PL203708B1 - Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko fuzyjne, wektor ekspresyjny zawierający tę cząsteczkę oraz komórka gospodarza bakteryjnego zawierająca ten wektor - Google Patents

Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko fuzyjne, wektor ekspresyjny zawierający tę cząsteczkę oraz komórka gospodarza bakteryjnego zawierająca ten wektor

Info

Publication number
PL203708B1
PL203708B1 PL353090A PL35309000A PL203708B1 PL 203708 B1 PL203708 B1 PL 203708B1 PL 353090 A PL353090 A PL 353090A PL 35309000 A PL35309000 A PL 35309000A PL 203708 B1 PL203708 B1 PL 203708B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
pro
polypeptide
leu
gly
arg
Prior art date
Application number
PL353090A
Other languages
English (en)
Other versions
PL353090A1 (pl
Inventor
Tillmann Rümenapf
Heinz-Jürgen Thiel
Jörg Windisch
Franz Knauseder
Original Assignee
Sandoz Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sandoz Ag filed Critical Sandoz Ag
Publication of PL353090A1 publication Critical patent/PL353090A1/pl
Publication of PL203708B1 publication Critical patent/PL203708B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • C12N9/506—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses derived from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej białko fuzyjne zawierające pierwszy polipeptyd o autoproteolitycznej funkcji autoproteazy Npro pestiwirusa, oraz drugi polipeptyd przyłączony do C-końca pierwszego polipeptydu, odcinany z białka fuzyjnego w komórce bakteryjnej w wyniku autoproteolitycznego dział ania pierwszego polipeptydu, przy czym drugi polipeptyd jest polipeptydem heterologicznym, zaś pierwszy polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów określoną w opisie. Ponadto, wynalazek dotyczy wektora ekspresyjnego zgodnego z określoną komórką bakteryjną i zawierającego cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, oraz komórki gospodarza bakteryjnego zawierającej ten wektor.
Wynalazek znajduje zastosowanie w sposobie wytwarzania pożądanego heterologicznego polipeptydu z jednoznacznie określonym homogennym N-końcem w komórce gospodarza bakteryjnego, w którym to sposobie pożądany polipeptyd heterologiczny jest autoproteolitycznie odcinany od bia ł ka fuzyjnego po wstępnej ekspresji.
Podczas otrzymywania zrekombinowanych białek w heterologicznych organizmach, takich, jak ekspresja białek ludzkich lub innych eukariontów w komórkach bakterii, często trudne jest uzyskać jednoznacznie określony N-końca o prawie 100% homogeniczności. Dotyczy to w szczególności wykorzystywanych w farmacji rekombinowanych białek, których sekwencja aminokwasów powinna w wielu przypadkach być identyczna z sekwencją aminokwasów naturalnie wystę pują cej u ludzi/zwierząt.
Przy naturalnej ekspresji na przykład u człowieka, wiele stosowanych w farmacji białek jest transportowanych do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, a odcięcie sekwencji sygnałowej, obecnej w tym celu w prekursorze białka, daje w efekcie jednoznacznie okreś lony N-koniec. Taki homogenny N-koniec nie zawsze jest łatwy do uzyskania, na przykład w komórkach bakterii, z kilku powodów.
Jedynie w rzadkich przypadkach możliwy jest eksport do peryplazmy bakteryjnej za pomocą prokariotycznej lub eukariotycznej sekwencji sygnałowej, ponieważ zwykle możliwa jest akumulacja w tym miejscu jedynie bardzo małych ilości produktu ze względu na małą pojemność transportową bakteryjnego układu eksportującego.
Jednak cytoplazma bakteryjna znacznie różni się od zewnątrzkomórkowej przestrzeni eukariontów. Z jednej strony są w niej obecne warunki redukujące, a z drugiej strony nie posiada ona mechanizmu umożliwiającego odcinanie N-końcowych sekwencji liderowych w celu uzyskania dojrzałych białek. Synteza wszystkich białek cytoplazmatycznych rozpoczyna się od metioniny, która jest określona przez odpowiedni kodon startowy (ATG = inicjacja translacji). Ta N-końcowa metionina jest zachowywana w wielu białkach, podczas gdy w innych jest odcinana przez aminopeptydazę metionionową (MAP) obecną w cytoplazmie i właściwą dla gospodarza. Wydajność odcinania zależy od dwóch parametrów: (1) natury następnego aminokwasu i (2) położenia N-końca w trójwymiarowej strukturze białka. N-końcowa metionina jest usuwana szczególnie łatwo, gdy następnym aminokwasem jest seryna, alanina, glicyna, metionina lub walina oraz gdy N-koniec jest eksponowany tzn. nie jest „ukryty wewnątrz struktury białkowej. Z drugiej strony, gdy kolejny aminokwas jest odmienny, a w szczególności gdy jest to aminokwas zawierający dodatkową grupę karboksylową lub aminową (przykładowo: kwas glutaminowy, kwas asparaginowy, lizyna, arginina) lub jeśli N-koniec znajduje się wewnątrz struktury białkowej, w większości przypadków nie zachodzi odcięcie N-końcowej metioniny (Knippers, Rolf (1995) Molekulare Genetik, wydanie 6, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nowy Jork, ISBN 3-13-103916-7).
Nawet jeśli aminokwas sprzyjający odcięciu jest obecny w pozycji 2, odcięcie rzadko jest kompletne. Zazwyczaj spora część (1-50%) pozostaje nienaruszona przez MAP.
Na początku wytwarzania zrekombinowanych farmaceutycznych białek w komórkach bakterii, procedura polegała po prostu na umieszczenie kodonu start ATG kodującego metioninę na początku otwartej ramki odczytu (ORF) dla dojrzałego białka (tzn. bez sekwencji sygnałowej lub innego przedłużenia N-końcowego). Wyrażane białko wówczas miało sekwencję H2N-Met-białko docelowe. Tylko w kilku przypadkach było możliwe uzyskanie całkowitego cięcia N-końcowej metioniny przez MAP właściwy dla gospodarza. Większość białek otrzymywanych w ten sposób to białka niehomogenne względem ich N-końca (mieszanina formy Met i formy bez Met) albo wszystkie białka mają dodatkowy obcy aminokwas (Met) na N-końcu (tylko forma Met).
Ta niehomogenność lub odchylenie od naturalnej sekwencji jest jednak w wielu przypadkach nie do przyjęcia, ponieważ te produkty często wykazują odmienne właściwości immunologiczne (na
PL 203 708 B1 przykład indukcja tworzenia przeciwciał) i farmakologiczne (okres półtrwania, farmakokinetyka). Z tych powodów obecnie w większości przypadków konieczne jest wytwarzanie produktu identycznego z naturalnym (homogennego i bez obcych aminokwasów na N-koń cu). W przypadku ekspresji cytoplazmatycznej, w większości przypadków odpowiednie jest przeprowadzenie fuzji sekwencji cięcia (lidera) dla specyficznej endopeptydazy (na przykład czynnika Xa, enterokinazy, endopeptydaz KEX, proteazy IgA) lub aminopeptydazy (na przykład aminopeptydazy dipeptydylowej) do N-końca docelowego białka. Stanowi to jednak dodatkowy etap obarczony znacznym nakładem kosztów i materiałów potrzebnych w dalszej obróbce, tak zwanej posyntetycznej obróbce produktu.
Istnieje więc zapotrzebowanie na sposób wytwarzania docelowego białka w komórkach bakterii, tak, aby docelowe białko mogło być przygotowane z jednorodnym, pożądanym N-końcem bez dodatkowych złożonych etapów in vitro (zwijanie, oczyszczanie, cięcie za pomocą proteazy, ponowne oczyszczanie, itd). Taki proces z wykorzystaniem wirusowej autoproteazy Npro z pestiwirusów opracowano w ramach niniejszego wynalazku.
