CN108601823A - 用于改性树枝状聚合物纳米颗粒疫苗递送的组合物和方法 - Google Patents
用于改性树枝状聚合物纳米颗粒疫苗递送的组合物和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108601823A CN108601823A CN201680067059.XA CN201680067059A CN108601823A CN 108601823 A CN108601823 A CN 108601823A CN 201680067059 A CN201680067059 A CN 201680067059A CN 108601823 A CN108601823 A CN 108601823A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mdnp
- antigen
- rna
- cell
- nano particle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0012—Lipids; Lipoproteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
- A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/64—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the architecture of the carrier-antigen complex, e.g. repetition of carrier-antigen units
- A61K2039/645—Dendrimers; Multiple antigen peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/14011—Filoviridae
- C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
- C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/36011—Togaviridae
- C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
- C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
Abstract
已研发出用于将例如大repRNA分子的治疗剂、预防剂和/或诊断剂以改性树枝状聚合物纳米颗粒(“MDNP”)递送到受试者的细胞中的组合物和方法。MDNP能够有效地驱动针对细胞内抗原的抗原特异性T细胞的增殖,并且增强抗原特异性抗体反应。MDNP能够通过复合来递送两个或更多个不同的repRNA来修改所编码抗原的表达动力学并且同时递送包括相同UTR元件的repRNA和mRNA来促进所编码抗原的表达。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年9月23日提交的U.S.S.N.62/222,515的优先权,其以全文并入本文中。
关于联邦赞助的研究或开发的声明
本发明是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予给Daniel G.Anderson和Robert S.Langer的NIH拨款号CCNE6924942和由美国军方授予给Daniel G.Anderson和Robert S.Langer的联合作战部队医疗研究计划(Joint WarfighterMedical Research Program)拨款号6930216的政府支持下完成的。美国政府在本发明中享有一定权利。
技术领域
本发明大体上涉及分子递送系统领域,并且更具体来说,涉及用于向受试者递送核酸、抗原或小分子来预防或治疗疾病和/或病况的树枝状聚合物纳米颗粒。
背景技术
接种疫苗仍然是预防传染病的最有效方法。据世界卫生组织(World HealthOrganization,WHO)报道,目前已有许可的疫苗可用于预防或帮助预防和控制二十五种感染(世界卫生组织,2011-2020全球疫苗行动计划(Global Vaccine Action Plan),日内瓦(Geneva),2012)。
