MXPA02001425A - Produccion de proteinas mediante disociacion autoproteolitica. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un proceso para la produccion de un polipeptido heterologo deseado con un termino N homogeneo claramente definido en una celula bacteriana huesped, en donde el polipeptido heterologo deseado se disocia autoproteoliticamente a partir de una proteina de fusion inicialmente expresada que comprende un polipeptido con la actividad autoproteolitica de una autoproteasa Npro de un pestivirus, y el polipeptido heterologo, mediante la actividad autoproteolitica de Npro.

Description

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE DISOCIACIÓN AUTOPROTEOLITICA La presente invención se refiere a un proceso para la producción de un polipéptido heterólogo deseado con un término N homogéneo claramente definido en una célula bacteriana huésped, en donde el polipéptido heterólogo deseado se disocia de una manera autoproteolítica a partir de una proteína de fusión inicialmente expresada que comprende un péptido con la actividad autoproteolítica de una autoproteasa Npro de un pestivirus y el polipéptido heterólogo mediante la actividad autoproteolítica Npro. En la producción de proteínas recombinantes en organismos heterólogos, tal como la expresión de proteínas humanas u otras proteínas eucarióticas en células bacterianas, con fre- cuencia es difícil obtener un término N claramente definido que sea tanto como casi el 100 por ciento homogéneo como sea posible. Esto se aplica en particular a las proteínas farmacéuticas recombinantes cuya secuencia de aminoácidos en muchos casos debe ser idéntica a la secuencia de aminoácidos que se presen- tan naturalmente en humanos/animales. Sobre su expresión natural, por ejemplo en seres humanos, muchas proteínas farmacéuticas que están en uso, se transportan hacia el espacio extracelular, y la disociación de la secuencia de señal presente en la proteína precursora para este propósito da como resultado un término N claramente defi- nido. Este término N homogéneo no siempre es fácil de producir, por ejemplo en células bacterianas, por varias razones. Solamente en casos raros es adecuada la exportación hacia el periplasma bacteriano con la ayuda de una secuencia de señal pro- o eucariótica, debido a que normalmente es posible acumular solamente cantidades muy pequeñas del producto aquí debido a la baja capacidad de transporte de maquinaria de exportación bacteriana. Sin embargo, el citoplasma bacteriano difiere consi- derablemente del espacio extracelular de los eucariotes . Por una parte, están presentes condiciones reductoras en el mismo, y por otra parte, no hay un mecanismo para disociar las secuencias líder N-terminales para formar proteínas maduras. La síntesis de todas las proteínas citoplásmicas empieza con una me- tionina que es especificada por el codón de inicio apropiado (ATG = inicio de traducción) . Esta metionina N-terminal es retenida en muchas proteínas, mientras que en otras, se disocia mediante la metionina-aminopeptidasa (MAP) presente en el citoplasma e intrínseca para el huésped. La eficiencia de la diso- ciación depende esencialmente de dos parámetros: 1. la naturaleza del siguiente aminoácido, y 2. la localización del término N en la estructura tridimensional de la proteína. La metionina N-terminal de preferencia se suprime cuando el siguiente aminoácido es serina, alanina, glicina, metionina, o valina, y cuando se expone el término N, es decir, no está "oculto" adentro de la proteína. Por otra parte, si el siguiente aminoácido es uno diferente, en particular uno cargado (ácido glutámico, ácido aspártico, lisina, arginina) , o si el término N se localiza dentro de la proteína, en la mayoría de los casos no ocurre la disociación de la metionina N-terminal (Knippers, Rolf (1995) Molekulare Genetik, 6a. edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nueva York. ISBN 3-13-103916-7) . E inclusive si está presente un aminoácido que promueva la disociación en la posición 2, la disociación raramente es completa. Es usual que una proporción no inconsiderable (del 1 al 50 por ciento) permanezca sin ser afectada por la MAP. En los primeros días de la producción de proteínas farmacéuticas recombinantes en células bacterianas, el procedi-miento era simplemente poner un codón de inicio ATG que codificara la metionina enfrente del marco de lectura abierta (ORF) para la proteína madura (es decir, sin la secuencia de señal u otra extensión N-terminal) . Luego la proteína expresada tenía la secuencia H2N-Met-proteína blanco. Solamente en unos cuan-tos casos era posible lograr una disociación completa de la metionina N-terminal mediante la NAP intrínseca del huésped. La mayoría de las proteínas producidas de esta manera, por consiguiente, son inhomogéneas en relación con su término N (mezcla de la forma Met y la forma libre de Met) , o tienen todas un aminoácido extraño adicional (Met) en el término N (solamente ...... íe ..* ía forma Met) . Esta inhomogeneidad o desviación de la secuencia natural, sin embargo, es inaceptable en muchos casos, debido a que estos productos con frecuencia muestran diferentes propie- dades inmunológicas (por ejemplo, inducción de formación de anticuerpos) y farmacológicas (vida media, farmacocinética) . Por estas razones, ahora es necesario en la mayoría de los casos producir un producto idéntico al de la naturaleza (homogéneo y sin aminoácidos extraños en el término N) . En el caso de la expresión citoplásmica, el remedio aquí en la mayoría de los casos es fusionar una secuencia de disociación (líder) para una endopeptidasa específica (por ejemplo el factor Xa, enterocina-sa, endopeptidasas KEX, proteasa IgA) , o aminopeptidasa (por ejemplo, dipeptidil-aminopeptidasa) con el término N de la pro-teína blanco. Sin embargo, esto hace un paso adicional, con gasto de costos y materiales, necesarios durante el procesamiento adicional, el denominado procesamiento corriente abajo, del producto. Por consiguiente, existe una necesidad de un proceso para producir una proteína blanco en células bacterianas, siendo la intensión de que la proteína blanco se pueda preparar con un término N deseado uniforme sin elaborar pasos adicionales in vi tro (repliegue, purificación, disociación de proteasa, purificación renovada, etcétera) . Dentro del alcance de la presen-te invención, se ha desarrollado este proceso, utilizando la autoproteasa viral Npro a partir de pestivirus. Los pestivirus forman un grupo de patógenos que causan serias pérdidas económicas en cerdos y rumiantes alrededor del mundo. Como el patógeno de una enfermedad transmisible no-tificable, el virus de fiebre de cerdos clásico (CSFV) es particularmente importante. Las pérdidas ocasionadas por el virus de diarrea viral bovina (BVDV) también son considerables, especialmente por la ocurrencia regular de infecciones intrauterinas de los fetos. Los pestivirus son pequeños virus envueltos con un genoma que actúa directamente como el ARNm, y es de un tamaño de 12.3 kb, y a partir del cual se transcriben los productos genéticos virales en el citoplasma. Esto tiene lugar en la forma de una sola poliproteína que comprende aproximadamente 4,000 aminoácidos, y que se descompone tanto mediante las proteasas virales como celulares en aproximadamente 12 proteínas maduras . Hasta la fecha, se han identificado 2 proteasas codificadas por virus en los pestivirus, la autoproteasa Npro, y la proteasa de serina NS3. La proteasa N-terminal Npro se localiza en el término N de la poliproteína, y tiene una masa molecular aparente de 23 kd. Cataliza una disociación que tiene lugar entre su propio término C (Cys 168) y el término N (Serl69) de la proteína de nucleocapsida C (R. Stark y colaboradores, J. Virol. 67 (1993), 7088-7095). En adición, se han descrito du-plicaciones del gen Npro en los virus BVDV citopatogénicos . En éstos, existe una segunda copia de Npro en el término N de la proteasa NS3 de la misma manera duplicada. Se observa una disociación autoproteolítica de la proteína Npro-NS3 en este caso también (R. Stark y colaboradores, ver anteriormente) . Npro es una autoproteasa con una longitud de 168 aminoácidos, y un Mr aparente de aproximadamente 20,000 d (in vi vo) . Es la primera proteína 'en la poliproteína de los pestivu-ris (tales como CSFV, BDV (virus de enfermedad límite) ó BVDV) , y sufre una disociación autoproteolítica a partir de la siguiente proteína de nucleocapsida C (M. iskerchen y colaboradores, J. Virol 65 (1991), 4508-4514; Stark y colaboradores, J. Virol. 67 (1993), 7088-7095). Esta disociación tiene lugar después del último aminoácido en la secuencia de Npro, Cysl68. De una manera sorprendente, ahora se ha encontrado, dentro del alcance de la presente invención, que se retiene la función autoproteolítica de una autoproteasa Npro de un pestivirus en los sistemas de expresión bacterianos, en particular sobre la expresión de las proteínas heterólogas. Por consiguien-te, la presente invención se refiere a un proceso para la producción de un polipéptido heterólogo deseado con un término N homogéneo claramente definido en una célula bacteriana huésped, en donde el polipéptido heterólogo deseado se disocia de una proteína de fusión inicialmente expresada que comprende un péptido con la actividad autoproteolítica de una autoproteasa .!-...«....... .ji,.-.. j Npro de un pestivirus, y el polipéptido heterólogo, mediante la actividad autoproteolítica de Npro. La invención se refiere además a medios de clonación que se emplean en el proceso de acuerdo con la invención. Un polipéptido con la actividad autoproteolítica de una autoproteasa Npro de un pestivirus o un polipéptido con la función autoproteolítica de una autoproteasa Npro de un pestivirus es, en particular, una autoproteasa Npro de un pestivirus, o un derivado de la misma, con actividad autoproteolítica. Dentro del alcance de la presente invención, el término "polipéptido heterólogo" significa un polipéptido que no se disocia naturalmente mediante una autoproteasa Npro de un pestivirus a partir de una proteína de fusión o poliproteína que se presente naturalmente. Los ejemplos de los polipéptidos heterólogos son enzimas industriales (enzimas de proceso) o polipéptidos con actividad farmacéutica, en particular farmacéutica humana. Los ejemplos de los polipéptidos preferidos con actividad farmacéutica humana son citocinas, tales como interleuci- ñas, por ejemplo IL-6, interferones, tales como interferones de leucocitos, por ejemplo interferón a2B, factores de crecimiento, en particular factores de crecimiento hemopoyéticos o de sanado de heridas, tales como G-CSF, eritropoyetina, o IGF, hormonas tales como hormona de crecimiento humana (hGH) , anti- cuerpos o vacunas.

