JP2005510244A - フラビウイルスワクチン送達系 - Google Patents

Abstract

異種核酸によってコードされるＲＮＡおよびタンパク質を高レベル発現させる細胞内自己複製を容易にするフラビウイルスレプリコンをそれぞれ含むフラビウイルス発現ベクター、構築物、および系を提供する。フラビウイルス発現ベクター、構築物、および系は、好ましくは、クンジンウイルスレプリコンを使用し、特に、ウイルス感染およびがんに対する防御的Ｔ細胞免疫を誘導する免疫原性タンパク質およびペプチドの発現を容易にするワクチン送達系として使用する。ワクチンを、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはウイルス様粒子の形態で投与することができる。

Description

本発明は、改良されたフラビウイルスレプリコン、発現ベクター、およびフラビウイルスレプリコンを含む構築物および系に関する。より詳細には、本発明は、ウイルス感染およびがんに対して防御的Ｔ細胞免疫を誘導する異種免疫原性タンパク質およびペプチドをコードするワクチン送達系として有用なフラビウイルス発現系に関する。ワクチンを、細胞内自己複製によりＲＮＡおよびコードされるタンパク質が高レベルに発現されるＤＮＡ、ＲＮＡ、またはウイルス様粒子の形態で投与することができる。

抗ウイルスおよび抗がんワクチンのためのプラス鎖ＲＮＡウイルスのレプリコンベースのベクターが開発されている（引例（２５）に概説）。いくつかの特徴により非常に有効かつ安全なワクチン開発のためにこれらのベクターが望ましく選択される。これらには、（ｉ）レプリコンＲＮＡ自体を複製する能力によるコードされた異種遺伝子（ＨＧ）の高レベル発現、（ｉｉ）核スプライシングおよび／または染色体組み込みに関連するいかなる可能な厄介な問題も排除した排他的細胞質複製、（ｉｉｉ）トランスフェクトされた（または感染した）細胞から回避することによりこれらのベクターが生物学的に安全になる免疫された被験体中のワクチンベクターの範囲が限定されるレプリコンＲＮＡの不能、および（ｉｖ）ｃＤＮＡを使用した容易な操作および組換え体の作製が可能な比較的小さなゲノムサイズ（７〜９ｋｂ）が含まれる。

アルファウイルス、ピコルナウイルス、およびフラビウイルスを含むほとんどの代表的なプラス鎖ＲＮＡウイルスファミリーのためのレプリコンベースの発現ベクターが開発されている（引例２５に概説）。しかし、実験動物におけるレプリコンベクターの免疫原性特性に関するデータの大部分は、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）などのアルファウイルスのレプリコンを使用して蓄積されている（概説については引例４７、およびより最近の研究については引例８、１０、１１、３９を参照のこと）。一般に、これらの研究は、アルファウイルスレプリコンベクターによりコードされた免疫原に対する強力な抗体および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答が誘導され、ほとんどの場合、免疫化された動物が適切なウイルスまたは腫瘍チャレンジから防御されることを示した。３つ全ての送達モダリティは有効であるが、ＶＬＰ送達が最も有効であることが示された。従来の（非複製）プラスミドＤＮＡベクターとアルファウイルスＤＮＡベースのレプリコンベクターとの比較研究において、一般に、後者がより強力な免疫応答をより低いＤＮＡ濃度で誘導した（４、１７）。しかし、いくつかの研究では、ＤＮＡベースのアルファウイルスレプリコンによって誘導された免疫応答の有効性は、コードされた免疫原の性質に依存するようであり、いくつかの免疫原に対する免疫は、同量の従来のプラスミドＤＮＡベクターによって誘導された免疫と同様であるかより低いことが示された（１０、２３）。

フラビウイルスであるクンジン（ＫＵＮ）由来のレプリコンベクターがいくつかの刊行物に記載されている（２６、２８、５２、５３；国際特許出願ＷＯ９９／２８４８７）。ＫＵＮレプリコン発現系は、アルファウイルスレプリコン系と同様に、３つの異なるモダリティ（すなわち、裸のＲＮＡ、ＶＬＰ、およびプラスミドＤＮＡとして（図１Ａ）（２５、５２、５３））によってレプリコンＲＮＡを送達可能である。同種アルファウイルスレプリコンパッケージング系と異なり（６、３３、４１）、ＫＵＮレプリコンパッケージング系により、ＫＵＮ構造タンパク質の産生のための無関係のＳＦＶウイルス由来のレプリコン発現ベクターが使用される（２８、５２）。これにより、感染性組換え物質によるＶＬＰの汚染に関連するいかなる潜在的な問題も排除される。さらに、免疫化研究で一般的に使用されている高度な細胞変性アルファウイルスレプリコンベクターと対照的に、ＫＵＮレプリコンは非細胞変性を示すようであり、インビトロおよびインビボの両方でＨＧを長期間発現する（５３）。非細胞変性アルファウイルスレプリコンベクターが開発されているが（１、１２、４０）、その免疫原性特性に関するデータは報告されていない。以前の研究では、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現する非細胞変性ＤＮＡベースのＫＵＮレプリコンベクターを含むＶＬＰによるマウスの免疫化により、抗β−ガラクトシダーゼ抗体応答が誘導される（５３；国際公開ＷＯ９９／２８４８７）。しかし、ＫＵＮレプリコンベクター系が防御免疫応答を誘導することができる免疫原を送達することができることは証明されていない。

本発明者らは、本明細書中で、第１に、抗体およびＴ細胞媒介応答によって長期間の防御免疫を得ることができるフラビウイルスレプリコンベースワクチンのワクチン送達系記載する。

さらに、本発明者らは、フラビウイルスレプリコンおよびＶＬＰ産生に有用なパッケージング系の修正および改良を提供する。

したがって、本発明の目的は、ワクチン送達に有用な改良されたフラビウイルスレプリコンベクター系を提供することである。

発明を解決するための手段

したがって、本発明は、広範に、フラビウイルス発現系およびフラビウイルスレプリコン、これらに有用な発現ベクターおよび発現構築物に関する。特定の実施形態では、本発明は、フラビウイルスワクチン送達系に関する。

１つの態様では、本発明は、
（ｉ）感染性ウイルスを産生することができないフラビウイルスレプリコンをコードし、前記フラビウイルスレプリコンが１つまたは複数の変異フラビウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）異種核酸の挿入部位と、
（ｉｉｉ）前記フラビウイルスレプリコンをコードするヌクレオチド配列に作動可能な連結されたプロモーターと、
（ｉｖ）少なくとも１つの自己プロテアーゼ（ａｕｔｏｐｒｏｔｅａｓｅ）をコードするヌクレオチド配列と
を含む、発現ベクターを提供する。

適切には、変異フラビウイルス非構造タンパク質をコードするフラビウイルスレプリコンにより、対応する野生型タンパク質をコードするフラビウイルスレプリコンと比較して動物細胞におけるより有効な持続的複製が確立される。

好ましくは、（ｉ）中の変異フラビウイルス非構造タンパク質は、
（ａ）変異非構造タンパク質ＮＳ１、
（ｂ）変異非構造タンパク質ＮＳ２Ａ、および
（ｃ）変異非構造タンパク質ＮＳ５
からなる群から選択される。

より好ましくは、（ｉ）中の変異フラビウイルス非構造タンパク質は、
（ｉ）プロリン２５０のロイシンへの変異を有する非構造タンパク質ＮＳ１、
（ｉｉ）アラニン３０のプロリンの変異を有する非構造タンパク質ＮＳ２Ａ、
（ｉｉｉ）アスパラギン１０１のアスパラギン酸の変異を有する非構造タンパク質ＮＳ２Ａ、および
（ｉｖ）プロリン２７０のセリンへの変異を有する非構造タンパク質ＮＳ５
からなる群から選択される。

好ましい実施形態では、自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ口蹄疫ウイルス２Ａ自己プロテアーゼをコードする。

１つの特定の実施形態では、発現ベクターは、１つの自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。この実施形態の例を、ＳＰ６ＫＵＮｒｅｐ５およびｐＫＵＮｒｅｐ５と命名する。

別の特定の実施形態では、発現ベクターは、少なくとも２つの前記自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列の第１の配列が前記挿入部位の５’に存在し、少なくとも２つの前記２つの自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列の第２の配列が前記挿入部位の３’に存在する、２つの自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。この実施形態の例を、ＳＰ６ＫＵＮｒｅｐ６およびｐＫＵＮｒｅｐ６と命名する。

別の態様では、本発明は、
（ｉ）感染性ウイルスを産生することができないフラビウイルスレプリコンをコードし、前記フラビウイルスレプリコンが１つまたは複数の変異フラビウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）異種核酸と、
（ｉｉｉ）前記フラビウイルスレプリコンをコードするヌクレオチド配列に作動可能な連結されたプロモーターと、
（ｉｖ）少なくとも１つの自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列と
を含む、発現構築物を提供する。

適切には、変異フラビウイルス非構造タンパク質をコードするフラビウイルスレプリコンにより、対応する野生型タンパク質をコードするフラビウイルスレプリコンと比較して動物細胞におけるより有効な持続的複製が確立される。

好ましくは、（ｉ）中の変異フラビウイルス非構造タンパク質は、
（ａ）変異非構造タンパク質ＮＳ１、
（ｂ）変異非構造タンパク質ＮＳ２Ａ、および
（ｃ）変異非構造タンパク質ＮＳ５
からなる群から選択される。

より好ましくは、（ｉ）中の変異フラビウイルス非構造タンパク質は、
（ｉ）プロリン２５０のロイシンへの変異を有する非構造タンパク質ＮＳ１、
（ｉｉ）アラニン３０のプロリンの変異を有する非構造タンパク質ＮＳ２Ａ、
（ｉｉｉ）アスパラギン１０１のアスパラギン酸の変異を有する非構造タンパク質ＮＳ２Ａ、および
（ｉｖ）プロリン２７０のセリンへの変異を有する非構造タンパク質ＮＳ５
からなる群から選択される。

好ましい実施形態では、自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ口蹄疫ウイルス２Ａ自己プロテアーゼをコードする。

１つの実施形態では、発現構築物は、少なくとも１つの前記自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列の第１の配列が前記異種核酸の５’に存在し、少なくとも１つの前記自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列の第２の配列が前記異種核酸の３’に存在する、少なくとも２つの自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。

特定の実施形態では、この態様は、
（ｉ）感染性ウイルスを産生することができないフラビウイルスレプリコンをコードし、前記フラビウイルスレプリコンが１つまたは複数の変異フラビウイルス非構造タンパク質をコードするＲＮＡ配列と、
（ｉｉ）異種タンパク質をコードする異種ＲＮＡ配列と
を含む、ＤＮＡ発現構築物から転写可能なＲＮＡを提供する。

１つの実施形態では、プロモーターは、インビボでＲＮＡ転写を促進するように操作可能である。

より好ましくは、プロモーターは、哺乳動物細胞中でＲＮＡ転写を促進するように操作可能である。

哺乳動物細胞中で操作可能な好ましいプロモーターの例は、ＣＭＶプロモーターである。

別の実施形態では、プロモーターは、インビトロでのＲＮＡ転写を促進するように操作可能である。

インビトロでのＲＮＡ転写を促進するように操作可能である好ましいプロモーターの例は、ＳＰ６プロモーターである。

特定の実施形態では、本発明の発現構築物の非限定的な例には、インビトロでのＲＮＡ発現のためのＳＰ６プロモーターを含むＲＮＡＬｅｕＭｐｔ、ＲＮＡＰｒｏＭｐｔ、ＫＵＮＲＮＡｇａｇ、または細胞内ＲＮＡ発現のためのＣＭＶプロモーターを含むＤＮＡＬｅｕＭｐｔ、ＤＮＡＰｒｏＭｐｔ、ＫＵＮＤＮＡｇａｇが含まれる。

さらに別の態様では、本発明は、
（ｉ）第１の態様に記載の発現ベクターまたは第２の態様に記載の発現構築物と、
（ｉｉ）フラビウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）への前記発現ベクターまたは構築物のパッケージングを容易にする１つまたは複数のタンパク質を発現することができる少なくとも別の発現構築物と
を含む発現系を提供する。

特定の実施形態では、別の発現構築物は、ＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ、ＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ／Ｎｅｏ、およびｐＳＦＶ３Ｌ７１３ＰＬａｃＺＮｅｏからなる群から選択されるパッケージング構築物である。これらの構築物には、細胞変性を減少させるためにＳＦＶ ｎｓＰ２遺伝子中のロイシン７１３のプロリンへの置換が含まれる。ＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ／ＮｅｏおよびｐＳＦＶ３Ｌ７１３ＰＬａｃＺＮｅｏは、安定な細胞株の作製に特に適切である。

なおさらに別の態様では、本発明は、
（ｉ）感染性ウイルスを産生することができないフラビウイルスレプリコンと、
（ｉｉ）免疫原性タンパク質と
をコードする、フラビウイルスＤＮＡ発現構築物から転写可能なＲＮＡを含む薬学的組成物を提供する。

さらなる態様では、本発明は、
ＲＮＡが動物細胞で転写可能なフラビウイルスＤＮＡ発現構築物を含み、前記転写可能なＲＮＡが、
（ｉ）感染性ウイルスを産生することができないフラビウイルスレプリコンと、
（ｉｉ）免疫原性タンパク質と
をコードする薬学的組成物を提供する。

好ましくは、上記核酸組成物によれば、ＤＮＡおよびＲＮＡ発現構築物には、少なくとも１つの口蹄疫ウイルス２Ａ自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列が含まれる。

より好ましくは、ＤＮＡおよびＲＮＡ構築物には、第１の口蹄疫ウイルス２Ａ自己プロテアーゼをコードする異種核酸の５’に存在するヌクレオチド配列および第２の口蹄疫ウイルス２Ａ自己プロテアーゼをコードする異種ＤＮＡの３’に存在するヌクレオチド配列が含まれる。

なおさらなる態様では、本発明は、第３の態様に記載の発現系によって産生された１つまたは複数のＶＬＰを含む薬学的組成物を提供する。

好ましくは、本発明の薬学的組成物は、免疫療法組成物、またはより好ましくはワクチンである。

なおさらなる態様では、本発明は、任意の上記の態様の薬学的組成物を動物に投与して動物に免疫を誘導するステップを含む、動物の免疫化方法を提供する。

動物には、ヒト、家畜、ペット、家禽類、および商業的に重要な他の動物が含まれるが、これらに限定されない。

好ましくは、動物は哺乳動物である。

より好ましくは、動物はヒトである。

免疫は、抗体媒介免疫および／またはＴ細胞媒介免疫などの細胞媒介免疫であり得る。

１つの実施形態では、Ｔ細胞免疫は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答によって特徴付けられる。

好ましくは、Ｔ細胞免疫は、長期エフェクターＣＤ＋８ＣＴＬ応答の誘導によって特徴付けられる。

別の実施形態では、Ｔ細胞応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答によって特徴付けられる。

１つの特定の実施形態では、免疫化方法によってウイルス感染に対する免疫が誘導される。

別の特定の実施形態では、免疫化方法により、黒色腫などのがんに対する免疫が誘導される。

本明細書を通して、特記しない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」を、排他的というよりもむしろ包括的に使用し、その結果記載された整数または整数群は１つまたは複数の記載していない整数または整数群を含み得る。

［表の説明］
表１。クンジンおよびＳＦＶレプリコンＲＮＡの連続トランスフェクションを示す表である。
表２。クンジンおよび非細胞変性ＳＦＶレプリコンＲＮＡの同時トランスフェクションを示す表である。
表３。クンジンレプリコンＲＮＡによりトランスフェクトされたＳＦＶＭＥＣＡ１２細胞株における分泌ＶＰＬの産生。
表４。ＫＵＮ−ＧＡＧレプリコンＲＮＡによりトランスフェクトされたＳＦＶＭＥＣＡ１２細胞株のＶＬＰ産生に対するインキュベーション温度の効果を示す表である。
表５。非細胞変性ＳＦＶレプリコンを発現し、且つｐＳＦＶＨｅｌｐｅｒＣｐｒＭＥおよびＫＵＮ−ＧＡＧ ＲＮＡによりトランスフェクトされた細胞株のＶＬＰ産生を示す表である。
表６。ＫＵＮｇａｇＶＬＰによる免疫化後のｒＶＶｇａｇによるチャレンジに対する防御を示す表である。
表７。ピューロマイシン耐性ＢＨＫ−ＫＵＮレプリコン細胞クローン番号１１および２０での適応変異を示す表である。