Pestiwirusy tworzą grupę patogenów, które powodują poważne straty ekonomiczne u świń i gryzoni na cał ym ś wiecie. Jako patogen poważ nej choroby zakaź nej szczególnie istotny jest klasyczny wirus gorączki świń (CSFV). Znaczne są także straty powodowane przez wirusa biegunki bydlęcej (BVDV), szczególnie ze względu na regularne występowanie wewnątrzmacicznego zakażenia płodów.
Pestiwirusy są małymi wirusami w otoczkach z genomem, który działa bezpośrednio jako mRNA i ma dł ugość 12,3 kb i którego produkty podlegają trabskrypcji w cytoplazmie. Produktem transkrypcji jest pojedyncza poliproteina, która zawiera około 4000 aminokwasów i która jest rozkładana przez zarówno wirusowe i komórkowe proteazy na około 12 dojrzałych białek.
Dotychczas u pestiwirusów zidentyfikowano dwie kodowane przez wirusa proteazy, autoproteazę Npro i proteazę serynową NS3. N-końcowa proteaza Npro jest umieszczona na N-końcu poliproteiny i ma pozorną masę cząsteczkową 23 kDa. Katalizuje cięcie, które odbywa się między jego własnym C-końcem (Cys168) i N-końcem (Ser169) białka C nukleokapsydu (R. Stark i wsp. J. Yirol. 67 (1993), 7088-7095). W dodatku opisano duplikacje genu Npro w cytopatogennych wirusach BVDV. Występuje w nich druga kopia Npro na N-końcu podobnie zduplikowanej proteazy NS3. Autoproteolityczne cięcie białka Npro-NS3 obserwowano także w tym przypadku (R. Stark i wsp., patrz powyżej).
Npro jest autoproteazą o długości 168 aa i pozornej Mr około 20000 Da (in vivo). Jest pierwszym białkiem w poliproteinie pestiwirusów (takich jak CSFV, BDV (wirus choroby granicznej) lub BVDV) i podlega autoproteolitycznemu odcięciu od kolejnego biał ka C nukleokapsydu (M. Wiskerchen i wsp., J. Virol. 65 (1991), 4508-4514; Stark i wsp., J. Virol. 67 (1993), 7088-7095). To odcięcie zachodzi po ostatnim aminokwasie w sekwencji Npro, Cys168.
Nieoczekiwanie stwierdzono, że autoproteolityczna funkcja autoproteazy Npro pestiwirusa jest utrzymywana w bakteryjnych układach ekspresyjnych, w szczególności przy ekspresji białka heterologicznego.
Przedmiotem wynalazku jest zatem cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko fuzyjne zawierające pierwszy polipeptyd o autoproteolitycznej funkcji autoproteazy Npro pestiwirusa, oraz drugi polipeptyd przyłączony do C-końca pierwszego polipeptydu, odcinany z białka fuzyjnego w komórce bakteryjnej w wyniku autoproteolitycznego działania pierwszego polipeptydu, przy czym drugi polipeptyd jest polipeptydem heterologicznym, zaś pierwszy polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej :
(a) sekwencję aminokwasów
1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRT
TLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRI
GRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168);
(b) sekwencję aminokwasów Glu22 - Cys168 autoproteazy Npro CSFV, przy czym pierwszy polipeptyd zawiera dodatkowo Met jako N-koniec, zaś polipeptyd heterologiczny jest bezpośrednio połączony z aminokwasem Cys168 autoproteazy Npro CSFV;
(c) sekwencję aminokwasów Pro17 - Cys168 autoproteazy Npro CSFV, przy czym pierwszy polipeptyd zawiera dodatkowo Met jako N-koniec, zaś polipeptyd heterologiczny jest bezpośrednio połączony z aminokwasem Cys168 autoproteazy Npro CSFV.
W jednym z korzystnych wariantów czą steczki kwasu nukleinowego według wynalazku pestiwirus jest wybrany z grupy CSFV, BDV i BVDV, a w szczególnie korzystnym przypadku pestiwirusem jest CSFV.
PL 203 708 B1
W kolejnym korzystnym wariancie cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest cząsteczka DNA.
Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny, który jest zgodny z określoną komórką gospodarza bakteryjnego, zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku oraz co najmniej jedną sekwencję kontrolującą ekspresję. W jednym z korzystnych wariantów wektora według wynalazku komórką gospodarza bakteryjnego jest komórka E. coli. W innym korzystnym wariancie wektorem ekspresyjnym jest plazmid.
Ponadto, przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza bakteryjnego zawierająca wektor według wynalazku, przy czym w korzystnym przypadku komórką gospodarza jest komórka E. coli.
Polipeptyd o autoproteolitycznej funkcji autoproteazy Npro pestiwirusa to w szczególności autoproteaza Npro pestiwirusa.
W zakresie tego wynalazku okreś lenie „polipeptyd heterologiczny oznacza polipeptyd, który nie jest naturalnie odcinany przez autoproteazę Npro pestiwirusa z naturalnie występującego białka fuzyjnego lub poliproteiny. Przykładem polipeptydów heterologicznych są enzymy przemysłowe (enzymy procesowe) lub polipeptydy o działaniu farmaceutycznym, a w szczególności wykazujące działanie farmaceutyczne w stosunku do ludzi.
Przykładami korzystnych polipeptydów z aktywnością farmaceutyków dla ludzi są cytokiny, takie, jak interleukiny, na przykład IL-6, interferony takie, jak interferony leukocytów, na przykład interferon α2Β, czynniki wzrostu, w szczególności hematopoetyczne czynniki wzrostu lub czynniki wzrostu gojące rany, takie, jak G-CSF, erytropoetyna, lub IGF, hormony takie, jak ludzki hormon wzrostu (hGH), przeciwciała lub szczepionki.
Pochodne z autoproteolityczną aktywnością autoproteazy Npro pestiwirusa to autoproteazy Npro wytworzone za pomocą mutagenezy, w szczególności podstawienie, delecję, addycję i/lub wstawienie aminokwasu o ile utrzymana jest wymagana autoproteolityczna aktywność, w szczególności dla generacji pożądanego białka z homogennym N-końcem. Sposoby otrzymywania takich pochodnych za pomocą mutagenezy są znane specjalistom. Za pomocą takich mutacji możliwa jest optymalizacja aktywności autoproteazy Npro, na przykład, w stosunku do różnych białek heterologicznych, które mają być cięte. Po uzyskaniu kwasu nukleinowego, który koduje białko fuzyjne, które oprócz pożądanego białka heterologicznego zawiera pochodną autoproteazy Npro wykazującą jedną lub większą liczbę mutacji w porównaniu z naturalnie występującą autoproteazą Npro, ustala się czy wymagana funkcja jest obecna przez określenie aktywności autoproteolitycznej w układzie ekspresyjnym.
Aktywność autoproteolityczna można być na przykład początkowo wykryta w układzie in vitro. W tym celu konstrukt DNA jest poddawany transkrypcji na RNA i ulega translacji do białka za pomocą zestawu do translacji in vitro. Aby zwiększyć czułość powstałe białko w niektórych przypadkach jest znakowane przez włączenie aminokwasu radioaktywnego. Powstałe białko fuzyjne docelowe białko-Npro przechodzi ko- i/lub posttranslacyjne cięcie autokatalityczne; na skutek aktywności autoproteolitycznej zachodzi dokładne odcięcie N-końcowej części Npro od następującego białka docelowego. Powstałe produkty odcięcia mogą być łatwo wykryte i mieszanina może być poddawana obróbce zaraz po zakończeniu reakcji translacji in vitro. Mieszaninę następnie nakłada się na żel białkowy (na przykład Lammli SDS-PAGE) i poddaje elektroforezie. Żel następnie barwi się odpowiednimi barwnikami lub poddaje autoradiografii. Możliwa jest też analiza techniką Western blot z następnym immunobarwieniem. Wydajność cięcia białka fuzyjnego może być oceniona na podstawie intensywności uzyskanych prążków dla białka.