En un aspecto, la presente invención se refiere de esta manera a una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión comprende un primer polipéptido que tiene la función autoproteolítica de una autoproteasa Npro de un pestivirus, y un segundo polipéptido que se conecta con el primer polipéptido en el término C del primer polipéptido de una manera tal que el segundo polipéptido es capaz de disociarse de la proteína de fusión mediante la actividad autoproteolítica del primer polipéptido, y en donde el segundo polipéptido es un polipéptido heterólogo. El pestivirus para este propósito de preferencia se selecciona a partir del grupo de CSFV, BDV, y BVDV, prefiriéndose particularmente el CSFV. Una molécula de ácido nucleico preferida de acuerdo con la in- vención es una en donde el primer polipéptido de la proteína de fusión comprende la siguiente secuencia de aminoácidos de la autoproteasa Npr0 de CSFV (ver también el número de acceso de la base de datos EMBL, X87939) (aminoácidos 1 a 168, leyendo desde la dirección N-terminal hasta la dirección C-terminal) : ( 1 ) -MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTT LRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGR- VTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLK IRNFTNCPLWVTSC- (168) , o la secuencia de aminoácidos de un derivado de la misma, con actividad autoproteolítica.

Los derivados con actividad autoproteolítica de una autoproteasa Npro de un pestivirus, son las autoproteasas Npro producidas mediante mutagénesis, en particular sustitución de aminoácidos, supresión, adición, y/o inserción de aminoácidos, siempre que se retenga la actividad autoproteolítica requerida, en particular para generar una proteína deseada con un término N homogéneo. Los métodos para generar estos derivados mediante mutagénesis son familiares para la persona experta. Mediante estas mutaciones, es posible optimizar la actividad de la auto-proteasa Npr0, por ejemplo, en relación con diferentes proteínas heterólogas que se vayan a disociar. Después de la producción de un ácido nucleico que codifique para una proteína de fusión que, además de la proteína heteróloga deseada, comprenda un derivado de autoproteasa Npro que exhiba una o más mutaciones me-diante su comparación con una autoproteasa Npro que se presente naturalmente, se establece si está presente la función requerida mediante la determinación de la actividad autoproteolítica en un sistema de expresión. Por ejemplo, la actividad autoproteolítica se puede detectar inicialmente mediante un sistema in vitro . Para este propósito, la construcción del ADN se transcribe al ARN, y se traduce en proteína con la ayuda de un estuche de traducción in vi tro . Con el objeto de incrementar la sensibilidad, la proteína resultante en algunos casos se marca mediante la incorpo-ración de un aminoácido radioactivo. La proteína de fusión de ->-- --* Npro-proteína blanco resultante sufre una disociación autocatalítica en conjunto con la traducción y/o posterior a la traducción, habiendo una disociación precisa de la porción Npro N- terminal por medio de su actividad autoproteolítica a partir de la siguiente proteína blanco. Los productos de disociación re- sultantes se pueden detectar fácilmente, y la mezcla se puede procesar inmediatamente después de la realización de la reacción de traducción ip vitro. La mezcla subsecuentemente se carga sobre un gel de proteína (por ejemplo Lámmli SDS-PAGE) , y se somete a electroforesis. El gel subsecuentemente se tiñe con tintes adecuados, o se auto-radiografía. También es posible una mancha Western con subsecuente inmunoteñido. La eficiencia de la disociación de la proteína de fusión se puede evaluar con base en la intensidad de las bandas de proteína re- sultantes. En un paso adicional , el fragmento de ácido nucleico para la proteína de fusión se puede clonar en un vector de expresión bacteriano (si esto no ha sucedido ya para la traducción in vi tro) , y el último se puede transformar en un huésped apropiado (por ejemplo, E. coli) . La cepa de expresión resultante expresa la proteína de fusión de una manera constitutiva, o después de la adición de un inductor. En el último caso, es necesario cultivar además durante 1 ó más horas después de la adición del inductor, con el objeto alcanzar una titulación su- ficiente del producto. Entonces la autoproteasa Npro se disocia ella misma conjuntamente con la traducción o posteriormente a la traducción a partir de la proteína de fusión expresada, de tal ma era que los fragmentos de disociación resultantes son la autoproteasa Npro por si misma, y la proteína blanco con el tér-mino N definido. Para evaluar la eficiencia de esta reacción de disociación, se toma una muestra después del final del cultivo o de la fase de inducción, y se analiza mediante SDS-PAGE como se describió anteriormente. Un derivado de autoproteasa Npro preferido de la pro-teína de fusión descrita tiene, por ejemplo, una región N-terminal en donde se han suprimido o sustituido uno o más aminoácidos en la región de los aminoácidos 2 a 21, siempre que el derivado resultante continúe exhibiendo la función autoproteolítica de la autoproteasa Npro hasta el grado deseado. En el contexto de la presente invención, los derivados de autoproteasa Npro que se prefieren en la proteína de fusión comprenden, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la autoproteasa Npro de CSFV con una supresión de los aminoácidos 2 a 16 ó 2 a 21. También es posible, mediante sustitución o adición de aminoáci-dos, intercambiar o introducir secuencias de aminoácidos, por ejemplo con el objeto de introducir una secuencia de aminoácidos que ayude a la purificación (ver los ejemplos) . Una molécula de ácido nucleico particularmente preferida de acuerdo con la presente invención, es una en donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos Glu22 a Cysl68 de la autoproteasa Npro de CSFV, o un derivado de la misma con actividad autoproteolítica, teniendo además el primer polipéptido un Met como el término N, y conectándose el polipéptido heterólogo directamente con el aminoácido Cysl68 de la autoproteasa Npr° de CSFV. Una molécula de ácido nucleico de la misma manera preferida de acuerdo con la presente invención, es una en donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos Pro 17 a Cys 168 de la autoproteasa Npro de CSFV, o un derivado de la misma con actividad autoproteolítica, teniendo además el primer polipéptido un Met como el término N, y conectándose el polipéptido heterólogo directamente con el aminoácido Cys 168 de la autoproteasa Npro de CSFV. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la in-vención está, en particular, en la forma de una molécula de ADN. La presente invención se refiere además a elementos de clonación, en particular vectores de expresión y células huésped, que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Por consiguiente, la presente invención se refiere además a un vector de expresión que es compatible con una célula bacteriana huésped previamente definida, que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, y cuando menos una secuencia de control de expresión. Las secuencias de control de expresión son en particular promotores (tales como lac, tac, T3, T7, trp, gac, vhb, lambda pL, ó phoA) , sitios de enlace de ribosoma (por ejemplo, sitios de enlace de ribosomas naturales que pertenezcan a los promotores anteriormente mencionados, ero o sitios de enlace de ribo-soma sintéticos) , o terminadores de transcripción (por ejemplo rrnB T1T2 ó bla) . La célula huésped anterior de preferencia es una célula bacteriana del género Escherichia, en particular E. coli . Sin embargo, también es posible utilizar otras células bacterianas (ver más adelante) . En una modalidad preferí-da, el vector de expresión de acuerdo con la invención es un plásmido. La presente invención se refiere además a una célula bacteriana huésped que comprende un vector de expresión de acuerdo con la invención. Esta célula bacteriana huésped se puede seleccionar, por ejemplo, a partir del grupo de los siguientes microorganismos: bacterias Gram-negativas, tales como especies de Escherichia, por ejemplo E. coli , u otras bacterias Gram-negativas, por ejemplo Pseudomonas sp. , tales como Pseudomonas aeruginosa, o Caulobacter sp, tales como Caulobacter crescentus, o bacterias Gram-positivas, tales como Bacillus sp, en particular Bacillus subtilis . Se prefiere en particular E. coli como la célula huésped. La presente invención se refiere además a un proceso para la producción de un polipéptido heterólogo deseado, el cu-al comprende : L J.A.J.-.J... (i) el cultivo de una célula bacteriana huésped de acuerdo con la presente invención, que comprende un vector de expresión de acuerdo con la presente invención, que a su vez comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la pre- senté invención, en donde el cultivo ocurre bajo condiciones que ocasionan la expresión de la proteína de fusión y la disociación autoproteolítica adicional del polipéptido heterólogo a partir de la proteína de fusión en la célula huésped mediante la actividad autoproteolítica del primer polipéptido, y (ii) el aislamiento del polipéptido heterólogo disociado. El proceso de acuerdo con la invención se realiza en principio cultivando inicialmente la célula bacteriana huésped, es decir, la cepa de expresión, de acuerdo con la práctica mi- crobiológica conocida por sí misma. La cepa generalmente se reproduce empezando a partir de una sola colonia sobre un medio nutriente, pero también es posible emplear suspensiones celulares crioconservadas (bancos de células) . La cepa generalmente se cultiva en un proceso de múltiples etapas con el objeto de obtener suficiente biomasa para un uso adicional . A una escala pequeña, esto puede tener lugar en matraces agitados, siendo posible la mayoría de los casos emplear un medio » complejo (por ejemplo, caldo LB) . Sin embargo, también es posible utilizar medios definidos (por ejemplo, un me- dio de citrato) . Para el cultivo, se hace crecer un precultivo de pequeño volumen de la cepa huésped (inoculada con una sola colonia o con una suspensión celular de un criocultivo) , no siendo en general crítica la temperatura para este cultivo para el posterior resultado de la expresión, de tal manera que es posible operar rutinariamente a temperaturas relativamente altas (por ejemplo a 30°C ó 37°C) . El cultivo principal se establece en un volumen más grande (por ejemplo 500 mililitros) , en donde es particularmente necesario asegurar una buena aireación (gran volumen del matraz comparándose con el volumen del conte- nido, alta velocidad de rotación) . Debido a que se pretende que la expresión tenga lugar en una forma soluble, el cultivo principal en la mayoría de los casos también se realizará a una temperatura un poco más baja (por ejemplo, a 22°C ó a 28°C) . ^anto los sistemas inducibles (por ejemplo con el promotor trp, lac, tac ó phoA) como los sistemas constitutivos, son adecuados para producir proteínas solubles. Después de que se ha alcanzado la ultima fase logarítmica (normalmente en una densidad óptica de 0.5 a 1.0 en matraces agitados), en los sistemas inducibles, se agrega la sustancia inductora (por ejemplo ácido indolacrílico, isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida = IPTG) , y se continúa la incubación durante 1 a 5 horas. En este caso, la concentración de la sustancia inductora tiende a seleccionarse en el límite más bajo con el objeto de hacer posible una expresión cuidadosa. Durante este tiempo, se forma la mayor parte de la proteína de fusión de Npro-proteína blanco, habiendo una disociación conjuntamente con la traducción o posterior a la traducción de la porción Npro, de tal manera que están presentes 2 porciones disociadas por separado después del final del cultivo. Las células resultantes se pueden cosechar y procesar adicionalmente. A una escala más grande, el sistema en múltiples etapas consiste en una pluralidad de biorreactores (fermentado- res), prefiriéndose emplear un medio nutriente definido en este caso, con el objeto de poder mejorar el control de la ingeníería del proceso. En adición, es posible incrementar mucho la biomasa y formación del producto introduciendo nutrientes particulares (lote alimentado) . De otra manera, el proceso es análogo al matraz agitado. Por ejemplo, se utilizan un fermen-tador de etapa preliminar y un termentador de etapa principal, seleccionándose la temperatura de cultivo similar a aquélla del matraz agitado. El fermentador de la etapa preliminar se inocula con el denominado inoculo que generalmente se cultiva a partir de una sola colonia o un criocultivo en un matraz agitado. También se debe asegurar una buena aireación y una concen-tración de inductor suficiente en el fermentador - y especialmente en su etapa principal. Sin embargo, la fase de inducción en algunos casos se debe hacer distintivamente más larga comparándose con el matraz agitado. Las células resultantes se suministran una vez más para un procesamiento adicional. La proteína blanco heteróloga que se ha disociado de la proteína de fusión entonces se puede aislar mediante los métodos de purificación de proteínas conocidos por la persona experta (ver, por ejemplo, M.P. Deutscher, en: Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification, Academic Press Inc., (1990), 309-392). Una secuencia de purificación comprende en general un paso de alteración celular, un paso de aclaración (centrifugación o microfiltración) , y diferentes pasos cromato- gráficos, filtraciones, y precipitaciones. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la pre- senté invención, sin limitar de ninguna manera su alcance.