本発明者らは、免疫原としてマウスＣＴＬポリエピトープまたはポリトープ（Ｍｐｔ）およびＨＩＶ−１ｇａｇを発現するＫＵＮレプリコンによるマウスの免疫化および裸のＲＮＡ、ＶＬＰ、またはプラスミドＤＮＡの形態における送達を記載する。これら全てのワクチン接種様式により、コードされたエピトープに特異的であり、裸のＲＮＡおよびＶＬＰの場合、ウイルスおよび腫瘍によるチャレンジからマウスが防御されるＣＤ８＋ＣＴＬ応答が誘導された。ＶＬＰとして送達された完全なＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子を発現するＫＵＮレプリコンによるマウスのさらなる免疫化により、ｇａｇに特異的な抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答が誘導され、ｇａｇ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスによる誘発からマウスが保護された。

また、異種免疫原をコードする配列の５’および３’のＦＭＤＶ２Ａ自己プロテアーゼ配列の挿入によって（ＷＯ９９／２８４８７に記載のものと比較して）ＫＵＮレプリコンを改変した。この改変により、発現した融合タンパク質が自己タンパク質を分解して外来アミノ酸配列を実質的に含まないタンパク質免疫原が遊離する。さらなる改変は、変異によってより有効な持続的複製が確立された本発明のフラビウイルスレプリコンの１つまたは複数のＮＳ１、ＮＳ２Ａ、およびＮＳ５タンパク質成分をコードする変異ヌクレオチド配列の使用を含む。本発明はまた、国際公開ＷＯ９９／２８４８７号に記載のＳＦＶベースの系よりも細胞変性も低い新規のＳＦＶベースのｖパッケージング系を提供する。

［ＫＵＮレプリコン発現ベクターおよび構築物］
本明細書中で使用される、用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖のｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡならびにｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡを示す。

本明細書中で使用される、「ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ」および「ｆｌａｖｉｖｉｒａｌ」は、６５種またはそれ以上の関連ウイルス種を含むフラビウイルス属内のフラビウイルス科のメンバーをいう。典型的には、フラビウイルスは、１つの糖タンパク質Ｅを含むペプロマーを有する小型の包膜ＲＮＡウイルス（直径約４５ｎｍ）である。他の構造タンパク質を、Ｃ（コア）およびＭ（膜様）と呼ぶ。一本鎖ＲＮＡは感染性を示し、典型的には、分子量が約４×１０⁶であり、５’末端にｍ７Ｇ’ｃａｐ’を有するが、３’末端にポリ（Ａ）領域を含まない（単独のメッセンジャーとして機能する）。フラビウイルスは広範な脊椎動物に感染し、多くがダニおよび蚊などの節足動物によって伝播するが、別のフラビウイルス群は「公知の媒介動物を持たない（ｎｏ−ｋｎｏｗｎ−ｖｅｃｔｏｒ）」（ＮＫＶ）と呼ばれている。

特に、フラビウイルスの非限定的な例は、ウェストナイルウイルス、クンジンウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、モンタナホウヒゲコウモリ白質脳炎ウイルス、ウスツウイルス、およびアルクフルマ（Ａｌｋｈｕｒｍａ）ウイルスである。

本発明の好ましいフラビウイルスレプリコンはクンジンウイルス由来であるが、任意のフラビウイルスレプリコンを使用して本発明の発現ベクター、発現構築物、および発現系を実施することができることが当業者に認識される。

比較的十分に特徴付けられたフラビウイルスレプリコンの例には、ウェストナイルウイルス１系統（引例６１）およびＩＩ系統（引例６２）レプリコンが含まれる。

本発明によって意図されるフラビウイルスレプリコンには、例えば、国際公開ＷＯ９９／２８４８７号に記載のフラビウイルスＲＮＡ由来の任意の自律複製成分が含まれる。

本明細書中で一般に使用される、「フラビウイルスレプリコン」は、フラビウイルスまたはフラビウイルス起源の他のウイルスに由来する。したがって、本明細書の文脈では、「フラビウイルスレプリコンをコードするヌクレオチド配列」は、複製に十分でありながら感染性ウイルスを産生することができないフラビウイルスレプリコンまたは少なくともその一部由来の配列情報を含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列である。

例えば、当業者に理解されるように、本明細書中で言及される本発明のＤＮＡベースの構築物は、レプリコンＲＮＡと相補的であるか由来するレプリコンＲＮＡのＤＮＡコピーを含む。

適切には、フラビウイルスレプリコンは、複製成分でありながら「感染性ウイルスを産生することができない」。これは、フラビウイルスレプリコンがウイルスパッケージングに必要な１つまたは複数の構造タンパク質の全てまたは一部を発現することができないことを意味する。ウイルスパッケージングを無効にするためのクンジンフラビウイルスレプリコンの改変についての詳細な説明は、国際公開ＷＯ９９／２８４８７号に記載されている。

好ましい実施形態では、フラビウイルスレプリコンは、
（ｉ）５’および３’非翻訳（ＵＴＲ）配列ならびにＣタンパク質の最初の２０個のアミノ酸（Ｃ２０）およびＥタンパク質の最後の２２個のアミノ酸（Ｅ２２）をそれぞれコードする配列と、
（ｉｉ）非構造タンパク質ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５をコードするヌクレオチド配列と
を含む。

特定の態様では、１つまたは複数の非構造タンパク質は変異している。

１つの特定の実施形態では、ＮＳ１タンパク質のプロリン残基２５０がロイシンに置換される。

別の特定の実施形態では、非構造タンパク質ＮＳ２Ａ中のアラニン３０がプロリンに置換される。

さらに別の特定の実施形態では、非構造タンパク質ＮＳ２Ａ中のアスパラギン１０１がアスパラギン酸に置換される。

なおさらに別の特定の実施形態では、非構造タンパク質ＮＳ５中のプロリン２７０がセリンに置換される。

上記各変異または置換が個別に存在するか、本発明のフラビウイルスレプリコンと組み合わせて存在し得ることも認識される。

本発明によれば、「発現ベクター」は、１つまたは複数の他の調節ヌクレオチド配列と共に上記のフラビウイルスレプリコンを含む。このような調節配列には、プロモーター、内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、１つまたは複数の異種核酸の挿入のための制限酵素部位、ポリアデニル化配列、ならびに確実に転写を終結して３’末端を正確に切断するデルタ肺炎ウイルスリボザイム（ＨＤＶｒ）の抗ゲノム配列などの他の配列が含まれるが、これらに限定されない。

本発明の発現ベクターおよび発現構築物は、少なくとも１つの自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むことが認識される。

好ましくは、ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの口蹄疫ウイルス２Ａ自己プロテアーゼをコードするか、より好ましくは、各ヌクレオチド配列は各口蹄疫ウイルス２Ａ自己プロテアーゼをコードする。

好ましくは、使用において、発現された融合タンパク質は、Ｎ末端口蹄疫ウイルス２Ａ自己プロテアーゼおよびＣ末端口蹄疫ウイルス２Ａ自己プロテアーゼに隣接する異種タンパク質を含む。この配置により、口蹄疫ウイルス２Ａ自己プロテアーゼが融合タンパク質を切断して他のアミノ酸配列を実質的に含まない異種タンパク質を遊離する。

本発明のＫＵＮレプリコンベクターの特定の例は、図６に示す１つのＦＭＤＶ２ＡプロテアーゼおよびＥＭＣＶ ＩＲＥＳをコードするｐＫＵＮｒｅｐ５およびＳＰ６ＫＵＮｒｅｐ５ならびに２つのＦＭＤＶ２ＡプロテアーゼをコードするＳＰ６ＫＵＮｒｅｐ６およびｐＫＵＮｒｅｐ６である。

本発明によれば、「発現構築物」は、ＲＮＡおよび／またはコードされたタンパク質の形態で発現可能なように異種核酸が挿入された発現ベクターである。

前記異種核酸は、１つまたは複数のペプチドもしくはポリペプチドをコードすることができるか、標的配列と実質的に同一であるか実質的に相補的なヌクレオチド配列をコードすることができる。

「タンパク質」は、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸には、当分野で周知の天然（すなわち、遺伝的にコードされている）、非天然、Ｄ型、およびＬ型のアミノ酸を含み得る。

「ペプチド」は、５０個未満のアミノ酸を有するタンパク質である。

「ポリペプチド」は、５０個またはそれ以上のアミノ酸を有するタンパク質である。

異種核酸は、ウイルス、真菌、細菌、原虫、無脊椎動物（寄生虫および節足動物など）などの病原体に由来するかこれらから得たタンパク質をコードすることができるか、あるいは、動物およびヒトを含む動物に由来するかこれらから得た変異タンパク質、発がんタンパク質、または腫瘍タンパク質（腫瘍抗原など）をコードすることができる。異種核酸はまた、免疫を誘導するために構築された免疫原性エピトープなどの合成または人工タンパク質をコードすることができる。

１つの実施形態では、異種核酸は、１つまたは複数の免疫原性タンパク質またはポリペプチド（これらに限定されない）をコードする。

好ましくは、１つまたは複数の免疫原性ペプチドまたはポリペプチドは、１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含む。

１つの特定の実施形態では、異種核酸は、以後により詳細に記載のマウスポリエピトープ（Ｍｐｔ）などの複数のペプチドエピトープ（ポリエピトープ）をコードする。エピトープ配列の例には、ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ、ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ、ＴＹＱＲＴＲＡＬＯＶ、ＳＹＩＰＳＡＥＫＩ、およびＳＩＩＮＦＥＫＬが含まれるが、これらに限定されない。

別の特定の実施形態では、異種核酸は、ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子またはそのフラグメントをコードする。

本発明の発現構築物では、プロモーターは、フラビウイルスレプリコンに作動可能に連結しているか接続している。

「作動可能に連結された」または「作動可能に接続された」は、フラビウイルスレプリコンをコードするＲＮＡ、異種核酸、およびＲＮＡプロセシングおよびタンパク質発現を容易にする他の調節配列の転写をインビトロまたはインビボで開始、調節、または制御するようにプロモーターが位置付けられていることを意味する。

好ましくは、プロモーターは、フラビウイルスレプリコンの５’に存在する。

ＤＮＡ発現構築物からのＲＮＡのインビトロ転写に好ましいプロモーターは、ＳＰ６プロモーターである。

哺乳動物細胞におけるＤＮＡ発現構築物からのＲＮＡのインビボ転写に好ましいプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。しかし、哺乳動物細胞中で活性な他の周知のプロモーター（ＳＶ４０プロモーター、ヒト伸長因子αプロモーター、およびαクリスタリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない）が意図されると認識される。

本発明の発現構築物を使用して安定に形質転換された宿主細胞を作製する実施形態では、発現ベクターは、形質転換宿主細胞を選択するための選択マーカー遺伝子をさらに含む。選択マーカー遺伝子は当分野で周知であり、ネオマイシントランスフェラーゼおよびピューロマイシンＮアセチルトランスフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。選択マーカー遺伝子を、欠失構造遺伝子の代わりに挿入するか、３’ＵＴＲ領域に挿入することができる。

タンパク質発現に適切な宿主細胞は、転写、翻訳、およびタンパク質発現に必要な任意の転写後および／または翻訳後プロセシングもしくは修飾を行う能力を有する任意の真核生物細胞株であり得る。典型的に核酸転写およびタンパク質発現で使用される哺乳動物細胞の例は、ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、ＣＶ−１、ＢＨＫ２１、ＨＥＫ２９３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、ＷＥＨＩ２３１、ＨｅＬａ、およびＢ１６黒色腫細胞であるが、これらに限定されない。

リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、リポフェクタミン、リポフェクチンおよび他の親油性薬剤、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、微粒子銃、微量注入、およびプロトプラスト融合などの当分野で周知の方法によって細胞をトランスフェクトすることができる。

本発明の発現構築物の例には、以後により詳細に記載されているＲＮＡＬｅｕＭｐｔ、ＲＮＡＰｒｏＭｐｔ、ＫＵＮＲＮＡｇａｇ、ＤＮＡＬｅｕＭｐｔ、ＤＮＡＰｒｏＭｐｔ、およびＫＵＮＤＮＡｇａｇが含まれる。

［ウイルスパッケージング］
本発明の第３の態様によれば、
（ｉ）上記のフラビウイルス発現構築物と、
（ｉｉ）第２の態様に記載の発現構築物のフラビウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）へのパッケージングを容易にする１つまたは複数のタンパク質を発現することができる少なくとも別の発現構築物と
を含むフラビウイルス発現系を提供する。

任意の非フラビウイルス由来のベクターを使用して、ウイルスパッケージングおよびＶＬＰの産生に必要な１つまたは複数の構造タンパク質を発現することができる。例えば、別の構築物は、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）またはシンドビスウイルス（ＳＩＮ）などの別のアルファウイルスまたはアデノウイルス、鳥痘ウイルス、もしくはワクシニアウイルスなどのＤＮＡウイルスに由来し得る。

ＶＬＰの産生ならびにＶＬＰの調製および精製に有用な別の構築物（ＳＦＶ由来構築物）の例を、以下に詳細に記載する。

他の実施形態では、本発明は、国際公開ＷＯ９９／２８４８７号に記載の系を改良し、パッケージング効率を簡単にした新規のパッケージング系を提供する。

一定の広範な実施形態では、フラビウイルスパッケージングを、
（ａ）フラビウイルス発現構築物およびウイルスパッケージングに必要な構造タンパク質を提供する別の発現構築物による宿主細胞（上記のものなど）の一過性トランスフェクション、
（ｂ）宿主細胞がウイルスパッケージングに必要な構造タンパク質を提供するパッケージング構築物で安定にトランスフェクトされたフラビウイルス発現構築物による宿主細胞の一過性トランスフェクション
によって行うことができることが認識される。

（ａ）に関して、発現構築物を、最適にＶＬＰが産生される時間枠内で同時トランスフェクトするか、個別にトランスフェクトすることができる。

上記に関して、「トランスフェクトされた」を、宿主細胞への外来遺伝物質の一過性または安定な導入を含む一般用語として便宜上使用する。

１つの特定の実施形態では、ＳＦＶ由来のパッケージング構築物であるＳＦＶ−ＭＥＣ１０５のその細胞変性を減少させるための改変を、ｎｓＰ２遺伝子中のアミノ酸７１３のロイシンからプロリンへの変異の移入によって行った（ＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ；図７）。

別の特定の実施形態では、ＳＦＶ−ＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ構築物は、抗生物質Ｇ４１８による選択による安定に発現する細胞株の確立を容易にするためのＩＲＥＳ−Ｎｅｏカセット（ＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ／Ｎｅｏ；図８）を含む。この細胞株のクンジンレプリコンＲＮＡによるトランスフェクションによって複製されて、クンジンＶＬＰが産生される。

さらに別の特定の実施形態では、クンジン構造タンパク質を発現するためのトランスフェクトされたＳＦＶヘルパーＲＮＡであるｐＳＦＶＨｅｌｐｅｒｐｒＭＥＣ（図１０）およびｐＳＦＶＨｅｌｐｅｒＣｐｒＭＥ（図１１）の増幅用の非細胞変性ＳＦＶレプリコンＲＮＡ構築物であるｐＳＦＶ３Ｌ７１３ＰＬａｃＺＮｅｏ（図９）を提供する。

別の構築物（ＳＦＶ由来の構築物）、ＳＦＶ由来の構築物を発現する安定な細胞株、ならびにＶＬＰの産生およびＶＬＰの調製および精製で有用な異なるパッケージングプロトコールの例は、以下に詳述されている。

［薬学的および免疫療法組成物およびワクチン］
本発明の特定の態様は、ワクチン送達系としてのフラビウイルス発現構築物および発現系の使用に関する。しかし、本発明は、より広範には、
（ｉ）本発明の発現系によって産生されたＶＬＰ、
（ｉｉ）本発明のＤＮＡ発現構築物から転写されたＲＮＡ、または
（ｉｉｉ）インビボでの複製ＲＮＡの転写を指示する本発明のプラスミドＤＮＡ発現構築物を含み得るワクチン送達における使用に制限されないが免疫療法組成物およびワクチン
を含む薬学的組成物を提供する。

薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤をさらに含み得る。

このような組成物を、ウイルス、細菌、原虫寄生体、および脊椎動物の寄生虫などの病原体（これらに限定されない）に対する免疫（好ましくは、防御免疫）の作製の目的のために送達することができる。

別の実施形態では、黒色腫などのがんの免疫治療上の処置は、本発明によって意図される。

「薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤」は、全身投与で安全に使用することができる固体または液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。特定の投与経路に依存して、当分野で周知の種々のキャリアを使用することができる。これらのキャリアを、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝化溶液、乳濁液、等張生理食塩水、無機酸塩（塩酸を含む）などの塩、臭化物、および硫化物、有機酸（酢酸、プロピオン酸、およびマロン酸など）、無発熱物質水を含む群から選択することができる。

薬学的に許容可能なキャリア、希釈物、および賦形剤を説明した有用な参考文献は、レミントン薬学（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ、１９９１）（参照することにより本明細書中に組み込まれる）である。

患者に本発明の組成物を投与するための任意の安全な投与経路を使用することができる。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、口腔内、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などを使用することができる。例えば、免疫療法組成物、タンパク性ワクチン、および核酸ワクチンの投与には筋肉内および皮下注射が適切である。

投与形態には、錠剤、分散物、懸濁液、注射液、溶液、シロップ、トローチ、カプセル坐剤、エアゾール、および経皮パッチなどが含まれる。これらの投与形態はまた、この目的のために特別にデザインされた注射用または移植用徐放デバイスまたはこの様式でさらに作用するように改変された他の移植片形態を含み得る。例えば、疎水性ポリマー（アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸を含む）およびヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの一定のセルロース誘導体でのコーティングによって治療薬を徐放させることができる。さらに、他のポリマー材料、リポソーム、および／またはミクロスフェアの使用によって徐放させることができる。

経口または非経口投与に適切な本発明の薬学的組成物は、所定量の１つまたは複数の本発明の治療薬を含むカプセル、カシェ剤（ｓａｃｈｅｔ）、または錠剤などの個別の単位として、粉末もしくは顆粒として、または水溶液、非水性溶液、水中油滴型乳濁液、または油中水滴型乳濁液中の溶液もしくは懸濁液として存在することができる。このような組成物を、任意の薬学的方法によって調製することができるが、全ての方法は、１つまたは複数の上記の薬剤の１つまたは複数の必要な成分を構成するキャリアとの会合工程を含む。一般に、組成物を、本発明の薬剤と液体キャリアまたは細かく砕いた固体キャリアまたはその両方との均一且つ密接な（ｉｎｔｉｍａｔｅｌｙ）混合および必要に応じて生成物の所望の形状への成型によって調製する。

上記の組成物を、投薬処方物に適合する様式および薬学的に有効な量で投与することができる。本発明の文脈では、患者への投与量は、適切な期間を超えて患者が有利な反応を示すのに十分でなければならない。投与すべき薬剤量は、年齢、性別、体重、および身体全体の健康状態を含め、治療を受ける患者に依存し得、これは、医師の判断に依存するであろう。

本発明の免疫療法組成物を使用して、ヒトなどの動物を予防的または治療的に免疫化することができる。

しかし、他の動物、好ましくは、家畜およびペットなどの家畜を含む脊椎動物が意図される。

以後により詳細に記載されるように、本発明のワクチンは、ＶＬＰ、ＲＮＡ、またはＤＮＡの形態であり得る。

本発明のワクチンを使用した免疫原性タンパク質およびペプチドエピトープ（ポリエピトープを含む）の適切な発現によって、ウイルス、腫瘍、細菌、原虫、および他の脊椎動物寄生虫に対する免疫応答を誘導することができる。

好ましくは、免疫応答は、抗体、ＣＤ８＋ＣＴＬ、および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導を含む。

より好ましくは、免疫応答は、長期エフェクターＣＤ８＋ＣＴＬの誘導を含む。

１つの特定の実施形態では、本発明者らは、オボアルブミン由来のＣＴＬエピトープをコードするＲＮＡおよびＶＬＰワクチンによる免疫化によりオボアルブミンを発現するＢ１６黒色腫細胞におけるチャレンジからマウスが保護されることを証明した。

別の特定の実施形態では、本発明者らは、完全なＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子をコードするＶＬＰワクチンによる免疫化により、ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスにおけるチャレンジからマウスが保護されることを証明した。

本発明の免疫療法組成物およびワクチンは、一定の実施形態では、アジュバントを含み得ることも認識される。

当分野で理解されるように、「アジュバント」は、ワクチン組成物の免疫原性および／または効力を増強させる１つまたは複数の物質を意味する。適切なアジュバントの非限定的な例には、スクアランおよびスクアレン（または動物由来の他のオイル）；ブロック共重合体；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０などの界面活性剤；Ｇｕｉｌ（登録商標）Ａ、ＤｒａｋｅｏｌまたはＭａｒｃｏｌなどの鉱物油、ピーナッツ油などの植物油；コリネバクテリウム・パルヴムなどのコリネバクテリウム由来のアジュバント；プロピオニバクテリウム・アクネ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅ）などのプロピオニバクテリウム由来のアジュバント；ウシ結核菌（Ｂａｃｉｌｌｅ ＣａｌｍｅｔｔｅおよびＧｕｅｒｉｎもしくはＢＣＧ）；インターロイキン２およびインターロイキン１２などのインターロイキン；インターロイキン１などのモノカイン；腫瘍壊死因子；γインターフェロンなどのインターフェロン；サポニン−水酸化アルミニウムまたはＱｕｉｌ−Ａ水酸化アルミニウムなどの組み合わせ；リポソーム；ＩＳＣＯＭ（登録商標）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバント；微生物細胞壁抽出物；ムラミルジペプチドなどの合成糖ペプチドまたは他の誘導体；Ａｖｒｉｄｉｎｅ；脂質Ａ誘導体；硫酸デキストラン；ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎまたは硫酸アルミニウム；Ｃａｒｂｏｐｏｌ’ＥＭＡなどのカルボキシポリメチレン；Ｎｅｏｃｒｙｌ Ａ６４０（例えば、米国特許第５，０４７，２３８号）などのアクリルコポリマー乳濁液；ワクシニアまたは動物ポックスウイルスタンパク質；クロレラ毒素などのサブウイルス粒子アジュバント；またはその混合物が含まれる。

本発明を容易に理解し、実用的効果を得ることができるように、当業者は、以下の非限定的な実施例を指示される。

［材料と方法］
［プラスミド］ＲＮＡベースの（ＲＮＡＬｅｕ）およびＤＮＡベースの（ＤＮＡＬｅｕ）ＫＵＮレプリコンベクターは、口蹄疫ウイルスの２Ａ自己プロテアーゼ（ＦＭＤＶ２Ａ）の２つのコピー（一方はクローニング部位の上流であり、他方は下流である）ならびにＫＵＮ ＮＳ１遺伝子中のアミノ酸２５０位にロイシン（Ｌｅｕ）を含む（図１Ｂ）。ＲＮＡＰｒｏおよびＤＮＡＰｒｏベクターは、アミノ酸２５０位にＬｅｕの代わりにプロリン（Ｐｒｏ）を含み、これらを、ＲＮＡＬｅｕおよびＤＮＡＬｅｕベクター中の全ＮＳ１遺伝子にわたるＳｐｈＩ−ＳｐｈＩフラグメントのＫＵＮ全長ｃＤＮＡプラスミド２５０ｐｒｏ由来の対応するＳｐｈＩ−ＳｐｈＩフラグメントとの置換によって構築した（１６）。マウスポリエピトープ（Ｍｐｔ）配列を、プライマーＭｐｔ−Ｆ（５’−ＧＣＧＡＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＡＧＡＡ−３’）およびＭｐｔ−Ｒ（５’−ＧＴＡＡＣＧＣＧＴＣＴＡＡＧＴＣＣＴＣＧＧＧＧＣＣＧＧ−３’）を使用して、プラスミドｐＳＴＭＰＤＶ（５０）からＰＣＲ増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を、ＭｌｕＩで消化し、４つの各ベクターのＭｌｕＩ部位にクローニングして、プラスミドＲＮＡＬｅｕＭｐｔ、ＲＮＡＰｒｏＭｐｔ、ＤＮＡＬｅｕＭｐｔ、およびＤＮＡＰｒｏＭｐｔをそれぞれ産生した（図１Ｂ）。

［ＤＮＡおよびＲＮＡトランスフェクション、ＩＦおよびノーザンブロット分析］ＤＮＡトランスフェクションのために、６ウェルプレート中またはカバーガラス上のＢＨＫ２１細胞を、製造者の説明通りにＬｉｐｏｆｅｃｔｇａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓトランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、２または０．４μｇのプラスミドＤＮＡによりそれぞれトランスフェクトした。以前に記載されたように（２６）、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによってＸｈｏＩ線状化ＲＮＡベースのプラスミドＤＮＡからＲＮＡをインビトロで転写し、ＢＨＫ２１細胞にエレクトロポレーションした。以前に記載されたように（５６）、トランスフェクトされた細胞を有するカバーガラスを、トランスフェクション後に冷アセトン中で４８時間固定し、抗ＮＳ３抗体による間接的免疫蛍光（ＩＦ）によってＫＵＮ ＮＳ３タンパク質発現についてアッセイした。ＫＵＮ３’ＵＴＲ領域またはＭｐｔ配列のいずれかを示す³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを使用して、トランスフェクトされた細胞由来の全ＲＮＡのノーザンブロット分析を以前に記載されたように（２６）行った。

［ＶＬＰの調製］ＶＬＰ（ＶＬＰＰｒｏＭｐｔおよびＶＬＰＬｅｕＭＰＴ）を、以前に記載されたように調製した（２８、５２）。簡単に述べれば、２×１０⁶ＢＨＫ２１細胞を、約１０〜２０μｇのインビトロ転写ＲＮＡＰｒｏＭｐｔまたはＲＮＡＬｅｕＭｐｔ ＲＮＡを用いて、１．５ｋＶ、２５μＦ、∝抵抗、１０秒間隔で２パルスにてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、細胞を８ｍｌのＤＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで希釈し、ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で６０ｍｍ皿にて培養した。３２時間後、細胞をトリプシン処理し、同一の条件下でＫＵＮ構造タンパク質を発現するインビトロ転写ＳＦＶレプリコンＲＮＡ（ＳＦＶ−ＭＥＣ１０５）と共に第２のエレクトロポレーションに使用した。第２のエレクトロポレーションから１８時間後、培地を３ｍｌのＤＭＥＭ／２％ｋＦＣＳと置換し、細胞をさらに２２時間インキュベートした。培地を回収し、８０００×ｇでのスピンによって明澄化し、その後１ｍｌのアリコートを−７０℃で保存した。ＶＬＰの１０倍連続希釈物によるＢＨＫ２１細胞の感染および感染後３０〜４０時間後でのＩＦ分析後のＮＳ３陽性細胞の計数によって感染性ＶＬＰのタイターを決定した。

［マウスの免疫］メスＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^d）マウス（６〜８週齢）を、Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｐｅｒｔｈ、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から得た。マウスを以下の処方に基づいて免疫した。（ｉ）ＫＵＮレプリコンポリトープＤＮＡプラスミド、Ｍｐｔを発現するＫＵＮレプリコンをコードするＤＮＡＬｅｕＭｐｔ、およびＤＮＡＰｒｏＭｐｔを大腿四頭筋に注射し（１００μｇを含む１００μｌＰＢＳを筋肉内、５０μｌを各脚）、（ｉｉ）インビトロ転写したＫＵＮレプリコンＲＮＡ、ＭｐｔをコードするＲＮＡＬｅｕＭｐｔ、およびＲＮＡＰｒｏＭｐｔをＤＥＰＣ処理ＰＢＳに溶解し、上記のように注射し（約３０μｇを含む１００μｌ（筋肉内）、５０μｌを各脚）、（ｉｉｉ）ＶＬＰにパッケージングしたレプリコンＲＮＡであるＲＮＡＰｒｏＭｐｔまたはＲＮＡＬｅｕＭｐｔ（それぞれＶＬＰＰｒｏＭｐｔおよびＶＬＰＬｅｕＭｐｔ）を、ＤＭＥＭ／２％ＦＣＳに溶解し（ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ）、腹腔内注射し（１ｍｌ中に約５×１０⁵〜１０⁶ＶＬＰを含む）、（ｉｖ）従来のプラスミドＤＮＡワクチンであるＭｐｔをコードするｐＳＴＭＰＤＶ（１００μｇを含む１００μｌＰＢＳ（筋肉内）、５０μｌを各大腿四頭筋）（５０）、そして（ｖ）Ｍｐｔをコードする組換えワクシニアウイルスを以前に記載のように注射した（１０⁷ｐｆｕを含む２００μｌＲＰＭＩ１６４０（腹腔内））（５１）。

［ＣＴＬアッセイ］以前に記載のように（３１）、エピトープ特異的ＩＦＮγ分泌細胞を、最小ＣＴＬペプチドエピトープを使用した酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイによって計数した。簡単に述べれば、平底の９６ウェルＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＡセルロースエステルメンブレンマイクロタイタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｌｔｄ．、Ｎｏｒｔｈ Ｒｙｄｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、５μｇ／ｍＬのラット抗マウスＩＦＮγ抗体（クローンＲＡ−６Ａ２、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）で一晩コートした。次いで、コートしたプレートを、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温で１時間ブロックし、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳで３回洗浄した。脾臓細胞（１×１０⁶／ウェル）を、ＥＬＩＳＰＯＴプレートの第１のウェルにプレートし、２倍に連続希釈した。組換えヒトＩＬ−２（Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡから入手）（１００ＩＵ／ｍｌ）をペプチド（Ｍｉｎｏｔｏｐｅｓ、Ｃｌａｙｔｏｎ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（１μｇ／ｍｌ）と共に添加し、プレートを１８時間インキュベートした。細胞を溶解し、プレートを洗浄し、ＩＦＮγスポットを、最初のビオチン化抗マウスＩＦＮγ抗体（クローンＸＭＧ１．２）（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）とのインキュベーションおよびその後のストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）およびＳｉｇｍａ Ｆａｓｔ ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｓｉｇｍａ）とのインキュベーションによって検出した。スポットを、ＫＳ ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｖｉｓｉｏｎ ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｂｅｒｇｍｏｏｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して計数した。

以前に記載されたように（９）、⁵¹クロム（Ｃｒ）放出アッセイを行った。簡単に述べれば、ＶＬＰＰｒｏＭｐｔによる免疫から２〜３週間後にマウスを屠殺し、１μｇ／ｍｌのペプチド（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）の添加によってインビトロで６日間脾臓細胞を再刺激した。得られたエフェクター集団を、分割し、表示のエフェクター：標的比でのペプチド感作および非感作⁵¹Ｃｒ標識Ｐ８１５標的細胞に対して二連で同数を使用した。

［ワクシニアウイルス保護アッセイ］６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝６）を、約３０μｇのＲＮＡＬｅｕＭｐｔまたはコントロール（ＲＮＡＬｅｕＣｏｎｔｒｏｌ）ＲＮＡで１回免疫化し、３週間後にマウスあたり１０⁷ｐｆｕのマウスポリトープをコードする組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶＭｐｔ）を使用してｉ．ｐ．でチャレンジを行った（５１）。感染４日後、両卵巣を取り出し、洗浄し、電動式グラインダーを使用して１ｍｌのＰＢＳ中でホモジナイズした。次いで、１００μｌの卵巣懸濁液を、１ｍｇ／ｍｌでトリプシン（Ｓｉｇｍａ）を含む９００μｌのＰＢＳと混合し、３７℃で３０分インキュベートした。溶液を、１０，０００×ｇで短時間遠心分離して破片を除去し、１００μｌの上清を９００μｌのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ培地と混合した。次いで、卵巣中のワクシニアウイルスタイターを、集密なＣＶ１細胞に対するプラークアッセイによって決定した。実験群およびコントロール群におけるウイルスタイターの有意差を、ウィルコクスンの順位和検定を使用して計算した（７）。

