CN1671851A - 黄病毒疫苗输送系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种黄病毒表达载体、构建体和系统，其均包含一种黄病毒复制子，该黄病毒复制子有助于进行细胞内自我复制由此可高水平表达由一种异源性核酸编码的RNA和蛋白。所述的黄病毒表达载体、构建体和系统优选地使用一种Kunjin病毒复制子，并特别适合用作一种疫苗输送系统以促进表达能够诱导针对病毒感染和癌症的保护性T细胞免疫的免疫原性蛋白质和肽。疫苗可以DNA、RNA或病毒样颗粒的形式进行施用。

Description

黄病毒疫苗输送系统
技术领域
本发明涉及一种改良的(improved)黄病毒复制子、包含该黄病毒复制子的表达载体、构建体和系统。更具体地，本发明涉及一种可用作疫苗输送系统的黄病毒表达系统，该表达系统编码异源性的免疫原性蛋白和肽，所述的蛋白和肽能够诱导抗病毒感染和抗癌症的保护性T细胞免疫。疫苗可通过DNA、RNA或病毒样颗粒的形式而施用，其经过在细胞内自我复制而产生高水平表达的RNA和所编码的蛋白。
背景技术
基于复制子的正链RNA病毒载体已经被研发用于抗病毒疫苗和抗癌症的疫苗(综述见参考文献25)。这些载体所具有的一些特征使其成为研发高效而安全的疫苗的一种合适的选择。这些特征包括：(i)由于复制子RNA具有自我扩增的能力，因而可高水平表达所编码的异源性基因(HG)，(ii)其仅在细胞质内进行复制，因此不会引起与细胞核内剪切和/或染色体整合相关的问题，(iii)复制子RNA不会脱离转染的(或感染的)细胞，因此限制了疫苗载体在被免疫的对象内的播散，这使得这些载体具有生物学安全性，以及(iv)其基因组(7-9kb)相对较小，因此易于对其cDNA进行处理并产生重组体。
基于复制子的表达载体已经被研发用于大多数典型的正链RNA病毒家族成员，包括α病毒、微小核糖核酸病毒(picomavirus)以及黄病毒(综述见参考文献25)。不过，绝大部分有关实验动物的复制子载体的免疫原特性的数据来源于α病毒的复制子，例如新培斯病毒(Sindbis virus，SIN)、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus，VEE)(综述见参考文献47，更新的研究结果见参考文献8，10，11，39)。总体而言，这些研究显示，α病毒复制子载体可诱导针对其所编码的免疫原的强烈的抗体和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答，且在大多数情况下，在适当的病毒或肿瘤攻击实验中可保护被免疫的动物。三种输送方式均是有效的，不过，VLP具有最高的输送功效。将常规(非复制型)质粒DNA载体与基于α病毒DNA的复制子载体进行比较研究发现，后者通常会诱导更强的免疫应答且所用的DNA浓度明显更低(4，17)。但是，一些研究发现，由基于DNA的α病毒复制子所诱导的免疫应答的功效似乎取决于所编码的免疫原的性质，且针对免疫原的免疫与等量的常规质粒DNA载体所诱导免疫效果相似或更低(10，23)。
衍生自黄病毒Kunjin(KUN)的复制子载体在一些出版物中已经有描述(26，28，52，53；国际申请WO 99/28487)。KUN复制子表达系统，例如α病毒复制子系统，可以三种方式输送复制子RNA，即以裸RNA、VLP和质粒DNA(图1A)(25，52，53)的方式。不同于同源性α病毒复制子包装系统(6，33，41)，KUN复制子包装系统利用了衍生自无关的SFV病毒的复制子表达载体来产生KUN结构蛋白(28，52)。这样可以消除可能存在与感染性重组材料污染VLP有关的问题。此外，与通常用于免疫接种研究的、对细胞具有高致病性的α病毒复制子载体不同，KUN复制子似乎不具有细胞致病性，因此能够在体外和体内长期表达HG(53)。尽管目前已经存在非细胞致病性的α病毒复制子载体(1，12，40)，但还没有有关其免疫原性特性的研究结果。已往的研究中，用包含非细胞致病性的、基于DNA的、表达β-半乳糖苷酶基因的KUN复制子载体的VLP免疫小鼠，可诱导产生抗β-半乳糖苷酶的抗体应答(53；国际申请WO99/28487)。但是，尚未证明KUN复制子载体系统可以输送能够诱导保护性免疫应答的免疫原。
发明目的
本发明人在此首次描述了基于黄病毒复制子的疫苗的疫苗输送系统，该疫苗输送系统能够通过抗体和T细胞介导的应答而提供长期的保护性免疫。
此外，本发明人对用于产生VLP的黄病毒复制子和包装系统进行了修饰和改良。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于输送疫苗的、经过改良的黄病毒复制子载体系统。
发明内容
因此本发明广泛涉及一种黄病毒表达系统以及其中所用的黄病毒复制子、表达载体和表达构建体。在一个具体实施方案中，本发明涉及一种黄病毒疫苗输送系统。
在一个方面，本发明提供了一种表达载体，其包含：
(i)一种编码不能产生感染性病毒的黄病毒复制子的核苷酸序列，其中所述的黄病毒复制子编码一或多种突变的黄病毒非结构蛋白；
(ii)一个异源性核酸的插入位点；
(iii)可操纵地连接于编码所述的黄病毒复制子的核苷酸序列的启动子；以及
(iv)至少一种编码自身蛋白酶(autoprotease)的核苷酸序列。
在适当条件下，相对于编码相应的野生型蛋白的黄病毒复制子而言，编码突变的黄病毒非结构蛋白的黄病毒复制子能够更有效地在动物细胞中实现持久的复制。
优选地，(i)中所述的突变的黄病毒非结构蛋白选自
(a)突变的非结构蛋白NS1；
(b)突变的非结构蛋白NS2A；以及
(c)突变的非结构蛋白NS5。
更优选地，(i)中所述的突变的黄病毒非结构蛋白选自：
(i)脯氨酸250突变为亮氨酸的非结构蛋白NS1；
(ii)丙氨酸30突变为脯氨酸的非结构蛋白NS2A；
(iii)天冬酰胺101突变为天冬氨酸的非结构蛋白NS2A；以及
(iv)脯氨酸270突变为丝氨酸的非结构蛋白NS5。
在一个优选的实施方案中，该种或每一种编码自身蛋白酶的核苷酸序列编码一种口蹄疫病毒2A自身蛋白酶。
在一个具体的实施方案中，该表达载体包含一种编码自身蛋白酶的核苷酸序列。该实施方案的实例被命名为SP6KUNrep5和pKUNrep5。
在另一个具体实施方案中，该表达载体包含两种编码自身蛋白酶的核苷酸序列，其中所述的至少两种编码自身蛋白酶的核苷酸序列中的第一种位于所述的插入位点的5′，而所述的至少两种编码自身蛋白酶的核苷酸序列中的第二种位于所述的插入位点的3′。该实施方案的实例被命名为SP6KUNrep6和pKUNrep6。
在另一方面，本发明提供了一种表达构建体，其包含：
(i)一种编码不能产生感染性病毒的黄病毒复制子的核苷酸序列，其中所述的黄病毒复制子编码一或多种突变的黄病毒非结构蛋白；
(ii)一种异源性核酸；
(iii)可操纵地连接于编码所述的黄病毒复制子的核苷酸序列的启动子；以及
(iv)至少一种编码自身蛋白酶的核苷酸序列。
在适当条件下，相对于编码相应的野生型蛋白的黄病毒复制子而言，编码突变的黄病毒非结构蛋白的黄病毒复制子能够更有效地在动物细胞中实现持久的复制。
优选地，(i)中所述的突变的黄病毒非结构蛋白选自
(a)突变的非结构蛋白NS1；
(b)突变的非结构蛋白NS2A；以及
(c)突变的非结构蛋白NS5。
更优选地，(i)中所述的突变的黄病毒非结构蛋白选自：
(i)脯氨酸250突变为亮氨酸的非结构蛋白NS1；
(ii)丙氨酸30突变为脯氨酸的非结构蛋白NS2A；
(iii)天冬酰胺101突变为天冬氨酸的非结构蛋白NS2A；以及
(iv)脯氨酸270突变为丝氨酸的非结构蛋白NS5。
在一个优选的实施方案中，该种或每一种编码自身蛋白酶的核苷酸序列编码一种口蹄疫病毒2A自身蛋白酶。
在一个实施方案中，所述的表达构建体包含至少两种编码自身蛋白酶的核苷酸序列，其中所述的至少一种编码自身蛋白酶的核苷酸序列中的第一种位于所述的异源性核酸的5′，而所述的至少一种编码自身蛋白酶的核苷酸序列中的第二种位于所述的异源性核酸的3′。
在一个具体实施方案中，该方面提供了可自一种DNA表达构建体转录而来的一种RNA，其中所述的RNA包含：
(i)其中所述的黄病毒复制子编码一或多种突变的黄病毒非结构蛋白；以及
(ii)一种编码一种异源性蛋白的异源性RNA序列。
在一个实施方案中，所述的启动子能以可操纵的方式在体内启动RNA转录。
更优选地，所述的启动子能以可操纵的方式在哺乳动物细胞中启动RNA转录。
一种优选的在哺乳动物细胞中可操纵的启动子的实例是CMV启动子。
在另一个实施方案中，所述的启动子能以可操纵的方式在体外启动RNA转录。
一种优选的能以可操纵的方式在体外启动RNA转录的启动子的实例是SP6启动子。
在具体的实施方案中，本发明的表达构建体的非限制性实例包括用于体外RNA表达的包含SP6启动子的RNALeuMpt、RNAProMpt、KUNRNAgag或用于细胞内RNA表达的包含CMV启动子的DNALeuMpt、DNAProMpt、KUNDNAgag。
在另一方面，本发明提供了一种表达系统，其包含：
(i)上述第一方面的表达载体或上述第二方面的表达构建体；和
(ii)至少另一种能够表达一或多种蛋白的表达构建体，所述的蛋白有助于将所述的表达载体或构建体包装入黄病毒病毒样颗粒(VLP)。
在具体的实施方案中，所述的另一种表达构建体是一种包装构建体，其选自：SFVMEC/L713P、SFVMEC/L713P/Neo或pSFV3L713PlacZNeo。这些构建体在SFV nsP2基因中将亮氨酸713以脯氨酸进行取代以降低细胞致病性。SFVMEC/L713P/Neo和pSFV3L713PlacZNeo特别适合用于产生稳定的细胞系。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含可自一种黄病毒DNA表达构建体转录而来的一种RNA，其中所述的RNA编码：
(i)一种不能产生感染性病毒的黄病毒复制子；和
(ii)一种免疫原性蛋白质。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含一种可在动物细胞中自其转录得到RNA的黄病毒DNA表达构建体，其中所述的转录得到的RNA编码：
(i)一种不能产生感染性病毒的黄病毒复制子；和
(ii)一种免疫原性蛋白质。
优选地，根据上述的核酸组合物，所述的DNA和RNA表达构建体包括一种编码至少一种口蹄疫病毒2A自身蛋白酶的核苷酸序列。
更优选地，所述的DNA和RNA构建体包括一种位于所述的编码第一种所述口蹄疫病毒2A自身蛋白酶的异源性核酸的5′的核苷酸序列以及一种位于所述的编码第二种所述口蹄疫病毒2A自身蛋白酶的异源性DNA的3′的核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含由上述第三方面的表达系统产生的一或多种VLP。
优选地，本发明的药物组合物是免疫治疗性组合物，或更优选地，是疫苗。
在另一方面，本发明提供了对动物进行免疫的方法，其包括将上述任一方面所述的药物组合物施用于所述的动物以便在所述的动物中诱导免疫。
动物包括人、家畜、宠物、家禽和其他具有商业价值的动物，尽管并不限于这些。
优选地，所述的动物是哺乳动物。
更优选地，所述的动物是人。
免疫可以是抗体介导的和/或细胞介导的免疫，例如T细胞介导的免疫。
在一个实施方案中，T细胞免疫的特征在于是CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。
优选地，T细胞免疫的特征在于诱导一种长期的效应细胞CD8+CTL应答。
在另一个实施方案中，T细胞免疫的特征在于是一种CD4+T细胞应答。
在一个具体的实施方案中，所述的免疫方法诱导针对病毒的免疫。
在另一个具体实施方案中，所述的免疫方法诱导针对癌症例如黑色素瘤的免疫。
在本文中，除非另有说明，“包含”取其包括而非排他的含义，因此所述及的整数或整数的组可以包括一或多个未被述及的其他的整数或整数的组。