Ejemplos Ejemplo 1: Expresión y disociación in vivo de una proteína de fusión Npro-C en un huésped bacteriano Se construye el plásmido NPC-pET para la expresión de una proteína de fusión Npro-C en un huésped bacteriano. El vector de expresión utilizado es el vector pETlla (F.W. Studier y colaboradores, Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-89). El gen es-tructural natural (a partir del genoma de ARN de CSFV) para la proteína de fusión Npro-C, se clona en este vector de expresión. El gen estructural para esta proteína de fusión se proporciona mediante amplificación con reacción en cadena de la polimerasa a partir de un genoma viral que se haya transcrito en el ADNc (y clonado en un vector) . Más aun, los primeros 16 aminoácidos - ^ ^á .. j...A.A^ de la secuencia natural de Npro (MELNHFELLYKTSKQK) son reemplazados por un auxiliar de purificación de oligo-histidina de 10 aminoácidos de largo (MASHHHHHHH) . La construcción resultante se denomina NPC-pET. La secuencia de la porción Npro y el sitio de disociación autoproteolítica de la proteína de fusión Npro-C codificada sobre NPC-pET tiene la siguiente estructura, localizándose el sitio de disociación entre los aminoácidos Cysl68 y Ser(169) : MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKG- DCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGS- DGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC ( 168 ) S (169) DDGAS- (proteina de nucleocapsida C) . En la secuencia, la prolina 17 (posición 2 de la proteína de fusión) a partir de la secuencia de Npro natural, se pone en itálicas, y el inicio de la secuencia C se imprime en negrillas. La proteína de fusión tiene un Mr aproximado de 32 kd, contando la porción Npro por 18 kd, y contando la porción C por 14 kd después de la disociación autoproteolítica. Con el objeto de evaluar el significado del primer aminoácido C-terminal del sitio de disociación, la serina 169 que está naturalmente presente ahí, es reemplazada por los otros 19 aminoácidos que se presentan naturalmente, mediante mutagénesis dirigida. Las construcciones producidas de esta manera se denominan NPC-pET-Ala, NPC-pET-Gly, etcétera. Las cepas de expresión se producen utilizando estos plásmidos. i-i-*-» »j XX. i «y» . <._-. ÍZZ?..-AZ-, . . Z ..z -- - -- - . — -. Z - ZX t . ,i _ ----É-É-JI- Se utiliza Escherichia coli BL21 (DE3) como la cepa huésped de Escherichia coli para la expresión de las proteínas de fusión Npro-C. Esta cepa tiene el siguiente genotipo: E. coli B F" dem ompT hsdS(rb~mb~) gal ?(DE3) La cepa está comercialmente disponible en la forma de células competentes en Stratagene. Aloja a un fago landa liso-génico en el genoma, que comprende al gen para la polimerasa de ARN T7 bajo el control del promotor lact7V5. De esta manera, se puede inducir la producción de la polimerasa de ARN T7, y eo consecuencia, también la proteína blanco, mediante la adición de isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida (IPTG) . Este sistema de dos etapas permite tener niveles de expresión específica y absoluta muy altos para muchas proteínas blanco. Las cepas de expresión BL21 (DE3) ( [MPC-pET) , BL21 (DE3) [MPC-pET-Ala] etcétera, se producen mediante la transformación del plásmido de expresión respectivo en BL21 (DE3) . La transformación tiene lugar de acuerdo con la información del fabricante sobre las células competentes (Stratagene o Nova-gen) . La mezcla de transformación se aplica sobre placas de ágar Luria con 100 miligramos/litro de ampicilina. Esta transformación da como resultado numerosos clones en cada caso después de la incubación a 37°C (durante la noche) . Se recoge una colonia de tamaño mediano con distintos márgenes, y forma la base para la cepa de expresión apropiada. El clon se cultiva y se conserva en crioampolletas a -80°C --M-s-k (banco de células maestro MCB) . La cepa se aplica sobre placas de ágar Luria (con ampicilina) para uso diario. La cepa particular se utiliza para inocular un precultivo en un matraz agitado a partir de una sola colonia sub-cultivada sobre una placa de ágar. Se utiliza una alícuota del precultivo para inocular un cultivo principal (10 a 200 mililitros en un matraz agitado) , y se reproduce hasta que la ODeoo sea de 0.5 a 1.0. Entonces se induce la producción de la proteína de fusión con IPTG 1.0 mM (concentración final) . Los cultivos se cultivan adicionalmente durante 2 a 4 horas, alcanzándose una ODgoo de aproximadamente 1.0 a 2.0. La temperatura de cultivo es de 30°C +/-2°C, y el medio utilizado es un medio LB + 2 gramos/litro de glucosa + 100 miligramos/litro de ampicilina. Se toman muestras de los cultivos antes de la inducción y en diferentes tiempos después de la inducción, y se centrifugan, y los granulos se hierven en un regulador de muestra desnaturalizante, y se analizan mediante SDS-PAGE y teñido con Coomassie, o mancha Western. Las muestras se toman bajo condi-ciones estandarizadas, y las diferencias en la densidad de los cultivos se compensan mediante el volumen del regulador de carga de muestra utilizado para la resuspensión. Las bandas que aparecen después de la inducción se localizan un poco arriba de 20 kd (Npro) , y a aproximadamente 14 kd (C) . La eficiencia de la disociación de la proteína de fu- Sión con cada construcción se estima con base en la intensidad de las bandas en el gen teñido con Coomassie y en la mancha Western. A partir de esto, se encuentra que la mayoría de los aminoácidos son tolerados en la posición inmediatamente C- 5 terminal del sitio de disociación (es decir, en el término N de la proteína blanco) , es decir, tiene lugar una disociación autoproteolítica muy eficiente. Estos datos muestran que es posible, en principio, emplear con éxito la actividad autoproteolítica de la autopro- 10 teasa Npro para la disociación específica de una proteína de fusión recombinante en una célula bacteriana huésped.