W dalszym etapie fragment kwasu nukleinowego dla białka fuzyjnego może być sklonowany do bakteryjnego wektora ekspresyjnego (jeśli to już nie zaszło przy translacji in vitro), który może być użyty do transformacji odpowiedniego gospodarza (np. E. coli). Powstały szczep ekspresyjny wyraża białko fuzyjne konstytutywnie lub po dodaniu induktora. W tym drugim przypadku konieczna jest dalsza hodowla przez jedną lub większą liczbę godzin po dodaniu induktora, aby uzyskać dostateczne miano produktu. Npro autoproteaza wówczas odcina się ko- lub posttranslacyjnie z wyrażanej fuzji białkowej tak, że powstałe fragmenty cięcia są samą Npro autoproteazą i docelowym białkiem z określonym N-końcem. Aby ocenić wydajność tej reakcji cięcia, pobiera się próbkę po końcu hodowli lub fazy indukcji i analizuje się za pomocą SDS-PAGE jak opisano powyżej.
Korzystna pochodna uzyskana za pomocą autoproteazy Npro opisanego białka fuzyjnego ma, na przykład, N-końcowy region w którym jeden lub większą liczbę aminokwasów poddano delecji lub podstawiono w regionie aminokwasów o długości 2 do 21, o ile powstała pochodna nadal wykazuje autoproteolityczną funkcję autoproteazy Npro w pożądanym stopniu. W kontekście tego wynalazku,
PL 203 708 B1 korzystne pochodne autoproteazy Npro w białku fuzyjnym zawierają na przykład sekwencję aminokwasów autoproteazy Npro CSFV z delecją aminokwasów od 2 do 16 lub od 2 do 21. Jest też możliwe przez podstawienie lub dodanie aminokwasów zamienienie lub wprowadzenie sekwencji aminokwasów, na przykład aby wprowadzić sekwencję aminokwasów, która pomaga w oczyszczaniu (patrz przykłady).
Szczególnie korzystną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest ta, w której pierwszy polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów Glu22 do Cys168 autoproteazy Npro CSFV lub jej pochodną z aktywnością autoproteolityczną, przy czym pierwszy polipeptyd dalej posiada Met jako N-koniec i polipeptyd heterologiczny jest połączony bezpośrednio do aminokwasu Cys168 autoproteazy Npro CSFV.
Podobnie korzystną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku jest ta, w której pierwszy polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów Pro17 do Cys168 autoproteazy Npro CSFV lub jej pochodną z aktywnością autoproteolityczną, pierwszy polipeptyd dalej posiada Met jako N-koniec i polipeptyd heterologiczny jest połączony bezpośrednio do aminokwasu Cys168 autoproteazy Npro CSFV.
Cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku jest w szczególności w postaci cząsteczki DNA.
Jak wskazano powyżej, wektor ekspresyjny według wynalazku zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku i przynajmniej jedną sekwencję kontroli ekspresji. Sekwencje kontroli ekspresji są w szczególności promotorami (takie jak lac, tac, T3, T7, trp, gac, vhb, lambda pL lub phoA), miejscami wiązania rybosomu (na przykład naturalne miejsca wiązania rybosomu, które należą do powyżej wymienionych promotorów, cro lub syntetyczne miejsca wiązania rybosomów) lub terminatory transkrypcji (na przykład rrnB T1T2 lub bla). O ile korzystnie komórką gospodarza jest komórka bakterii z rodzaju Escherichia, w szczególności E. coli, to jednak jest też możliwe stosowanie innych komórek bakterii (patrz poniżej). W korzystnym wykonaniu wektor ekspresyjny według wynalazku jest plazmidem.
Jak wskazano powyżej wynalazek dotyczy również komórki gospodarza bakteryjnego, która zawiera wektor ekspresyjny według wynalazku. Taka komórka gospodarza bakteryjnego może być wybrana na przykład z grupy następujących mikroorganizmów: bakterie Gram-ujemne takie, jak Escherichia, na przykład E. coli, lub inne bakterie Gram-ujemne, na przykład Pseudomonas sp., takie jak Pseudomonas aeruginosa, lub Caulobacter sp., takie jak Caulobacter crescentus, lub bakterie Gram-dodatnie takie jak Bacillus sp., w szczególności Bacillus subtilis. E. coli jest szczególnie korzystna jako komórka gospodarza.
Sposób wytwarzania pożądanego heterologicznego polipeptydu obejmuje (i) hodowlę komórki gospodarza bakteryjnego według tego wynalazku, który zawiera wektor ekspresyjny według wynalazku, który z kolei zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, przy czym hodowla zachodzi w warunkach, które powodują ekspresję białka fuzyjnego i dalej autoproteolityczne odcięcie polipeptydu heterologicznego z białka fuzyjnego w komórce gospodarza w wyniku aktywnoś ci autoproteolitycznej pierwszego polipeptydu oraz (ii) izolację odciętego polipeptydu heterologicznego.
Sposób jest realizowany zasadniczo przez wstępne hodowanie komórki gospodarza bakteryjnego tzn. szczepu ekspresyjnego zgodnie z praktyką mikrobiologiczną znaną per se. Szczep na ogół jest hodowany przy wyjściu od pojedynczej kolonii na podłożu odżywczym, ale jest też możliwe stosowanie przechowywanych w stanie zamrożenia zawiesin komórek (banków komórek). Szczep na ogół jest hodowany w procesie wieloetapowym, aby uzyskać dostateczną biomasę do dalszego stosowania.
Na małą skalę może odbywać to się w kolbach poddawanych ciągłemu wstrząsaniu, możliwe w większości przypadków jest stosowanie poż ywki złoż onej (na przykład bulionu LB). Jednak jest też możliwe stosowanie zdefiniowanych podłoży (na przykład podłoże cytrynianowe). Dla celów hodowli, hoduje się prehodowlę małej objętości szczepu gospodarza (zaszczepionego pojedynczą kolonią lub zawiesiną komórek z zamrożonej hodowli), temperatura dla tej hodowli na ogół nie jest krytyczna dla późniejszego wyniku ekspresji tak, że jest możliwe rutynowo pracowanie w stosunkowo wysokich temperaturach (na przykład 30°C lub 37°C). Główną hodowlę zakłada się w większej objętości (na przykład 500 ml), gdzie jest w szczególności konieczne zapewnienie dobrego napowietrzania (kolba o dużej pojemności w porównaniu z zawartą objętością, rotacja z wysoką częstością). Ponieważ celem jest, aby ekspresja zachodziła w formie rozpuszczalnej, główna hodowla będzie także przeprowadzana w większości przypadków w nieco niższej temperaturze (na przykład 22 lub 28°C). Do wytwarzania rozpuszczalnego białka odpowiednie są zarówno układy indukowalne (na przykład z promotorem trp, lac, tac lub phoA) i konstytutywne. Po osiągnięciu późnej fazy logarytmicznej (zazwyczaj przy
PL 203 708 B1 gęstości optycznej 0,5 do 1,0 w kolbach poddawanych ciągłemu wstrząsaniu) w układach indukowalnych dodawana jest substancja indukująca (na przykład kwas indoloakrylowy, izopropylo-p-D-tiogalaktopiranozyd = IPTG) i kontynuuje się inkubację przez 1 do 5 godzin. Stężenie substancji indukującej będzie w tym przypadku na ogół wybierane przy dolnej granicy, aby umożliwić staranną ekspresję. W tym czasie otrzymywana jest większość białka fuzyjnego Npro-białko docelowe, i zachodzi ko- lub post-translacyjne odcięcie części Npro tak, że po zakończeniu hodowli dwie cięte części występują oddzielnie. Powstałe komórki mogą być zebrane i dalej poddawane obróbce.