附图和表格说明
表1.贯序转染Kunjin和SFV复制子RNA。
表2.同时转染Kunjin和非细胞致病性的SFV复制子RNA。
表3.在以Kunjin复制子RNA转染的SFVMECA12细胞系中产生分泌的VPL。
表4.孵育温度对以KUN-GAG复制子RNA转染的SFVMECA12细胞系产生VLP的影响。
表5.VLP在表达非细胞致病性的SFV复制子并以pSFVHelperCprME和KUN-GAG RNA转染的细胞系中的产生。
表6.以KUNgag VLP进行免疫后对rVVgag攻击实验(challenge)的保护作用。
表7.嘌呤霉素抗性BHK-KUN复制子细胞克隆No11和No20中的适应性突变(adaptive mutations)。
图1.基于KUN复制子的复制子基因表达和输送系统(A)和编码鼠多表位(murine polyepitope，Mpt)的KUN复制子构建体(B)的示意图。(A)可自掺入了噬菌体SP6启动子的质粒DNA进行体外转录得到KUN复制子RNA并将其作为裸RNA通过转染或注射进行输送(26，52)。还可以借助于细胞的RNA聚合酶II，自转染的或注射的掺入了巨细胞病毒(CMV)启动子的质粒DNA进行体内合成得到KUN复制子RNA(53)。此外，可使用如前所述的包装系统首先将KUN复制子RNA包装入病毒样颗粒(virus-like particles，VLP)中(28)，然后通过转染而输送(52)。无论输送方式如何，一旦进入细胞质，KUN复制子RNA即开始自我复制产生多个RNA拷贝，再由其进行翻译，引起所编码的异源性基因(HG)产物的产生增加。CAP代表在体外转录过程中通过合成方法或在体内转录或KUN RNA复制过程中天然添加到复制子RNA分子5′端的帽结构，其可确保有效起始翻译过程。(B)KUN复制子构建体含有KUN RNA复制所需的序列，即5′和3′非翻译区(UTR)，编码KUN C蛋白(C20)的前20个氨基酸和KUN E蛋白(E22)的最后22个氨基酸的序列，以及编码KUN非结构蛋白NS1(以NS1表示)、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、和NS5(以NS2-NS5表示)的完整的非结构区。此外，构建体还含有位于KUN 5′UTR上游的SP6或CMV启动子，以便在体外或体内分别驱动RNA转录，以及插入到3′UTR下游的含有丁型肝炎病毒核酶(HDVr)的反基因组序列(antigenomic sequence)和来自猿猴病毒40的聚腺苷酸化信号(pA)，以确保产生具有有效起始复制所需的精确3′端的KUN复制子RNA分子。为了使Mpt肽能够自KUN C20和E22肽释放到细胞质，所述构建体含有2个拷贝的口蹄疫病毒2A自身蛋白酶(FMDV2A)，其分别位于该Mpt序列的上游和下游。Pro和Leu变体分别在KUNNS1基因的250位含有氨基酸Pro或Leu。
图2.编码鼠多表位(polytope)的KUN复制子构建体在转染的BHK21细胞中复制的证据。(A)对以基于DNA或基于RNA的编码Mpt的KUN复制子转染的BHK21细胞进行IF分析。以KUN复制子多表位DNA(DNALeuMpt和DNAProMpt)或RNA(RNALeuMpt和RNAProMpt)转染位于盖玻片上的细胞，在转染后48小时通过IF分析KUN NS3蛋白的表达。(B)对来自以KUN复制子多表位DNA和RNA转染的BHK21细胞的总RNA进行Northern印迹分析。按照材料和方法中所述进行细胞转染、RNA分离和Northern印迹分析。左图所示为以代表KUN 3′非翻译区的KUN-特异性探针进行Northern印迹分析的结果，右图所示为以代表Mpt序列的探针对同一张膜进行再次杂交的Northern印迹分析的结果。来自DNA转染的细胞的样品含有6μg总RNA，而来自RNA转染的细胞的样品含有12μg总RNA。pKUNβRep2(dGDD)条带显示的是分离自以产生编码β-半乳糖苷酶基因的非复制型KUN复制子RNA的pKUNβRep2(dGDD)DNA(53)转染的BHK细胞的RNA样品。在左图中该RNA的位置以星号示出。对照RNA为10ng体外转录的RNALeuMptRNA。
图3.以各种编码Mpt免疫原的基于KUN复制子的载体进行免疫所诱导的特异于YPHFMPTML(YPH)、RPQASGVYM(RPQ)、TYQRTRALV(TYQ)和SYIPSAEKI(SYI)表位的CTL应答。(A)在以指定疫苗进行免疫后对Balb/c小鼠(n＝4/组)的脾细胞进行ELISPOT分析。(B)对经过再次刺激的、来自以VLPProMpt进行免疫的Balb/c小鼠(n＝3/组)的脾细胞群进行51铬(Cr)释放分析。使用经过指定的肽致敏(实心方块)或未经指定的肽致敏(空心方块)的标记的靶细胞进行标准的6h Cr释放分析。
图4.以不同剂量的基于DNA的编码Mpt的KUN复制子进行免疫诱导的特异于SYIPSAEKI表位的CD8+CTL应答。将DNALeuMpt和DNAProMpt以PBS进行连续稀释，并以指定剂量注射到Balb/c小鼠(n＝4/组)的四头肌。2周后处死小鼠并以ELISPOT分析测定CD8+CTL应答。
图5.A和B。接种RNALeuMpt疫苗后以重组痘苗病毒(vacciniavirus)和B16-OVA肿瘤进行攻击实验.(A)重组牛痘(vaccinia)攻击实验。以RNALeuMpt RNA或RNALeuControl RNA接种Balb/c小鼠(n＝6/组)一次，然后以rVVMpt攻击。在感染后第4天测定卵巢内的痘苗病毒滴度。(B)B16-OVA攻击实验。Balb/c小鼠(n＝6/组)以RNALeuControlRNA或RNALeuMpt RNA免疫两次或者以编码鼠多表位(rVVMpt)的重组牛痘免疫一次，然后以B16-OVA细胞进行攻击实验。上图显示的是三组小鼠中每组12个肿瘤部位的平均肿瘤面积。当某一组中的第一个肿瘤的大小达到15×15mm时需要对动物处以安乐死(euthanisation)，肿瘤生长曲线随即终止。下图为三组小鼠的Kaplin-Meier存活曲线。当肿瘤的大小达到15×15mm时对小鼠处以安乐死。
图5C.接种VLPLeuMpt疫苗后的B16-OVA肿瘤攻击实验的Kaplan-Meier存活曲线。当肿瘤的大小达到15×15mm时将小鼠处死。VLPLeuMpt与rVV相比，Log rank统计p＜0.01。
图6.含有1拷贝FMDV2A蛋白酶的表达载体pKUNrep4(已经发表于参考文献53)、pKUNrep5和SP6KUNrep5以及含有2拷贝FMDV2A蛋白酶的表达载体EMCV IRES、SP6KUNrep6和pKUNrep6的例子。通过自pKUNrep4缺失PAC基因而得到pKUNrep5。通过在pKUNrep5质粒中以SP6启动子取代CMV启动子而制备SP6KUNrep5。pKUNrep5和SP6KUNrep5载体仅具有一个FMDV2A序列可供裂解释放出具有一个邻近真实N端(authentic N-terminus)的异源性基因产物。插入的异源性基因下游的EMCV IRES序列使得KUN非结构基因可独立起始转录，因此该异源性基因可具有一个终止密码子因此也就具有一个真实C端。pKUNrep6载体是DNALeuMpt和DNAProMpt表达构建体的基础，而SP6KUNrep6是RNALeuMpt和RNAProMpt表达构建体的基础，如图1B所示。
图7.构建pSFVMECL713P。首先，将来自pSFV1载体(LifeTechnologies)的、含有塞姆利基森林病毒nsP2基因的SacI-XhoI片段连接到pBluescriptII KS中，以诱导第713位氨基酸突变。这通过采用重叠PCR而进行，重叠PCR在nsP2基因中产生了一个AvrI1位点，将第713位氨基酸由亮氨酸改变为脯氨酸。该突变L713P可产生一种非细胞致病性的SFV株(59)。随后将得到的质粒命名为pBSKS/SFVSac-Xho frt。然后，将此构建体的RsrII-Bsu36I片段转染到pSFVMEC105内遗产生所述构建体，pSFVMECL713P。
图8.构建pSFVMECL713Pneo。用MluI和XbaI将EMCV内部的核酶进入位点(IRES)的序列和新霉素基因自pBS-CIN4IN切下。然后将IRES/Neo基因插入位于插入的Kunjin核心序列下游的pSFVMECL713P的BamHI位点。然后将此构建体用于建立表达KUN结构基因的稳定细胞系。
图9.构建pSFV3L713PlacZNeo。首先，使用来自pBS-CIN4IN的MluI-XhaI末端补平片段将IRES/Neo基因插入pSFV3LacZ，所述的来自pBS-CIN4IN的MluI-XhaI末端补平片段与将IRES/Neo克隆入pSFVMECL713Pneo所用的片段相同，该MluI-XhaI片段插入pSFV3LacZ的SmaI位点。随后，以相同的限制性位点，将来自pSFVMECL713P的含有SFV非结构蛋白1-4的SpeI-NotI片段转移至pSFV3LacZNeo，以便引入产生SFV复制子非细胞致病性表型的L713P突变。
图10.构建pSFVHelperprMEC。为了构建用于在pSFV3L713PlacZNeo稳定细胞系中表达Kunjin结构基因的辅助质粒，用MscI-SpeI位点将KUN prMEC基因盒自pSFVMEC105中切下，然后将该片段以相同的限制性位点插入pSFVHelper2(Life Technologies)并取代SFV结构蛋白。应当注意的是，该构建体中，prME和C被置于两个单独的26S启动子的控制下。
图11.构建pSFVHelperCprME。使用Pfu聚合酶和适当的引物，并以含有全长Kunjin cDNA(27)的FLSDX质粒DNA作为模板，通过PCR产生两端具有BglII位点的Kunjin CprME cDNA片段。然后将该CprME片段与含有同样由PCR产生的并在两端含有BamHI位点的pSFVHelper2载体的片段相连接。
图12.以KUNgagVLP(n＝6/组)和rVVgag(n＝3/组)免疫接种后引起小鼠产生的抗HIV gag抗体。以106 PFU的KUNgagVLP或对照KUNVLP(KUN对照)免疫接种小鼠2次，或以106 PFU的rVVgag免疫接种小鼠1次。末次免疫接种后2-3周，用针对纯化重组gag蛋白的ELISA分析小鼠血清的抗gag抗体。
图13.对来自以KUNgagVLP免疫接种的小鼠的脾细胞进行T细胞增殖分析。HIV-1 gag蛋白脉冲处理的脾细胞用于刺激脾细胞。SE＝标准误。经过和未经过免疫接种的小鼠的刺激指数分别按照以HIV-1 gag抗原刺激的计数(黑色条形)/无抗原刺激的计数(白色条形)计算出。
图14.KUN复制子VLP疫苗引起的长期免疫应答
(A)以KUNgagVLP单次免疫接种2周和6个月后，Balb/c小鼠(n＝4/组)中针对AMQ表位的ELISPOT应答。(B)以编码鼠多表位免疫原(mpt)的KUN复制子VLP2次免疫接种Balb/c小鼠(n＝8/组)(间隔4周)，6个月后对来自该小鼠的脾细胞进行ELISPOT分析。显示了针对由Mpt编码的各个表位，即YPHFMPTML(YPH)、RPQASGVYM(RPQ)、TYQRTRALV(TYQ)和SYIPSAEKI(SYI)的CD8+T细胞应答。(C)以KUNmpt VLP间隔4周免疫接种Balb/c小鼠(n＝6/组)共2次，第二次免疫接种10个月后，以编码mpt(rVVmpt)的重组痘苗病毒对小鼠进行攻击实验。感染后第4天，测定卵巢中痘苗病毒的滴度。
图15.来自KUN复制子RNA的β-半乳糖苷酶在不同的抗嘌呤霉素的BHK细胞克隆的第4代中的表达。
图16.适应性突变对KUN复制子RNA在BHK21细胞中实现持久复制的能力的影响。从左至右，培养盘为repPACβ-gal、repPACβ-gal NS2A(A-P)、repPACβ-gal NS2A(N-D)和repPACβ-gal NS5(P-S).