Ejemplo 2: Expresión y disociación in vivo de una proteína de fusión de Npro e interleucina humana 6 (hIL6) para producir 15 hIL6 madura homogénea Se construye el plásmido NP6-pET para la expresión de la proteína de fusión Npro-hIL6. Se utiliza pETlla (F.W. Stu- dier y colaboradores, Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-89) como el vector de expresión. Primeramente, se clona una proteína de 20 fusión consistente en Npro y la proteína de nucleocapsida CSFV, en este vector de expresión (ver el Ejemplo 1) . El gen estructural para esta proteína de fusión es proporcionado mediante una reacción en cadena de la polimerasa. Esto implica que se reemplacen los primeros 16 aminoácidos de la secuencia natural -5-2-7»; de Npro (MELNHFELLYKTSKQK) por un auxiliar de purificación de oligo-histidina de 10 aminoácidos de largo (MASHHHHHHH) . Se introduce un sitio de disociación Spel en el plásmido de expresión resultante, en la unión entre Npro y la pro- teína de nucleocapsida, mediante mutagénesis dirigida. Esto hace posible suprimir el gen estructural para la proteína de nucleocapsida a partir del vector mediante restricciones con Spel en el extremo 5' (que corresponde al término N de la proteína) y Xhol en el extremo 3' (que corresponde al término C de la proteína) . El vector Npro-pETlla linearizado correspondiente se remueve del fragmento del gen de nucleocapsida mediante electroforesis en gel de preparación. Entonces, es posible introducir el gen estructural hIL6 por medio de los extremos "pegajosos" Spel y Xhol. Para esto, es necesario el siguiente proceso de preparación. Se amplifica el gen estructural con la ayuda de una reacción en cadena de la polimerasa de alta precisión (por ejemplo, sistema Pwo de Roche Biochemicals, el procedimiento mencionado por el fabricante) , a partir de un clon de ADNc de hIL6, que se puede producir a partir de células C10-MJ2. Se emplean los siguientes oligonucleótidos para este propósito: Oligonucleótido 1 ("N-terminal") : 5'- ATAATTACTA GTTGTGCTCC AGTACCTCCA GGTGAAG -3' Oligonucleótido 2 ("C-terminal"): 5'- ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTACATTTGC CGAAGAGCCC TCAGGC -3' iaá-A.-, ? -t-A-a... x .. . -*<----»---»< _.-„~----*.

Se introduce un sitio de disociación Spel en el extremo 5', y se introduce un sitio de disociación Xhol en el extremo 3' por medio de los oligonucleótidos utilizados. En adición, se introduce un doble codón de paro ochre (TAATAA) en el extremo 3' del gen estructural para una terminación eficiente de la traducción. El sitio de disociación Spel en el extremo frontal permite el ligamiento en el marco de lectura con el vector Npro-pETlla descrito anteriormente. El sitio de disociación Xhol en el extremo posterior hace posible la clonación di- rigida. Más adelante se ilustra la secuencia del fragmento de la reacción en cadena de la polimerasa (593 pares de bases) con el gen estructural para hIL6 (leerse en la dirección N-terminal hacia C-terminal). Los sitios de disociación de restricción están subrayados, y el primer codón de hIL6 (Ala) y el codón de paro está impresos en negrillas: ATAATTACTAGTTGTGCTCCAGTACCTCCAGGTGAAGATTCTAAAGATGTAGCCGCCCCA- CACAGACAGCCACTCACCTCTTCAGAACGAATTGACAAACAAATTCGGTACATCCTCGA- CGGCATCTCAGCCCTGAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAACATGTGTGAAAGCAGCAAA- GAGGCACTGGCAGAAAACAACCTGAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGATGCTT- CCAATCTGGATTCAATGAGGAGACTTGCCTGGTAAAAATCATCACTGGTCTTTTGGAGTTT- GAGGTATACCTAGAGTACCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCTG- TGCAGATGAGTACAAAAGTCCTGATCCAGTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAATCTAGAT- GCAATAACCACCCCTGACCCAACCACAAATGCCAGCCTGCTGACGAAGCTGCAGGCACAGA- ACCAGTGGCTGCAGGACATGACAACTCATCTCATTCTGCGCAGCTTTAAGGAGTTCCTGCA- GTCCAGCCTGAGGGCTCTTCGGCAAATGTAATAACTCGAGGATCCAATTAT La construcción producida mediante el ligamiento con el plásmido Npr0-pETlla se denomina NP6-pET. La secuencia de la proteína de fusión Npro-hIL6 (347 aminoácidos, de los cuales 162 aminoácidos son para la porción Npro, y 185 aminoácidos son para la porción hIL6) , codificada sobre NP6-pET, se ilustra más adelante, imprimiéndose la secuencia de hIL6 en negrillas .

MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRK- GDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDG- KLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCAPVPPGEDSKDVAAPHR- QPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEAIAENN NLPKMAEKDGCFQS- GFNEETC VKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKV IQFLQKKAKN- DAITTPDPTTNASLLTK QAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRAI-RQM La proteína de fusión tiene un Mr de 39,303.76 d en el estado reducido, y después de una disociación posible de la porción Npro (reducida) tendría un Mr de 18,338.34 d, y la por- ción hIL6 (reducida) tendría 20,983.63 d. Npro tiene seis cisteínas, y hIL6 tiene cuatro. Es posible que estas cisteínas estén en su mayor parte en una forma reducida en el citoplasma bacteriano. Durante el subsecuente procesamiento, presumiblemente hay una formación cuando menos parcial de puentes de di- sulfuro. Se debe esperar que la metionina N-terminal en la proteína de fusión (o en la porción Npro) se disocie en su mayor parte mediante la metionina-aminopeptidasa (MAP) intrínseca al huésped, que reduciera el Mr por aproximadamente 131 d en cada caso hasta 39,172.76 d (proteína de fusión), y 18,207.13- d (Npro) . La cepa huésped de Escherichia coli para expresar la proteína de fusión Npro-hIL6 es Escherichia coli BL21 (DE3) (ver el Ejemplo 1) . La cepa de expresión BL21 (DE3) [MP6-pET] se produce mediante la transformación del plásmido de expresión MP6-pET descrito anteriormente, en BL21(DE3), como se describe en el Ejemplo 1. La cepa BL21 (DE3) [MP6-pET] se subcultiva a partir de una sola colonia sobre una placa de ágar, que luego se utiliza para inocular un precultivo en caldo Luria + 100 miligramos/litro de ampicilina (200 mililitros en 1 matraz de pantalla de 1 litro) . El precultivo se agita a 250 rpm y a 30°C durante 14 horas, y alcanza una OD6oo de aproximadamente 1.0 durante esto. Luego se utilizan porciones de 10 mililitros del precultivo pa-ra inocular los cultivos principales (330 mililitros de Caldo Luria en cada matraz de pantalla de 1 litro) (3 por ciento de inoculo) . Los cultivos principales se ejecutan a 30°C (250 rpm) hasta que la OD600 se haya incrementado hasta 0.8, y luego se induce la producción de la proteína de fusión con IPTG 0.5 ó 1.0 mM (concentración final). Los cultivos se cultivan adicio- •=. ,- g- nalmente a 30°C y a 250 rpm durante 3 horas, alcanzando la ODeoo de aproximadamente 1.0 a 2.0. Los cultivos se transfieren a frascos centrífugos estériles de 500 mililitros, y se centrifugan a 10,000 g durante 30 minutos. El sobrenadante de la centrifugación se desecha completamente, y los granulos se congelan a -80°C hasta que se procesan adicionalmente. La aparición de nuevas bandas de proteína en el lisado completo se puede detectar fácilmente mediante teñido con Coomassie después del SDS-PAGE. Aparecen bandas con masas moleculares aparentes de aproximadamente 19 kd, 21 kd, y 40 kd en el lisado de BL21 (DE3) [MP6-pET] . Los análisis de esta expresión utilizando anticuerpos específicos anti-hIL6 confirman esencialmente el resultado obtenido después del teñido con Coo-massie. Para optimizar la disociación de Npro-hIL6, se realizan inducciones a diferentes temperaturas y concentraciones de IPTG, y nuevamente se analizan tanto en el gel teñido como mediante mancha Western. Se observa una disociación casi comple-ta de Npro-IL6 a una temperatura del cultivo de 22 °C. Este experimento muestra que las proteínas heterólogas también se pueden fusionar con el término C de Npro en un sistema de expresión bacteriano, y tiene lugar una disociación muy eficiente. Un cambio en el aminoácido N-terminal de la si-guíente proteína (alanina en lugar de serina) no tiene efectos ^^m adversos tampoco. Este sistema, de acuerdo con lo anterior, es adecuado de acuerdo con la invención para producir proteínas recombinantes con un término N homogéneo auténtico, especialmente en un sistema de expresión heterólogo, tal como un siste- ma de expresión bacteriano, sin pasos de procesamiento adicionales .

EJEMPLO 3 : Expresión y disociación in vitro de una proteina de fusión compuesta de Npro e interferón humano a2B(IFNa2B) para producir la INFa2B madura homogénea La manera de clonar IFNa2B para producir el vector NPI-pET corresponde a la manera descrita para hIL6 en el Ejemplo 2. El gen estructural se amplifica mediante reacción en cadena de la polimerasa de alta precisión (por ejemplo, el sis-tema Pwo de Roche Biochemicals, el procedimiento mencionado por el fabricante) la plantilla utilizada es un clon de IFNa2B-ADNc que se puede producir a partir de leucocitos humanos mediante métodos convencionales conocidos por la persona experta. Una posibilidad alternativa también es realizar una síntesis com-pleta del gen. La secuencia del gen estructural se puede obtener en una forma electrónica mediante la base de datos Genbank bajo el número de acceso V00548. Se emplean los siguientes oligonucleótidos para la amplificación. Oligonucleótido 1 ("N-terminal") : 5'- ATAATTACTA GTTGTTGTGA TCTGCCTCAA ACCCACAGCC -3' Iftáj ^^^J^ijgjájgg^^^^^^^^^^ Oligonucleótido 2 ("C-terminal") : 5'- ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTATTCCTTA CTTCTTAAAC TTTCTTGCAA G - 3' La secuencia del fragmento de la reacción en cadena de la polimerasa (533 pares de bases) con el gen estructural para IFNa2B, se ilustra enseguida. Los sitios de disociación de restricción están subrayados, el primer codón de IFNa2B (Cys) y el codón de paro está impresos en negrillas.

ATAATTACTAGTTGTTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGA-TGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGAC-TTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCC-TCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTT-GGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGA-AGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATT-CTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCC-CTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTT-GCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATAATAACTCGAGGATCCAATTAT La construcción producida mediante el ligamiento con el plásmido Npro-pETlla se denomina NPI-pET. La secuencia de la proteína de fusión Npro-IFNa2B (327 aminoácidos, de los cuales 162 son de Npro, y 165 son de IFNa2B) codificada sobre NPI-pET, se ilustra enseguida, imprimiéndose ÍAAm. ,í ,i,x la secuencia de IFNa2B en negrillas (ilustrado en la dirección desde el término N hasta el término C) : MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKG-DCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGS- DGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCCDLPQTHSLGSRRTL-MLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSAAWDE-TLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCA-WEWRAEIMRSFSLSTNLQESLRS E La proteína de fusión tiene un Mr de 37,591.44 d en el estado reducido, y después de una disociación posible, la porción Npro (reducida) tendría un Mr de 18,338.34 d, y la porción IFNa2B (reducida) tendría 19,271.09 d. Npro tiene seis cisteínas, y IFNa2B tiene cuatro. Es posible que estas cisteínas estén en su mayor parte en una forma reducida en el citoplasma bacteriano. Durante el subsecuente procesamiento, presumiblemente hay una formación cuando menos parcial de puentes de disulfuro. se debe esperar que la metionina N-terminal en la proteína de- fusión (o en la porción Npro) se disocie en su mayor parte mediante la metionina-aminopeptidasa (MAP) intrínseca al huésped, que reduciría el Mr por aproximadamente 131 d en cada caso/ hasta 37,460.23 d (proteína de fusión), y 18,207.13 d (Npro) .

La cepa huésped de Escherichia coli para expresar la proteína de fusión Npro-IFNa2B es Escherichia coli BL21(DE3) (ver el Ejemplo 1) . La cepa de expresión BL21 (DE3) [NPI-pET] se produce mediante la transformación del plásmido de expresión NPI-pET descrito anteriormente, en BL21(DE3), como se describe en el Ejemplo 1. La cepa BL21(DE3) [NPI-pET] se subcultiva a partir de una sola colonia sobre una placa de ágar, y esto se utiliza para inocular un precultivo en caldo Luria + 100 miligramos/litro de ampicilina (200 mililitros en un matraz de pantalla de 1 litro) . El precultivo se agita a 250 rpm y a 30°C durante 14 horas, y alcanza una OD60o de aproximadamente 1.0 durante esto. Luego se utilizan porciones de 10 mililitros de precultivo para inocular los cultivos principales (330 mililitros de caldo Luria en cada matraz de pantalla de 1 litro) (3 por ciento de inoculo) . Los cultivos principales se ejecutan a 30°C (250 rpm) , hasta que la OD6oo se haya incrementado hasta 0.8, y luego se induce la producción de la proteína de fusión con IPTG 0.5 ó 1.0 mM (concentración final). Los cultivos se cultivan adicionalmente a 30°C y a 250 rpm durante 3 horas, durante lo cual, se alcanza una OD60o de aproximadamente 1.0 a 2.0. Los cultivos se transfieren a frascos centrífugos estériles de 500 mililitros, y se centrifugan a 10,000 g durante 30 minutos. El sobrenadante de la centrifugación se desecha completamente, y los granulos se congelan a -80°C hasta que se procesan adicionalmente. La aparición de nuevas bandas de proteína en el lisado completo se pueden detectar fácilmente mediante teñido con Coomassie después del SDS-PAGE. Aparecen masas moleculares de aproximadamente 38 kd y de aproximadamente 19 kd en el lisado de BL21 (DE3) [MP6-pET] . La banda de IFNa2B no se puede separar de la banda de Npro mediante SDS-PAGE. Los análisis de estas muestras utilizando anticuerpos específicos anti- y IFNa2B, confirman la presencia de una banda de IFNa2B disociada. Para optimizar la disociación de Npro-IFNa2B, se realizan inducciones a diferentes temperaturas y concentraciones de IPTG en esta caso también, y nuevamente se analizan tanto en el gel teñido como mediante una mancha Western. En este caso, también se encuentra que tiene lugar una disociación óptima a temperaturas reducidas (de 22°C a 30°C) . íxi-itA x ¡ : íz - . » a. . i .