［腫瘍保護アッセイ］オボアルブミンを発現するＢ１６黒色腫細胞（Ｂ１６−ＯＶＡ）（３）を、Ｋ．Ｒｏｃｋ博士（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＵＳＡ）から入手した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス群（ｎ＝６）に、約３０μｇのＲＮＡＬｅｕＭｐｔまたはコントロールＲＮＡＬｅｕＣｏｎｔｒｏｌＲＮＡのいずれかを４週間間隔で２回筋肉内にワクチン接種するか、ｒＶＶＭｐｔで１回接種し、最後の免疫化から２週間後にマウスの背中の２つの異なる部位にＢ１６−ＯＡ細胞（１０⁵細胞／マウス）を皮下注射した。注射前に腫瘍の出現の測定を容易にするために注射部位周囲の毛を電気カミソリで除去した。成長した腫瘍をモニターし、腫瘍サイズが１５ｍｍ×１５ｍｍに達した時に動物を屠殺した。腫瘍チャレンジ後の表示の日数での各治療群についての平均腫瘍領域を計算した。群間の平均腫瘍成長の相違を、分散分析を使用して計算した（４５）。動物が屠殺された時間も記録し、カプラン−マイヤー生存曲線で示した（２０）。カプラン−マイヤー生存曲線間の相違を、ログランク検定を使用して計算した（２０）。

ＶＬＰＬｅｕＭｐｔを使用した腫瘍保護研究のために、雌Ｃ５７ＢＬ６（Ｈ−２^d）マウス（６〜８週齢；ｎ＝６）を、これらのＶＬＰで１回（ＶＬＰＬｅｕＭｐｔ×１）または２回（２週間間隔でＶＬＰＬｅｕＭｐｔ×２）；コントロールＶＬＰ（ＶＬＰＬｅｕｃｏｎｔｒｏｌ）；または（ｉｖ）Ｍｐｔをコードする組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶＭｐｔ）により腹腔内（ｉ．ｐ）に免疫した。最後の免疫から２週間後、マウスに５×１０⁵Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫腫瘍細胞を２つの異なる皮下部位に注射してチャレンジを行った。

［結果］
［トランスフェクトされた細胞におけるマウスポリエピトープをコードするＫＵＮレプリコンの有効な複製］
マウスポリトープ（Ｍｐｔ）を発現するＫＵＮレプリコンｃＤＮＡをコードするプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡＬｅｕＭｐｔおよびＤＮＡＰｒｏＭｐｔ）を、ＢＨＫ２１細胞にトランスフェクトし、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって細胞に転写された対応するレプリコンＲＮＡの複製および発現をノーザンブロットおよびＩＦ分析によって試験した。インビトロ合成ＭｐｔコードＫＵＮレプリコンＲＮＡ（ＲＮＡＬｅｕＭｐｔおよびＲＮＡＰｒｏＭｐｔ）をエレクトロポレーションによってＢＨＫ２１細胞にトランスフェクトし、その複製および発現を分析した。ＫＵＮ抗ＮＳ３抗体を使用してトランスフェクトされた細胞のＩＦ分析は、ＤＮＡベースのレプリコンによるトランスフェクション後に約５０％の細胞が陽性であり、ＲＮＡベースのレプリコンによるエレクトロポレーション後に約８０％の細胞が陽性であることを示した（図２Ａ）。ＫＵＮレプリコンＲＮＡのエレクトロポレーションを使用した以前の実験では、ＫＵＮ ＮＳ３の発現を、これらのＲＮＡが複製することができる場合にＩＦによってのみ検出することができる（２６、２７）。しかし、ＫＵＮｃＤＮＡをコードするプラスミドＤＮＡのトランスフェクションにより、ＫＵＮ ＲＮＡが複製不可能である場合でさえもＩＦによってＫＵＮタンパク質発現が検出された（３０）。トランスフェクトされたプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡＬｅｕＭｐｔおよびＤＮＡＰｒｏＭｐｔ）由来の細胞中で産生されたレプリコンＲＮＡが確実に複製されるために、ＫＵＮ特異的放射性標識ｃＤＮＡプローブを使用したノーザンブロット分析によって全細胞ＲＮＡを分析した（図２Ａ）。これらのサンプル中の放射性シグナルの強度と同量のコントロールプラスミドＤＮＡｐＫＵＮβｒｅｐ２（ｄＧＤＤ）産生複製欠損ＫＵＮレプリコンＲＮＡ（５３）によりトランスフェクトされた細胞から単離したＲＮＡサンプル中で検出された強度との比較は、ｐＫＵＮβｒｅｐ２（ｄＧＤＤ）をトランスフェクトされた細胞よりもＤＮＡＬｅｕＭｐｔおよびＤＮＡＰｒｏＭｐｔをトランスフェクトされた細胞で約５〜１０倍量のＫＵＮ特異的ＲＮＡが産生されたことを示した。レプリコンコンピテントおよび複製欠損ＫＵＮ ＤＮＡベースのレプリコン構築物を使用した以前の研究により、ＲＮＡの蓄積量の類似の相違が示された（５３）。これらの結果は、細胞中にトランスフェクトされたプラスミドＤＮＡ（ＤＮＡＬｅｕＭｐｔおよびＤＮＡＰｒｏＭｐｔ）から産生されたレプリコンＲＮＡは複製能力があることを証明した。インビトロ合成ＲＮＡ（ＲＮＡＬｅｕＭｐｔおよびＲＮＡＰｒｏＭｐｔ）と共にエレクトロポレーションを行った細胞から単離した全ＲＮＡのＫＵＮ特異的ｃＤＮＡプローブを使用したノーザンブロット分析（図２Ｂ）によりＩＦの結果（図２Ａ）が確認され、まとめると、これらにより、トランスフェクトされた細胞中におけるＫＵＮレプリコンＲＮＡの有効な複製および蓄積が証明された。ＤＮＡトランスフェクトサンプルよりもＲＮＡトランスフェクトサンプルの方が２回以上の細胞全ＲＮＡをゲル上にロードしていることおよびゲルの臭化エチジウム染色によって対応する（ＲＮＡトランスフェクトまたはＤＮＡトランスフェクト）サンプル中のリボゾームＲＮＡ濃度は類似していたことに留意のこと（データ示さず）。

細胞中のレプリコンＲＮＡの複製中にＭｐｔ配列が保持されるかを試験するために、同一のＲＮＡサンプルを含むメンブレン（図２Ｂの左のパネル）を、Ｍｐｔ配列に特異的な放射性標識ｃＤＮＡプローブで再探索した。結果（図２Ｂ中の右のパネル）は、ＫＵＮ特異的プローブを使用して得た結果（図２Ｂ中の左のパネル）と同一であり、トランスフェクトされた細胞中のＫＵＮレプリコンＲＮＡの増幅中にＭｐｔ配列が実際に保持されていることが明らかに証明された。

ＬｅｕおよびＰｒｏを含む構築物を作製する目的は、ＫＵＮレプリコンＲＮＡの複製および蓄積ならびにそれによるインビトロおよびインビボでの両方でコードされたＨＧの発現レベルに対するＫＵＮ ＮＳ１遺伝子中のアミノ酸２５０位でのこの変異の可能な効果を評価することであった。ＫＵＮ ＮＳ１中のアミノ酸２５０位でのＰｒｏ（野生型）のＬｅｕへの変異によりＮＳ１タンパク質の二量体化が欠損することが以前に示されていた。これは、Ｖｅｒｏ細胞でのウイルス複製の遅延およびマウスでのウイルス複製の減衰に起因していた（１６）。等量のＬｅｕおよびＰｒｏ含有ウイルスによるＶｅｒｏ細胞の感染により、最初の２４時間で約１／１００未満のＬｅｕ含有ウイルスが産生されるが、感染から４８時間後に類似の収率のＬｅｕおよびＰｒｏ含有ウイルスが得られた。インビボ実験では、マウスにおける類似の疾患の臨床症状を得るために約１００倍のＬｅｕ含有ウイルスが必要であった（１６）。ＫＵＮ−Ｍｐｔレプリコン構築物を使用した現在の研究では、ＤＮＡベースのＬｅｕおよびＰｒｏ含有レプリコン構築物によりトランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞中のＫＵＮ ＲＮＡの蓄積量は類似していたが（図２ＢのＤＮＡＬｅｕＭｐｔレーンとＤＮＡＰｒｏＭｐｔレーンとを比較）、インビトロ転写したＲＮＡによるトランスフェクションではＰｒｏ含有ＲＮＡよりもＬｅｕ含有ＲＮＡでトランスフェクションした細胞中のＲＮＡ蓄積レベルが僅かに高かった（図２ＢのＲＮＡＬｅｕＭｐｔとＲＮＡＰｒｏＭｐｔとを比較）。上記のように、臭化エチジウム染色で判断したところ、対応するサンプル中のリボゾームＲＮＡ量は類似していた。ＲＮＡＬｅｕＭｐｔ ＲＮＡのトランスフェクションによってもＩＦ分析においてＮＳ３陽性細胞の産生が僅かに高くなった（図２Ａ）。明らかに、ＲＮＡＬｅｕＭｐｔ ＲＮＡによるトランスフェクション後よりもＲＮＡＰｒｏＭｐｔ ＲＮＡによるトランスフェクション後に有意に多数の丸い（死）ＮＳ３陽性細胞が認められ（図２Ａ）、これにより、元のＲＮＡのより高い細胞変性が示唆される。対応するＫＵＮレプリコンベクターであるＲＮＡ ＲＮＡＰｒｏおよびＲＮＡＬｅｕのトランスフェクション後にＰｒｏとＬｅｕ含有変異型との間の類似の相違も認められた（データ示さず）。

［ポリトープ免疫原を発現するＤＮＡ−、ＲＮＡ−、およびＶＬＰベースのＫＵＮレプリコンによる免疫化後のＣＴＬ応答の誘導］
マウスポリトープ免疫原（Ｍｐｔ）は、Ｈ−２ｄで制限された４つの結合ＣＴＬエピトープを含み、これらには、ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ（マウスサイトメガロウイルスｐｐ８９由来のＨ−２Ｌｄ制限エピトープ）、ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ（ＬＣＭＶ核タンパク質由来のＨ−２Ｌｄ制限エピトープ）、ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ（インフルエンザウイルス核タンパク質由来のＨ−２Ｋｄ制限エピトープ）、およびＳＹＩＰＳＡＥＫＩ（Ｐ．Ｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイト周囲タンパク質由来のＨ−２Ｋｄ制限エピトープ）が含まれる。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、Ｍｐｔ免疫原をコードするＫＵＮレプリコンＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＶＬＰにより１回免疫し、２〜３週間後、４つの各ＣＴＬペプチドエピトープのＣＴＬ応答をＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴを使用して測定した（図３Ａ）。ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＶＬＰ ＫＵＮワクチンによって得られたＥＬＩＳＰＯＴ応答は、同一のポリトープ免疫原をコードする組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶＭｐｔ）によって誘導されたものと類似しており（図３Ａ）、同一の免疫原をコードする従来のＤＮＡワクシニアによって誘導されたものよりも有意に高かった（図４を参照のこと）（３１）。ＲＰＱ特異的応答はＹＰＨ応答を支配し、ＳＹＩ応答がＴＹＱ応答を支配するというエピトープ応答のヒエラルキーが以前に認められており、劣位エピトープのより低いＭＨＣ結合親和性を反映すると考えられている（３１）。Ｐｒｏ含有レプリコンはトランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞中でＬｅｕ含有レプリコンよりも細胞変性が高いようであるが（前の節を参照のこと）、ＣＴＬ応答誘導においてこれらの変異型の間に有意差は認められなかった（図３Ａおよび図４を参照のこと）。

ＶＬＰＰｒｏＭｐｔにより１回免疫されたマウスも、⁵¹Ｃ放出アッセイによってＣＴＬ応答の誘導についてアッセイした。各エピトープに特異的な有意なＣＴＬ活性が認められた（図３Ｂ）。これらの応答もｒＶＶＭｐｔにより１回免疫したマウスで以前に認められたものに類似しており（５１）、ポリトープ免疫原をコードする従来のＤＮＡワクチンにより２回免疫化したマウスで以前に認められたものよりも高かった（５０）。

１０倍連続希釈のＤＮＡベースのＫＵＮポリトープレプリコンＤＮＡＬｅｕＭｐｔおよびＤＮＡＰｒｏＭｐｔによるマウスの免疫化により、たった０．１μｇのＫＵＮレプリコンＤＮＡによる１回の免疫化後にＣＴＬ応答が依然として検出可能であることが例示された（図４）。０．１μｇのＫＵＮワクチンに誘導されたＣＴＬ応答の規模は、１００μｇの従来のプラスミドＤＮＡ−ポリトープワクチンによる免疫によって誘導されたものに匹敵した（図４）。

この節で示したデータは、任意の３つの異なるモダリティ（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＶＬＰ）によって送達されたＫＵＮレプリコンベースのワクチンがＣＴＬを有効に誘導することができ、組換えワクシニアウイルスベースのベクターに類似の規模であり且つ従来のＤＮＡワクチンよりも有意に高い応答を示すことを例示する。

［ポリトープをコードする裸のＲＮＡまたはＶＬＰによる免疫化によりウイルスおよび腫瘍チャレンジからマウスが防御される］
ＫＵＮレプリコンベクターによる免疫化によって誘導されたＣＴＬ応答がウイルスチャレンジを防御することができるかどうかを決定するために、マウスにＲＮＡＬｅｕＭｐｔ ＲＮＡまたはＲＮＡＬｅｕＣｏｎｔｒｏｌ ＲＮＡ（ＲＮＡＬｅｕベクターＤＮＡから調製）で１回ワクチン接種し、その後、ｒＶＶＭｐｔでチャレンジを行った。ｒＶＶＭｐｔチャレンジアッセイにより、ＫＵＮワクチンによって提示された４つ全てのＨ−２ｄ制限エピトープによって媒介された防御を測定した。ＲＮＡＬｅｕＭｐｔ ＲＮＡによる１回のワクチン接種後、卵巣ｒＶＶタイターで有意な減少（約７０％）が認められた（図５Ａ、ｐ＝０．０３）。従来のＤＮＡポリトープワクチンを使用しても類似の保護が得られたが、２回の免疫化後に限られる（５０）。

Ｍｐｔ配列はまた、オボアルブミン由来ＣＴＬエピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）（５０、５１）をコードし、オボアルブミンを発現するＢ１６腫瘍細胞（Ｂ１６−ＯＶＡ）によるチャレンジを使用したＫＵＮワクチン接種後の腫瘍防御を試験した。マウスをＲＮＡＬｅｕＭｐｔおよびＲＮＡＬｅｕＣｏｎｔｒｏｌで２回またはｒＶＶＭｐｔにより１回免疫し、Ｂ１６−ＯＶＡでチャレンジした。ＲＮＡＬｅｕＣｏｎｔｒｏｌ免疫化動物と比較してＲＮＡＬｅｕＭｐｔ免疫化マウスで有意に遅い腫瘍成長速度が認められた（ｐ＜０．００１）（図５Ｂ、上のグラフ）。さらに、ＲＮＡＬｅｕＭｐｔ免疫化マウスの平均腫瘍成長速度は、ｒＶＶＭｐｔによる免疫化後のものよりも低かった（ｐ＝０．００１）。表示の測定点におけるマウスの生存率を示すカプラン−マイヤー生存曲線（図５Ｂ、下のグラフ）でも同一の実験を示す。また、ＲＮＡＬｅｕＭｐｔ免疫化マウスは、ＲＮＡＬｅｕＣｏｎｔｒｏｌ免疫化マウス（ｐ＝０．０１５）およびｒＶＶＭｐｔ免疫化動物（ｐ＝０．０１６）よりも有意に良好であった。

図５Ｃに関して、データは、ＶＬＰＬｅｕＭｐｔによる免疫化によって裸のＲＮＡによる免疫化と比較してＢ１６−ＯＶＡ腫瘍チャレンジ由来の免疫化マウスの生存が非常に増大したことを示す。２回のＶＬＰ免疫化（ＶＬＰＬｅｕＭｐｔ×２）を受けたマウスは１回のＶＬＰ免疫化を受けたマウスと比較して生存率が多少改良されたことも留意される（ＶＬＰＬｅｕＭｐｔ×１）。

［改変されたウイルスパッケージング系の作製および評価］
３つの異なるアプローチを使用して、パッケージング効率を改良してパッケージングプロトコールを簡単にするために国際公開ＷＯ９９／２８４８７号に記載の以前に開発したクンジンレプリコンＲＮＡパッケージング系を改変した。