具体实施方式
本发明人描述了以表达鼠CTL多表位(polyepitope或polytope)(Mpt)和HIV-1 gag的KUN复制子作为免疫原，并以裸RNA、VLP、或质粒DNA的形式输送从而对小鼠进行免疫接种。所有这些免疫接种的方式均诱导了针对所编码的表位的特异性CD8+CTL应答，且在裸RNA和VLP的情况下，保护小鼠抵抗病毒和肿瘤攻击实验。此外，将表达完整HIV-1 gag基因的KUN复制子以VLP形式输送从而对小鼠进行免疫接种，诱导了特异于gag的抗体和CD4+T细胞应答，并保护小鼠抵抗以表达所述gag基因的重组痘苗病毒进行的攻击实验。
此外，KUN复制子经过修饰(与WO 99/28487相比)，在编码异源性免疫原的序列的5′和3′插入了FMDV2A自身蛋白酶序列。这种修饰可引起所表达的融合蛋白发生自身蛋白裂解而释放基本上无外来氨基酸序列的蛋白质免疫原。进一步的修饰包括使用编码本发明的黄病毒复制子的NS1、NS2A和NS5蛋白成分中的一或多种的突变的核苷酸序列，该突变可更加有效地建立持久的复制。本发明还提供了一种新的、基于SFV的病毒包装系统，其较国际申请WO 99/28487所述的基于SFV的系统具有更低的细胞治病性。
KUN复制子表达载体和构建体
术语“核酸”在此是指单链或双链的mRNA、RNA、cRNA和DNA包括cDNA和基因组DNA。
在此，“黄病毒”是指属于黄病毒属(genus Flavivirus)的黄病毒科(family Flaviviridae)成员，其含有65或更多种相关的病毒。典型地，黄病毒是小的、有包膜RNA病毒(直径大约45nm)，具有包含单一糖蛋白E的包膜突起。其他结构蛋白称为C(核心)和M(膜样)。单链RNA具有感染性，典型地，其分子量为大约4×106，5′末端具有m7G帽，但在3′末端无poly(A)；其仅仅起到信使(messenger)的作用。黄病毒可感染很多种脊椎动物，其中多为节肢动物如蜱和蚊子所转播，不过个别黄病毒群(group)通过未知载体(NKV)传播。
具体而言，黄病毒的非限制性实例为西尼罗河病毒(West Nilevirus)、Kunjin病毒、黄热病毒(Yellow Fever virus)、日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus)、登革热病毒(Dengue virus)、Montana Myotis白质脑炎病毒(Montana Myotis leukoencephalitis virus)、乌苏土病毒(Usutuvirus)、和Alkhurma病毒(Alkhurma virus)。
尽管本发明的优选的黄病毒复制子来自Kunjin病毒，但本领域技术人员能够理解本发明的表达载体、表达构建体和表达系统可以采用任何黄病毒复制子。
研究较为深入的黄病毒复制子的例子包括西尼罗河病毒I系(参考文献61)和II系病毒株(参考文献62)复制子。
本发明所预期的黄病毒复制子包括任何来自黄病毒RNA的自我复制型成分，例如见国际申请WO 99/28487所述。
在此一般而言，黄病毒复制子衍生自黄病毒或者是黄病毒起源的。因此，在本说明书中，“编码黄病毒复制子的核苷酸序列”是指一种DNA或RNA序列，其包含的来自黄病毒复制子或至少其一部分的序列信息足以进行复制但不能产生感染性病毒。
例如，本领域人员能够明了，在此所指的本发明的基于DNA的构建体包含复制子RNA的一个DNA拷贝，其互补于所述的复制子RNA或者是衍生于所述的复制子RNA。
适当地，所述的黄病毒复制子能够复制但是“不能产生感染性病毒”。这意味着所述黄病毒复制子无法表达病毒包装所需的一或多种结构蛋白的完整分子或部分。国际申请WO 99/28487详细说明了如何修饰Kunjin黄病毒复制子以使其无法进行病毒包装。
在一个优选的实施方案中，所述黄病毒复制子包含：
(i)5′和3′非翻译(UTR)序列以及分别编码C蛋白的前20个氨基酸(C20)和E蛋白的最后22个氨基酸(E22)的序列；和
(ii)编码非结构蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5的核苷酸序列。
在一个具体方面，所述的非结构蛋白中的一或多种是突变的。
在一个具体的实施方案中，NS1蛋白的脯氨酸残基250被亮氨酸取代。
在另一个具体实施方案中，非结构蛋白NS2A中的丙氨酸30被脯氨酸取代。
在另一个具体实施方案中，非结构蛋白NS2A中的天冬酰胺101被天冬氨酸取代。
在另一个具体实施方案中，非结构蛋白NS5中的脯氨酸270被丝氨酸取代。
还应该理解，上述各种突变或取代可单独出现或以组合形式出现于本发明的黄病毒复制子中。
根据本发明，“表达载体”包含上述黄病毒复制子连同一或多种其他调节核苷酸序列。此类调节序列包括但不限于启动子、内部核糖体进入位点(IRES)、用于插入一或多种异源性核酸的限制性酶切位点、聚腺苷酸化序列以及其他序列如丁型肝炎病毒核酶(HDVr)的反基因组序列以分别确保转录的终止和精确裂解3′端。
应该理解，本发明的表达载体和表达构建体包括编码至少一种自身蛋白酶的核苷酸序列。
优选地，所述的核苷酸序列编码至少一种口蹄疫病毒2A自身蛋白酶，或更优选地，所述的核苷酸序列中的每种各自编码一种相应的口蹄疫病毒2A自身蛋白酶。
优选地，使用一种表达的融合蛋白，其包含一种两翼分别为一种N-端口蹄疫病毒2A自身蛋白酶和一种C-端口蹄疫病毒2A自身蛋白酶的异源性蛋白。这种排列引起所述口蹄疫病毒2A自身蛋白酶裂解该融合蛋白以释放出基本上不含其他氨基酸序列的该异源性蛋白。
本发明的特定的KUN复制子载体的例子为编码一种FMDV2A蛋白酶和EMCV IRES的pKUNrep5和SP6KUNrep5以及编码两种FMDV2A蛋白酶的SP6KUNrep6和pKUNrep6，如图6所示。
根据本发明，“表达构建体”是一种表达载体，其中插入了一种异源性核酸以使得其能够以RNA的形式和/或作为一种被编码的蛋白而表达。
所述的异源性核酸可编码一或多种肽或多肽，或编码一种基本上与靶序列相同或基本上与其互补的核苷酸序列。
“蛋白质”是指一种氨基酸聚合物。氨基酸可包括天然的(即遗传学编码的)、非天然的、D-氨基酸和L-氨基酸，皆为本领域所熟知。
“肽”是指具有少于50个氨基酸的蛋白质。
“多肽”是指具有50个或更多个氨基酸的蛋白质。
异源性核酸可编码由致病生物体例如病毒、真菌、细菌、原虫、无脊椎动物如寄生虫和节肢动物所产生的或得到的蛋白质，或者可编码由包括动物和人在内的动物所产生的或得到的突变的、致癌的或肿瘤性蛋白质如肿瘤抗原。异源性核酸也可编码合成的或人工蛋白质如构建的用来诱导免疫的免疫原性表位。
在一个实施方案中，所述的异源性核酸编码一或多种免疫原性肽或多肽，但不限于此。
优选地，所述一或多种免疫原性肽或多肽包含一或多种T细胞表位。
在一个具体的实施方案中，所述的异源性核酸编码多种肽表位(多表位)如一种鼠多表位(Mpt)，后者将在下文中做详细说明。表位序列的例子包括YPHFMPTNL、RPQASGVYM、TYQRTRALOV、SYIPSAEKI和SIINFEKL，但不限于此。
在另一个特定实施方案中，所述的异源性核酸编码HIV-1 gag基因或其片段。
在本发明的表达构建体中，启动子可操纵地连接于所述的黄病毒复制子。
“可操纵地连接于”是指所述的启动子的位置可以在体外或体内起始、调控或控制编码所述的黄病毒复制子、所述的异源性核酸和促进RNA剪切和蛋白质表达的其他调控序列的RNA的转录。
优选地，所述启动子位于所述黄病毒复制子的5′。
用于在体外自所述的DNA表达构建体转录RNA的优选的启动子是SP6启动子。
用于在体内自哺乳动物细胞中的所述的DNA表达构建体转录RNA的优选的启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。不过，应该理解的是本发明也预期了其他在哺乳动物细胞内具有活性的熟知的启动子，包括SV40启动子(一种人类延长因子α启动子)和α晶体蛋白启动子，但不限于此。
在用本发明的表达构建体产生稳定转化的宿主细胞的实施方案中，表达载体进一步包含一种选择标记基因以便对转化的宿主细胞进行筛选。选择标记基因是本领域熟知的，包括新霉素转移酶和嘌呤霉素N-乙酰转移酶，但不限于此。可将选择标记基因插入以取代缺失的结构基因或插入至3′UTR区域。
用于蛋白质表达的合适的宿主细胞可以是任何能够实现转录、翻译以及蛋白质表达所需的任何转录后和/或翻译后处理或修饰的真核细胞系。可用于核酸转染和蛋白质表达的哺乳动物细胞的典型的例子为COS、Vero、CV-1、BHK21、HEK293、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NIH 3T3、Jurkat、WEHI231、HeLa和B16黑色素瘤细胞，但不限于此。
可通过本领域已知的方法实施转染，如磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质转染胺试剂(lipofectamine)、脂质转染试剂(lipofectin)和其他亲脂试剂、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖、微粒子轰击法(microparticle bombardment)、微注射和原生质体融合。
本发明的表达构建体的例子包RNALeuMpt、RNAProMpt、KUNRNAgag、DNALeuMpt、DNAProMpt和UNDNAgag，将在下文中进一步详述。
病毒包装
根据本发明的第三方面，提供了一种黄病毒表达系统，其包含：
(i)上文中所述的黄病毒表达构建体；和
(ii)至少另一种能够表达一或多种蛋白的表达构建体，所述的蛋白有助于将第二方面所述的表达构建体包装入黄病毒病毒样颗粒(VLP)。
可使用任何非黄病毒衍生的载体来表达用于病毒包装并产生VLP所需的一或多种结构蛋白。例如，所述的另一种构建体可衍生自另一种α病毒如塞姆利基森林病毒(SFV)或新培斯病毒(SIN)或衍生自DNA病毒如腺病毒、禽痘病毒(fowlpox virus)或痘苗病毒。
下文将详细描述可用于产生VLP以及制备并纯化VLP的所述另一种构建体(一种SFV衍生的构建体)的一个例子。
在其他实施方案中，本发明提供了新的包装系统，其提高了国际申请WO 99/28487所述的系统的包装功效并使之简化。
应该理解的是，在一些宽泛的实施方案中，黄病毒包装可通过以下方式实现：
(a)用一种黄病毒表达构建体和能够提供病毒包装所需的结构蛋白的所述另一种表达构建体瞬时转染宿主细胞(如上文中所述的)；
(b)用一种黄病毒表达构建体瞬时转染宿主细胞，其中所述的宿主细胞已经稳定转染了一种能够提供病毒包装所需的结构蛋白的包装构建体。
就(a)来说，这些表达构建体可以进行共转染或在一个时间框架内分别转染以实现的VLP最佳产生。
上文中，“转染”是为了方便起见所使用的一个通用术语，其涵盖了将外源性遗传物质瞬时引入或稳定引入到宿主细胞内部。
在一个具体的实施方案中，通过在nsP2基因中引入突变使得第713位的亮氨酸突变为脯氨酸(SFVMEC/L713P；图7)，从而达到对衍生自SFV的包装构建体SFV-MEC105进行修饰以降低其细胞致病性的目的。
在另一个具体实施方案中，SFV-MEC/L713P构建体含有一个IRES-Neo盒(SFVMEC/L713P/Neo；图8)以便通过抗生素G418进行选择从而建立稳定表达的细胞系。转染入该细胞系的Kunjin复制子RNA可进行复制并产生Kunjin VLP。
在另一个具体实施方案中，提供了一种非细胞致病性的SFV复制子RNA构建体pSFV3L713PLacZNeo(图9)，以扩增转染进去的SFV辅助RNA pSFVHelperprMEC(图10)和pSFVHelperCprME(图11)，由此可表达Kunjin结构蛋白。
所述的另一种构建体(衍生自SFV的构建体)、表达所述的衍生自SFV的构建体的细胞系以及各种用于产生VLP的包装方案和VLP的制备并纯化将在下文中详细阐述。
药物和免疫治疗性组合物和疫苗
本发明的一个具体方面涉及黄病毒表达构建体和表达系统作为疫苗输送系统的用途。不过，本发明更广泛地提供了一种药物组合物，其不限于用于疫苗输送，而是包括免疫治疗性组合物和疫苗，可包含：
(i)由本发明的表达系统产生的VLP；