Na większą skalę układ wieloetapowy składa się z szeregu bioreaktorów (fermentatorów), jest korzystne w tym przypadku stosowanie podłoży o określonym składzie, aby móc ulepszać kontrolę procesu. Dodatkowo jest możliwe duże zwiększenie tworzenia biomasy i produktu przez odmierzanie poszczególnych składników odżywczych (odmierzane partie). Poza tym proces podobny jest do procesu prowadzonego w kolbie poddawanej ciągłemu wstrząsaniu. Przykładowo, stosuje się fermentator wstępnego stadium i fermentator głównego stadium, a temperatura hodowli jest wybierana podobna jak w kolbie poddawanej ciągłemu wstrząsaniu. Fermentator wstępnego stadium zaszczepia się tak zwanym inokulum, które jest na ogół hodowane z pojedynczej hodowli lub zamrożonej kultury w kolbie poddawanej ciągłemu wstrząsaniu. Dobre napowietrzanie i wystarczające stężenie induktora musi być także zapewnione w fermentatorze, a w szczególności w stadium głównym. Faza indukcji musi jednak w niektórych przypadkach być wyraźnie dłuższa w porównaniu z procesem prowadzonym w kolbie poddawanej ciągłemu wstrząsaniu. Powstałe komórki są ponownie dostarczane do dalszego przetwarzania.
Heterologiczne białko docelowe, które było odcięte z białka fuzyjnego może być izolowane za pomocą znanych specjalistom metod oczyszczania białek (patrz na przykład M.P. Deutscher, w: Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification, Academic Press Inc., (1990), 309-392). Sekwencja oczyszczania na ogół obejmuje rozbicie komórek, etap klarowania (wirowanie lub mikrosączenie) i róż ne etapy chromatograficzne, są czenia i strącenia.
Następujące przykłady służą jako ilustracja wynalazku, nie ograniczając w jakikolwiek sposób jego zakresu.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1: Ekspresja i cięcie in vivo białka fuzyjnego Npro-C w gospodarzu bakteryjnym
Plazmid NPC-pET skonstruowano dla ekspresji białka fuzyjnego Npro-C w gospodarzu bakteryjnym. Zastosowany wektor ekspresyjny jest wektorem pET11a (F.W. Studier i wsp., Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-89). Naturalny gen struktury (z genomu CSFV RNA) dla białka fuzyjnego Npro-C wklonowano do tego wektora ekspresyjnego. Gen struktury dla tego białka fuzyjnego jest dostarczony za pomocą amplifikacji PCR z genomu wirusa, który był przepisany na cDNA (i sklonowany w wektorze). Co więcej, pierwsze 16 aminokwasów naturalnej sekwencji Npro (MELNHFELLYKTSKQK) zastąpiono 10 aminokwasową oligohistydynową sekwencją wspomagającą czyszczenie (MASHHHHHHH). Powstały konstrukt nazwano NPC-pET. Sekwencja części Npro i miejsce cięcia autoproteolitycznego białka fuzyjnego Npro-C kodowanego na NPC-pET ma następującą strukturę, przy czym miejsce cięcia jest umieszczone między aminokwasami Cys168 i Ser(169):
MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSG NHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILL KLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC (168) S(169)DDGAS-(białko C nukleokapsydu)
Sekwencja proliny 17 (pozycja 2 białka fuzyjnego) z naturalnej sekwencji Npro jest podana kursywą i początek sekwencji C jest wytłuszczony. Białko fuzyjne ma przybliżony Mr 32 kDa, z tego po odcięciu autoproteolitycznym część Npro ma 18 kDa, a część C ma 30 14 kDa.
Aby ocenić znaczenie pierwszego aminokwasu na C-końcu miejsca cięcia, zastąpiono serynę 169, która tam naturalnie występuje, 19 innymi naturalnie występującymi aminokwasami za pomocą mutagenezy ukierunkowanej. Konstrukty w ten sposób uzyskane nazwano NPC-pET-Ala, NPC-pET-Gly itd. Szczepy ekspresyjne uzyskano stosując te plazmidy.
Escherichia coli BL21(DE3) stosowano jako szczep gospodarza Escherichia coli dla ekspresji białek fuzyjnych Npro-C. Ten szczep ma następujący genotyp:
E. coli B F dcm ompT hsdS(rb-mb-) gal λ (DE3)
Szczep jest handlowo dostępny w postaci komórek kompetentnych od Stratagene. Niesie lizogenny fag lambda w genomie, który zawiera gen dla polimerazy RNA 17 pod kontrolą promotora lacUV5. Wytwarzanie polimerazy RNA T7 i w efekcie także docelowego białka może być zatem indukowane przez dodanie izopropylo-p-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Ten dwuetapowy układ pozwala na uzyskanie bardzo wysokiego poziomu ekspresji specyficznej i całkowitej dla wielu białek docelowych.
PL 203 708 B1
Szczepy ekspresyjne BL21(DE3)[MPC-pET], BL21(DE3)[MPC-pET-Ala] itd. uzyskuje się przez transformację odpowiednich plazmidów ekspresyjnych do BL21(DE3). Transformacja zachodzi zgodnie z informacją producenta komórek kompetentnych (Stratagene lub Novagen). Mieszaninę transformacyjną wysiewano na podłożach z agarem Lurii z 100 mg/l ampicyliny. Ta transformacja daje liczne klony w każdym przypadku po inkubacji w 37°C (przez noc).
Wybrano kolonię średniej wielkości z wyraźnymi brzegami i ustanowiono ją jako podstawę odpowiedniego szczepu ekspresyjnego. Klon hodowano i przetrzymywano w ampułkach do zamrażania w -80°C (bank wyjś ciowy komórek ang. master cell bank - MCB). Szczep wysiewano na pł ytkach z agarem Lurii (z ampicyliną) do codziennego użytku.
Dany szczep stosowany jest do zaszczepienia prekultury z pojedynczej hodowli podhodowanej na płytce z agarem. Próbkę prekultury zastosowano do zaszczepienia hodowli głównej (10 do 200 ml w kolbach poddawanych ciągłemu wstrząsaniu) i hodowano do OD600 od 0,5 do 1,0. Wytwarzanie białka fuzyjnego następnie indukowano 1,0 mM IPTG 30 (stężenie końcowe). Hodowle następnie hodowano przez 2-4 godz. osiągając wartość OD600 od około 1,0 do 2,0. Temperatura hodowli wynosiła 30°C +/- 2°C i stosowano podłoże LB + 2 g/l glukozy + 100 mg/l ampicyliny.
Próbki pobierano z hodowli przed indukcją i w różnych momentach po indukcji i wirowano je, osady gotowano w denaturującym buforze do próbek i analizowano za pomocą SDS-PAGE oraz barwienia Coomassie lub techniką Western blot. Próbki pobierano w standaryzowanych warunkach, a różnice w gęstości hodowli kompensowano przez objętość buforu do nakładania próbek, stosowaną do ponownego sporządzania zawiesiny.
Prążki pojawiające się po indukcji są zlokalizowane nieco powyżej kDa (Npro) i przy około 14 kDa (C). Wydajność cięcia białka fuzyjnego z każdym konstruktem oceniano na podstawie intensywności prążków w żelu barwionym Coomassie i za pomocą techniki Western blot. Stwierdzono, że większość aminokwasów jest tolerowanych w pozycji zaraz na C-końcu miejsca cięcia (tj. na N-końcu docelowego białka), tj. zachodzi bardzo wydajne cięcie autoproteolityczne.
Dane te wykazują że jest zasadniczo możliwe wykorzystywanie z powodzeniem autoproteolitycznej aktywności autoproteazy Npro dla specyficznego cięcia zrekombinowanego białka fuzyjnego w komórce gospodarza bakteryjnego.