但是,目前用于递送肽疫苗抗原的方法常常依赖于快速生产能力有限和影响免疫反应的类型、持续时间和效力的相关工程参数上有限的技术。虽然某些疫苗策略能够有效地利用蛋白质抗原,但是定制肽常常缺乏免疫原性潜力并且需要使用大量佐剂,而且可能最适合作为体外筛选工具。
近来,RNA渐渐成为了一种引人注目的抗原载体。已在小鼠模型中使用mRNA证明了短(<30aa)新抗原序列的免疫治疗潜力(Bhadury等人,《瘤形成》(Oncogenesis)2,e44,doi:10.1038/oncsis(2013))。然而,作为免疫载体,研究过纯mRNA,取得了不同程度的成功,尤其是在癌症免疫疗法领域中。裸mRNA的给予能够在直接注射到淋巴结中时赋予抗肿瘤免疫力(Kreiter等人,《癌症研究》(Cancer Res)70,9031-9040,(2010);Van Lint等人《癌症研究》72,1661-1671,(2012))。还研发过大的复制RNA(repRNA)来递送疫苗抗原到细胞。RepRNA通过与宿主细胞的核糖体机制相互作用来翻译和复制。因此,RepRNA提供模板以增加RNA分子翻译的数目,这又增加了抗原产生的轮数,从而引起抗原表达相对于mRNA延长(McCullough等人,《核酸分子疗法》(Molecular Therapy-Nucleic Acids),3,e173(2014))。
然而,纯化后的RNA非常不稳定,并且极其容易降解,例如被核酸酶、羟基自由基、紫外光以及Mg2+介导的内部攻击降解。此外,受到限制的跨细胞膜易位和相当大的肝清除率严重限制了基于RNA的药物化合物的潜在应用,基于RNA的药物化合物如siRNA、mRNA,并且尤其是大的复制RNA。RepRNA的翻译和后来的复制均使得它对核糖核酸酶特别敏感,核糖核酸酶能够很容易地破坏核糖体进入或基因翻译。因此,将完整的、从功能上来说活的RNA分子递送到细胞内仍然是基于RNA的技术的治疗应用的主要挑战。
研发过基于活减毒病毒的疫苗,如无传染性的病毒体和病毒样颗粒(virus-likeparticle,VLP),并取得了某种程度的成功。令人遗憾的是,目前基于活减毒病毒的疫苗的生产方法所需的生产时间长。基于受精卵的方法和更新的细胞生物反应器方法需要数个月的前置时间。VLP的生产还取决于所培养的细胞。以基于腺病毒、AAV、CMV、rVSV以及各种α病毒的病毒样颗粒形式给予的基因疫苗因为预先存在的或诱导出来的抗载体免疫力所以使用受到限制,抗载体免疫力会妨碍重复给药。
基于生物材料的纳米颗粒,如阳离子聚合物(cationic polymer,CP)的“聚合复合物(Polyplexes)”,也显示出了递送核酸和蛋白质到哺乳动物细胞中的能力。然而,CP聚合复合物和相关核酸常常因为盐和血清组分而变得不稳定,并且会在生理流体中分裂或聚集(Al-Dosari等人《美国药学科学家协会杂志》(AAPSJ.)11,671-681(2009);Tros deIlarduya等人《欧洲药物科学杂志》(Eur.J.Pharm.Sci.)40,159-170(2010)),而且认为它们作为体内递送封装剂于细胞的媒剂效率低下。此外,许多阳离子聚合物显示出细胞毒性(Tros de Ilarduya等人《欧洲药物科学杂志》40,159-170(2010);Gao等人《生物材料》(Biomaterials)32,8613-8625(2011);Feigner等人《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)269,2550-2561(1994);Kafil等人《生物影响》(Bioimpacts)1,23-30(2011);Lv等人《控释杂志》(JContr.Rel.)114,100-109(2006))。
各种纳米颗粒形式通过皮内(Hoerr等人,《欧洲免疫学杂志》(Eur J Immunol),30,1-7(2000))、脾内(Zhou等人,《人类基因疗法》(Hum Gene Ther),10,2719-2724(1999))、皮下(Pollard,C.等人,《分子疗法》(Mol Ther),21,251-259(2013))、静脉内(Hoerr等人,《欧洲免疫学杂志》,30,1-7(2000);Mockey等人,《癌症基因疗法》(CancerGene Ther),14,802-814(2007))、甚至鼻内(Phua等人,《科学报告》(Sci Rep),4,5128,(2014))给药途径展现出功效。但是,这类方法中只有少数几种通过了临床试验。