(ii)自本发明的DNA表达构建体转录得到的RNA；或
(iii)在体内指导复制型RNA转录的本发明的质粒DNA表达构建体。
该药物组合物可进一步包含药物学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
可通过输送此类组合物以产生针对病原体的免疫力，优选为保护性免疫，所述的病原体例如为病毒、细菌、原虫寄生虫和无脊椎寄生虫，但不限于此。
在另一个替代性实施方案中，本发明意欲对癌症例如黑色素瘤进行免疫治疗性治疗。
“药物学可接受的载体、稀释剂或赋形剂”是指能够安全地用于全身施用的固体或液体的填充物、稀释剂或包囊化物质(encapsulatingsubstance)。根据特定的施用途径，可以使用本领域熟知的多种载体。这些载体可以选自糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石粉、硫酸钙、植物油、人造脂肪、多元醇、褐藻酸、磷酸缓冲液、乳化剂、等张盐水和盐类例如包括氯化物、溴化物和硫酸盐在内的无机酸盐、有机酸例如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐以及无致热原的水。
介绍药理学可接受的载体、稀释剂和赋形剂的参考文献Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)，本文将其并入作为参考。
可采用任何安全的施用途径将本发明的组合物施用于患者。例如可采用经口服、直肠、胃肠外、舌下、口腔、静脉、关节内、肌肉、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脑室内、经皮等等。例如，肌肉注射和皮下注射是施用免疫治疗性组合物、蛋白质疫苗和核酸疫苗的合适的方式。
剂型包括片剂、分散剂(dispersion)、混悬剂、注射液、溶液、糖浆、锭剂、胶囊、栓剂、气雾剂、经皮贴剂等等。这些剂型可包括专门为此目的而设计的注入式或植入式控释装置、或其他经过改良后可用于此目的的植入体。通过对治疗剂进行包被可实现治疗剂的控释，例如使用疏水性聚合物，包括丙烯酸树脂、石蜡、高级脂族醇(higher aliphaticalcohols)、聚乳酸和聚乙二醇酸以及某些纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethyl cellulose)。此外，也可采用其他聚合物基质、脂质体和/或微球体以实现控释。
适于口服或胃肠外施用的本发明的药物组合物可以是分散的单位如胶囊、小药囊(sachets)或片剂，分别含有一个预先确定的量的本发明的一或多种治疗剂，所述治疗剂为粉剂或颗粒或为水性液、非水性液、水包油乳剂或油包水液体乳剂质的溶液或混悬剂。可通过任何制药方法制备此类组合物，但所有的方法均包括将一或多种上述制剂与构成一或多种必要成分的载体相结合的步骤。通常，所述组合物通过将本发明的制剂与液体载体或细分的固体载体进行均匀地和密切地混合而制备，然后，如有必要，将产品制成所需的形状。
上述的组合物可以按照与剂量配方相适应的方式施用，施用的量是药物学有效剂量。根据本发明，施用于患者的剂量应该足以在一段适当的时间后对患者产生有益的反应。所施用的制剂的量取决于治疗对象的情况，包括其年龄、性别、体重和一般健康状况，这些因素由从业者进行判定。
本发明的免疫治疗性组合物可用于对动物例如人进行预防性或治疗性免疫。
不过，其他动物也适用，优选地为脊椎动物，包括家畜如牲畜和宠物。
如下文中将要详细说明的，本发明的疫苗的形式可以是VLP、RNA或DNA。
通过采用本发明的疫苗适当地表达免疫原性蛋白质和肽表位包括多表位，可诱导针对病毒、肿瘤、细菌、原虫以及其他无脊椎动物寄生虫的免疫应答。
优选地，所述免疫应答涉及诱导抗体、CD8+CTL和/或CD4+T细胞。
更优选地，所述免疫应答涉及诱导长期效应细胞CD8+CTL。
在一个具体的实施方案中，本发明人证实了以编码衍生自卵清蛋白的CTL表位的RNA和VLP疫苗进行免疫，能够在以表达卵清蛋白的B16黑色素瘤细胞进行的攻击实验中保护小鼠。
在另一个具体实施方案中，本发明人以编码完整HIV-1 gag基因的VLP疫苗进行免疫，能够在以表达HIV-1 gag基因的重组痘苗病毒进行的攻击实验中保护小鼠。
还应理解的是，本发明的免疫治疗性组合物和疫苗可以在某些实施方案中包括一种佐剂。
本领域可以理解，“佐剂”是指一或多种物质，所述物质可增强疫苗组合物的免疫原性和/或效力。合适的佐剂的非限制性实例包括异三十烷(squalane)和鲨烯(squalene)(或其他的动物来源油脂)；阻断共聚物(blockcopolymers)；去垢剂如Tween-80；QuilA，矿物油如Drakeol或Marcol，植物油如花生油；衍生自棒杆菌属(Corynebacterium)的佐剂如小棒杆菌(Corynebacterium parvum)；衍生自丙酸杆菌属(Propionibacterium)的佐剂如疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acne)；牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)(卡介苗或BCG)；白介素如白介素2和白介素12；单核因子如白介素1；肿瘤坏死因子；干扰素如γ-干扰素；一些组合形式如皂角苷-氢氧化铝(saponin-aluminium hydroxide)或Quil-A氢氧化铝；脂质体；ISCOM和ISCOMATRIX佐剂；分枝杆菌细胞壁提取物；合成的糖肽如胞壁酸二肽(muramyl dipeptide)或其他衍生物；Avridine；脂质A衍生物；硫酸葡聚糖；DEAE-葡聚糖或加上磷酸铝；羧基聚亚甲基(carboxypolymethylene)如Carbopol′EMA；丙烯酸共聚物乳剂如NeocrylA640(如U.S.专利No.5,047,238)；牛痘或动物痘病毒蛋白；亚病毒颗粒佐剂如霍乱毒素，或其混合物。
为了使得本发明能够容易地被理解和付诸实践，本领域人员可参照以下非限制性实施例。
实施例1
材料与方法
质粒。基于RNA(RNALeu)的和基于DNA(DNALeu)的KUN复制子载体具有2个拷贝的口蹄疫病毒(FMDV2A)的2A自身蛋白酶，一个位于克隆位点上游，另一个位于克隆位点下游，并在KUN NS1基因的第250位氨基酸处具有亮氨酸(Leu)(图1B)。RNAPro和DNAPro载体在第250位氨基酸具有脯氨酸(Pro)而不是Leu，它们是通过将RNALeu和DNALeu载体中跨过完整NS1基因的SphI-SphI片段，以来自KUN全长cDNA质粒250pro(16)的相应的SphI-SphI进行取代而构建的。用引物Mpt-F(5′GCGACGCGTCTAGAGCCAGCAACGAGAA-3′)和Mpt-R(5′-GTAACGCGTCTAAGTCCTCGGGGCCGG-3′)，自质粒pSTMPDV(50)中PCR扩增鼠多表位(Mpt)序列。PCR产物经MM消化后克隆入上述4种载体中的每一种的MluI位点，以分别产生质粒RNALeuMpt、RNAProMpt、DNALeuMpt和DNAProMpt(图1B)。
DNA和RNA转染，IF和Northern印迹分析。为进行DNA转染，使用Lipofectamine Plus转染试剂(Life Technologies，Melbourne，Australia)，按照制造商的说明，分别以2或0.4μg质粒DNA转染6孔板中或盖玻片上的BHK21细胞。如前所述(26)，以SP6 RNA聚合酶，自XhoI线性化的基于RNA的质粒DNA中体外转录RNA，并将其电穿孔至BHK21细胞中。转染后48小时，将载有转染细胞的盖玻片固定于冷丙酮中，并如前所述(56)，用抗NS3抗体，通过间接免疫荧光法(IF)分析KUN NS3蛋白的表达。如前所述(26)，使用代表KUN 3′UTR区域或Mpt序列的、32P标记的cDNA探针，对来自转染细胞的总RNA进行Northern印迹分析。
制备VLP。如前所述(28，52)制备VLP(VLPProMpt和VLPLeuMPT)。简言之，2×106BHK21细胞以大约10-20μg体外转录的RNAProMpt或RNALeuMPt RNA进行电穿孔，1.5kV，25μF，∝电阻，2次脉冲，中间间隔10秒。电穿孔后，将细胞稀释于8ml DMEM/10％FCS中，并培养于60mm培养皿中，置于37℃，CO2培养箱内。32小时后，将细胞胰蛋白酶化，用于以体外转录的表达KUN结构蛋白(SFV-MEC105)(28)的SFV复制子RNA，在相同条件下进行第二次电穿孔。第二次电穿孔后18小时，将培养基更换为3ml的DMEM/2％FCS，将细胞进一步孵育22小时。收集培养基并在8000xg离心，然后按1ml进行分装，储存于-70℃。以10倍系列稀释的VLP感染BHK21细胞，并在感染后30-40小时进行IF分析，计数NS3阳性细胞数，由此确定感染性VLP的滴度。
对小鼠进行免疫接种。雌性BALB/c(H-2d)小鼠(6-8周龄)由Animal Resources Centre(Perth，Western Australia)提供。用以下配方对小鼠进行免疫：(i)KUN复制子多表位DNA质粒，编码DNALeuMpt和DNAProMpt的、表达MptKUN复制子并注射至股四头肌(100μg于100μlPBS中，i.m.，每处腿部各50μl)；(ii)将体外转录的编码Mpt的KUN复制子RNA、RNALeuMpt和RNAProMpt溶于经DEPC处理的PBS并按上述进行注射(约30μg于100μl，i.m.，每处腿部50μl)；(iii)包装于VLP的复制子RNA、RNAProMPt或RNALeuMPT(分别为VLPProMpt和VLPLeuMpt)以溶于DMEM/2％FCS的形式输送，并i.p.注射(1ml中～5×105至106VLP)；(iv)常规质粒DNA疫苗、编码Mpt的pSTMPDV(100μg溶于100μl的PBS中，i.m.，每处股四头肌50μl)(50)；和(v)一种编码Mpt的重组痘苗病毒(107pfu，200μl RPMI 1640，i.p.)，如前所述(51)。
CTL分析。通过酶联免疫斑点法(enzyme linked immuno-spot(ELISPOT))，使用前述的最小CTL肽表位(31)计数分泌表位特异性IFN-γ的细胞。简言之，以5μg/mL的大鼠抗小鼠IFN-γ抗体(克隆RA-6A2，BD PharMingen，San Diego，USA)过夜包被平底96孔MultiScreen-HA纤维素酯膜微滴定板(Millipore Australia Ltd.，North Ryde，Australia)。然后将经过包被的平板以1％牛血清白蛋白(溶于PBS)在室温下封闭1小时，并以含有0.05％Tween 20(Sigma)的PBS洗涤3次。将脾细胞(1×106/孔)铺于ELISPOT平板的第一排孔中，并按2倍进行系列稀释。加入重组人IL-2(由Cetus Corp.，Emeryville，California，USA惠赠)(100IU/ml)和肽(Mimotopes，Clayton，Victoria，Australia)(1μg/ml)，将平板孵育18小时。裂解细胞，洗涤平板，并先以生物素化的抗小鼠IFN-γ抗体(克隆XMG 1.2)(BD PharMingen)孵育，然后以streptavidin-碱性磷酸酶(BD PharMingen)和Sigma Fast BCIP/NBT底物(Sigma)孵育，以检测IFN-γ斑点。以KS ELISPOT读数器(Carl Zeiss Vision GmbH，Hallbergmoos，Germany)计数斑点。
按照先前的方法(9)进行51Cr释放分析。简言之，以VLPProMpt对小鼠进行免疫，2-3周后处死小鼠，加入1μg/ml的肽(Mimotopes)对脾细胞在体外进行再次刺激6天。将得到的效应细胞群平分，并将等量的细胞以双份的形式与肽致敏的和非致敏的51Cr标记的P815靶细胞作用，效应细胞与靶细胞的比例是指定的。