P r z y k ł a d 2: Ekspresja i cięcie in vivo białka fuzyjnego Npro i ludzkiej interleukiny 6 (hIL6) w celu wytwarzania homogennej dojrzał ej hIL6
Skonstruowano plazmid NP6-pET do ekspresji fuzji białkowej Npro-hIL6. pET11a (F.W. Studier i wsp., Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-89) zastosowano jako wektor ekspresyjny. Najpierw sklonowano białko fuzyjne złożone z Npro i białka nukleokapsydu CSFV w tym wektorze ekspresyjnym (patrz przykład 1). Gen struktury tego białka fuzyjnego uzyskano za pomocą PCR. To powoduje zastąpienie pierwszych 16 aa naturalnej sekwencji Npro (MELNHFELLYKTSKQK) przez oligohistydynową sekwencję o długości 10 aa, która pomaga w oczyszczeniu (MASHHHHHHH).
Miejsce cięcia Spel wprowadzono do powstałego plazmidu ekspresyjnego na styku między Npro i biał kiem nukleokapsydu za pomoc ą mutagenezy ukierunkowanej. Umoż liwia to delecję genu struktury dla białka nukleokapsydu z wektora przez cięcie Spel na końcu 5' (odpowiadającym N-końcowi białka) i Xhol na końcu 3' (odpowiadającym C-końcowi białka). Odpowiedni zlinearyzowany wektor Npro-pET11a oddzielono od fragmentu genu nukleokapsydu za pomocą elektroforezy preparatywnej w żelu. Wówczas możliwe jest wprowadzenie genu struktury hIL6 za pomocą „lepkich końców Spel i Xhol.
Następujące prace przygotowawcze są do tego konieczne. Gen struktury amplifikowano za pomocą wysoce precyzyjnego PCR (na przykład system Pwo od Roche Biochemicals, procedura jak podaje producent) z klonu cDNA hIL6, który można pozyskać z komórek C10-MJ2. W tym celu stosowano następujące oligonukleotydy:
Oligonukleotyd 1 („N-końcowy):
5'-ATAATTACTA GTTGTGCTCC AGTACCTCCA GGTGAAG-3'
Oligonukleotyd 2 („C-końcowy):
5'- ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTACATTTGC CGAAGAGCCC TCAGGC -3'
Wprowadzono miejsce cięcia Spel na końcu 5' i miejsce cięcia Xhol wprowadzono na końcu 3' za pomocą stosowanych oligonukleotydów. Dodatkowo wprowadzono podwójny kodon stop ochre (TAATAA) na końcu 3' genu struktury dla wydajnej terminacji translacji. Miejsce Spel z przodu pozwala na ligację w fazie z wektorem Npro-pET11a opisanym powyżej. Miejsce cięcia Xhol z tyłu umożliwia ukierunkowane klonowanie.
PL 203 708 B1
Sekwencja fragmentu PCR (593 bp) z genem struktury dla hIL6 jest przedstawiona poniżej (czytana w kierunku od N-końca do C-końca). Miejsca cięcia przez enzymy restrykcyjne zaznaczono kursywą a pierwszy kodon hIL6 (Ala) i kodon stop wytłuszczono.
ATAATTACTAGTTGTGCTCCAGTACCTCCAGGTGAAGATTCTAAAGATGTAGCCGCCCCACACAG
ACAGCCACTCACCTCTTCAGAACGAATTGACAAACAAATTCGGTACATCCTCGACGGCATCTCAG
CCCTGAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAACATGTGTGAAAGCAGCAAAGAGGCACTGGCAGA
AAACAACCTGAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGATGCTTCCAATCTGGATTCAATGAGG
AGACTTGCCTGGTAAAAATCATCACTGGTCTTTTGGAGTTTGAGGTATACCTAGAGTACCTCCAGA
ACAGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTACAAAAGTCCTGATCCA
GTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAATCTAGATGCAATAACCACCCCTGACCCCCACAAATGCCAGC
CTGCTGACGAAGCTGCAGGCACAGAACCAGTGGCTGCAGGACATGACAACTCATCTCATTCTGC
GCAGCTTTAAGGAGTTCCTGCAGTCCAGCCTGAGGGCTCTTCGGCAAATGTAATAACTCGAGGA
TCCAATTAT
Konstrukt uzyskany przez ligację z plazmidem Npro-Pet11a nazwano NP6-pET.
Sekwencja białka fuzyjnego Npro-hIL6 (347 aminokwasów, z czego 162 aminokwasy dla części Npro i 185 aminokwasów dla części hIL6), kodowana na NP6-pET jest przedstawiona poniżej, sekwencja hIL6 jest wytłuszczona:
MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSG
NHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILL
KLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALR
KETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKITGLLEFEVYLEYLQNRFES
SEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFL
QSSLRALRQM
Białko fuzyjne ma Mr 39303,76 Da w stanie zredukowanym i po możliwym odcięciu część Npro (zredukowana) miałaby Mr 18338,34 Da, a część hIL6 (zredukowana) miałaby 20983,63 Da. Npro ma sześć cystein a hIL6 cztery. Jest prawdopodobne, że cysteiny są głównie w formie zredukowanej w cytoplazmie bakterii. W czasie nastę pnej obróbki prawdopodobnie przynajmniej częściowo zachodzi tworzenie mostków dwusiarczkowych. Należy oczekiwać, że N-końcowa metionina w białku fuzyjnym (lub w części Npro) jest głównie cięta przez aminopeptydazę metioninową (MAP) właściwą dla gospodarza, co obniżyłoby Mr o około 131 Da, w każdym przypadku do 39172,76 Da (białko fuzyjne) i 18207,13 Da (Npro).
Szczepem gospodarza Escherichia coli do ekspresji białka fuzyjnego Npro-hIL6 jest Escherichia coli BL21 (DE3) (patrz przykład 1).
Szczep ekspresyjny BL21(DE3)[MP6-pET] uzyskuje się przez transformację plazmidem ekspresyjnym MP6-pET jak opisano powyżej do BL21 (DES) jak opisano w Przykładzie 1.
Szczep BL21(DE3)[MP6-pET] hodowano z pojedynczej kolonii na płytce agarowej i następnie używano do zaszczepienia prekultury w bulionie Lurii + 100 mg/l ampicyliny (200 ml w 1 l kolbie z wypukł o ś ciami). Prekulturę poddawano wytrząsaniu przy 250 obr./min. i 30°C przez 14 godz., która osiągała w tym czasie OD600 około 1,0. Następnie porcje prekultury po 10 ml stosowano do zaszczepienia głównych hodowli (330 ml bulionu Lurii w każdej 1 l kolbie z wypukłościami) (3% inokulum). Główne hodowle prowadzono w 30°C (250 obr./min.) aż OD600 wzrosło do 0,8, a następnie indukowano wytwarzanie białka fuzyjnego za pomocą 0,5 lub 1,0 mM IPTG (stężenie końcowe). Hodowle prowadzono dalej w 30°C i 250 obr./min. przez 3 godz., w tym czasie OD600 osiągało około 1,0 do 2,0.
Hodowle przenoszono do sterylnych 500 ml butelek do wirowania i wirowano przy 10000 g przez 30 min. Supernatant z wirowania całkowicie odrzucano i osady zamrażano w -80°C do czasu dalszej obróbki.
Pojawienie się nowych prążków białkowych dla lizatu całkowitego można łatwo wykryć za pomocą barwienia Coomassie po SDS-PAGE. Prążki z pozornymi masami cząsteczkowymi około 19 kDa, 21 kDa i 40 kDa pojawiły się dla lizatu BL21(DE3)[MP6-pET]. Analiza tej ekspresji stosując specyficzne przeciwciała anty-hIL6 zasadniczo potwierdza wyniki uzyskane po barwieniu Coomassie.
Aby zoptymalizować cięcie Npro-hIL6 przeprowadzono indukcję w różnych temperaturach i stężeniach IPTG i ponownie analizowano zarówno w barwionym żelu i techniką Western bLot. Zaobserwowano nieomal kompletne odcinanie Npro-IL6 w temperaturze hodowli 22°C.
Ten eksperyment pokazuje, że heterologiczne białka mogą też być połączone z C końcem Npro w bakteryjnych ukł adach ekspresyjnych i zachodzi bardzo wydajne cięcie. Zmiana w aminokwasie N-Końcowym następującego białka (alanina zamiast seryny) także nie ma niekorzystnego wpływu.