（ｉ）第１のアプローチは、アミノ酸７１３のロイシンからプロリンへの変異（ＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ；図７）の導入によって細胞変性を減少させるためにＳＦＶ由来パッケージング構築物ＳＦＶ−ＭＥＣ１０５の改変を含んでいた。これにより、ＳＦＶ ＲＮＡ複製に悪影響を与えることなくクンジン構造遺伝子の発現が延長され、クンジンとＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ ＲＮＡとの同時トランスフェクションによってパッケージングプロトコールが単純になった。結果を、表１および２に示す。クンジンとＳＦＶ−ＭＥＣ１０５ ＲＮＡとの同時トランスフェクションを使用する以前の試みでは、クンジンＲＮＡ複製が完全に阻害された。

（ｉｉ）第２のアプローチは、改変された非細胞変性ＳＦＶレプリコンＲＮＡからクンジン構造タンパク質が持続的に産生される安定な細胞株の作製を含んでいた。これを達成するために、本発明者らは、ＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ構築物にＩＲＥＳ−Ｎｅｏカセットを挿入し（ＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ／Ｎｅｏ；図８）、抗生物質Ｇ４１８による選択によって安定に発現する細胞クローンを確立した。クンジンレプリコンＲＮＡによるこの細胞株のトランスフェクションによって複製されて、比較的高タイターのクンジンＶＬＰが産生された（表３および４）。

（ｉｉｉ）第３のアプローチは、クンジン構造タンパク質を発現するためにトランスフェクトされたＳＦＶヘルパーＲＮＡ（ｐＳＦＶＨｅｌｐｅｒｐｒＭＥＣ（図１０）およびｐＳＦＶＨｅｌｐｅｒＣｐｒＭＥ（図１１））の増幅に使用するための非細胞変性ＳＦＶレプリコンＲＮＡであるｐＳＦＶ３Ｌ７１３ＰＬａｃＺＮｅｏ（図９）を安定に発現する細胞株を作製することであった。これらのヘルパーＲＮＡのいずれかを、クンジンレプリコンＲＮＡと共にｐＳＦＶＬ７１３ＰｌａｃＺＮｅｏ細胞株にトランスフェクトし、ＳＦＶヘルパーＲＮＡおよびＫＵＮレプリコンＲＮＡの両方を増幅し、これにより比較的低タイターであるが分泌されたクンジンＶＬＰが産生される（表５）。

［細胞変性と非細胞変性ＳＦＶ由来のパッケージング構築物との間のクンジンＶＬＰ産生の有効性の比較］
最初に、ＢＨＫ２１細胞を、ＲＮＡＬｅｕＭｐｔなどの構築物から転写されたクンジンレプリコンＲＮＡ（異種遺伝子を含む）によりエレクトロポレーションした。３２時間後、これらのクンジンＲＮＡによりトランスフェクトされた細胞を、ｐＳＦＶＭＥＣ１０５またはｐＳＦＶＭＥＣＬ７１３Ｐをそれぞれ転写された細胞変性（ｃｙｔｏ）または非細胞変性（ｎｏｎｃｙｔｏ）セムリキ森林熱ウイルスＲＮＡによりエレクトロポレーションした。次いで、表１に示した第２のトランスフェクション後の異なる時間で分泌ＶＬＰを含む組織倍溶液を回収した。

あるいは、クンジンレプリコンＲＮＡおよび非細胞変性ＳＦＶ ＲＮＡを、同時にＢＨＫ２１細胞にトランスフェクトし、表２に示した種々の時間間隔で組織培養液を回収した。

表１および２に示した異なるクンジンＲＮＡ：ＳＦＶ ＲＮＡ比を使用して、ＶＬＰ発現レベルの至適化を補助したことも留意すべきである。

［クンジンレプリコンＲＮＡによるトランスフェクション後の改変非細胞変性ＳＦＶ由来のパッケージング構築物由来のクンジン構造タンパク質を発現する安定な細胞株におけるクンジンＶＬＰ産生］
安定な細胞株ＳＦＶＭＥＣＡ１２は、ＶＬＰ産生のために非細胞変性ＳＦＶレプリコンからクンジン構造タンパク質を発現した。この細胞株は、クンジン構造タンパク質をコードする非細胞変性ＳＦＶレプリコンを発現した。この細胞株を確立するために、ＢＨＫ２１細胞株をＳＦＶＭＥＣＬ７１３ＰＮｅｏ ＲＮＡによりトランスフェクトし（図８）、１つのクローン（Ａ１２）を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地におけるインキュベーションによって選択した。次いで、この細胞クローンを、ＨＩＶ ＧＡＧまたはマウスポリトープ（Ｍｐｔ）などの異種遺伝子をコードするクンジンレプリコンＲＮＡによるエレクトロポレーションによって評価した。クンジンレプリコンＲＮＡによるエレクトロポレーション後、異なる測定点で組織培養液を回収し、感染アッセイおよび免疫蛍光によってＶＬＰのタイターを計算した（表３）。

さらなる実験によりＶＬＰ産生に対する種々の温度のインキュベーションの効果を評価した。すわなち、クンジンレプリコンＲＮＡによるＳＦＶＭＥＣＡ１２細胞のエレクトロポレーション後、細胞を、３７℃、３３℃、または３７℃／３３℃（３７℃で一晩、その後トランスフェクション後から５０時間後まで３３℃）でインキュベートした（表４）。

［クンジン構造タンパク質を発現するＳＦＶＨｅｌｐｅｒＲＮＡおよびクンジンレプリコンＲＮＡによる同時トランスフェクション後の非細胞変性ＳＦＶレプリコンを発現する安定な細胞株におけるクンジンＶＬＰの産生］
非細胞変性ＳＦＶレプリコンおよびＬａｃＺ遺伝子を発現する安定な細胞株を、構築物ｐＳＦＶ３Ｌ７１３ＰｌａｃＺＮｅｏを使用して確立した。この細胞株Ｌ７１３Ｐ変異、コードされたＮｅｏおよびＬｅｃＺ遺伝子を有する非細胞変性ＳＦＶレプリコンを発現した。これらの細胞内における発現のレベルおよび均一性を、ＬａｃＺ発現によってモニターした。さらなるＶＬＰ産生分析のためにこれらの異なるクローンを選択した（すなわち、クローン番号Ｃ５、Ｃ６、およびＣ１１）。各細胞クローンを、クンジンレプリコンＲＮＡおよび２つのＳＦＶ−クンジンヘルパーＲＮＡの１つと同時にエレクトロポレーションした。クンジンレプリコンＲＮＡは、ＨＩＶ ＧＡＧまたはマウスポリトープ（Ｍｐｔ）などの異種遺伝子をコードした。ＳＦＶ−クンジンヘルパーＲＮＡは、１つの２６Ｓプロモーター（ｐＳＦＶＨｅｌｐｅｒＣｐｒＭＥ；図１０）の調節下でクンジンＣｐｒＭＥ遺伝子カセットをコードするか、ｐＳＦＶＨｅｌｐｅｒ２ベクターにクローニングされた２つの異なる２６Ｓプロモーター（ｐＳＦＶＨｅｌｐｅｒｐｒＭＥＣ；図１１）の調節下でクンジンｐｒＭＥおよびＣ遺伝子をコードした。次いで、組織培養液を、トランスフェクションから２８時間および４５時間後に回収し、粒子産生レベルを試験した（表５）。

［材料と方法］
［プラスミド］マウスユビキチン遺伝子上流およびクローニング部位のＦＭＤＶ２Ａ自己プロテアーゼ配列下流を含むＲＮＡベースおよびＤＮＡベースのＫＵＮレプリコンベクター（それぞれＣ２０ＵｂＨＤＶｒｅｐおよびｐＫＵＮｒｅｐ１）を、ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子を含むプラスミドの構築のために使用した。本質的に、完全なＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子を、プライマーｇａｇＢｓｓＨＩＩ−Ｆ（５’−ＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＡＴＣＧＧＴＡＴＴＡ−３’）およびｇａｇＢｓｓＨＩＩ−Ｒ（５’−ＣＴＡＡＡＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＴＧＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣ−３’）を使用したＰＣＲによってプラスミドｐＢＲＤＨ２−ｎｅｏから増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を、ＢｓｓＨＩＩで消化し、２つのＫＵＮベクターのＡｓｃＩ部位に挿入して、プラスミドＫＵＮＲＮＡｇａｇおよびＫＵＮＤＮＡｇａｇをそれぞれ産生した。

ＫＵＮｇａｇ ＶＬＰの調製。３×１０⁶個のＢＨＫ２１細胞を約３０μｇのインビトロ転写ＫＵＮｇａｇＲＮＡでエレクトロポレーションすること以外は、本質的に前に記載のようにＶＬＰを調製した。エレクトロポレーションから３２時間後、細胞をトリプシン処理し、ｎｓＰ２遺伝子中にロイシン７１３からプロリンへの置換を含む構築物ＳＦＶＭＥＣ１０５、ＳＦＶＬ７１３ＰＭＥＣの低細胞変性形態由来のインビトロ転写ＲＮＡを使用して第２のエレクトロポレーションに供した。第２のエレクトロポレーション後、細胞を３７℃で１８時間インキュベートし、その後培地を６ｍｌのＤＭＥＭ−５％ＦＣＳと置換し、細胞を３３℃でさらに３０時間インキュベートした。感染性ＶＬＰのタイターを、ＶＬＰの１０倍連続希釈物によるＶｅｒｏ細胞の感染および感染から３０〜４０時間後のＩＦ分析によるＮＳ３陽性細胞の計数によって決定した。

［マウスの免疫化］雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^d）マウス（６〜８週齢）を、Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｐｅｒｔｈ、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。マウスを、以下のうちの１つを用いて免疫した。（ｉ）ＤＭＥＭ−５％ＦＣＳ中のｇａｇＶＬＰをマウスあたり約１×１０⁶感染単位で腹腔内（ｉ．ｐ）注射することおよび（ｉｉ）ＨＩＶ−１ｇａｇをコードする組換えワクシニアウイルス（１０⁷ｐｆｕを含む２００μｌのＲＰＭＩ１６４０のｉ．ｐ．注射）。

［間接的ＥＬＩＳＡ］９６ウェルプレートを、抗原コーティング緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ₂ＣＯ₃、３５ｍＭ ＮａＨＣＯ₃、ｐＨ９．６）中で４℃にて一晩１μｇの精製組換えｐ５５抗原でコートした。次いで、ウェルを、５０μｌのブロッキング緩衝液（０．２５％ゼラチン／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）との３７℃で１時間のインキュベーションによってブロックし、洗浄緩衝液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。ブロッキング緩衝液で希釈した免疫化マウス由来の血清サンプルを、室温で１〜２時間インキュベートし、３回洗浄した。ブロッキング緩衝液で２０００倍に希釈した二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合ヤギ抗マウスＩｇＧ）を室温で３０分間インキュベートした。３回洗浄後、結合した抱合体を、５０μｌのＫ−Ｂｌｕｅ ＴＭＢ基質（Ｇｒａｐｈｉｃ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）との室温の暗所で１０分間または発色するまでのインキュベーションによって発色させた。次いで、５０μｌの２Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄の添加によって反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用してＯＤ₄₅₀での吸光度の読取りを同定した。

［クンジンＶＬＰ中和アッセイ］キャプシド形成ＫＵＮベクターレプリコンＲＮＡ（５×１０⁵ＩＵ）を含む２００μｌのＫＵＮ ＶＬＰを、ＥＬＩＳＡによって最も高いｇａｇ抗体タイターを示したＫＵＮｇａｇ ＶＬＰ免疫化マウス由来の２０μｌの３つ異なる血清サンプルと３７℃で１時間インキュベートした。アッセイの正および負のコントロールとして抗体ではなくＫＵＮ抗Ｅモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を使用した同一の条件下でＶＬＰもインキュベートした。インキュベーション後、各サンプルの希釈物によるＶｅｒｏ細胞の感染によって各サンプルのタイターを決定した。次いで、ＫＵＮ抗ＮＳ３抗体を使用してＩＦ分析を行い、陽性の病巣を計数し、タイターを計算した。

［ワクシニアウイルス防御アッセイ］６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝５〜６）を、（ｉ）約１０⁶ＩＵ／マウスのＫＵＮｇａｇＶＬＰを１回および２回（４週間間隔）免疫し、３週間後、１０⁷ＰＦＵ／マウスのＨＩＶ−１ｇａｇをコードする組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶｇａｇ（１４））により腹腔内チャレンジを行った。感染４日後、両卵巣を取り出し、洗浄し、電動グラインダーを使用して１ｍｌのＰＢＳ中でホモジナイズした。卵巣懸濁物中のワクシニアウイルスタイターを、集密なＣＶ１細胞に対するプラークアッセイによって決定した。実験群とコントロール群との間のウイルスタイターの有意差を、ウィルコクスンの順位和検定を使用して計算した。

［ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答の測定］雌Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２^d）マウス（６〜８週齢）を、Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｐｅｒｔｈ、ＷＡ）から入手した。マウス（ｎ＝４）を、ＫＵＮｇａｇＶＬＰにより１回腹腔内に免疫するか（ＫＵＮｇａｇＶＬＰ）、免疫しなかった（未処理）。免疫から２週間後、マウスの脾臓細胞（ｇａｇ）または培地のみ（Ｍｅｄｉａ）を選択し、１８時間にわたって³Ｈチミジンでパルスした。グラスファイバー上に細胞を回収し、交配し、β波放出を測定した。ｇａｇパルスした天然の脾臓細胞を、アッセイ前日に調製し、未処理マウス由来の脾臓細胞をＲＢＣ溶解緩衝液で処置し、インビトロで２μｇ／ｍｌのＨＩＶ−１ｇａｇタンパク質で一晩パルスした。

［結果］
［ＨＩＶ−１ｇａｇを発現するＫＵＮレプリコンによる免疫後のＨＩＶ Ｇａｇタンパク質に対する抗体応答の誘導］
ＫＵＮｇａｇ ＶＬＰ（１０⁶ＩＵ／マウス）で２回またはＨＩＶ−１ｇａｇをコードする組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶｇａｇ；１０⁷ＰＦＵ／マウス）で１回免疫したマウス由来の血清を、ｇａｇに対する抗体の存在について試験した。ｇａｇＶＬＰにより免疫化したマウス８匹のうちの６匹およびｒＶＶｇａｇにより免疫化したマウス４匹のうち３匹が免疫化に対して応答し、これらのマウスで有意なタイター（１２８００倍超）の抗ｇａｇ抗体が検出された（図１２）。抗体応答は、ＫＵＮｇａｇ ＶＬＰおよびｒＶＶｇａｇ免疫化マウスで類似していた。

［中和抗体の非存在によりＫＵＮレプリコンＶＬＰによる免疫化後にＫＵＮ ＶＬＰタンパク質に対して応答する］
ＫＵＮｇａｇ ＶＬＰによる免疫化後にＫＵＮ ＶＬＰの表面上にディスプレイされたＫＵＮエンベロープタンパク質に対して任意の有意な中和抗体の応答が存在するかどうかを決定するために、キャプシド形成ＫＵＮベクターレプリコンＲＮＡを含むＫＵＮ ＶＬＰとのＫＵＮｇａｇＶＬＰ免疫化および非免疫化マウス由来の血清のインキュベーションによる感染力中和アッセイを行った。いかなる抗体ともインキュベートしなかったＫＵＮ ＶＬＰのタイターは、２．８×１０⁶ＩＵ／ｍｌであった。非免疫化マウス由来の３つの異なる血清とインキュベートしたＫＵＮ ＶＬＰの平均タイターは、２．１×１０⁶ＩＵ／ｍｌであった。ＫＵＮ ＶＬＰをＫＵＮ Ｅタンパク質に対するモノクローナル抗体とインキュベートした場合、感染力は認められなかった。ＫＵＮｇａｇＶＬＰで２回免疫化したマウス由来の３つの異なる血清とインキュベートしたＫＵＮ ＶＬＰの平均タイターは、６．３×１０⁵ＩＵ／ｍｌであった。非パラメータの対応のないマン−ホイットニーの検定は、ＫＵＮｇａｇＲＮＡ免疫化マウス由来の血清を使用して中和アッセイで得たＶＬＰタイターは非免疫化マウス由来の血清を使用して得たタイターと比較して有意差は認められないことを示した（ｐ＜０．１)。したがって、ＶＬＰ中に存在するＫＵＮタンパク質に対する有意な中和抗体応答は、ＫＵＮｇａｇＶＬＰによる２回の免疫化後に認められなかった。