痘苗病毒保护分析。各组(n＝6)6-8周龄的雌性Balb/c小鼠以大约30μg RNALeuMpt或对照(RNALeuControl)RNA免疫接种一次，3周后，给每只小鼠腹腔注射107pfu的编码鼠多表位(rVVMpt)(51)的重组痘苗病毒进行攻击实验。感染后第4天，取出双侧卵巢，洗涤并在1ml的PBS中以自动匀浆器进行匀浆。将100μl的卵巢悬液与含有1mg/ml的胰蛋白酶(Sigma)的900μl的PBS混合，在37℃孵育30分钟。将溶液简单离心，10,000xg，以去除杂质，将100μl上清液与900μl的RPMI/10％FCS培养基混合。然后通过在汇合的CV1细胞上进行斑点分析以测定卵巢中的痘苗病毒的滴度。以Wilcoxan rank-sum检验(7)计算实验组和对照组病毒滴度之间的差异的显著性。
肿瘤保护分析。表达卵清蛋白(B16-OVA)的B16黑色素瘤细胞(3)由Dr K.Rock(Dana-Farber Cancer Institute，Boston，USA)惠赠。给各组C57BL/6小鼠(n＝6)肌注两次～30μg的RNALeuMpt RNA或对照RNALeuControl RNA(间隔4周)或一次rVVMpt，进行免疫接种，末次接种2周后，在小鼠背部两处不同位置皮下注射B16-OVA细胞(每只小鼠105细胞)。注射前用电动剃刀去除注射部位周围的毛发，以便观察肿瘤的出现。监测肿瘤的生长，当肿瘤大小达到15mm×15mm时处死动物。在肿瘤攻击实验后的指定天数计算每组的平均肿瘤面积。以方差分析(45)计算各组之间的平均肿瘤生长的差异。记录动物被处死的时间并以Kaplan-Meier存活曲线(20)表示。以log-rank统计(20)计算存活曲线的差异。
在以VLPLeuMpt进行的肿瘤保护研究中，给雌性C57BL6(H-2b)小鼠(6-8周龄；n＝6)腹腔注射(i.p)这些VLP一次(VLPLeuMptx1)或两次(VLPLeuMptx2，间隔两周)；对照VLP(VLPLeucontrol)；或(iv)编码Mpt的重组痘苗病毒(rVVMpt)，以进行免疫接种。末次接种后2周，以5×105B16-OVA黑色素瘤肿瘤细胞皮下注射于2个不同部位对小鼠进行攻击实验。
结果
编码鼠多表位的KUN复制子在转染细胞内的有效复制。
将编码表达鼠多表位(Mpt)的KUN复制子cDNA的质粒DNADNALeuMpt和DNAProMpt转染至BHK21细胞，通过Northern印迹和IF分析测定相应的复制子RNA在细胞内的复制及其通过RNA聚合酶II的转录表达。通过电穿孔将体外合成的编码Mpt的KUN复制子RNARNALeuMpt和RNAProMpt转染至BHK21细胞，并分析其复制和表达。用KUN抗NS3抗体对转染细胞进行IF分析显示，在以基于DNA的复制子转染后，～50％的细胞为阳性，而在以基于RNA的复制子进行电穿孔后，～80％的细胞为阳性(图2A)。在以前的用KUN复制子RNA进行的电穿孔中，仅在这些RNA能够复制的情况下(26，27)IF才能检测到KUNNS3的表达。不过，转染编码KUNcDNA的质粒DNA的确导致可通过IF检测到KUN蛋白的表达，即使是在KUN RNA无法复制的情况下(30)。为确保细胞产生的来自转染的质粒DNA DNALeuMpt和DNAProMpt的复制子RNA是复制型的，我们通过用KUN特异性放射性标记的cDNA探针进行Northern印迹，对细胞总RNA进行分析(图2A)。将这些样品中的放射性信号的强度与分离自以相同量的产生复制缺陷型KUN复制子RNA的对照质粒DNA pKUNβrep2(dGDD)(53)转染的细胞的RNA样品进行比较，发现以DNALeuMpt和DNAProMpt转染的细胞所产生的KUN特异性RNA的量较以pKUNβrep2(dGDD)转染的细胞高大约5-10倍。以往对能够复制的和复制缺陷型的基于DNA的KUN复制子构建体的研究发现积聚的RNA的量存在相似的差异(53)。这些结果证实，细胞产生的来自转染的质粒DNA DNALeuMpt和DNAProMpt的复制子RNA是能够复制的。以KUN特异性cDNA探针对分离自以体外合成的RNARNALeuMpt和RNAProMpt电穿孔的细胞的总RNA进行Northern印迹分析(图2B)证实了IF的结果(图2A)，它们共同证实KUN复制子RNA在转染细胞内进行有效的复制和积聚。请注意，RNA转染的样品的细胞总RNA在凝胶中的上样量是DNA转染的样品的细胞总RNA上样量的2倍以上(图2B)，此外溴化乙啶凝胶染色发现相应(RNA转染的或DNA转染的)样品中核糖体RNA的浓度相似(数据未显示)。
为检查复制子RNA在细胞内复制过程中Mpt序列是否保留，以放射性标记的特异于Mpt序列的cDNA探针对含有相同RNA样品的膜(图2B左侧)进行再次分析。结果(图2B右侧)与用KUN特异性探针得到的结果一致(图2B左侧)，并明确证实，在复制子RNA在细胞内复制的过程中，Mpt序列确实保留。
产生含有Leu和Pro的构建体的目的是评价KUNNS1基因的第250位氨基酸的此种突变对KUN复制子RNA的复制和积聚所可能产生的影响，且因此产生的对被编码的HG在体外和体内的表达水平的影响。以往发现，KUNNS1基因第250位氨基酸由Pro(野生型)突变为Leu导致NS1蛋白不能发生二聚化。这引起病毒在Vero细胞中的复制延迟并减弱病毒在小鼠中的复制(16)。以等量的含有Leu和含有Pro的病毒感染Vero细胞，在第一个24小时内产生的含有Leu的病毒低于含有Pro的病毒大约100倍，但感染后48小时，含有Leu和含有Pro的病毒具有相似的产量。在体内实验中，需要大约100倍以上的含有Leu的病毒才能在小鼠中产生类似的疾病的临床症状(16)。在以KUN-Mpt复制子构建体进行的本研究中，以基于DNA的、含有Leu和含有Pro的复制子构建体转染的BHK21细胞中积聚的KUN RNA的量相似(比较图2B中的DNALeuMpt和DNAProMpt)，而以体外转录的RNA进行转染发现，以含有Leu的RNA转染的细胞中RNA积聚的水平略微高于以含有Pro的RNA转染的细胞(比较图2B中的RNALeuMpt和RNAProMpt)。如上所述，由溴化乙啶染色判断，核糖体RNA在相应的样品中是相似的。IF分析发现，转染RNALeuMpt RNA同样引起NS3阳性细胞比例轻度升高(图2A)。引人注目的是，RNAProMpt RNA转染后可见圆形(死亡的)NS3阳性细胞的数量明显高于RNALeuMpt RNA转染(图2A)，提示前者RNA具有更高的细胞致病性。以相应的KUN复制子载体RNA RNAPro和RNALeu进行转染后，含有Pro的变体和含有Leu的变体之间在细胞致病性方面也存在类似的差异(数据未显示)。
以基于DNA、基于RNA以及基于VLP的、表达多表位免疫原的KUN复制子免疫接种诱导CTL应答。
鼠多表位免疫原(Mpt)含有4种结合的H-2d限制性CTL表位；其包括YPHFMPTNL(一种来自鼠巨细胞病毒pp89的H-2Ld限制性表位)、RPQASGVYM(来自LCMV核蛋白的H-2Ld限制性表位)、TYQRTRALV(来自流感病毒核蛋白的H-2Kd表位)以及SYIPSAEKI(来自伯氏疟原虫(P.Berghei)环子孢子蛋白的H-2Kd表位)。以编码该Mpt免疫原的KUN复制子DNA、RNA和VLP免疫接种Balb/c小鼠一次，2-3周后，用IFN-γELISPOT测定针对该4种CTL肽表位中的每种的CTL应答(图3A)。由DNA、RNA或VLP KUN疫苗产生的应答ELISPOT与由编码相同多表位免疫原(rVVMpt)的重组痘苗病毒诱导的应答相当(图3A)，而显著高于由编码相同免疫原的常规DNA疫苗(31)所诱导的应答(见图4)。以往已经观察到表位应答具有层次(hierarchy)，RPQ特异性应答较YPH应答更有优势，而SYI应答较TYQ应答更有优势，据认为这反映了亚优势表位的较低的MHC结合亲和力(31)。尽管在转染的BHK21细胞中含有Pro的复制子似乎较含有Leu的复制子具有更强的细胞致病性(见前文)，但在诱导CTL应答方面这些变体之间没有明显差异(图3A和图4)。
小鼠经VLPProMpt免疫接种一次，通过51C释放分析对诱导CTL应答进行分析。观察到特异于每种表位的显著的CTL活性(图3B)。这些应答同样与以往用rVVMpt免疫接种一次的小鼠的应答(51)相当，并高于以常规的编码多表位免疫原的DNA疫苗(50)免疫接种2次的小鼠的应答。
以十倍系列稀释的基于DNA的KUN多表位复制子DNALeuMpt和DNAProMpt对小鼠进行免疫接种说明，仅用0.1μg的KUN复制子DNA单次免疫接种仍然能检测到CTL应答(图4)。由0.1μgKUN疫苗诱导的CTL应答的幅度与用100μg的常规质粒DNA多表位疫苗免疫接种所诱导的应答相当(图4)。
本节的数据说明，以三种不同方式(DNA、RNA和VLP)之任一种方式输送的KUN基于复制子的疫苗均能有效诱导CTL，其产生的应答的幅度与基于重组痘苗病毒的载体相当，而显著高于常规的DNA疫苗。免疫接种编码多表位的裸RNA或VLP保护小鼠对抗病毒和攻击实验。
为了确定免疫接种KUN复制子载体所诱导的CTL应答是否能够产生抗病毒攻击实验的保护作用，给小鼠免疫接种一次RNALeuMpt RNA或RNALeuControl RNA(由RNALeu载体DNA制备得到)，然后以rVVMpt进行攻击实验。rVVMpt攻击实验分析测定了由KUN疫苗呈递的所有4种H-2d限制性表位介导的保护作用。单次RNALeuMpt RNA免疫接种后，观察到卵巢rVV滴度显著下降(～70％)(图5A；p＝0.03)。采用常规的DNA多表位疫苗，只有进行2次免疫接种后才能得到与此相当的保护作用(50)。
Mpt序列还编码来自卵清蛋白的CTL表位，SIINFEKL(50，51)，因此可以用表达卵清蛋白的B16肿瘤细胞(B16-OVA)进行攻击实验以检测KUN免疫接种的肿瘤保护作用。小鼠以RNALeuMpt和RNALeuControl免疫接种2次或以rVVMpt免疫接种一次，然后以B16-OVA进行攻击实验。与RNALeuControl免疫接种的动物相比，在RNALeuMpt免疫接种的小鼠中肿瘤生长的速度明显较慢(p＜0.001)(图5B，上图)。此外，RNALeuMpt免疫接种的小鼠中肿瘤生长的平均速度也低于rVVMpt免疫接种的小鼠(p＝0.001)。同一实验还表示为Kaplan-Meier曲线(图5B，下图)，其显示的是在指定时间点小鼠存活的百分数。同样，RNALeuMpt免疫接种的小鼠明显优于RNALeuControl免疫接种的动物(p＝0.015)以及rVVMpt免疫接种的动物(p＝0.016)。
参照图5C，数据显示，与接种裸RNA相比，免疫接种VLPLeuMpt极大地提高了接受免疫的小鼠在B16-OVA肿瘤攻击实验中的存活。还注意到，2次免疫接种VLP(VLPLeuMptx2)较1次免疫接种VLP(VLPLeuMptx1)可改善存活率。
改良的病毒包装系统的产生和评价
采用三种不同方法以改良先前在国际申请WO 99/28487中开发的Kunjin复制子RNA包装系统，以便提高包装效率并简化包装方案。
(i)第一种方法涉及改良衍生自SFV的包装构建体SFV-MEC105，通过在第713位引入亮氨酸至脯氨酸的氨基酸突变以降低其致病性(SFVMEC/L713P；图7)。这使得Kunjin结构基因的表达延长而对SFVRNA复制无不良影响，并通过同时转染Kunjin和SFVMEC/L713P RNA而简化了包装方案。这些结果在表1和2中给出。以往试图采用同时转染Kunjin和SFV-MEC105 RNA，结果完全抑制了Kunjin RNA复制。
(ii)第二种方法涉及产生一种稳定的细胞系，其持续产生来自改良的非细胞致病性的SFV复制子RNA的Kunjin结构蛋白。为此，本发明人将一种IRES-Neo盒插入至SFVMEC/L713P构建体(SFVMEC/L713P/Neo；图8)中，并通过抗生素G418筛选建立了一种稳定表达细胞克隆。以Kunjin复制子RNA转染该细胞系使其能够复制并产生相对高滴度的Kunjin VLP(表3和4)。
(iii)第三种方法是产生一种稳定表达非细胞致病性的SFV复制子RNA pSFV3L713PLacZNeo(图9)的细胞系，以便用其扩增转染的SFV辅助RNA pSFVHelperprMEC(图10)和pSFVHelperCprME(图11)以表达Kunjin结构蛋白。当这两种辅助RNA之一与Kunjin复制子RNA一同转染至pSFVL713PlacZNeo细胞系时，SFV辅助RNA和KUN复制子RNA均可被扩增，这导致产生分泌型Kunjin VLP，尽管滴度相对较低(表5)。