虽然有报道过在人类中的免疫保护的相关联系,但是临床功效令人失望(Weide等人,《免疫疗法杂志》(J Immunother),31,180-188,(2008);Weide等人,《免疫疗法杂志》,32,498-507,(2009);Rittig等人,《分子疗法》(Mol Ther),19,990-999,(2011);Kreiter等人,《免疫学新见》(Curr Opin Immunol),23,399-406,(2011))。在经过皮内免疫的鼠、白鼬和猪的流感感染模型中,鱼精蛋白复合mRNA给药显示出成功迹象(Petsch等人,《自然·生物技术》(NatBiotechnol),30,1210-1216,(2012))。
大RNA分子,如基于repRNA的治疗剂,存在另外的有效体内递送问题。RNA分子在未经过修饰时容易发生细胞内降解,mRNA表达是短暂的,并且因为RNA本身固有的免疫原性导致了翻译阻遏(Kariko等人,《生物化学杂志》(J Biol Chem),279,12542-12550,(2004);Pichlmair等人,《科学》(Science),314,997-1001,(2006);Levin等人,《生物化学杂志》,256,7638-7641(1981)),这些全都限制了功效。用于部署疫苗的递送化合物的免疫原性和/或毒性则是另一种并发症。在一些应用中有效(Geall等人,《美国国家科学院院刊》(ProcNatl Acad Sci USA),109,14604-14609,(2012))的阳离子脂质当以较高剂量使用时并且如果不完全复合,是有毒的(Hofland等人,《美国国家科学院院刊》,93,7305-7309(1996);Li等人,《基因疗法》5,930-937,(1998);Lv等人,《控释杂志》(J Control Release),114,100-109,(2006))。它们取决于高正ζ电位以进行有效递送,该ζ电位因为体内血清中的中和而可能变成限制因素(Mirska等人,《胶体和表面B:生物界面》(Colloids Surf BBiointerfaces),40,51-59(2005))。此外,阳离子脂质具有免疫原性,这会限制转基因表达,而且提高了安全隐患(Henriksen-Lacey等人《分子药剂学》(Mol Pharm),8,153-161,(2011))。实际上,响应于mRNA的IFN产生会限制基于mRNA的疫苗的功效(Pollard等人,《分子疗法》,21,251-259(2013))。使用阳离子脂质产生的脂质纳米颗粒在其配制品中通常还需要额外的稳定赋形剂,这增加了最终产品的成本和复杂性。
需要能够有效地将如完整遗传物质的封装剂递送到受试者细胞中的改良系统。
因此,本发明的目标是提供通过施加最小的或不施加免疫原性和细胞毒性的递送媒剂来进行核酸、蛋白质和小分子的细胞内递送的组合物和方法。
本发明的另一个目标是提供将两个或更多个repRNA分子同时递送到细胞内部的方法和组合物。
本发明的另一个目标是提供靶宿主细胞对外源基因的持续表达的组合物、方法和装置。
本发明的另一个目标是提供用于将治疗性分子递送到受试者细胞中的方法和组合物。
发明内容
提供用于向受试者递送治疗剂、预防剂和/或诊断剂的改性树枝状聚合物纳米颗粒(modified dendrimer nanoparticle,“MDNP”),治疗剂、预防剂和/或诊断剂例如核酸、抗原或小分子,包括大repRNA分子,已研发出用于递送到受试者细胞的MDNP。MDNP能够有效地驱动针对细胞内抗原的抗原特异性CD8+ T细胞的增殖,并且增强针对特定抗原的抗体反应。纳米颗粒包括一种或多种烷基化树枝状聚合物;一种或多种两亲性聚合物,如PEG-脂质聚合物,其通过疏水性末端部分附接到NP;以及待递送的治疗剂、预防剂或诊断剂。
待递送的药剂典型地是多核苷酸、蛋白质或肽、或小分子。优选实例包括复制RNA,最优选地是编码抗原的复制RNA。在一些实施例中,纳米颗粒包括两个或更多个能够编码相同或不同抗原的复制RNA,这些复制RNA可以按不同速率在受试者细胞中表达。在一些实施例中,纳米颗粒包括一个或多个复制RNA和一个或多个信使RNA。信使RNA中的一个或多个可以经过修饰以包括复制RNA的5'和3'非翻译区。
在其它实施例中,纳米颗粒包括一个或多个能够引起针对相应靶基因的干扰活性的RNA,如微小RNA(miRNA);短干扰RNA(siRNA)以及长度是至少24个核苷酸的双链RNA(dsRNA)。在一些实施例中,将RNA以约5:1的RNA:树枝状聚合物摩尔比包装在纳米颗粒内。纳米颗粒的大小典型地介于30nm与450nm之间且包括端值,优选介于60nm与190nm之间且包括端值。