［ＨＩＶ−１ｇａｇをコードするＫＵＮレプリコンによるＶＬＰ粒子免疫化は実験的ウイルスチャレンジからマウスを防御する］
ＫＵＮレプリコンベクターによる免疫化によって誘導されるＣＤ８⁺Ｔ細胞応答がウイルスチャレンジを防御することができるかを決定するために、６匹のマウス群を、ＫＵＮｇａｇＶＬＰで１回または２回免疫化するか、免疫化せず、その後ｒＶＶｇａｇでチャレンジした。１回免疫化した群のマウス６匹のうちの３匹（５０％）および２回免疫化した群のマウス６匹のうちの４匹（６７％）でチャレンジされたウイルスが完全に存在せず（表１）、完全な防御を示す。ＫＵＮｇａｇＶＬＰ×１群内の１匹は、非免疫化マウスとほとんど同一のチャレンジウイルスタイター（２×１０⁷）を有し、免疫化の失敗を示す。したがって、ＫＵＮｇａｇＶＬＰでの１回および２回免疫化後の残りの２匹の応答における平均タイターは、それぞれ６．７×１０⁶ＩＵ／ｍｌおよび１．３×１０⁵ＩＵ／ｍｌであり、１０⁷ＰＦＵのチャレンジウイルス（ｒＶＶｇａｇ）由来の１回または２回免疫化したマウスのウイルス複製が６ｌｏｇを超えて減少することを示す。本節で示した結果は、ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子をコードするＫＵＮレプリコンベースのワクチンによってＨＩＶ−１ｇａｇ特異的防御ＣＴＬ応答が誘導され、１回のＶＬＰ免疫化によって裸のＲＮＡでの２回免疫化よりもさらに有効に防御されることを証明した。

［ＨＩＶ−１ｇａｇをコードするクンジンＶＬＰは、ｇａｇ特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を誘発する］
ＨＩＶ−１ｇａｇに対する抗体産生がＣＤ４⁺Ｔ細胞によって得られるＴ細胞の援助を伴うかどうかを決定するための実験を行った。図１３に示したデータは、ＶＬＰｇａｇａ免疫化マウスについて、刺激指数（ＳＩ）は３．４であり、未処理マウスについてはＳＩはゼロに近いことを示す。これらのデータは、ＶＬＰｇａｇが免疫化マウス中で特異的なＣＤ４Ｔ細胞応答を誘導することを証明する。

［長期防御ＣＤ８Ｔ細胞応答の誘導］
［方法］
［ＶＬＰの調製］３×１０⁶ＢＨＫ２１細胞を約３０μｇのインビトロ転写ＫＵＮｇａｇＲＮＡでエレクトロポレーションを行うこと以外は、本質的に前記のようにＶＬＰを調製した。エレクトロポレーションから３２時間後、細胞をトリプシン処理し、ＫＵＮ構造タンパク質（ＳＦＶ−ＭＥＣ１０５のＬ７１３ＰＭＥＣ１０５誘導体；引例２８）をコードするインビトロ転写された非細胞変性セムリキ森林熱ウイルスレプリコンＲＮＡを使用した第２のエレクトロポレーションに供し、４８時間インキュベートし、分泌されたＶＬＰを回収した。感染性ＶＬＰのタイターを、ＶＬＰの１０倍連続希釈物によるＶｅｒｏ細胞の感染および感染から３０〜４０時間後のＩＦ分析によるＮＳ３陽性細胞の計数によって決定した。

マウスの免疫化。雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２^d）マウス（６〜８週齢）を、Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｐｅｒｔｈ、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。マウスを、以下のうちの１つを用いて免疫化した。（ｉ）１００μｇのＫＵＮｇａｇＤＮＡを１００μｌＰＢＳで希釈し、各後肢の大腿四頭筋に筋肉内（ｉ．ｍ．）注射する（各脚あたり５０μｌ）、（ｉｉ）約３０μｇのインビトロ転写ＫＵＮｇａｇＲＮＡを１００μｌのジエチルピロカルボン酸処理ＰＢＳに溶解し、ｉ．ｍ．で注射する（各脚あたり５０μｌ）、（ｉｉｉ）ＫＵＮｇａｇＶＬＰを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）−５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を約１×１０⁶感染単位／マウスで腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射した、（ｉｖ）４つのＨ−２ｄ制限エピトープ（ＹＰＨＦＭＰＴＭＬ（ＹＰＨ）、ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ（ＲＰＱ）、ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ（ＴＹＱ）、およびＳＹＩＰＳＡＥＫＩ（ＳＹＩ）（６０））を含むマウスポリトープ（ＫＵＮｍｐｔ ＶＬＰ）をコードするＫＵＮ ＶＬＰを（ｉｉｉ）のように注射した、（ｖ）ＨＩＶ−１ｇａｇをコードするＨＩＶ−１ｇａｇ（ＷＲ ＴＫ）をコードする組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶｇａｇ）（２×１０⁷ｐｆｕを含む２００μｌのＰＢＳのｉ．ｐ．注射）。

［ＥＬＩＰＯＴおよびクロム放出アッセイ］エピトープ特異的ＩＦＮγ分泌ＣＤ８Ｔ細胞を、以前に記載されたように（３４）ペプチドエピトープ（Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ、Ｃｌａｙｔｏｎ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用した酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイによって計数した。対応のないスチューデントｔ検定を使用して群間の有意差を決定した。免疫化から２〜３週間後に屠殺したマウス由来の脾臓細胞を使用して⁵¹クロム（⁵¹Ｃｒ）放出アッセイを行い、脾臓細胞をＡＭＱＭＬＫＥＴＩペプチドで感作した（２５μｇ／ｍｌを含む２００μｌ培地中、３７℃で１時間、その後２回洗浄）照射ＬＰＳ芽細胞（応答物：刺激物質比は２０：１）にてインビボで６日間再刺激した。得られたエフェクター集団を分割し、ペプチド感作および非感作⁵¹Ｃｒ標識Ｐ８１５標的細胞に対して二連で同数を使用した（表示のエフェクター：標的比で）。

［ワクシニアウイルス防御アッセイ］６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ、Ｐｅｒｔｈ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）（ｎ＝６）を免疫化し、チャレンジする場合、コントロールマウスを１０⁶ｐｆｕ／マウスのＨＩＶ−１ｇａｇ（ｒＶＶｇａｇ）をコードする組換えワクシニアウイルス（ＷＲ ＴＫ）または同一用量のｒＶＶｍｐｔ（引例３１）によりｉ．ｐ．でチャレンジした。感染４日後、両卵巣を取り出し、洗浄し、アルミニウムメッシュを使用して１ｍｌのＰＢＳ中でホモジナイズした。次いで、卵巣ワクシニアウイルスタイターを、集密なＣＶ１細胞に対するプラークアッセイによって決定した。実験群とコントロール群との間のウイルスタイターの有意差を、非パラメータの対応のないｔ検定を使用して計算した。

［結果］
ＫＵＮｇａｇＶＬＰの１回の接種を用いてマウスを免疫化し、ＡＭＱ特異的応答を２週間および６ヵ月後のＥＬＩＳＰＯＴによって分析した。６ヶ月での応答は、２週間で認められた応答より有意な低下は認められず（ｐ＝０．７５、図１４Ａ）、ＫＵＮｇａｇＶＬＰワクチンによる長期ＣＤ８Ｔ細胞応答の誘導を示す。マウスポリトープ（４つのＨ−２ｄ制限ＣＤ８Ｔ細胞エピトープをコードするワクチン）をコードするＫＵＮ ＶＬＰ（ＫＵＮｍｐｔＶＬＰ）による免疫化後にＩＦＮγを分泌することができるエピトープ特異的ＣＤ８Ｔ細胞で類似の長期維持が認められた。本発明者らは、以前に、ＫＵＮｍｐｔＶＬＰによる免疫化から２〜３週間後のこれら４つのエピトープに対する応答を記載しており、ここでは６ヶ月後にこれらの応答が有意に減少しないことを示したことにより（図１４Ｂ）、ＣＤ８Ｔ細胞応答の長期維持はＡＭＱ特異的ＣＤ８Ｔ細胞に限定されないことが示された。さらに、ＫＵＮｍｐｔＶＬＰで１０ヶ月前に免疫化していたマウスに同一の４つのエピトープをコードする組換えワクシニアウイルスでチャレンジした場合、実質的な防御が依然として明らかであった（図１４Ｃ）。ＫＵＮｍｐｔＶＬＰ免疫化マウスは、コントロールマウスと比較して卵巣タイターにおいて平均して約１／１２０であり（ｐ＝０．０１５）、ＫＵＮｍｐｔＶＬＰ免疫化マウスの８３％がチャレンジウイルスを完全に含まなかった。

［ＢＨＫ細胞における持続的複製に適応したＫＵＮレプリコン変異体の選択］
持続的に複製するＫＵＮレプリコンＲＮＡを保有するピューロマイシン耐性ＢＨＫ細胞クローンの選択。ＢＨＫ２１細胞を、ＮＳ１中の２５０位にＰｒｏを含む野生型ＫＵＮ ｃＤＮＡ配列と同一のインビトロ転写ｒｅｐＰＡＣβ−ｇａｌ ＲＮＡでエレクトロポレーションした（引例１６）。５μｇ／ｍｌピューロマイシンを含む培地中で７日間のインキュベーションによってピューロマイシン耐性細胞クローンを確立した。各細胞クローンを選択し、ピューロマイシン含有培地中で４世代増殖させた。Ｘ−ｇａｌ染色で検出したところ、細胞は１００％β−ｇａｌ陽性であり、異なる細胞クローンのβ−ｇａｌ発現を、β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって決定した。異なる細胞クローンで広範なβ−ｇａｌ発現レベルが認められた（図１５）。異なる発現レベルを示す２つの対照的なクローンである番号１１および番号２０を、ＫＵＮレプリコンＲＮＡの配列決定分析のために選択した。

［２つの選択された細胞クローン由来のＫＵＮレプリコンＲＮＡの適応変異の決定］ピューロマイシン耐性細胞クローン番号１１および番号２０由来のＫＵＮレプリコンＲＮＡを、Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、ＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、全ＫＵＮレプリコン配列（β−ｇａｌ遺伝子以外）を、ＢｉｇＤｙｅ配列決定キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用した配列決定分析によって決定した。１つの適応変異は、クローン２０から単離したＫＵＮ ＲＮＡで見出され（ＮＳ２Ａ中のＡｓｎ１０１からＡｓｐ）、２つの適応変異は、クローン１１から単離されたＫＵＮ ＲＮＡで見出された（ＮＳ２Ａ中のＡｌａ３０からＰｒｏおよびＮＳ５中のＰｒｏ２７０からＳｅｒ）（表７）。

適応変異は、ＨＢＫ細胞中における持続的複製の確立に利点を付与する。クローン１１およびクローン２０から単離されたＫＵＮレプリコンＲＮＡ中で同定された適応変異は、部位特異的ＰＣＲ変異誘発によって元のｒｅｐＰＡＣβ−ｇａｌに個別に移入されて、ｒｅｐＰＡＣβ−ｇａｌ／ＮＳ２Ａ（Ａ−Ｐ）、ｒｅｐＰＡＣβ−ｇａｌ／ＮＳ２Ａ（Ｎ−Ｄ）、およびｒｅｐＰＡＣβ−ｇａｌ／ＮＳ５（Ｐ−Ｓ）が作製された。ＢＨＫ細胞を、野生型および変異ＲＮＡでエレクトロポレーションし、ピューロマイシン添加から４日後のピューロマイシン耐性細胞コロニー数の相違によって適応変異の効果を評価した（図１６）。図１６から証明されるように、変異を含むＲＮＡのトランスフェクションにより、野生型レプリコンよりも多数のピューロマイシン耐性細胞コロニーが選択され、ＮＳ２ＡにおけるＡｌａ３０のＰｒｏへの変異によってＢＨＫ細胞中の持続的複製に最も有効な適応が付与される。

同一の変異によってＨＥＫ２９３細胞中の持続的複製の確立が有利になることもまた本発明者らによって見出された。

［総括的考察］
本発明者らは、ＫＵＮレプリコンベクターが１回の免疫化後にコードされるモデル抗原に対してＣＴＬを誘導する能力を証明した。３つ全ての送達モダリティ（すなわち、裸のＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、およびＶＬＰ）は、ＣＤ８＋ＣＴＬ応答誘導で有効であった。裸のレプリコンＲＮＡおよびＶＬＰによる免疫化により、マウスはウイルスおよび腫瘍チャレンジからも保護された。これらの結果は、ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＣＤ４＋Ｔ細胞を含む防御Ｔ細胞応答の誘導のためのＫＵＮレプリコンベースのワクチンベクターの可能性を証明する。ＫＵＮレプリコンベクターを使用して得たＣＴＬ応答の規模は、組換えワクシニアウイルス（ＣＴＬ誘導に有効なベクターと広く見なされているワクチンベクターモダリティ）を使用して得られる規模に匹敵するかより大きかった（４４）。霊長類およびヒトで防御ＣＴＬを誘導する能力について多数のポックスウイルスワクチンベクターが現在試験されており、これらには、改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（４８）、トリ痘ウイルス（４３）、およびＡＬＶＡＣ（１５）が含まれる。

動物モデルにおける免疫応答の誘導のためにアルファウイルスレプリコンが広く使用されて降り、ＶＥＥウイルス由来のレプリコンがヒトでの前臨床試験で承認されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｐｈａｖａｘ．ｃｏｍ／ｐｐ＿ｉｎｈｏｕｓｅ．ｈｔｍｌ）。本明細書の結果は、以下の３つのモダリティによってＫＵＮレプリコンを送達することができることを示す。裸のＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、およびＶＬＰ。たった０．１μｇのＫＵＮ ＤＮＡベースのレプリコンによる免疫化でＣＴＬ応答の誘発に十分であった。１０００倍用量（１００μｇ）の従来のプラスミドＤＮＡワクチンによる免疫後しか類似のＣＴＬ誘導レベルは達成されなかった（図４）。

本発明の特定の態様は、ＲＮＡ免疫化に関する。裸のＲＮＡによる免疫化により、ＤＮＡ組み込みに関する問題が回避され、ＶＬＰによる免疫化を超えるさらなる利点を付与することができる。裸のＲＮＡと対照的に、ＶＬＰによる免疫化によってＶＬＰの構造タンパク質に対する中和抗体応答（回数を制限することができる現象）が誘導されるようであり、ＶＬＰを１つの個体で使用することができる。ＲＮＡベースのワクチンはまた、ＶＬＰよりも製造が容易である。最近の報告は、ＲＮＡを微粒子にカプセル化して遺伝子銃を使用した衝撃によって動物に送達させることができることを示唆している（３７、５４）。カプセル化ＲＮＡはまた、４℃で８〜１２ヶ月安定であることも示された。

本発明者らは、ＫＵＮレプリコンワクチンによるＲＮＡ免疫化によりＤＮＡベースまたはＶＬＰベースのＫＵＮレプリコンを使用した免疫化後に得られたものに匹敵する効率でコードされた免疫原に特異的なＣＴＬ応答が誘導されることを示した（図３Ａ）。ＫＵＮまたはＳＩＮレプリコンを使用したＲＮＡワクチン接種によっても異なる腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍保護が誘導される（図５Ｂ）（５８）。

Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓの１つの特徴は、安全なワクチンベクターとしてそのレプリコンの使用に有利であることを証明することができる。Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓは、一般に、異なるウイルスまたはウイルス株間での組換えの証拠は示されていなかった。ヘルパーとして欠損全長ＫＵＮ ＲＮＡおよびレプリコンＲＮＡを使用した本発明者らの以前の多数の相補性実験でも、両方のＲＮＡの広範で完全な相同領域が存在するにもかかわらず同一の細胞中で同時複製するこれらの２つの（全長およびレプリコン）ＲＮＡの間にいかなる組換えの証拠を示すことができなかった（引例２９にまとめる）。相同（黄熱病）または異種（デング熱）ウイルスのいずれか由来のヘルパーＮＳ１タンパク質を供給する場合に、ＮＳ１遺伝子が欠損した黄熱病ウイルスのＲＮＡを使用した相補性実験でも組換えウイルスが回収される組換えは検出されなかった（３４、３５）。Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓのこの特徴は、アルファウイルスＲＮＡの十分に報告された組換え能力（１８、４２、４６）と対照的であり、個体へのワクチン接種でさらなる安全レベルを得ることができ、免疫化の直前またはしばらくして同一または他のフラビウイルスで感染させることができる。さらに、ＫＵＮ構造タンパク質の発現および発現構築物の特定のデザインのために全く無関係のウイルス（ＳＦＶ）由来のレプリコンＲＮＡベースのベクターを使用したＫＵＮレプリコンパッケージング系の性質の違いによって、完全に安全であり且ついかなる感染性組換えウイルス材料を含まないＫＵＮ ＶＬＰ調製物が作製される（２８、５２）。

おそらくＫＵＮレプリコンの最も明らかな特徴の１つは、その複製により顕著な細胞変性効果（ＣＰＥ）またはアポトーシスを引き起こさないという点である（２６、５２、５３）。ワクチン抗原を含む感染細胞のＣＰＥまたはアポトーシスは、ワクチン抗原が樹状細胞（ＤＣ）に送達されてＣＴＬを有効に誘導する有効なクロスプライミング方法であることが報告された（２、５８）。しかし、インビトロで非常に低い／検出不可能なレベルの細胞変性しか示さないにもかかわらず（Ｌｅｕ含有変異型；図２Ａ）、ＫＵＮレプリコンは、マウスでＣＴＬ応答を有効に誘導した（図３および４）。さらに、トランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞による細胞変性の程度が異なるＫＵＮレプリコンベクターのＬｅｕおよびＰｒｏ含有変異体（図３および４）によってＣＴＬ誘導の有意差は認められなかった（図２Ａ）。したがって、ＫＵＮレプリコンによるＣＴＬ誘導は、アポトーシス媒介クロスプライミングに依存することができ、（５）そして／またはクロスプライミングは必要ないかもしれない。フラビウイルスはＤＣに直接感染、複製、および活性化することができることが示されており（１９、２１、２２、３２、５７）、ＫＵＮレプリコンもまた；ＤＣ中でワクチン抗原を複製および産生することができることが示唆される。ワクチンベクターによるＤＣの直接感染は、クロスプライミングよりも有効なＣＴＬ誘導ストラテジーを示し得る（４９）。リンパ指向性ＶＥＥレプリコン粒子およびＤＣ適応ＳＩＮレプリコン粒子は、ＤＣに感染してコードされたワクチン抗原を発現することができることが最近示された（１４、３６）。しかし、アルファウイルスレプリコンＲＮＡの細胞変性は、抗原提示ＤＣのアポトーシスを誘導し、ＣＴＬ活性または誘導を減少させることができる。対照的に、制限されたレベルの細胞変性を有するＫＵＮレプリコンによりアポトーシスを引き起こすことなくＤＣで抗原発現を延長することができる（ＣＴＬ応答の長期刺激に寄与することができる特徴）。危険なシグナルを誘導してＤＣを活性化させると考えられている二本鎖ＲＮＡの継続的存在によって耐性が誘導される可能性が低い（１３）。

ＫＵＮ ＶＬＰ免疫化のおそらくほとんどの印象的な結果は、４日間のｒＶＶチャレンジアッセイの範囲内でＩＦＮγの直接分泌および保護の媒介が可能な６〜１０ヶ月間のＣＤ８＋Ｔ細胞応答の持続である。ワクチン誘導記憶ＣＤ８Ｔ細胞プール由来の新規のエフェクターのチャレンジ後作製が非常に遅くて爆発的なレトロウイルス感染を有効に扱えないので、直接的防御活性が可能なエフェクターＣＤ８Ｔ細胞のこのような長期間の維持により、ＨＩＶに対する有効なワクチン接種の重要な特徴として出現し得る。

まとめると、ＫＵＮレプリコンは、長期の防御ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導のための有効なワクチンベクターであることが示され、がんおよびＨＩＶワクチンのための新規の魅力的なモダリティを示し得る。

明細書を通して、任意の１つの実施形態または特定の特徴の集まりに本発明が限定されることなく本発明の好ましい実施形態を説明することを目的とした。本発明の広い範囲および精神を逸脱することなく本明細書中に記載および例示の実施形態に対する種々の変形形態および修正形態を得ることができる。

本明細書中で言及した全てのコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許、および化学論文は、その全てが参照することにより本明細書中に組み込まれる。

［参考文献］

ＫＵＮレプリコン（Ａ）に基づくレプリコン遺伝子発現および送達系ならびにマウスポリエピトープ（Ｍｐｔ）をコードするＫＵＮレプリコン構築物（Ｂ）の略図である。（Ａ）ＫＵＮレプリコンＲＮＡを、バクテリオファージＳＰ６プロモーターを組み込んだプラスミドＤＮＡからインビトロで転写し、トランスフェクションまたは注入（２６、２５）を介して裸のＲＮＡとして送達することができる。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを組み込んだトランスフェクトまたは注入したプラスミドＤＮＡから、細胞ＲＮＡポリメラーゼＩＩによってインビボで合成することもできる（５３）。さらに、ＫＵＮレプリコンＲＮＡを、以前に記載されたパッケージング系（２８）を使用してウイルス様粒子（ＶＬＰ）に最初にパッケージングし、その後感染によって送達させることができる（５２）。送達様式に関係なく、一旦細胞質に送達されると、ＫＵＮレプリコンＲＮＡは自己複製を開始して多数のＲＮＡコピーを産生し、その翻訳によってコードされた異種遺伝子（ＨＧ）産物の産生が増強される。ＣＡＰは、有効な翻訳を確実に開始するためにインビトロ転写時に合成的にまたはインビボ転写時に天然にまたはＫＵＮ ＲＮＡ複製のいずれかでレプリコンＲＮＡ分子の５’末端に付加したキャップ構造を示す。（Ｂ）ＫＵＮレプリコン構築物は、ＫＵＮ ＲＮＡ複製に必要な配列（すなわち、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＫＵＮ Ｃタンパク質の最初の２０個のアミノ酸（Ｃ２０）およびＫＵＮ Ｅタンパク質の最後の２２個のアミノ酸（Ｅ２２）をコードする配列、ならびにＫＵＮ非構造タンパク質ＮＳ１（ＮＳ１として示す）、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５（ＮＳ２−ＮＳ５として示す）をコードする全非構造領域）を含む。さらに、構築物は、インビトロまたはインビボＲＮＡ転写をそれぞれ駆動するためのＫＵＮ ５’ＵＴＲのＳＰ６またはＣＭＶプロモーター上流のいずれか、ならびに有効な複製の開始のために正確な３’末端を有するＫＵＮレプリコンＲＮＡ分子の産生を確実にするために３’ＵＴＲの下流に挿入されたデルタ肺炎ウイルスリボザイム（ＨＤＶｒ）のアンチゲノム配列およびシミアンウイルス４０由来のポリアデニル化シグナル（ｐＡ）を含む。ＫＵＮ Ｃ２０およびＥ２２ペプチドからＭｐｔペプチドを細胞質放出させるために、構築物は、口蹄疫ウイルスの２Ａ自己プロテアーゼ（ＦＭＤＶ２Ａ）の２つのコピー（一方はＭｐｔ配列の上流であり、他方は下流である）を含む。ＰｒｏおよびＬｅｕ変異型は、それぞれＫＵＮ ＮＳ１遺伝子中の２５０位にアミノ酸ＰｒｏまたはＬｅｕを含む。 トランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞におけるマウスポリトープをコードするＫＵＮレプリコン構築物の複製の証拠を示す図である。（Ａ）ＭｐｔをコードするＤＮＡベースまたはＲＮＡベースＫＵＮレプリコンによりトランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞のＩＦ分析。カバーガラス上の細胞を、ＫＵＮレプリコンポリトープＤＮＡ（ＤＮＡＬｅｕＭｐｔおよびＤＮＡＰｒｏＭｐｔ）またはＲＮＡ（ＲＮＡＬｅｕＭｐｔおよびＲＮＡＰｒｏＭｐｔ）によりトランスフェクトし、ＩＦによってトランスフェクションから４８時間後のＫＵＮ ＮＳ３タンパク質の発現をアッセイした。（Ｂ）ＫＵＮレプリコン−ポリトープＤＮＡおよびＲＮＡによりトランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞由来の全ＲＮＡのノーザンブロット。材料と方法に記載されたように細胞のトランスフェクション、ＲＮＡ単離、およびノーザンを行った。左のパネルは、ＫＵＮ３’非翻訳領域を示すＫＵＮ特異的プローブを使用したノーザンブロットの結果を示し、右のパネルは、Ｍｐｔ配列を示すプローブで再ハイブリッド形成した同一メンブレンのノーザンブロットの結果を示す。ＤＮＡトランスフェクション細胞由来のサンプルは６μｇの全ＲＮＡを含み、ＲＮＡトランスフェクション細胞由来のサンプルは１２μｇの全ＲＮＡを含む。ｐＫＵＮβＲｅｐ２（ｄＧＤＤ）株は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする非複製ＫＵＮレプリコンＲＮＡを産生するｐＫＵＮβＲｅｐ２（ｄＧＤＤ）ＤＮＡによりトランスフェクトされたＢＨＫ細胞から単離したＲＮＡサンプルを示す（５３）。左のパネル中このＲＮＡの位置を、アスタリスクで示す。コントロールＲＮＡは、１０ｎｇのインビトロで転写ＲＮＡＬｅｕＭｐｔ ＲＮＡを示す。 Ｍｐｔ免疫原をコードする種々のＫＵＮレプリコンベースのベクターによる免疫化によって誘導されるＹＰＨＦＭＰＴＭＬ（ＹＰＨ）、ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ（ＲＰＱ）、ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ（ＴＹＱ）、およびＳＹＩＰＳＡＥＫＩ（ＳＹＩ）エピトープに特異的なＣＴＬ応答を示す図である。（Ａ）示したワクチンによる免疫化後のＢｌａｂ／ｃ（ｎ＝４／群）脾臓細胞のＥＬＩＳＰＯＴ分析。（Ｂ）ＶＬＰＰｒｏＭｐｔにより免疫化したＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３／群）由来の再刺激脾臓細胞集団の⁵¹クロム（Ｃｒ）放出アッセイ。表示のペプチドで感作した（黒塗りの四角）または感作していない（白抜きの四角）標識標的細胞を使用して、標準的な６時間のＣｒ放出アッセイを行った。 異なる用量のＭｐｔをコードするＤＮＡベースのＫＵＮレプリコンによる免疫化後に誘導されたＳＹＩＰＳＡＥＫＩエピトープに特異的なＣＤ８＋ＣＴＬ応答を示す図である。ＤＮＡＬｅｕＭｐｔおよびＤＮＡＰｒｏＭｐｔをＰＢＳで連続希釈し、表示の用量をＢａｌｂ／ｃマウスの大腿四頭筋に注射した（ｎ＝４／群）。２週間後にマウスを屠殺し、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによってＣＤ８＋ＣＴＬ応答を測定した。 ＲＮＡＬｅｕＭｐｔワクチン接種後の組換えワクシニアウイルスおよびＢ１６−ＯＶＡ腫瘍のチャレンジを示す図である。（Ａ）組換えワクシニアチャレンジ。Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６／群）をＲＮＡＬｅｕＭｐｔまたはＲＮＡＬｅｕコントロールＲＮＡを１回ワクチン接種し、ｒＶＶＭｐｔによりチャレンジした。感染４日後に卵巣中のワクシニアウイルスタイターを測定した。（Ｂ）Ｂ１６−ＯＶＡチャレンジ。Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６／群）を、ＲＮＡＬｅｕコントロールまたはＲＮＡＬｅｕＭｐｔＲＮＡのいずれかを用いて２回免疫化するか、マウスポリトープをコードする組換えワクシニア（ｒＶＶＭｐｔ）により１回免疫化し、その後Ｂ１６−ＯＶＡ細胞でチャレンジした。上のグラフは、それぞれ３群のマウスの１２個の腫瘍部位についての平均腫瘍領域を示す。群の第１の腫瘍サイズが１５×１５ｍｍに達したときの日数に対する腫瘍成長線を停止させる（動物を安楽死させることが必要である）。下のグラフは、３群のマウスのカプラン−マイヤー生存曲線を示す。腫瘍サイズが１５×１５ｍｍに達した時にマウスを安楽死させた。 ＶＬＰＬｅｕＭｐｔワクチン接種後のＢ１６−ＯＶＡ腫瘍チャレンジのカプラン−マイヤー生存曲線を示す図である。腫瘍サイズが１５×１５ｍｍに達した時にマウスを屠殺した。ｒＶＶと比較したＶＬＰＬｅｕＭｐｔについてのログランク検定はｐ＜０．０１である。 発現ベクター（１コピーのＦＭＤＶ２Ａプロテアーゼを含むｐＫＵＮｒｅｐ４（引例５３で以前に公開されている）、ｐＫＵＮｒｅｐ５、およびＳＰ６ＫＵＮｒｅｐ５ならびに２コピーのＦＭＤＶ２Ａプロテアーゼを含むＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＳＰ６ＫＵＮｒｅｐ６、およびｐＫＵＮｒｅｐ６）の例を示す図である。ｐＫＵＮｒｅｐ５を、ｐＫＵＮｒｅｐ４からのＰＡＣ遺伝子の欠失によって作製した。ＳＰ６ＫＵＮｒｅｐ５を、ｐＫＵＮｒｅｐ５プラスミド中のＣＭＶプロモーターのＳＰ６プロモーターへの置換によって調製した。ｐＫＵＮｒｅｐ５およびＳＰ６ＫＵＮｒｅｐ５ベクターは、ほぼ正確にＮ末端を有する異種遺伝子産物を放出させるためにたった１つのＦＭＤＶ２Ａ配列しか有していない。挿入した異種遺伝子のＥＭＣＶ ＩＲＥＳ配列下流によりＫＵＮ非構造遺伝子の翻訳が独立して開始されるので、異種遺伝子は終止コドンを有することができ、それにより同様に真のＣ末端も有することができる。図１Ｂに示すように、ｐＫＵＮｒｅｐ６ベクターはＤＮＡＬｅｕＭｐｔおよびＤＮＡＰｒｏＭｐｔ発現構築物の基礎を形成し、ＳＰ６ＫＵＮｒｅｐ６はＲＮＡＬｅｕＭｐｔおよびＲＮＡＰｒｏＭｐｔ発現構築物の基礎を形成する。 ｐＳＦＶＭＥＣＬ７１３Ｐの構築を示す図である。最初に、アミノ酸７１３での変異の移入のために、セムリキ森林熱ウイルスｎｓＰ２遺伝子を含むｐＳＦＶ１ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）由来のＳａｃＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳにライゲーションした。重複ＰＣＲを使用してこれを行ってｎｓＰ２遺伝子にＡｖｒＩＩ部位を作製し、アミノ酸７１３をロイシンからプロリンに改変する。この変異Ｌ７１３Ｐにより、ＳＦＶの非細胞変性株が産生されるはずである（５９）。その後、得られたプラスミドを、ｐＢＳＫＳ／ＳＦＶＳａｃ−Ｘｈｏ ｆｒｔと命名した。次いで、この構築物のＲｓｒＩＩ−Ｂｓｕ３６Ｉフラグメントを、ｐＳＦＶＭＥＣ１０５に導入して、構築物ｐＳＦＶＭＥＣＬ７１３Ｐを産生した。 ｐＳＦＶＭＥＣＬ７１３ＰＮｅｏの構築を示す図である。ＥＭＣＶの内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ）およびネオマイシン遺伝子の配列を、ＭｌｕＩおよびＸｂａＩを使用してｐＢＳ−ＣＩＮ４ＩＮから切り出した。次いで、ＩＲＥＳ／Ｎｅｏ遺伝子を、挿入クンジンコア配列のｐＳＦＶＭＥＣＬ７１３Ｐ下流のＢａｍＨＩ部位に挿入した。次いで、この構築物を使用して、ＫＵＮ構造遺伝子を発現する安定な細胞株を確立した。 ｐＳＦＶ３Ｌ７１３ＰＬａｃＺＮｅｏの構築。最初にＩＲＥＳ／Ｎｅｏ遺伝子を、ｐＳＦＶＭＥＣＬ７１３ＰｎｅｏへのＩＲＥＳ／Ｎｅｏのクローニングに使用したｐＢＳ−ＣＩＮ４ＩＮ由来の同一のＭｌｕＩ−ＸｂａＩ末端充填フラグメントを使用してｐＳＦＶ３ＬａｃＺに挿入した。このＭｌｕＩ−ＸｂａＩフラグメントを、ｐＳＦＶ３ＬａｃＺのＳｍａＩ部位に挿入した。その後、同一の制限部位を使用してｐＳＦＶＭＥＣＬ７１３Ｐ由来のＳＦＶ非構造タンパク質１〜４を含むＳｐｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントのｐＳＦＶ３ＬａｃＺＮｅｏへの導入によってＳＦＶレプリコンの非細胞変性表現型を付与するＬ７１３Ｐ変異を移入した。 ｐＳＦＶＨｅｌｐｅｒｐｒＭＥＣの構築を示す図である。ｐＳＦＶ３Ｌ７１３ＰｌａｃＺＮｅｏ安定性細胞株中におけるクンジン構造遺伝子発現のためのヘルパープラスミドの構築のために、ＫＵＮ ｐｒＭＥＣ遺伝子カセットを、ＭｓｃＩ−ＳｐｅＩ部位を使用してｐＳＦＶＭＥＣ１０５から切り出した。次いで、このフラグメントを、同一の制限部位を使用してｐＳＦＶＨｅｌｐｅｒ２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に挿入し、ＳＦＶ構造タンパク質を置換した。この構築物では、ｐｒＭＥおよびＣは２つの個別の２６Ｓプロモーターの調節下に置かれていることに留意すべきである。 ｐＳＦＶＨｅｌｐｅｒＣｐｒＭＥの構築を示す図である。Ｐｆｕポリメラーゼ、適切なプライマー、およびテンプレートとして全長クンジンｃＤＮＡ（２７）を含むＦＬＳＤＸプラスミドＤＮＡを使用したＰＣＲによって、末端にＢｇｌＩＩ部位を有するクンジンＣｐｒＭＥ ｃＤＮＡフラグメントを作製した。次いで、このＣｐｒＭＥフラグメントを、ＰＣＲによって作製され、且つ各末端にＢａｍＨＩ部位を含むｐＳＦＶＨｅｌｐｅｒ２ベクターを含むフラグメントにライゲーションした。 ＫＵＮｇａｇＶＬＰ（ｎ＝６／群）およびｒＶＶｇａｇ（ｎ＝３／群）による免疫化に応答したマウスの抗ＨＩＶｇａｇ抗体を示す図である。マウスを、１０⁶ＰＦＵのＫＵＮｇａｇＶＬＰまたはコントロールＫＵＮ ＶＬＰ（ＫＵＮコントロール）により２回免疫化するか、１０⁶ＰＦＵのｒＶＶｇａｇにより１回免疫化した。最後の免疫化から２〜３週間後、ＥＬＩＳＡを使用して精製組換えｇａｇタンパク質に対する抗ｇａｇ抗体についてマウス血清を分析した。 ＫＵＮｇａｇＶＬＰにより免疫化したマウス由来の脾臓細胞のＴ細胞増殖アッセイを示す図である。ＨＩＶ−１ｇａｇタンパク質パルス脾臓を使用して、脾臓細胞を刺激した。ＳＥ＝標準誤差。ＨＩＶ−１ｇａｇ抗原を使用した数（黒のバー）／抗原を使用しない数（白のバー）（それぞれ免疫化および非免疫化マウス）として刺激指数を計算することができる。 ＫＵＮレプリコンＶＬＰワクチンによって誘発された長期免疫応答を示す図である。（Ａ）ＫＵＮｇａｇＶＬＰによる１回の免疫化から２週間および６ヶ月後のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４／群）におけるＡＭＱエピトープに対するＥＬＩＳＰＯＴ応答。（Ｂ）マウスポリトープ免疫原（ｍｐｔ）をコードするＫＵＮレプリコンＶＬＰで２回の免疫化（４週間間隔）から６ヵ月後に検出されたＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８／群）由来の脾臓細胞のＥＬＩＳＰＯＴ分析。Ｍｐｔによってコードされた各エピトープ（すなわち、ＹＰＨＦＭＰＴＭＬ（ＹＰＨ）、ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ（ＲＰＱ）、ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ（ＴＹＱ）、およびＳＹＩＰＳＡＥＫＩ（ＳＹＩ））についてのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。（Ｃ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６／群）に、４週間間隔で２回ＫＵＮｍｐｔＶＬＰをワクチン接種し、２回目の免疫化から１０ヵ月後、ｍｐｔをコードする組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶｍｐｔ）によりマウスをチャレンジした。感染から４日後に卵巣中のワクシニアウイルスタイターを測定した。 第４世代の異なるピューロマイシン耐性ＢＨＫ細胞クローンにおけるＫＵＮレプリコンＲＮＡ由来のβ−ガラクトシダーゼ発現を示す図である。 ＫＵＮレプリコンＲＮＡがＢＨＫ２１細胞中で持続的な複製を確立する能力に対する適応変異の効果を示す図である。左から右に、プレートは、ｒｅｐＰＡＣβ−ｇａｌ、ｒｅｐＰＡＣβ−ｇａｌ ＮＳ２Ａ（Ａ−Ｐ）、ｒｅｐＰＡＣβ−ｇａｌ ＮＳ２Ａ（Ｎ−Ｄ）、およびｒｅｐＰＡＣβ−ｇａｌ ＮＳ５（Ｐ−Ｓ）である。