细胞致病性和非细胞致病性的衍生自SFV的包装构建体之间产生KunjinVLP的相对效率。
首先，以转录自构建体如RNALeuMpt的Kunjin复制子RNA(含有异源性基因)对BHK21细胞进行电穿孔。然后，在32小时，用分别转录自pSFVMEC105或pSFVMECL713P的细胞致病性(cyto)或非细胞致病性的(noncyto)塞姆利基森林病毒RNA对这些Kunjin RNA转染的细胞进行电穿孔。然后如表1所示，在第二次转染后的不同时间收集此含有分泌型VLP的组织培养液。
或者，将Kunjin复制子RNA和非细胞致病性的SFV RNA同时转染至BHK21细胞内，并如表2所示，以不同的时间间隔收集此组织培养液。
还应该主要的是，如表1和2所示，选取Kunjin RNA与SFV RNA的不同比例以便使得VLP表达水平达到最佳。
Kunjin复制子RNA转染后Kunjin VLP在表达来自改良的非细胞致病性的衍生自SFV的包装构建体的Kunjin结构蛋白的稳定细胞系中的产生。
稳定细胞系SFVMECA12表达用于产生VLP的来自非细胞致病性的SFV复制子的Kunjin结构蛋白。该细胞系表达编码Kunjin结构蛋白的非细胞致病性的SFV复制。为了建立该细胞系，以SFVMECL713PNeoRNA(图8)转染BHK21细胞，并通过在含有1mg/ml G418的培养基中孵育而选出一个克隆，A12。然后以编码异源性基因如HIV GAG或鼠多表位(Mpt)的Kunjin复制子RNA进行电穿孔以评价该细胞克隆。以Kunjin复制子RNA电穿孔后，在不同时间点收集组织培养液，并通过感染分析和免疫荧光法测算VLP的滴度(表3)。
在进一步的实验中评价了不同孵育温度对产生VLP的影响。也就是说，以Kunjin复制子RNA对SFVMECA12细胞进行电穿孔后，将细胞孵育在37℃、33℃或37C/33℃(37℃过夜然后33℃)直至转染后50小时(表4)。
共转染表达Kunjin结构蛋白的SFVHelper RNA和Kunjin复制子RNA后，表达非细胞致病性的SFV复制子的稳定细胞系产生Kunjin VLP。
使用构建体pSFV3L713PlacZNeo建立表达非细胞致病性的SFV复制子和LacZ基因的稳定细胞系。该细胞系表达具有L713P突变的非细胞致病性的SFV复制子、所编码的Neo和LacZ基因。根据LacZ的表达监测这些细胞中的表达水平和均一性。选择不同的克隆进一步分析VLP的产生，即克隆C5、C6和C11。同时以Kunjin复制子RNA和两种SFV-Kunjin辅助RNA之一电穿孔每种细胞克隆。所述Kunjin复制子RNA编码异源性基因如HIV GAG或鼠多表位(Mpt)。所述SFV-Kunjin辅助RNA编码置于一种26S启动子控制下的Kunjin CprME基因盒(pSFVHelperCprME；图10)或者是置于两种不同26S启动子控制下的Kunjin prME和C基因(pSFVHelperprMEC；图11)，均克隆入pSFVHelper2载体。在转染后28小时和45小时收集组织培养液以检测颗粒产生的水平(表5)。
实施例2
材料与方法
质粒。基于RNA的和基于DNA的KUN复制子载体(分别为C20UbHDVrep和pKUNrep1)在克隆位点的上游含有小鼠泛素基因并在克隆位点的下游含有FMDV2A自身蛋白酶序列，将其用于构建含有HIV-1 gag基因的质粒。基本上，通过PCR自质粒pBRDH2-neo扩增完整的HIV-1 gag基因，引物为gagBssHII-F(5′-ACCATGGGCGCGAGCATCGGTATTA-3′)和gagBssHII-R(5′-CTAAAGCGCGCCTTGTGACGAGGGGTC-3′)。将PCR产物以BssHII消化并分别插入至此两种KUN载体的AscI位点以产生质粒KUNRNAgag和KUNDNAgag。
制备KUNgag VLP。基本上按照前述方法制备VLP，不同之处在于用大约30μg体外转录的KUNgag RNA对3×106 BHK21细胞进行电穿孔。电穿孔后32小时，将细胞以胰蛋白酶消化并进行第二次电穿孔，电穿孔使用的是自构建体SFVMEC105的一种细胞致病性较低的形式，即含有亮氨酸713被取代为脯氨酸的nsP2基因的SFVL713PMEC体外转录得到的RNA。第二次电穿孔后，将细胞在37℃孵育18小时，然后将培养基更换为6ml的DMEM-5％FCS，将细胞在33℃进一步孵育30小时。通过以10倍系列稀释的VLP感染Vero细胞并在感染后30-40小时进行免疫荧光分析计数NS3阳性细胞数量来确定感染性VLP的滴度。
对小鼠进行免疫接种。雌性BALB/c(H-2d)小鼠(6-8周龄)得自Animal Resources Centre(Perth，Western Australia)。将小鼠以下列之一进行免疫接种：(i)gag VLP溶于DMEM-5％FCS，腹腔内注射(i.p.)，每只小鼠大约1×106感染单位，以及(ii)编码HIV-1 gag的重组痘苗病毒(107pfu，溶于200μl的RPMI 1640，i.p.)。
间接ELISA。将96孔板以1μg纯化的重组p55抗原在4℃的抗原包被缓冲液中(15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.6)包被过夜。然后将各孔在50μl封闭缓冲液(0.25％Gelatin/0.1％Tween-20溶于PBS)中37℃孵育1小时进行封闭，并以洗涤缓冲液(0.05％Tween-20溶于PBS)洗涤3次。将来自经过免疫的小鼠的血清稀释于封闭缓冲液中，室温孵育1-2小时，然后洗涤3次。以第二抗体，即1∶2000稀释于封闭缓冲液中的缀合辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG，在室温下孵育30分钟。洗涤3次，然后，以50μl的K-Blue TMB底物(Graphic Scientific，Australia)在室温下避光孵育10分钟直至发生结合的缀合物得以显色。加入50μl的2 M H2SO4终止反应，使用ELISA平板读数器测定OD450吸光度读数。
Kunjin VLP中和分析。将200μl含有衣壳化的KUN载体复制子RNA(5×105IU)的KUN VLP与20μl的来自KUNgag VLP免疫接种的小鼠的3种不同的血清样品在37℃孵育1小时，所述小鼠经ELISA测定显示具有最高的gag抗体滴度。还将VLP在相同条件下进行无抗体孵育以及与KUN抗E单克隆抗体(Mab)进行孵育，作为分析的阳性和阴性对照。孵育后，通过用每种样品的稀释液感染Vero细胞而确定每种样品的滴度。用KUN抗NS3抗体进行IF分析并计数阳性点，计算滴度。
痘苗病毒保护分析。按照每只小鼠～106IU的KUNgag VLP，对各组(n＝5-6)6-8周龄的雌性Balb/c小鼠进行免疫接种(i)一次或两次(间隔4周)，3周后进行攻击实验，即每只小鼠腹腔注射107PFU的编码HIV-1gag(rVVgag(14))的重组痘苗病毒。感染后第4天，切除双侧卵巢，洗涤并使用电动研磨器在1ml的PBS中进行匀浆。通过在汇合的CV1细胞上进行斑点分析确定卵巢悬液中的痘苗病毒的滴度。采用Wilcoxonrank-sum检验计算实验组和对照组的病毒滴度之间的差异的显著性。
测定CD4+T细胞应答。雌性Balb/c(H-2d)小鼠(6-8周龄)得自Animal Resource Centre(Perth，WA)。小鼠(n＝4)经腹腔内注射(i.p)KUNgag VLP一次(KUNgagVLP)进行免疫接种或保持未免疫状态(原初(naive))。免疫后2周，将小鼠挑出并处死，取脾细胞(gag)或单纯的培养基(Media)在最后18小时中脉冲式加入3H胸苷。收集细胞于玻璃纤维上，测定配对物和β-射线。Gag脉冲的原初脾细胞在分析前一天制备；以RBC裂解缓冲液处理来自原初小鼠的脾细胞，并以2μg/ml的HIV-1 gag蛋白在体外脉冲过夜。
结果
接种表达HIV-1 gag的KUN复制子后诱导针对HIV Gag蛋白的抗体应答。
测定接种了2次KUNgag VLP(106IU每只小鼠)或1次编码HIV-1gag的重组痘苗病毒(rVVgag；107PFU每只小鼠)的小鼠的血清中的抗gag抗体。接种gag VLP的8只小鼠中的6只和接种rVVgag的4只小鼠中的3只对免疫接种产生应答，并在这些小鼠中检测到显著的抗gag抗体滴度(＞1∶12800)(图12)。这些抗体应答与免疫接种KUNgag VLP和rVVgag的小鼠的应答相似。
免疫接种KUN复制子VLP后未出现针对KUN VLP蛋白的中和抗体应答。
为了确定接种KUNgag VLP后是否出现针对KUN VLP表面的KUN包膜蛋白的中和抗体应答，我们通过将来自免疫接种KUNgag VLP的和未免疫接种的小鼠的血清与含有衣壳化KUN载体复制子RNA的KUNVLP进行孵育，进行感染性中和分析。未与任何抗体孵育的KUN VLP的滴度是2.8×106IU/ml。与来自未免疫接种的小鼠的3种不同血清孵育的KUN VLP的平均滴度是2.1×106IU/ml。当KUN VLP与针对KUN E蛋白的单克隆抗体孵育时，未观察到感染性。与来自2次接种KUNgagVLP的小鼠的3种不同血清孵育的KUN VLP的平均滴度是6.3×105IU/ml。非参数非配对Mann-Whitney检验显示，未免疫接种的小鼠的血清相比，在用来自接种KUNgag RNA的小鼠的血清进行的中和分析中，VLP滴度无显著性差异(p＜0.1)。因此，2次免疫接种KUNgag VLP后，没有观察到针对VLP中的KUN蛋白的明显的中和抗体应答。
以编码HIV-1 gag的KUN复制子进行的VLP颗粒免疫接种保护小鼠抵抗实验性病毒攻击实验。
为了确定由免疫接种KUN复制子载体诱导的CD8+T细胞应答是否能够保护抵抗病毒攻击实验，给各组的6只小鼠免疫接种1次或2次KUNgag VLP或者是不接种，然后以rVVgag进行攻击实验。1次免疫接种组中的6只小鼠中有3只(50％)而2次免疫接种组中的6只小鼠中有4只(67％)完全没有攻击实验病毒(表1)，说明产生完全的保护作用。KUNgag VLPx1组的1只小鼠携带的攻击实验病毒的滴度几乎与未免疫接种的小鼠(2×107)相同，提示免疫接种失败。因此，接种1次和2次KUNgag VLP的其余2只产生应答的小鼠的平均滴度分别为6.7×106IU/ml和1.3×105IU/ml，这说明在接种1次或2次的小鼠中，自107PFU的攻击实验病毒rVVgag，病毒复制的减少高达超过6个对数级。本节的结果证实，编码HIV-1 gag基因的KUN基于复制子的疫苗诱导了HIV-1gag特异性的保护性CTL应答，单次VLP免疫接种产生了较两次免疫接种裸RNA更加有效的保护作用。
编码HIV-1 gag的Kunjin VLP引发gag特异性CD4+T细胞应答。
进行的实验是要确定针对HIV-1 gag的抗体产生是否伴有来自CD4+T细胞的T细胞辅助。图13的数据指出，对于VLP gag免疫接种的小鼠，刺激指数(SI)为3.4，而对于原初小鼠，该SI为接近0。这些数据证实了在免疫接种的小鼠中存在VLPgag诱导的特异性的CD4 T细胞应答。
实施例3
诱导长期的保护性CD8 T细胞应答
方法
制备VLP。VLP的制备基本上如前所述，不同之处在于，用大约30μg体外转录的KUNgag RNA对3×106 BHK21细胞进行电穿孔。电穿孔32小时后，将细胞用胰蛋白酶消化，用体外转录的编码KUN结构蛋白的非细胞致病性塞姆利基森林病毒复制子RNA(衍生自SFV-MEC105的SFV-L713PMEC105；ref28)进行第二次电穿孔，并孵育48小时，然后收集分泌的VLP。通过以10倍系列稀释的VLP感染Vero细胞，并在感染后30-40小时进行IF分析计数NS3阳性细胞而确定感染性VLP的滴度。
