgccg tggaatgccc catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc 6240

tgggttgtct gccggccctg caatggcact ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga 6300

cggtcgcaaa ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga 6360

gaagttgaag gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg 6420

tgaatcgtgg caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc 6480

cggtgcgccg tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc 6540

gatgctctat gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg 6600

tctgtcgaag cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca 6660

cgtagaggtt tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact 6720

gatggcggtt tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa 6780

gcccggccgc gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga 6840

tggcggaaag cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt 6900

tgccatgcag cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga 6960

agccttgatt agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga 7020

gatcgagcta gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct 7080

gacggttcac cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct 7140

ggcacgccgc gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg 7200

cagtggcagc gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc 7260

aaatgacctg ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt 7320

catgcgctac cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca 7380

gatgctaggg caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga 7440

tagcacgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa 7500

cccaaagccg tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa 7560

aggcgatttt tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc 7620

ctgtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg 7680

gtcgctgcgc tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc 7740

aaaaatggct ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc 7800

actcgaccgc cggcgcccac atcaaggcac cctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg 7860

aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg 7920

ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca 7980

tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca 8040

gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 8100

ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 8160

gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 8220

ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 8280

ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 8340

acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 8400

tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 8460

ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 8520

ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 8580

ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 8640

actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 8700

gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 8760

tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 8820

caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 8880

atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 8940

acgttaaggg attttggtca tgcattctag gtactaaaac aattcatcca gtaaaatata 9000

atattttatt ttctcccaat caggcttgat ccccagtaag tcaaaaaata gctcgacata 9060

ctgttcttcc ccgatatcct ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt cataccactt 9120

gtccgccctg ccgcttctcc caagatcaat aaagccactt actttgccat ctttcacaaa 9180

gatgttgctg tctcccaggt cgccgtggga aaagacaagt tcctcttcgg gcttttccgt 9240

ctttaaaaaa tcatacagct cgcgcggatc tttaaatgga gtgtcttctt cccagttttc 9300

gcaatccaca tcggccagat cgttattcag taagtaatcc aattcggcta agcggctgtc 9360

taagctattc gtatagggac aatccgatat gtcgatggag tgaaagagcc tgatgcactc 9420

cgcatacagc tcgataatct tttcagggct ttgttcatct tcatactctt ccgagcaaag 9480

gacgccatcg gcctcactca tgagcagatt gctccagcca tcatgccgtt caaagtgcag 9540

gacctttgga acaggcagct ttccttccag ccatagcatc atgtcctttt cccgttccac 9600

atcataggtg gtccctttat accggctgtc cgtcattttt aaatataggt tttcattttc 9660

tcccaccagc ttatatacct tagcaggaga cattccttcc gtatctttta cgcagcggta 9720

tttttcgatc agttttttca attccggtga tattctcatt ttagccattt attatttcct 9780

tcctcttttc tacagtattt aaagataccc caagaagcta attataacaa gacgaactcc 9840

aattcactgt tccttgcatt ctaaaacctt aaataccaga aaacagcttt ttcaaagttg 9900

ttttcaaagt tggcgtataa catagtatcg acggagccga ttttgaaacc gcggtgatca 9960

caggcagcaa cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga gatcatccgt 10020

gtttcaaacc cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag 10080

tctgccgcct tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat 10140

cgagtggtga ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga 10200

tatattgtgg tgtaaaca 10218

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatatattg tggtgtaaac actgcaagag ctcgtgcagc gtga 44

<210> 5

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctggtaaaaa atacgtacac gtgcctaggg aattcgagct cacgcgtgga tccgacaaat 60

ttgtttgtca gatcaaattt ttaagc 86

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcttagttgc cgttcttccg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgttcatgg cgtaatgtct cc 22

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agggacgcgt tccttcg 17

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

catcccgaac ggcatcaa 18

Claims (10)

1.一种植物转基因筛选表达盒，其特征在于，以植物内源基因作为筛选标记。

2.如权利要求1所述的植物转基因筛选表达盒，其特征在于，所述植物内源基因为水稻P450基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求2所述的植物转基因筛选表达盒，其特征在于，所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种植物遗传转化筛选载体，其特征在于，含有权利要求1-3任一所述的植物转基因筛选表达盒。

5.如权利要求4所述的植物遗传转化筛选载体，其特征在于，其为植物双元表达载体，可通过克隆其他植物表达盒进入该载体进行遗传转化，所述其他植物表达盒是指除权利要求1-3任一所述的植物转基因筛选表达盒之外的植物表达盒，包括但不限于荧光蛋白表达盒、GUS报告基因表达盒、抗虫表达盒、抗除草剂表达盒。

6.如权利要求4或5所述的植物遗传转化筛选载体，其特征在于，其为pCBA6，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.权利要求1-3任一所述的植物转基因筛选表达盒或权利要求4-6任一所述的植物遗传转化筛选载体在制备转基因植物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，制备转基因植物时，所用的筛选培养基中，苯达松浓度为200-500mg/L或苄嘧磺隆浓度为10-100mg/L。

9.权利要求1-3任一所述的植物转基因筛选表达盒或权利要求4-6任一所述的植物遗传转化筛选载体在植物遗传转化筛选中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，在植物遗传转化筛选中，所用的筛选培养基含有浓度为200-500mg/L的苯达松或浓度为10-100mg/L的苄嘧磺隆。