PL 203 708 B1
Ten układ jest zatem odpowiedni do wytwarzania zrekombinowanych białek z homogennym autentycznym N-końcem zgodnie z wynalazkiem, szczególnie w heterologicznym układzie ekspresyjnym takim, jak bakteryjny układ ekspresyjny bez dalszych etapów obróbki.
P r z y k ł a d 3: Ekspresja i cię cie in vivo białka fuzyjnego zł o ż onego z Npro i ludzkiego interferonu α2Β (IFNa2B) w celu uzyskania homogennego dojrzałego IFNa2B
Sposób klonowania IFNa2B dla uzyskania wektora NPI-pET odpowiada sposobowi opisanemu dla hIL6 w przykładzie 2. Gen struktury amplifikowano za pomocą wysoce precyzyjnego PCR (na przykład system Pwo od Roche Biochemicals, procedura jak podaje producent). Stosowana matryca jest klonem cDNA IFNa2B, który można otrzymać z ludzkich leukocytów standardowymi sposobami znanymi specjaliście. Alternatywnym sposobem jest też przeprowadzenie pełnej syntezy genu. Sekwencję genu struktury można uzyskać w formie elektronicznej z bazy danych Genbank pod numerem dostępu V00548. Do amplifikacji stosowano następujące oligonukleotydy:
Oligonukleotyd 1 („N-końcowy):
5'- ATAATTACTA GTTGTTGTGA TCTGCCTCAA ACCCACAGCC -3'
Oligonukleotyd 2 („C-końcowy):
5' - ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTATTCCTTA CTTCTTAAAC TTTCTTGCAA G -3'
Sekwencja fragmentu PCR fragment (533 bp) z genem struktury IFNa2B jest przedstawiona poniżej. Miejsca cięcia przez enzymy restrykcyjne zaznaczono kursywą, a pierwszy kodon IFNa2B (Cys) i kodon stop wytłuszczono.
ATAATTACTAGTTGTTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCC
TGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCC
CAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCA
GCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACA
AATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGG
GGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGA
ATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAAT
CATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATAATAACTCGA
GGATCCAATTAT
Konstrukt uzyskany za pomocą ligacji do plazmidu Npro-pETl la plazmid nazwano NPI-pET.
Sekwencja białkowa fuzyjnego Npro-IFNa2B (327 aa, z czego 162 Npro i 165 IFNa2B) 15 kodowana na NPI-pET jest przedstawiona poniżej, sekwencja IFNa2B jest wytłuszczona (przedstawiona w kierunku od N-końca do C-końca):
MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSG
NHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYYCYDGCILL
KLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQ
EEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTET
PLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEWRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE
Białko fuzyjne ma Mr 37591,44 Da w stanie zredukowanym i po możliwym odcięciu część Npro (zredukowana) miałaby Mr 18338,34 Da i część IFNa2B (zredukowana) miałaby 19271,09 Da. Npro ma sześć cystein a IFNa2B cztery. Jest prawdopodobne, że cysteiny są głównie w formie zredukowanej w cytoplazmie bakterii. W czasie następnej obróbki prawdopodobnie przynajmniej częściowo zachodzi tworzenie mostków dwusiarczkowych. Należy oczekiwać, że N-końcowa metionina w białku fuzyjnym (lub w części Npro) jest głównie cięta przez aminopeptydazę metioninową (MAP) właściwą dla gospodarza, co obniżyłoby Mr o około 131 Da w każdym przypadku do 37460,23 Da (białko fuzyjne) i 30 18207,13 Da (Npro).
Szczepem gospodarza Escherichia coli do ekspresji białka fuzyjnego Npro-IFNa2B jest Escherichia coli BL21(DE3) (patrz przykład 1).
Szczep ekspresyjny BL21(DE3)[NPl-pET] uzyskuje się przez transformację plazmidu ekspresyjnego NPI-pET jak opisano powyżej do BL21(DE3) jak opisano w przykładzie 1.
Szczep BL21(DE3)[NPI-pET] hodowano z pojedynczej kolonii na płytce agarowej i następnie używano zaszczepienia prekultury w bulionie Lurii + 100 mg/l ampicyliny (200 ml w 1 l kolbie z wypukłościami). Prehodowlę poddawano wytrząsaniu przy 250 obr./min. i 30°C przez 14 godz., która w tym czasie osiąga wartość OD600 około 1,0. Następnie 10 ml porcje prekultury stosowano do zaszczepienia głównych hodowli (330 ml bulionu Lurii w każdej 1 l kolbie z wypukłościami) (3% inokulum). Główne hodowle prowadzono w 30°C (250 obr./min.) aż wartość OD600 wzrosła do 0,8, a następnie indukowano wytwarzanie białka fuzyjnego za pomocą 0,5 lub 1,0 mM IPTG (stężenie końco10
PL 203 708 B1 we). Hodowle prowadzono dalej w 30°C i 250 obr./min. przez 3 godz., w którym to czasie wartość OD600 osiągała około 1,0 do 2,0.
Hodowle przenoszono do sterylnych 500 ml butelek do wirowania i wirowano przy 10000 g przez 30 min. Supernatant z wirowania całkowicie odrzucano i osady zamrażano w -80°C do czasu dalszej obróbki.
Pojawienie się nowych prążków białkowych dla lizatu całkowitego można łatwo wykryć za pomocą barwienia Coomassie po SDS-PAGE. Prążki dla pozornych mas cząsteczkowych około 38 kDa i około 19 kDa pojawiły się dla lizatu BL21(DE3)[MP6-pET]. Prążek IFNa2B nie daje się oddzielić od prążka Npro za pomocą SDS-PAGE.
Analizy tych próbek z zastosowaniem specyficznych przeciwciał anty-IFNa2B potwierdzają obecność odciętego prążka IFNa2B.
Aby zoptymalizować cięcie Npro-IFNa2B, przeprowadzono indukcje w różnych temperaturach i stężeniach IPTG także w tym przypadku, i ponownie analizowano zarówno w barwionym żelu, jak i techniką Western blot. Także w tym przypadku stwierdzono, że optymalne cięcie zachodzi przy obniżonych temperaturach (22 do 30°C).
PL 203 708 B1
LISTA SEKWENCJI <110> Biochemie Gesellschaft m.b.H.
<120> Wytwarzanie białek przez cięcie autoproteoiityczne <130> G-31109/A/BCK <140> PCT/EPOO/07642 <141> 2000-08-07 <160> 12 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <2il> 168 <212> PRT <213> Pestiwirus, gat.
<400> 1
Met 1 Glu Leu Asn His 5 Phe Glu Leu Leu Tyr 10 Lys Thr Ser Lys Gin 15 Lys
Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu
20 25 30
Phe Giy Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro
35 40 45
His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro
50 55 60
Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly
65 70 75 80
Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr Gly Pro
85 90 95
PL 203 708 B1
Val Tyr His Arg Ala 100 Pro Leu Glu Phe 105 Phe Asp Glu Ala Gin 110 Phe Cys
Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu
115 120 125
Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala
130 135 140
Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn
145 150 155 160
Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys
165
<210> 2
<211> 168
<212> PRT
<213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Określenie syntetycznej sekwencji:
Oligo-histydynowy fragment ułatwiający oczyszczanie połączony
Z sekwencj ią pestiwirusa
<400> 2
Met Ala Ser His His His His His His His Pro Val Gly Val Glu Glu
1 5 10 15
Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu Phe Gly Asn Pro Ser Glu
20 25 30
Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro His Asp Arg Gly Arg Gly
35 40 45
Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro Arg Lys Gly Asp Cys Arg
50 55 60
Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly Ile Tyr Ile Lys Pro Gly
65 70 75 80
PL 203 708 B1
Pro Val Tyr Tyr Gin Asp 85 Tyr Thr Gly Pro Val 90 Tyr His Arg Ala 95 Pro
Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys Glu Val Thr Lys Arg Ile
100 105 110
Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu Tyr His Tle Tyr Val Cys
115 120 125
Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala Lys Arg Gly Thr Pro Arg
130 135 140
Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn Cys Pro Leu Trp Val Thr
145 150 155 160
Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser
165 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Pestiwirus, gat.