对小鼠进行免疫接种。雌性BALB/c(H-2d)小鼠(6-8周龄)得自Animal Resources Centre(Perth，Western Australia)。小鼠以下列之一进行免疫接种：(i)100μg的KUNgag DNA，稀释于100μl PBS，并肌注(i.m.)于每条后腿的四头肌部位(每条腿50μl)，(ii)大约30μg的体外转录的KUNgag RNA，溶于100μl焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate)处理的，并肌注(每条腿50μl)，(iii)KUNgag VLP溶于Dulbecco modified Eaglemedium(DMEM)-5％FCS，注射于腹腔内(i.p.)，每只小鼠大约～1×106感染单位，(iv)编码鼠多表位的KUN VLP(KUNmpt VLP)，其含有4个H-2d限制性表位YPHFMPTML(YPH)、RPQASGVYM(RPQ)、TYQRTRALOV(TYQ)、SYIPSAEKI(SYI)(60)，并按照(iii)注射，以及(v)编码HIV-1 gag(WR TK-)的重组痘苗病毒(rVVgag)(2×107pfu溶于200μl PBS，i.p.)。
ELISPOT和铬释放分析。使用如前所述(34)的肽表位(Mimotopes，Clayton，Australia)通过ELISPOT分析计数表位特异性的分泌IFN-γCD8T细胞。采用非配对学生t检验确定各组之间的差异的显著性。使用免疫接种后2-3周处死的小鼠的脾细胞进行51Cr释放分析，且脾细胞以照射过的LPS母细胞(应答细胞∶刺激细胞比例20∶1)在体外再刺激6天，该LPS母细胞以AMQMLKETI肽致敏(25μg/ml处理1小时，200μl培养基，37℃，随后洗涤2次)。将得到的效应细胞群平分，并将等量的细胞以双份的形式与肽致敏的和非致敏的51Cr标记的P815靶细胞作用，效应细胞与靶细胞的比例是指定的。
痘苗病毒保护分析。给各组(n＝6)6-8周龄的雌性Balb/c小鼠(Animal Resources Centre，Perth，Australia)进行免疫接种，且和对照进行攻击实验，即每只小鼠腹腔注射106pfu的编码HIV-1 gag(rVVgag)的重组痘苗病毒(WR TK-)或等量的rVVmpt(参考文献31)。感染后第4天，切除双侧卵巢，洗涤并使用铝网在1ml的PBS中进行匀浆。通过在汇合的CV1细胞上进行斑点分析确定卵巢中的痘苗病毒的滴度。采用非参数非配对t检验计算实验组和对照组的病毒滴度之间的差异的显著性。
结果
给小鼠接种一次KUNgag VLP仅免疫，然后在2周和6个月后通过ELISPOT分析AMQ特异性应答。6个月时的应答较2周时无明显降低(p＝0.75，图14A)，说明KUNgag VLP疫苗诱导了长期持续的CD8 T细胞应答。与此类似，使用一种编码鼠多表位的KUN VLP(KUNmptVLP)，即一种编码4种H-2d限制性CD8 T细胞表位的疫苗进行免疫接种后，观察到存在长期的能够分泌IFN-γ的表位特异性CD8 T细胞。我们此前已经说明了在接种KUNmptVLP 2-3周后出现针对这4种表位的应答，而现在发现6个月后这些应答没有明显地减弱(图14B)，说明长期维持的CD8 T细胞应答并不局限于AMQ特异性CD8 T细胞。此外，使用编码同样4种表位的重组痘苗病毒对10个月前接种KUNmptVLP的小鼠进行攻击实验，依旧明显存在实质性的保护作用(图14C)。与对照小鼠相比，接种KUNmpt VLP的小鼠的卵巢病毒滴度平均下降大约120倍(p＝0.015)，83％的接种KUNmptVLP的小鼠中攻击实验病毒完全消失。
实施例4
选择适于在BHK细胞中持久复制的KUN复制子突变体
选择携带持久复制型KUN复制子RNA的嘌呤霉素抗性BHK细胞 克隆。以体外转录的repPACβ-gal RNA对BHK21细胞进行电穿孔，repPACβ-gal RNA具有与野生型KUN cDNA相同的序列，包括NS1中250位的Pro(参考文献16)。通过在含有5μg/ml嘌呤霉素的培养基中孵育7天建立嘌呤霉素抗性细胞克隆。将各个细胞克隆挑出并在含有嘌呤霉素的培养基中传代4代。经X-gal染色测定，细胞为100％β-gal阳性，通过β-半乳糖苷酶分析试剂盒(Promega)测定不同细胞克隆的β-gal表达情况。不同细胞克隆之间的β-gal表达水平具有很宽的范围(图15)。选出具有不同表达水平的两种差别明显的克隆No.11和No.20用于对KUN复制子RNA进行测序分析。
确定来自两种选定的细胞克隆的KUN复制子RNA的适应性突变。使用Absolutely RNA试剂盒(Qiagen)分离来自嘌呤霉素抗性细胞克隆No.11和No.20的KUN复制子RNA，RT-PCR扩增，并使用Big Dye测序试剂盒(Perkin Elmer)通过测序分析来确定完整的KUN复制子序列(不包括β-gal基因)。在自克隆20分离的KUN RNA中发现一种适应性突变(NS2A中的Asn101被Asp取代)，在分离自克隆11的KUN RNA中发现两种适应性突变(NS2A中的Ala30被Pro取代，以及NS5中的Pro270被Ser取代)(表7)。
适应性突变赋予在BHK细胞中达到持久复制的优势。通过定点PCR诱变，将由分离自克隆11和克隆20的KUN复制子RNA中鉴定出的适应性突变分别引入最初的repPACβ-ga1构建体以产生repPACβ-gal/NS2A(A-P)、repPACβ-gal/NS2A(N-D)和repPACβ-gal/NS5(P-S)。用野生型和突变的RNA对BHK细胞进行电穿孔，并在加入嘌呤霉素后第4天，通过嘌呤霉素抗性细胞克隆数目的差别评价适应性突变的效果(图16)。如图16所见，与野生型复制子相比，转染含有突变的RNA导致选择出更多数量的嘌呤霉素抗性细胞克隆，其中NS2A中Ala30被Pro取代的突变产生了最为有效的在BHK细胞中进行复制的适应性。
本发明人还发现，相同的突变还产生了在HEK293细胞中达到持久复制的优势。
综合讨论
本发明人已经证实，KUN复制子载体单次免疫就能够诱导针对其所编码的免疫原的CTL。所用三种输送模式，即裸RNA、质粒DNA以及VLP，均可有效诱导CD8+CTL应答。免疫接种裸复制子RNA和VLP同样保护小鼠抵抗病毒和肿瘤攻击实验。这些结果证实基于KUN复制子的疫苗载体能够用于诱导包括CD8+CTL和CD4+T细胞的保护性T细胞应答。与用重组痘苗病毒，即一种被广泛视作能够有效诱导CTL的载体的疫苗载体模型(44)相比，使用KUN复制子载体所得到的CTL应答的程度与之相当或更优越。目前正在测试一些痘病毒疫苗载体在灵长类和人类诱导保护性CTL的能力；这些包括改良的安卡拉痘苗病毒(vacciniaAnkara)(48)、禽痘病毒(43)和ALVAC(15)。
α病毒复制子已经被广泛用于在动物模型中诱导免疫应答，同时衍生自VEE病毒的复制子最近已经被批准用于人类临床前期试验( http：//www.alphavax.com/pp inhouse.html)。这里的结果显示KUN复制子可通过三种不同的模式输送：作为裸RNA、作为质粒DNA以及作为VLP。仅仅以0.1μg的KUN基于DNA的复制子进行免疫接种就足以诱发CTL应答。而要达到相似的CTL诱导水平，则需要免疫接种剂量为1000倍以上(100μg)的常规质粒DNA疫苗(图4)。
本发明的一个具体的方面涉及RNA免疫接种。裸RNA免疫接种可避免涉及DNA整合的问题，并具有优于免疫接种VLP的其他的优势。不同于裸RNA，免疫接种VLP有可能导致诱导针对VLP结构蛋白的中和抗体应答，这一现象可能会限制VLP在个体中的使用次数。基于RNA的疫苗还较VLP更容易制造。最近的报道还提示RNA能够被包囊化入微颗粒中，并通过以基因枪轰击的方法施用于动物(37，54)。还发现包囊化的RNA能够在4℃稳定8-12个月。
本发明人已经发现，以KUN复制子疫苗进行RNA免疫接种可诱导特异于所编码的免疫原的CTL应答，其效率堪与使用基于DNA的或基于VLP的KUN复制子进行免疫接种所达到的效率相媲美(图3A)。使用KUN或SIN复制子进行RNA免疫接种还可在多种肿瘤模型中诱导显著的抗肿瘤保护作用(图5B)(58)。
黄病毒的一个独特的特征可证实使用其复制子作为安全的疫苗载体是有益的。总体而言，尚未发现黄病毒在天然存在的不同病毒或病毒株之间发生重组的迹象。我们以前使用缺陷型全长KUN RNA和复制子RNA作为辅助物进行的多个补充实验也没有发现这两种(全长和复制子)在同一细胞中共同复制的RNA之间有任何重组迹象，尽管两种RNA存在具有高度相同性的长区域(总结于参考文献29)。用在NS1基因中含有缺失的黄热病毒RNA进行的补充实验中，当补充来自同源性(黄热病病毒)或来自异源性(登革热病毒)病毒的辅助NS1(34，35)时，也没有检测到导致恢复重组病毒的重组。黄病毒的这种特征不同于文献中广泛记载所α病毒RNA的重组能力(18，42，46)，因此当个体在免疫接种之前或之后的一段时间感染同一种或其他黄病毒时，其为该个体提供的免疫接种具有高水平的安全性。此外，使用来自完全不相关的病毒SFV的、用于表达KUN结构蛋白的、基于RNA的复制子载体的KUN复制子包装系统的异源性特性，以及表达构建体的特殊设计，使得KUN VLP制剂绝对安全，并且不含任何感染性重组病毒物质(28，52)。
或许KUN复制子最具区别性的特征之一在于其复制不会引起明显的细胞致病效应(CPE)或凋亡(26，52，53)。有文献报道，含有疫苗抗原的感染细胞的CPE或凋亡是一种有效的交叉诱导(cross priming)方法，结果是疫苗抗原被输送至树突状细胞(DC)并有效诱导CTL(2，58)。不过，尽管其在体外的细胞致病性水平很低或检测不到(含有Leu的变体；图2A)，KUN复制子可在小鼠中有效诱导CTL应答(图3和4)。此外，在含有Leu和含有Pro的KUN复制子载体变体所诱导的CTL中没有观察到显著的区别(图3和4)，而以两者转染的BHK21细胞则出现不同程度的细胞致病性(图2A)。因此，KUN复制子诱导CTL可能不依赖于凋亡介导的交叉诱导(5)和/或可能不需要交叉诱导。已经发现，黄病毒能够直接感染、复制并激活DC(19，21，22，32，57)，提示KUN复制子可能同样能够在DC中复制并产生疫苗抗原。疫苗载体直接感染DC可能代表了一种较交叉诱导更为有效的CTL诱导策略(49)。最近发现，嗜淋巴细胞性VEE复制子颗粒以及DC适应性SIN复制子颗粒能够感染DC并表达由其编码的疫苗抗原(14，36)。不过，α病毒复制子RNA的细胞致病性可引起抗原呈递DC的凋亡并降低CTL的激活或诱导。与此不同，具有有限细胞致病性的KUN复制子可使得抗原在DC中长期表达，而不会引起凋亡；这一特征可以促使对CTL应答产生长期的刺激。由于持续存在双链RNA，而这被认为可诱导危险信号并激活DC(13)，因此诱导耐受的可能性不大。
或许免疫接种KUN VLP的最不同寻常的结果持续存在长达6-10个月的CD8+T细胞应答，能够在rVV攻击实验分析的4天内引起立即分泌IFN-γ并介导保护作用(图14)。长期存在能够立即产生保护性活性的CD8 T效应细胞可以成为有效的抗HIV免疫接种的一个重要特征，这是因为，攻击实验后自疫苗诱导的记忆性CD8 T细胞库中产生新的效应细胞的确是太慢了，其可能无法有效对抗迅速扩张的逆转录病毒的感染。
总之，已经发现，KUN复制子是诱导长期的、具有保护性的CD8+T细胞的有效的疫苗载体，并代表了癌症和HIV疫苗中的一种很有吸引力的新模式。
本说明书的目的在于结合优选实施方案对本发明作出说明，而非是要将本发明限制于任何一种实施方案或是各种特征的具体集合。在不脱离本发明的宽泛的精神和范围的条件下，可以对在此所述的实施方案作出各种变动和改良。
本说明书中引用的所有计算机程序、演算法、专利以及科技文献均以其全文并入本文作为参考。
表1
    KUN/SFV              第2次转染后不同时间的滴度(感染单位/ml)
  23h     37h   45h     61h
    KUN/SFVMEC1051∶1   3.8×104     7.8×104   1.8×105     1.6×105
    KUN/SFVL713MEC1∶1   8×103     1.5×104   2.3×104     2.6×104
    KUN/SFVL713MEC2∶2   3×103     2.8×104   5.1×104     4.8×104