纳米颗粒典型地由一种或多种烷基化树枝状聚合物形成,如聚丙烯亚胺四胺和聚(酰胺胺)。示范性烷基化树枝状聚合物包括1到7代树枝状聚合物。在一些实施例中,树枝状聚合物中的一个或多个通过添加环氧化物封端的烷基链来改性。环氧化物封端的烷基链的大小可在介于1个碳与30个碳之间且包括端值,优选介于6个碳与16个碳之间且包括端值的范围内,最优选是6个碳。
在一些实施例中,疏水性锚定聚合物的聚合物组分可以是聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、聚(丙二醇)(poly(propylene glycol),PPG)和乙二醇与丙二醇的共聚物、聚(糖)或其共聚物和混合物。在一些实施例中,疏水性锚定聚合物的聚合物组分是分子量介于120Da与25,000Da之间且包括端值,优选是2,000Da的聚乙二醇。在某些实施例中,疏水性锚定聚合物是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。纳米颗粒的树枝状聚合物与聚乙二醇的质量比典型地介于20:1与5:1之间,优选是11.5:1。在一些实施例中,纳米颗粒包括一个或多个长度是约10到15,000个核苷酸的核糖核酸序列。树枝状聚合物与核糖核酸的质量比可以介于10:1与1.5:1之间,优选是5:1。
还提供了疫苗,疫苗包括用于向受试者递送核酸、抗原或小分子的纳米颗粒和给药用的药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中,疫苗包括纳米颗粒,纳米颗粒包括两个或更多个在受试者细胞中以不同速率表达一个或多个抗原的复制RNA。
附图说明
图1A到图1C是RNA有效载荷的示意性表示。图1A显示复制RNA的“完整复制子”,从右到左示出了5'帽子;5'非翻译区;多个亚单位的RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependentRNA polymerase,RdRp),分别包括nsP1、nsP2、nsP3和nsP4结构域;抗原;3'非翻译区以及3'poly(A)尾。在完整复制子下面所描绘的是由来自完整复制子RNA的RdRp产生的多个末端mRNA转录产物,从右到左分别包括5'帽子;抗原;3'非翻译区以及3'poly(A)尾。图1B描绘一种有效载荷,其包括与图1A中相同的复制RNA的“完整复制子”,以及信使RNA(mRNA)构建体,该mRNA构建体包括与由复制mRNA编码的RdRp相同的非翻译区。在完整复制子下面所描绘的是由来自完整复制子和mRNA构建体的RdRp产生的多个末端mRNA转录产物,从右到左分别包括5'帽子;抗原;3'非翻译区以及3'poly(A)尾。图1C是一个示意图,分别描绘了siRNA、mRNA和复制子RNA的相对大小。
图2A到图2C是示意性表示,显示了用于细胞内货物递送的三组分系统。图2A是1到3代(G1到G3)PEI树枝状聚合物、1到4代(G1到G4)DAB-Am 4树枝状聚合物以及0到3代(G0到G3)PAMAM树枝状聚合物的分子结构,以及大小在C6-C18范围内、可用于配制基于可电离的树枝状聚合物的纳米材料的环氧化物的分子结构。图2B是一个草图,描绘了三种组分,包括RNA封装剂(可电离的树枝状聚合物、脂质锚定的PEG以及RNA)。图2C是基于改性树枝状聚合物的纳米颗粒(10)的图,如图2B中所描绘般配制,包括呈层状形式的树枝状聚合物材料(12)、两亲性聚合物(14),包括疏水性组分(16)和亲水性组分(18),以及封装的RNA(20)。图2D是线图,显示了强度(%)对比对数刻度的改性树枝状聚合物纳米颗粒(MDNP)直径(nm)。误差棒±S.D.,并且n=3。图2E是直方图,显示了由未转化的BHK细胞介导的BHK细胞、以及经过常规mRNA和基于VEE和SFV基因组的复制子RNA转化的BHK细胞中的萤火虫荧光素酶活性(RLU)。误差棒±技术性三次重复试验的S.D.。图2F是线图,分别显示了PG1.C12(▲)、PG1.C15(●)、PEI(◇)、游离RNA(■)和PBS(x)各自在0-110分钟的一段时间内的归一化FRET信号(0.9-1.7)对比时间。N=4-8,并且误差棒±S.D.。图2G是直方图,分别显示了在1天、3天、20天和30天这些时间点,在0-45,000范围内的发光(任意单位)对比纳米颗粒疫苗年龄。N=4,并且误差棒±S.D.。