Claims (64)

1. （ｉ）感染性ウイルスを産生することができないフラビウイルスレプリコンをコードし、前記フラビウイルスレプリコンが１つまたは複数の変異フラビウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
   （ｉｉ）異種核酸の挿入部位と、
   （ｉｉｉ）前記フラビウイルスレプリコンをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターと、
   （ｉｖ）少なくとも１つの自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列と
   を含む、発現ベクター。
2. ２つの自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、少なくとも２つの前記自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列の第１の配列が、前記挿入部位の５’に存在し、少なくとも２つの前記自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列の第２の配列が、前記挿入部位の３’に存在する、請求項１の発現ベクター。
3. 前記自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列が、それぞれ口蹄疫ウイルス２Ａ自己プロテアーゼをコードする、請求項１の発現ベクター。
4. 前記（ｉ）中の変異フラビウイルス非構造タンパク質が、
   （ｉ）プロリン２５０のロイシンへの変異を有する非構造タンパク質ＮＳ１、
   （ｉｉ）アラニン３０のプロリンの変異を有する非構造タンパク質ＮＳ２Ａ、
   （ｉｉｉ）アスパラギン１０１のアスパラギン酸の変異を有する非構造タンパク質ＮＳ２Ａ、および
   （ｉｖ）プロリン２７０のセリンへの変異を有する非構造タンパク質ＮＳ５
   からなる群から選択される、請求項１の発現ベクター。
5. Ｃタンパク質の最初の２０個のアミノ酸（Ｃ２０）およびＥタンパク質の最後の２２個のアミノ酸（Ｅ２２）をそれぞれコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１の発現ベクター。
6. 前記レプリコンが、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５から選択される野生型非構造フラビウイルスタンパク質をそれぞれコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含む、請求項１の発現ベクター。
7. 前記レプリコンがクンジンウイルスに由来する、請求項１の発現ベクター。
8. ＳＰ６ＫＵＮｒｅｐ５またはｐＫＵＮｒｅｐ５である、請求項１の発現ベクター。
9. ＳＰ６ＫＵＮｒｅｐ６またはｐＫＵＮｒｅｐ６である、請求項２の発現ベクター。
10. （ｉ）感染性ウイルスを産生することができないフラビウイルスレプリコンをコードし、前記フラビウイルスレプリコンが１つまたは複数の変異フラビウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、
    （ｉｉ）異種核酸と、
    （ｉｉｉ）前記フラビウイルスレプリコンをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターと、
    （ｉｖ）少なくとも１つの自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列と
    を含む、発現構築物。
11. 少なくとも２つの自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、少なくとも１つの前記自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列の第１の配列が、前記異種核酸の５’に存在し、少なくとも１つの前記自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列の第２の配列が、前記異種核酸の３’に存在する、請求項１０の発現構築物。
12. 前記自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列が、それぞれ口蹄疫ウイルス２Ａ自己プロテアーゼをコードする、請求項１０の発現ベクター。
13. 前記（ｉ）中の変異フラビウイルス非構造タンパク質が、
    （ｉ）プロリン２５０のロイシンへの変異を有する非構造タンパク質ＮＳ１、
    （ｉｉ）アラニン３０のプロリンの変異を有する非構造タンパク質ＮＳ２Ａ、
    （ｉｉｉ）アスパラギン１０１のアスパラギン酸の変異を有する非構造タンパク質ＮＳ２Ａ、および
    （ｉｖ）プロリン２７０のセリンへの変異を有する非構造タンパク質ＮＳ５からなる群から選択される、請求項１０の発現構築物。
14. Ｃタンパク質の最初の２０個のアミノ酸（Ｃ２０）およびＥタンパク質の最後の２２個のアミノ酸（Ｅ２２）をそれぞれコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１０の発現構築物。
15. ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５から選択されるフラビウイルス野生型非構造タンパク質をそれぞれコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１０の発現構築物。
16. 前記フラビウイルスレプリコンがクンジンウイルスに由来する、請求項１５の発現構築物。
17. 前記異種核酸が、免疫原性タンパク質をコードする、請求項１０の発現構築物。
18. 前記免疫原が、１つまたは複数のエピトープ配列ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ、ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ、ＴＹＱＲＴＲＡＬＯＶ、ＳＹＩＰＳＡＥＫＩ、およびＳＩＩＮＦＥＫＬを有するマウスポリエピトープタンパク質である、請求項１７の発現構築物。
19. 前記免疫原性タンパク質がＨＩＶｇａｇタンパク質である、請求項１７の発現構築物。
20. ＲＮＡ構築物である、請求項１０の発現構築物。
21. ＲＮＡＬｅｕＭｐｔ、ＲＮＡＰｒｏＭｐｔ、またはＫＵＮＲＮＡｇａｇである、請求項２０の発現構築物。
22. ＤＮＡ構築物である、請求項１０の発現構築物。
23. ＤＮＡＬｅｕＭｐｔ、ＤＮＡＰｒｏＭｐｔ、またはＫＵＮＤＮＡｇａｇである、請求項２２の発現構築物。
24. 請求項１０の発現構築物を含む、宿主細胞。
25. （ｉ）請求項１０の発現構築物と、
    （ｉｉ）前記発現構築物のフラビウイルスウイルス様粒子（ＶＬＰ）へのパッケージングを容易にする１つまたは複数のタンパク質を発現することができる少なくとも別の発現構築物と
    を含む、発現系。
26. 前記別の発現構築物が、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）またはシンドビスウイルス（ＳＩＮ）に由来する、請求項２５の発現系。
27. ＳＦＶに由来する、請求項２７の発現系。
28. ＳＦＶの変異ｎｓＰ２遺伝子をさらに含む、請求項２７の発現系。
29. 前記ＳＦＶの変異ｎｓＰ２遺伝子がロイシン７１３のプロリンへの置換をコードする、請求項２９の発現系。
30. 前記少なくとも別の発現構築物が、ＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ／Ｎｅｏ、ｐＳＦＶ３Ｌ７１３ＰＬａｃＺＮｅｏ、またはＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐである、請求項３０の発現系。
31. ＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ／Ｎｅｏ、ｐＳＦＶ３Ｌ７１３ＰＬａｃＺＮｅｏ、またはＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３から選択される少なくとも別の発現構築物を含む、宿主細胞。
32. ＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ／ＮｅｏまたはｐＳＦＶ３Ｌ７１３ＰＬａｃＺＮｅｏによって安定にトランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞である、請求項３２の宿主細胞。
33. 請求項１０の発現構築物をさらに含む、請求項３２の宿主細胞。
34. 免疫原性タンパク質をコードするＲＮＡを含む１つまたは複数のＶＬＰを産生する、請求項３４の宿主細胞。
35. ＲＮＡが動物細胞で転写可能なフラビウイルスＤＮＡ発現構築物および薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含み、前記転写可能なＲＮＡが、
    （ｉ）感染性ウイルスを産生することができないフラビウイルスレプリコンと、
    （ｉｉ）免疫原性タンパク質と
    をコードする、薬学的組成物。
36. フラビウイルスＤＮＡ発現構築物から転写可能なＲＮＡおよび薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤を含み、前記ＲＮＡが、
    （ｉ）感染性ウイルスを産生することができないフラビウイルスレプリコンと、
    （ｉｉ）免疫原性タンパク質と
    をコードする、薬学的組成物。
37. 前記フラビウイルスＤＮＡ発現構築物が、
    （ｉ）感染性ウイルスを産生することができないフラビウイルスレプリコンをコードし、前記フラビウイルスレプリコンが１つまたは複数の変異フラビウイルス非構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列と、
    （ｉｉ）前記免疫原性タンパク質をコードする異種ＤＮＡと、
    （ｉｉｉ）動物細胞中で操作可能であり、且つフラビウイルスレプリコンをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたプロモーターと、
    （ｉｖ）少なくとも１つの自己プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列と
    を含む、請求項３６または３７の薬学的組成物。
38. 前記フラビウイルスがクンジンウイルスである、請求項３６または３７の薬学的組成物。
39. ワクチンである、請求項３６または３７の薬学的組成物。
40. 投与時に動物に対して防御的Ｔ細胞応答を誘発することができる、請求項４０のワクチン。
41. 前記Ｔ細胞応答がＣＴＬ応答である、請求項４１のワクチン。
42. 前記ＣＴＬ応答が、長期エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞応答によって特徴付けられる、請求項４２のワクチン。
43. 前記免疫原がウイルスタンパク質である、請求項４３のワクチン。
44. 前記ウイルスタンパク質がＨＩＶｇａｇである、請求項４４のワクチン。
45. 前記動物が哺乳動物である、請求項４０のワクチン。
46. 前記哺乳動物がヒトである、請求項４６のワクチン。
47. ＶＬＰが前記免疫原性タンパク質をコードするＲＮＡを含む、請求項２０の発現系によって産生される１つまたは複数のＶＬＰを含むワクチン。
48. 前記免疫原性タンパク質がウイルスタンパク質である、請求項４８のワクチン。
49. 前記ウイルスタンパク質がＨＩＶｇａｇである、請求項４９のワクチン。
50. 請求項４０〜４８のワクチンを動物に投与し、それにより前記動物に免疫が誘導されるステップを含む、動物の免疫化方法。
51. 前記免疫が抗体によって媒介される、請求項５１の方法。
52. 前記免疫が細胞媒介免疫である、請求項５１の方法。
53. 前記免疫がＴ細胞媒介免疫である、請求項５３の方法。
54. 前記Ｔ細胞免疫が、ＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）応答によって特徴付けられる、請求項５４の方法。
55. 前記Ｔ細胞免疫が、長期エフェクターＣＤ８＋ＣＴＬ応答の誘導によって特徴付けられる、請求項５５の方法。
56. 前記Ｔ細胞免疫が、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答によって特徴付けられる、請求項５６の方法。
57. ウイルス感染に対する免疫が動物で誘導される、請求項５１の方法。
58. 前記動物で腫瘍免疫が誘導される、請求項５１の方法。
59. 前記動物で黒色腫に対する免疫が誘導される、請求項５９の方法。
60. 前記動物が哺乳動物である、請求項５１の方法。
61. 前記哺乳動物がヒトである、請求項６０の方法。
62. ＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ／Ｎｅｏ、ｐＳＦＶ３Ｌ７１３ＰＬａｃＺＮｅｏ、またはＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐからなる群から選択されるパッケージング構築物。
63. 請求項６３のパッケージング構築物を含む、宿主細胞。
64. ＳＦＶＭＥＣ／Ｌ７１３Ｐ／ＮｅｏまたはｐＳＦＶ３Ｌ７１３ＰＬａｃＺＮｅｏで安定にトランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞である、請求項６４の宿主細胞。
    

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