<400> 3
Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gin Lys 15 10 15 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Określenie syntetycznej sekwencji:
Oligo-histydynowy fragment ułatwiający oczyszczanie <400> 4
Met Ala Ser His His His His His His His 15 10
PL 203 708 B1 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220 <223> Określenie syntetycznej sekwencji:
Oligonukleotyd <400> 5 ataattacta gttgtgctcc agtacctcca ggtgaag 37 <210> 6 <211> 46 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Określenie syntetycznej sekwencji: Oligonukleotyd
<400> 6 ataattggat cctcgagtta ttacatttgc cgaagagccc tcaggc 46
<210> 7
<211> 593
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400 7
ataattacta gttgtgctcc agtacctcca ggtgaagatt ctaaagatgt agccgcccca 60
cacagacagc cactcacctc ttcagaacga attgacaaac aaattcggta catcctcgac 120
ggcatctcag ccctgagaaa ggagacatgt aacaagagta acatgtgtga aagcagcaaa 180
gaggcactgg cagaaaacaa cctgaacctt ccaaagatgg ctgaaaaaga tggatgcttc 240
caatctggat tcaatgagga gacttgcctg gtaaaaatca tcactggtct tttggagttt 300
gaggtatacc tagagtacct ccagaacaga tttgagagta gtgaggaaca agccagagct 360
gtgcagatga gtacaaaagt cctgatccag ttcctgcaga aaaaggcaaa gaatctagat 420
gcaataacca cccctgaccc aaccacaaat gccagcctgc tgacgaagct gcaggcacag 480
aaccagtggc tgcaggacat gacaactcat ctcattctgc gcagctttaa ggagttcctg 540
cagtccagcc tgagggctct tcggcaaatg taataactcg aggatccaat tat 593
PL 203 708 B1 <210> 8 <211> 347 <212> ΡΒΤ <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Określenie syntetycznej sekwencji:
Oligo-histydynowy fragment ułatwiający oczyszczanie połączony
z sekwencj ą pe istiwirus la i Homo sap ilens
<40C » 8
Met Ala Ser His His His His His His His Pro Val Gly Val Glu Glu
1 5 10 15
Pro Val Tyr Asp Thr Al a Gly Arg Pro Leu Phe Gly Asn Pro Ser Glu
20 25 30
Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys Leu Pro His Asp Arg Gly Arg Gly
35 40 45
Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro Arg Lys Gly Asp Cys Arg
50 55 60
Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly Ile Tyr Ile Lys Pro Gly
65 70 75 80
Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr dy Pro Val Tyr His Arg Ala Pro
85 90 95
Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin Phe Cys Glu Val Thr Lys Arg Ile
100 105 110
Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu Tyr His Ile Tyr Val Cys
115 120 125
Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala Lys Arg Gly Thr Pro Arg
130 135 140
Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn Cys Pro Leu Trp Val Thr
145 150 155 160
Ser Cys Ala Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala
165 170 175
PL 203 708 B1
Pro His Arg Gin 180 Pro Leu Thr Ser Ser 185 Glu Arg Ile Asp Lys 190 Gin Ile
Arg Tyr I le Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn
195 200 205
Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn
210 215 220
Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gin Ser Gly
225 230 235 240
Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu
245 250 255
Phe Glu Vai Tyr Leu Glu Tyr Leu Gin Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu
260 265 270
Glu Gin Ala Arg Ala Val Gin Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gin Phe
275 280 285
Leu Gin Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro
290 295 300
Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gin Ala Gin Asn Gin Trp
305 310 315 320
Leu Gin Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe
325 330 335
Leu Gin Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gin Met
340 345
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> Syntetyczna s ekwencja
<220>
<223> Określenie syntetycznej sekwencji
Oligonukleotyd
PL 203 708 B1 <400> 9 ataattacta gttgttgtga tctgcctcaa acccacagcc 40 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Określenie syntetycznej sekwencji:
Oligonukleotyd
<400> 10 tttcttgcaa g 51
ataattggat cctcgagtta ttattcctta cttcttaaac
<210> 11
<211> 533
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
ataattacta gttgttgtga tctgcctcaa acccacagcc tgggtagcag gaggaccttg 60
atgctcctgg cacagatgag gagaatctct cttttctcct gcttgaagga cagacatgac 120
tttggatttc cccaggagga gtttggcaac cagttccaaa aggctgaaac catccctgtc 180
ctccatgaga tgatccagca gatcttcaat ctcttcagca caaaggactc atctgctgct 240
tgggatgaga ccctcctaga caaattctac actgaactct accagcagct gaatgacctg 300
gaagcctgtg tgatacaggg ggtgggggtg acagagactc ccctgatgaa ggaggactcc 360
attctggctg tgaggaaata cttccaaaga atcactctct atctgaaaga gaagaaatac 420
agcccttgtg cctgggaggt tgtcagagca gaaatcatga gatctttttc tttgtcaaca 480
aacttgcaag aaagtttaag aagtaaggaa taataactcg aggatccaat tat 533
<210> 12 <211> 327 <212> PRT <213> Syntetyczna sekwencja <220>
<223> Określenie syntetycznej sekwencji:
Oligo-histydynowy fragment ułatwiający oczyszczanie połączony z sekwencją pestiwirusa i Homo sapiens
PL 203 708 B1 <400> 12
Met Ala Ser His His His His His 1 5
Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg 20
Val His Pro Gin Ser Thr Leu Lys 35 40
Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp 50 55
Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val 65 70
Pro Val Tyr Tyr Gin Asp Tyr Thr 85
Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gin 100
Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly 115 120
Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys 130 135
Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe 145 150
Ser Cys Cys Asp Leu Pro Gin Thr 165
Leu Met Leu Leu Ala Gin Met Arg 180
Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe 195 200
Phe Gin Lys Ala Glu Thr Ile Pro 210 215
His His Pro Val Gly Val Glu Glu 10 15
Pro Leu Phe Gly Asn Pro Ser Glu 25 30
Leu Pro His Asp Arg Gly Arg Gly 45
Leu Pro Arg Lys Gly Asp Cys Arg 60
Ser Gly Ile Tyr Ile Lys Pro Gly 75 80
Gly Pro Val Tyr His Arg Ala Pro 90 95
Phe Cys Glu Val Thr Lys Arg Ile 105 110
Lys Leu Tyr His Ile Tyr Val Cys 125
Leu Ala Lys Arg Gly Thr Pro Arg 140
Thr Asn Cys Pro Leu Trp Val Thr 155 160
His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr 170 175
Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu 185 190
Pro Gin. Glu Glu Phe Gly Asn Gin 205
Val Leu His Glu Met Ile Gin Gin 220
PL 203 708 B1

Claims (9)

1. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko fuzyjne zawierające pierwszy polipeptyd o autoproteolitycznej funkcji autoproteazy Npro pestiwirusa, oraz drugi polipeptyd przyłączony do C-końca pierwszego polipeptydu, odcinany z białka fuzyjnego w komórce bakteryjnej w wyniku autoproteolitycznego działania pierwszego polipeptydu, przy czym drugi polipeptyd jest polipeptydem heterologicznym, zaś pierwszy polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej:
(a) sekwencję aminokwasów
1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRT
TLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRI GRVTGSDGKLYHIYVC VDGCILLKLAKRGTPRTLK WIRNFTNCPLWVTSC-(168);
(b) sekwencję aminokwasów Glu22 - Cys168 autoproteazy Npro CSFV, przy czym pierwszy polipeptyd zawiera dodatkowo Met jako N-koniec, zaś polipeptyd heterologiczny jest bezpośrednio połączony z aminokwasem Cys168 autoproteazy Npro CSFV;
(c) sekwencję aminokwasów Pro17 - Cys168 autoproteazy Npro CSFV, przy czym pierwszy polipeptyd zawiera dodatkowo Met jako N-koniec, zaś polipeptyd heterologiczny jest bezpośrednio połączony z aminokwasem Cys168 autoproteazy Npro CSFV.
2. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że pestiwirus jest wybrany z grupy CSFV, BDV i BVDV.
3. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 2, znamienna tym, że pestiwirusem jest CSFV.
4. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienna tym, że cząsteczką kwasu nukleinowego jest cząsteczka DNA.
5. Wektor ekspresyjny, który jest zgodny z określoną komórką gospodarza bakteryjnego, zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 1 albo 2 albo 3 albo 4 oraz co najmniej jedną sekwencję kontrolującą ekspresję.
PL 203 708 B1
6. Wektor ekspresyjny według zastrz. 5, znamienny tym, że komórką gospodarza bakteryjnego jest komórką E. coli.
7. Wektor ekspresyjny według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że wektorem ekspresyjnym jest plazmid.
8. Komórka gospodarza bakteryjnego zawierająca wektor określony w zastrz. 5 albo 6 albo 7.
9. Komórka gospodarza bakteryjnego według zastrz. 8, znamienna tym, że komórką gospodarza jest komórka E. coli.
PL353090A 1999-08-09 2000-08-07 Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko fuzyjne, wektor ekspresyjny zawierający tę cząsteczkę oraz komórka gospodarza bakteryjnego zawierająca ten wektor PL203708B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT136899 1999-08-09
PCT/EP2000/007642 WO2001011056A1 (en) 1999-08-09 2000-08-07 Production of proteins by autoproteolytic cleavage

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL353090A1 PL353090A1 (pl) 2003-10-06
PL203708B1 true PL203708B1 (pl) 2009-11-30

Family

ID=3512383

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL353090A PL203708B1 (pl) 1999-08-09 2000-08-07 Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko fuzyjne, wektor ekspresyjny zawierający tę cząsteczkę oraz komórka gospodarza bakteryjnego zawierająca ten wektor

Country Status (17)

Country Link
US (1) US7378512B2 (pl)
EP (1) EP1200603B1 (pl)
JP (1) JP5480458B2 (pl)
KR (1) KR100735791B1 (pl)
CN (1) CN1230542C (pl)
AU (1) AU775681B2 (pl)
CA (1) CA2380302C (pl)
CZ (1) CZ303341B6 (pl)
HK (1) HK1047127B (pl)
HU (1) HU230117B1 (pl)
IL (2) IL147411A0 (pl)
MX (1) MXPA02001425A (pl)
NO (1) NO329246B1 (pl)
PL (1) PL203708B1 (pl)
SK (1) SK288290B6 (pl)
TR (1) TR200200048T2 (pl)
WO (1) WO2001011056A1 (pl)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2823220B1 (fr) 2001-04-04 2003-12-12 Genodyssee Nouveaux polynucleotides et polypeptides de l'erythropoietine (epo)
JP2005510244A (ja) * 2001-11-26 2005-04-21 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・クイーンズランド フラビウイルスワクチン送達系
GB0508435D0 (en) * 2005-04-26 2005-06-01 Sandoz Ag Organic compounds
JP2008538897A (ja) 2005-04-26 2008-11-13 サンド・アクチエンゲゼルシヤフト 融合タンパク質の自己タンパク質分解切断による組換えタンパク質の産生
AU2011253661B2 (en) * 2005-04-26 2013-06-13 Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg Production of recombinant proteins by autoproteolytic cleavage of a fusion protein
GB0508434D0 (en) * 2005-04-26 2005-06-01 Sandoz Ag Organic compounds
US20100137563A1 (en) * 2008-12-03 2010-06-03 Northwestern University Cysteine Protease Autoprocessing of Fusion Proteins
EP2684951A1 (en) 2012-07-13 2014-01-15 Sandoz Ag Method for producing a recombinant protein of interest
EP2746390A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Sandoz Ag Method for producing a recombinant protein of interest
EP2746391A1 (en) 2012-12-19 2014-06-25 Sandoz Ag Method for producing a recombinant protein of interest
UY35874A (es) 2013-12-12 2015-07-31 Novartis Ag Un proceso para la preparación de una composición de proteínas pegiladas

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4743679A (en) * 1986-02-24 1988-05-10 Creative Biomolecules, Inc. Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
EP0321973B1 (de) * 1987-12-23 1993-11-03 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Expression der viral kodierten Protease P2A des HRV2
US6077694A (en) * 1990-09-21 2000-06-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method for over-expression and rapid purification of biosynthetic proteins
MX219629B (es) * 1997-04-25 2004-03-30 Sembiosys Genetics Inc Metodo para separar proteinas de fusion
DE59812768D1 (de) * 1997-08-22 2005-06-09 Roche Diagnostics Gmbh Autokatalytisch aktivierbare zymogene vorstufen von proteasen und deren verwendung
WO1999010483A2 (de) * 1997-08-22 1999-03-04 Roche Diagnostics Gmbh Autokatalytisch aktivierbare vorstufen von proteasen und deren verwendung
HU230231B1 (hu) * 1999-08-09 2015-10-28 Sandoz Ag Fehérjék termelése

Also Published As

Publication number Publication date
AU6699800A (en) 2001-03-05
JP2003506092A (ja) 2003-02-18
JP5480458B2 (ja) 2014-04-23
EP1200603B1 (en) 2014-12-24
HUP0203051A2 (hu) 2002-12-28
TR200200048T2 (tr) 2002-04-22
AU775681B2 (en) 2004-08-12
CZ2002480A3 (cs) 2002-05-15
HK1047127A1 (en) 2003-02-07
HUP0203051A3 (en) 2003-12-29
PL353090A1 (pl) 2003-10-06
MXPA02001425A (es) 2002-08-12
KR100735791B1 (ko) 2007-07-06
WO2001011056A1 (en) 2001-02-15
CA2380302C (en) 2013-02-26
SK288290B6 (sk) 2015-07-01
EP1200603A1 (en) 2002-05-02
CA2380302A1 (en) 2001-02-15
NO329246B1 (no) 2010-09-20
CN1367837A (zh) 2002-09-04
HK1047127B (zh) 2015-08-21
IL147411A (en) 2013-12-31
CZ303341B6 (cs) 2012-08-08
HU230117B1 (hu) 2015-08-28
KR20020021175A (ko) 2002-03-18
NO20020507L (no) 2002-04-05
US20040215008A1 (en) 2004-10-28
SK1872002A3 (en) 2002-07-02
NO20020507D0 (no) 2002-01-31
US7378512B2 (en) 2008-05-27
IL147411A0 (en) 2002-08-14
CN1230542C (zh) 2005-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20050186564A1 (en) Production of proteins
EP0682709B1 (en) Method for producing tobacco proteinase nla
JP4871960B2 (ja) 優れたシャペロン活性およびフォールディング活性を有するキメラ融合タンパク質
Elce et al. Recombinant calpain II: improved expression systems and production of a C105A active-site mutant for crystallography
PL203708B1 (pl) Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca białko fuzyjne, wektor ekspresyjny zawierający tę cząsteczkę oraz komórka gospodarza bakteryjnego zawierająca ten wektor
EP1597369B1 (en) Use of caspase enzymes for maturation of engineered recombinant polypeptide fusions
EP1621556A1 (en) Method of producing target protein, fused protein and gene thereof, partial sequence protein of intein and gene thereof, expression vector and transformant
Chaudhuri et al. A modified Kex2 enzyme retained in the endoplasmic reticulum prevents disulfide-linked dimerisation of recombinant human insulin-like growth factor-1 secreted from yeast
Whitmarsh et al. Protein fusions as an aid to purification
KR20090025482A (ko) Ｔｓｆ를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법