图3是示意性图示,显示了示范性疫苗接种方案,使用改性树枝状聚合物纳米颗粒(30),肌肉内注射到测试动物中(32),在肌肉细胞中产生并释放肿瘤相关的抗原(34),然后是对抗原的免疫反应,引起抗原特异性抗体和细胞毒性T细胞的产生(36);并且通过将肿瘤细胞注射到免疫后的小鼠中(40)制备肿瘤细胞表达抗原(38),导致免疫系统识别到肿瘤细胞(42)并破坏肿瘤细胞(44)。
图4A是线图,分别显示了未免疫的、裸mRNA、裸SFV rep、mRNA MDNP以及SFV MDNP各自的肿瘤大小(0-200mm2)对比时间(n=2,攻击后10-28天)。图4B是线图,分别显示了未免疫的、裸mRNA、裸SFV rep、mRNA MDNP以及SFV MDNP各自的小鼠(n=10)存活率(%)对比时间(攻击后10-28天)。
图5A到图5G是这样的图,显示了游离mRNA(图5A)与纳米封装的mRNA(图5B)、游离VEE repRNA(图5C)与纳米封装的VEE repRNA(图5D)以及游离SFV repRNA(图5E)与纳米封装的SFV repRNA(图5F)的计数(细胞)对比CFSE。图5G显示阴性对照和阳性对照的CFSE对比细胞计数。分别用叉(无表达,参见图5G中的阴性对照)和勾(有表达,参见图5G中的阳性对照)指示各图中的可检测的蛋白质表达。
图6A到图6G是这样的图,显示了游离mRNA(图6A)与纳米封装的mRNA(图6B)、游离VEE repRNA(图6C)与纳米封装的VEEV repRNA(图6D)以及游离SFV repRNA(图6E)与纳米封装的SFV repRNA(图6F)的计数(细胞)对比CFSE。图6G显示未免疫对照的CFSE对比细胞计数。在图6A到图6G中各自用叉(无表达,参见图6G中的阴性对照)和勾(有表达,参见图6D)指示可检测的蛋白质表达。
图7A到图7B是荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting,FACS)图,显示了OT-1细胞在转移后4天/用40μg纳米封装的repRNA VEEV-cOVA MDNP免疫后3天的细胞计数对比CFSE。实验结果分别代表两个测试动物小鼠1(图7A)和小鼠2(图7B)各自相同的独立实验。
图8A和图8B是显示了在第3天(图8A)和第14天(图8B)的OT1增殖的图,分别显示了每一个未免疫样品、以及经过裸mRNA、MDNP mRNA、裸VEEV、MDNP VEEV、裸SFV以及MDNP SFV免疫的样品各自的增殖%。
图8C是直方图,分别显示了PBS、5meC/ΨmRNA以及VEEV样品各自的I型IFN(□)和II型IFN(■)在OD650下的相对量。误差棒±生物学三次重复试验的SD。
图9是直方图,分别显示了未免疫的、40μg MDNP VP40、40μg裸cOVA、0.4μgMDNPcOVA、4μg MDNP cOVA以及40μg MDNP各自的肽刺激的培养物上清液中针对未刺激的细胞归一化后的IFNg浓度。
图10A是表达的时间过程的草图表示,分别显示了纳米封装的mRNA、SFV以及VEE的抗原产生对比时间。图10B是基于改性树枝状聚合物的纳米颗粒(50)的示意性图示,包括呈层状形式的树枝状聚合物材料(52)、两亲性聚合物(54),并且含有多个核酸有效载荷,包括三个纳米封装的repRNA(56)、(58)、(60),各自编码不同抗原(抗原A-C),以及mRNA构建体(62),编码第四抗原(抗原D),其中纳米封装的repRNA(64)的5'非翻译序列与mRNA(66)的5'非翻译序列相同。
图11A是这样的图,分别显示了未转染样品和经过VEE HA转染的样品各自的细胞计数(针对模式归一化,0-100)对比HA蛋白质计数。图11B是线图,分别显示了经过cOVA免疫的动物和经过HA免疫的动物各自的平均体重(感染前%)对比时间(感染后天数)。安乐死截止是感染前体重的80%,由一条线指示。图11C是直方图,分别显示了1到3号经过cOVA免疫的小鼠和1到3号经过HA免疫的小鼠各自在攻击前和攻击后在450nm下的O.D.。图11D是线图,分别显示了已接种疫苗(--)和未接种疫苗(···)小鼠的存活率%对比H1N1感染后的时间(天数)。