    KUN/SFVL713MEC1∶2   5.8×104     1.1×104   1.4×104     nd
表2
    KUN/SFV比               转染后不同时间的滴度(感染单位/ml)
  24h     42h     51h     66h
    KUN/SFVL713MEC1∶1   1×102     2.3×103     3.5×103     9.4×103
    KUN/SFVL713MEC2∶2   4×102     4.4×103     7.1×103     9×103
    KUN/SFVL713MEC1∶2   0     1.9×103     5.1×103     9.2×103
表3
           转染后不同时间的VLP滴度(感染单位/ml)
  39h     48h     63h     72h
 Kun-GAG VLPs   2×105     2.6×105     1.9×105     2×105
 Kun-Mpt VLPs   7×105     2.7×105     2.3×105     -
表4
 SFVMECA12细胞+Kun GAG RNA         滴度(感染单位/ml)
    实验1     实验2
 37℃50h     6×105     1.4×105
 33℃50h     1.3×106     5×104
 37℃18h/33℃32h     -     4×105
表5
  细胞克隆# 转染的RNA         滴度(感染单位/ml)
    28h     45h
  C5 SFVHelperCprME+KUN-GAG     1.3×103     3×104
  C6 SFVHelperCprME+KUN-GAG     2.9×104     5.7×104
  C11 SFVHelperCprME+KUN-GAG     2×104     1.5×105
表6
组                      rVVGag滴度                             降低的倍数
    对照(n＝5)   2.8×107
    KUNgagVLP×1(n＝6)   3小鼠(50％)-＜101小鼠  -2×1031小鼠  -3.5×1041小鼠  -2×107  ＞2500000140008001.4
    KUNgagVLP×2(n＝6)   4小鼠(67％)-＜101小鼠  -1.5×1041小鼠  -2.5×105  ＞25000001867112
表7
蛋白位置   氨基酸    野生型   克隆11   克隆20
 NS2ANS2ANS5    30101270     Ala(A)Asn(N)Pro(P)   Pro(P)--Ser(S)   --Asp(D)--
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Claims (64)

1.一种表达载体，其包含：
(i)一种编码不能产生感染性病毒的黄病毒复制子的核苷酸序列，其中所述的黄病毒复制子编码一或多种突变的黄病毒非结构蛋白；
(ii)一个异源性核酸的插入位点；
(iii)可操纵地连接于编码所述的黄病毒复制子的核苷酸序列的启动子；以及
(iv)至少一种编码自身蛋白酶的核苷酸序列。
2.权利要求1的表达载体，其包含两种编码自身蛋白酶的核苷酸序列，其中所述的至少两种编码自身蛋白酶的核苷酸序列中的第一种位于所述的插入位点的5′，而所述的至少两种编码自身蛋白酶的核苷酸序列中的第二种位于所述的插入位点的3′。
3.权利要求1的表达载体，其中所述的编码自身蛋白酶的核苷酸序列分别编码一种口蹄疫病毒2A自身蛋白酶。
4.权利要求1的表达载体，其中(i)中所述的突变的黄病毒非结构蛋白选自如下一组：
(i)脯氨酸250突变为亮氨酸的非结构蛋白NS1；
(ii)丙氨酸30突变为脯氨酸的非结构蛋白NS2A；
(iii)天冬酰胺101突变为天冬氨酸的非结构蛋白NS2A；以及
(iv)脯氨酸270突变为丝氨酸的非结构蛋白NS5。
5.权利要求1的表达载体，进一步包含分别编码C蛋白的前20个氨基酸(C20)和E蛋白的最后22个氨基酸(E22)的核苷酸序列。
6.权利要求1的表达载体，其中所述的复制子包含一或多种分别编码选自NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B或NS5的野生型黄病毒非结构蛋白的核苷酸序列。
7.权利要求1的表达载体，其中所述的复制子衍生自Kunjin病毒。
8.权利要求1的表达载体，其是SP6KUNrep5或pKUNrep5。
9.权利要求2的表达载体，其是SP6KUNrep6或pKUNrep6。
10.一种表达构建体，其包含：
(i)一种编码不能产生感染性病毒的黄病毒复制子的核苷酸序列，其中所述的黄病毒复制子编码一或多种突变的黄病毒非结构蛋白；
(ii)一种异源性核酸；
(iii)可操纵地连接于编码所述的黄病毒复制子的核苷酸序列的启动子；以及
(iv)至少一种编码自身蛋白酶的核苷酸序列。
11.权利要求10的表达构建体，其包含至少两种编码自身蛋白酶的核苷酸序列，其中所述的至少一种编码自身蛋白酶的核苷酸序列中的第一种位于所述的异源性核酸的5′，而所述的至少一种编码自身蛋白酶的核苷酸序列中的第二种位于所述的异源性核酸的3′。
12.权利要求10的表达构建体，其中所述的编码自身蛋白酶的核苷酸序列分别编码一种口蹄疫病毒2A自身蛋白酶。
13.权利要求10的表达构建体，其中(i)中所述的突变的黄病毒非结构蛋白选自如下一组：
(i)脯氨酸250突变为亮氨酸的非结构蛋白NS1；
(ii)丙氨酸30突变为脯氨酸的非结构蛋白NS2A；
(iii)天冬酰胺101突变为天冬氨酸的非结构蛋白NS2A；以及
(iv)脯氨酸270突变为丝氨酸的非结构蛋白NS5。
14.权利要求10的表达构建体，进一步包含分别编码C蛋白的前20个氨基酸(C20)和E蛋白的最后22个氨基酸(E22)的核苷酸序列。
15.权利要求10的表达构建体，进一步包含分别编码选自NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B或NS5的一种野生型黄病毒非结构蛋白的核苷酸序列。
16.权利要求15的表达构建体，其中所述的黄病毒复制子衍生自Kunjin病毒。
17.权利要求10的表达构建体，其中所述的异源性核酸编码一种免疫原性蛋白质。
18.权利要求17的表达构建体，其中所述的免疫原是一种具有表位序列YPHFMPTNL、RPQASGVYM、TYQRTRALOV、SYIPSAEKI和SIINFEKL中的一或多种的鼠多表位蛋白。
19.权利要求17的表达构建体，其中所述的免疫原性蛋白质是HIVgag蛋白。
20.权利要求10的表达构建体，其是一种RNA构建体。
21.权利要求20的表达构建体，其是RNALeuMpt、RNAProMpt或KUNRNAgag。
22.权利要求10的表达构建体，其是一种DNA构建体。
23.权利要求22的表达构建体，其是DNALeuMpt、DNAProMpt或KUNDNAgag。
24.包含权利要求10的表达构建体的宿主细胞。
25.一种表达系统，其包含：
(i)权利要求10的表达构建体；和
(ii)至少另一种能够表达一或多种蛋白的表达构建体，所述的蛋白有助于将所述的表达构建体包装入黄病毒病毒样颗粒(VLP)。
27.权利要求25的表达系统，其中所述的另一种表达构建体衍生自塞姆利基森林病毒(SFV)或新培斯病毒(SIN)。
28.权利要求27的表达系统，其衍生自SFV。
29.权利要求27的表达系统，进一步包含SFV的突变的nsP2基因。
30.权利要求29的表达系统，其中所述的SFV的突变的nsP2基因编码一个由亮氨酸713至脯氨酸的取代。
31.权利要求30的表达系统，其中所述的至少另一种表达构建体是SFVMEC/L713P/Neo、pSFV3L713PLacZNeo或SFVMEC/L713P。
32.一种宿主细胞，其包含选自SFVMEC/L713P/Neo、pSFV3L713PLacZNeo或SFVMEC/L713P的所述的至少另一种表达构建体。
33.权利要求32的宿主细胞，其是以SFVMEC/L713P/Neo或pSFV3L713PLacZNeo稳定转染的BHK21细胞。
34.权利要求32的宿主细胞，其进一步包含权利要求10的表达构建体。
35.权利要求34的宿主细胞，其产生一或多种包含编码一种免疫原性蛋白质的RNA的VLP。
36.一种药物组合物，包含一种可在动物细胞中自其转录得到RNA的黄病毒DNA表达构建体和一种药物学可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述的转录得到的RNA编码：
(i)一种不能产生感染性病毒的黄病毒复制子；和
(ii)一种免疫原性蛋白质。
37.一种药物组合物，包含一种可自黄病毒DNA表达构建体转录得到的RNA和一种药物学可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述RNA编码：
(i)一种不能产生感染性病毒的黄病毒复制子；和
(ii)一种免疫原性蛋白质。
38.权利要求36或37的药物组合物，其中所述的黄病毒DNA表达构建体包含：
(i)编码一种不能产生感染性病毒的黄病毒复制子的DNA序列，其中所述的黄病毒复制子编码一或多种突变的黄病毒非结构蛋白；
(ii)一种编码所述免疫原性蛋白质的异源性DNA；
(iii)一种在动物细胞内可操纵的启动子，且该启动子可操纵地连接于所述编码黄病毒复制子的DNA序列；和
(iv)至少一种编码自身蛋白酶的核苷酸序列。
39.权利要求36或37的药物组合物，其中所述的黄病毒是Kunjin病毒。
40.权利要求36或37的药物组合物，其是一种疫苗。
41.权利要求40的疫苗，其在施用于动物后能够引发一种保护性T细胞应答。
42.权利要求41的疫苗，其中所述的T细胞应答是CTL应答。
43.权利要求42的疫苗，其中所述的CTL应答的特征在于一种长期的效应细胞CD8+T细胞应答。
44.权利要求43的疫苗，其中所述的免疫原是一种病毒蛋白质。
45.权利要求44的疫苗，其中所述的病毒蛋白质是HIVgag。
46.权利要求40的疫苗，其中所述的动物是一种哺乳动物。
47.权利要求46的疫苗，其中所述的哺乳动物是人。
48.一种疫苗，包含由权利要求20的表达系统产生的一或多种VLP，其中所述的VLP包括一种编码所述的免疫原性蛋白质的RNA。
49.权利要求48的疫苗，其中所述的免疫原性蛋白质是一种病毒蛋白质。
50.权利要求49的疫苗，其中所述的病毒蛋白质是HIVgag。
51.一种免疫动物的方法，包括将权利要求40或权利要求48的疫苗施用于所述的动物的步骤从而在所述的动物中诱导免疫。
52.权利要求51的方法，其中所述的免疫是抗体介导的。
53.权利要求51的方法，其中所述的免疫是细胞介导的免疫。
54.权利要求53的方法，其中所述的免疫是T细胞介导的免疫。
55.权利要求54的方法，其中T细胞免疫的特征在于CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。
56.权利要求55的方法，其中T细胞免疫的特征在于诱导一种长期的效应细胞CD8+CTL应答。
57.权利要求56的方法，其中T细胞免疫的特征在于CD4+T细胞应答。
58.权利要求51的方法，其中在所述的动物中诱导针对病毒感染的免疫。
59.权利要求51的方法，其中在所述的动物中诱导肿瘤免疫。
60.权利要求59的方法，其中在所述的动物中诱导针对黑色素瘤的免疫。
61.权利要求51的方法，其中所述的动物是哺乳动物。
62.权利要求60的方法，其中所述的哺乳动物是人。
63.一种选自SFVMEC/L713P/Neo、pSFV3L713PLacZNeo或SFVMEC/L713P的包装构建体。
64.一种包含权利要求63的包装构建体的宿主细胞。
65.权利要求64的宿主细胞，其是以SFVMEC/L713P/Neo或pSFV3L713PLacZNeo稳定转染的BHK21细胞。
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