LISTADO DE SECUENCIA <110> Biochemie Gesellschaft m.b.H. <120> Producción de Proteínas <130> G-31110/A/BCK <140> PCT/EPOO/07643 <141> 2000-08-07 <160> 13 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 168 <212> PRT <213> Pestivirus sp. <400> 1 Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30 Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45 His Asp Arg Gly Arg Gly Asp lie Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60 Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80 lie Tyr lie Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95 Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gln Phe Cys 100 105 110 Glu Val Thr Lys Arg lie Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125 tyr His lie Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys lie Leu Leu Lys Leu Ala 130 13-5 140 Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp lie Arg Asn Phe Thr Asn 145 150 155 160 Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys 165 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Pestivirus sp. <400> 2 Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gln Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: aguda para purificación de oligo- histidina <400> 3 Met Ala Ser His His His His His His His 1 5 10 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido <400> 4 ataattacta gttgtttccc aaccattccc ttatccaggc c 41 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido <400> 5 ataattggat cctcgagtta ttagaagcca cagctgccct ccac 44 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <400> 6 agggtatcta gaattctatg ccagtgggag tggaggaacc g 41 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Oligonucleótido <400> 7 agaattaagc ttctagatta ttagaagcca cagctgccct ccac 44 <210> 8 <211> 1072 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de pestivirus combinada con secuencia de Homo sapiens <400> 8 agggtatcta gaattctatg ccagtgggag tggaggaacc ggtgtatgac accgcgggga 60 gaccactatt tgggaaccca agtgaggtac acccacaatc aacgctgaag ctgccacacg 120 acagggggag aggagatatc agaacaacac tgagggacct acccaggaaa ggtgactgta 180 ggagtggcaa ccatctaggc ccggttagtg ggatatacat aaagcccggc cctgtctact 240 atcaggacta cacgggccca gtctatcaca gagctccttt agagttcttt gatgaggccc 300 agttctgcga ggtgactaag agaataggca gggtcacggg tagtgatggt aagctttacc 360 acatatatgt gtgcgtcgat ggttgcatac tgctgaaatt agccaaaagg ggcacaccca 420 gaaccctaaa gtggattagg aacttcacca actgtccatt atgggtaact agttgtttcc 480 caaccattcc cttatccagg ccttttgaca acgctatgct ccgcgcccat cgtctgcacc 540 agctggcctt tgacacctac caggagtttg aagaagccta tatcccaaag gaacagaagt 600 attcattcct gcagaacccc cagacctccc tctgtttctc agagtctatt ccgacaccct 660 ccaacaggga ggaaacacaa cagaaatcca acctagagct gctccgcatc tccctgctgc 720 tcatccagtc gtggctggag cccgtgcagt tcctcaggag tgtcttcgcc aacagcctgg 780 tgtacggcgc ctctgacagc aacgtctatg acctcctaaa ggacctagag gaaggcatcc 840 aaacgctgat ggggaggctg gaagatggca gcccccggac tgggcagatc ttcaagcaga 900 cctacagcaa gttcgacaca aactcacaca acgatgacgc actactcaag aactacgggc 960 tgctctactg cttcaggaag gacatggaca aggtcgagac attcctgcgc atcgtgcagt 1020 gccgctctgt ggagggcagc tgtggcttct aataatctag aagcttaatt ct 1072 <210> 9 <211> 344 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de Pestivirus combinada con secuencia de Homo sapiens <400> 9 Met Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro 1 5 10 15 Leu Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu 20 25 30 i Pro His Asp Arg Gly Arg Gly Asp lie Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu 35 40 45 Pro Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser 50 55 60 % Gly lie Tyr lie Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly 65 70 75 80 Pro Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gln Phe Cys Glu Val Thr Lys Arg lie Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys 100 105 110 Leu Tyr His lie Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys lie Leu Leu Lys Leu 115 120 125 Ala Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp lie Arg Asn Phe Thr 130 135 140 Asn Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys Phe Pro Thr lie Pro Leu Ser 145 150 155 160 Arg Pro Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu 165 170 175 Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr lie Pro Lys Glu 180 185 190 Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser 195 200 205 Glu Ser lie Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser 210 215 220 Asn Leu Glu Leu Leu Arg lie Ser Leu Leu Leu lie Gln Ser Trp Leu 225 230 235 240 Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr 245 250 255 Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu 260 265 270 Gly lie Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr 275 280 285 Gly Gln lie Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His 290 295 300 Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg 305 310 315 320 Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg lie Val Gln Cys Arg 325 330 335 Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 340 ____ i_____j £ .--£ .3 -fcB-J-.-s.8l ¡¡.¿ $¿ &?*. i ¿ _t_ __ -. i _ fi -]A?ia?l-_._¿-. a.---j_- _ i te *J. - . fe fe»ft ;>.fc JL <210> 10 <211> 4840 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Secuencia de .plásmido, de expresión que comprende secuencia de Pestivirus y secuencia de Homo sapiens <400> 10 gaattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt tatcacagtt 60 aaattgctaa cgcagtcagg caccgtgtat gaaatctaac aatgcgctca tcgtcatcct 120 cggcaccgtc accctggatg ctgtaggcat aggcttggtt atgccggtac tgccgggcct 180 cttgcgggat atcgtccatt ccgacagcat cgccagtcac tatggcgtgc tgctagcgct 240 atatgcgttg atgcaatttc tatgcgcacc cgttctcgga gcactgtccg accgctttgg 300 ccgccgccca gtcctgctcg cttcgctact tggagccact atcgactacg cgatcatggc 360 gaccacaccc gtcctgtgga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc 420 cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg 480 ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg 540 gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg 600 cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag agcgtcgacc 660 gatgcccttg ágagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat 720 cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc 780 gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc 840 gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac 900 caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccgacg cgctgggcta 96Q cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc cccattatga ttcttctcgc 1020 ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg tccaggcagg tagatgacga 1080 ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc agcctaactt cgatcactgg 1140 accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc acatggaacg ggttggcatg 1200 gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg ttgcgtcgcg gtgcatggag 1260 ccgggccacc ?cgacctgaa tggaagccgg cggcacctcg ctaacggatt caccactcca 1320 agaattggag ccaatcaatt cttgcggaga actgtgaatg cgcaaaccaa cccttggcag 1380 aacatatcca tcgcgtccgc catctccagc agccgcacgc ggcgcatctc gggcagcgtt 1440 gggtcctggc cacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg 1500 cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac 1560 tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt 1620 tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc 1680 gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat 1740 tgaccctgag tgatttttct ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg tttaccctca 1800 caacgttcca gtaaccgggc atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag catcctctct 1860 cgtttcatcg gtatcattac ccccatgaac agaaattccc ccttacacgg aggcatcaag 1920 tgaccaaaca ggaaaaaacc gcccttaaca tggcccgctt tatcagaagc cagacattaa 1980 cgcttctgga gaaactcaac gagctggacg cggatgaaca ggcagacatc tgtgaatcgc 2040 ttcacgacca cgctgatgag ctttaccgca gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg 2100 ttcacgacca cgctgatgag ctttaccgca gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg 2100 aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg 2160 ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca 2220 tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca 2280 gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 2340 ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 2400 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 2460 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 2520 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 2580 acgctca'agt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 2640 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 2700 ? 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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido que tiene la función autoproteolítica de una autoproteasa Npro de un pestivirus, y un segundo polipéptido que está conectado con el primer polipéptido en el término C del primer polipéptido de una manera tal que el segundo polipéptido es capaz de disociarse de la proteína de fusión mediante la actividad autoproteolí-tica del primer polipéptido, y en donde el segundo polipéptido es un polipéptido heterólogo.

2. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el pestivirus se selecciona a partir del grupo de CSFV, BDV y BVDV.

3. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el pestivirus es CSFV.

4. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el primer polipéptido comprende la siguiente secuencia de aminoácidos : (1) -MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTT LRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGR-VTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC- (168) , o la secuencia de aminoácidos de un derivado de la misma con actividad autoproteolítica.

5. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos Glu22 a Cysl68 de la autoproteasa Npro de CSFV, o un derivado de la misma con actividad autoproteolí-tica en donde el primer polipéptido tiene adicionalmente un Met como el término N, y en donde el polipéptido heterólogo se conecta directamente con el aminoácido Cysl68 de la autoproteasa Npro de CSFV.

6. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el primer polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos Pro 17 a Cys 168 de la autoproteasa Npro de CSFV, o un derivado de la misma con actividad autoproteolítica, en donde el primer polipéptido tiene adicionalmente un Met como el término N, y en donde el polipéptido heterólogo se conecta directamente con el aminoácido Cysl68 de la autoproteasa Npro de CSFV.

7. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN.

8. Un vector de expresión que es compatible con una célula bacteriana huésped previamente definida, que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y cuando menos una secuencia de control de expresión.

9. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la célula bacteriana huésped es una célula de E. coli .

10. Un vector de expresión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, en donde el vector de expresión es un plásmido.

11. Una célula bacteriana huésped que comprende un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

12. Una célula bacteriana huésped de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la célula huésped es una célula de E. coli.

13. Un proceso para la producción de un polipéptido heterólogo deseado, el cual comprende: (i) el cultivo de una célula bacteriana huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, en donde el cultivo ocurre bajo condiciones que ocasionan la expresión de la proteína de fusión y la disociación autoproteolítica del polipéptido heterólogo a partir de la proteína de fusión en la célula huésped, mediante la actividad autoproteolítica del primer polipéptido, y (ii) el aislamiento del polipéptido heterólogo disociado. -,:----.,. y?j -y J?.? - 1