图12A是线图,分别显示了含有佐剂(●)、GP(■)、GP/VP40(▲)和佐剂/GP/VP40(▼)的样品各自在加强免疫后第14天的经过1/100稀释的血清中的EBOV GP IgG的OD。图12B是线图,分别显示了未免疫对照中的动物(●;0/7)、经过GP免疫的动物(■:6/7)、经过GP/VP40免疫的动物(▲;6/7)以及经过Poly/GP/VP40免疫的动物(▼;4/7)在经过埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)攻击后的鼠存活率百分比。图13A是这样的图,分别显示了两个40μgcOVA MDNP剂量(对照);两个40μg裸GP复制子剂量(■);两个0.4μg GP MDNP剂量(▲);两个4.0μg GP MDNP剂量(▼);两个40μg GP MDNP剂量(◆);以及一个40μg GP MDNP剂量(ο)各自的抗体滴度。图13B是线图,分别显示了经过两个40μg cOVA MDNP剂量(对照);两个40μg裸GP复制子剂量;两个0.4μg GP MDNP剂量;两个4.0μg GP MDNP剂量;两个40μg GP MDNP剂量;以及一个40μg GP MDNP剂量未免疫的动物在经过埃博拉病毒(EBOV)攻击后的鼠存活率百分比。
图14A是线图,分别显示了已接种疫苗(-)和未接种疫苗(对照)小鼠的存活率%对比刚地弓形虫(T.gondii)感染后的时间(天数)。图14B是线图,分别显示了已接种疫苗(·)和未接种疫苗(□;对照)小鼠的平均相对体重(%)对比刚地弓形虫感染后的时间(天数)。图14C是线图,分别显示了已接种疫苗(刚地弓形虫)和未接种疫苗(对照弓形虫)小鼠的存活率%对比刚地弓形虫攻击后的天数(0-175天)。图14D是线图,分别显示了已接种疫苗(·)和未接种疫苗(□;对照弓形虫)小鼠的平均相对体重(%)对比刚地弓形虫感染后的时间(0-175天)。
图15A是显示了两种MDNP疫苗各自的(IgG)抗体终点滴度的图:分别是对照(针对扎伊尔埃博拉病毒(Zaire Ebola virus)的NP配制品);和ZIKV(针对寨卡病毒(Zikavirus)的NP配制品)。图15B是显示两种MDNP疫苗各自在免疫后,独立地在用OVA(对照)肽或ZIKA(寨卡病毒衍生肽)刺激之后的IFNγCD8+脾细胞百分比的图:分别是对照(针对扎伊尔埃博拉病毒的NP配制品);和ZIKV(针对寨卡病毒的NP配制品)。
图16A和图16B是这样的图,分别显示了有疫苗(▼)和无疫苗(·),由Hmga2+细胞(图16A)和Hmga2-细胞(图16B)诱导的d>5、2<d<5以及d<2组各自的肿瘤数量(0-6)对比肿瘤直径(mm)。
具体实施方式
I.定义
术语“宿主细胞”是指可以在其中引入重组表达载体的原核细胞和真核细胞。
术语“疏水性锚定聚合物”、两亲性聚合物以及“脂质聚合物”可互换使用,是指与一个或多个脂族基共价结合的聚合物。
术语“树枝状聚合物”打算包括但不限于具有一个内部核心和多层(或“代”)重复单元的分子结构,所述重复单元连接到这个内部核心并从这个内部核心延伸出去,每一层具有一个或多个分支点,并且末端基团的外表面连接到最外面的那代。树枝状聚合物具有规则的树枝状或“星型”分子结构。
术语“烷基”是指饱和或不饱和脂族基,包括直链烷基、烯基或炔基;支链烷基、烯基或炔基;环烷基、环烯基或环炔基(脂环基);被烷基取代的环烷基、环烯基或环炔基;以及被环烷基取代的烷基、烯基或炔基。除非另外指明,否则直链或支链烷基在其主链中具有30个或少于30个碳原子(例如直链是C1-C30,支链是C3-C30),更优选是20个或少于20个碳原子,更优选是12个或少于12个碳原子,并且最优选是8个或少于8个碳原子。同样,优选的环烷基在其环结构中具有3-10个碳原子,并且更优选地在环结构中具有5、6或7个碳。烷基还可以被一个或多个基团取代,这一个或多个基团包括但不限于卤素、羟基、氨基、硫基、醚基、酯基、羧基、氧代以及醛基。烷基还可以含有一个或多个杂原子。“低碳烷基”意指1到6个碳,优选1到5个碳,更优选1到4个碳,最优选1到3个碳。
术语“胺”和“氨基”是本领域中所了解的,并且是指未被取代的和被取代的胺,例如可以由以下通式表示的部分:
其中R9、R10和R'10各自独立地表示氢、烷基、烯基、-(CH2)m-R8,或R9和R10与其所连接的N原子连在一起形成在环结构中具有4到8个原子的杂环;R8表示芳基、环烷基、环烯基、杂环或多环;并且m是零或1到8范围内的整数。在优选实施例中,R9或R10中只有一个可以是羰基,例如R9、R10和氮一起不形成酰亚胺。在更优选的实施例中,术语“胺”不涵盖酰胺,例如在酰胺中,R9和R10中的一个表示羰基。在甚至更优选的实施例中,R9和R10(和任选地R'10)各自独立地表示氢、烷基或环烷基、烯基或环烯基、或炔基。因此,术语“烷基胺”是指如上文所定义的胺基上面连有被取代的(如上文关于烷基所述)或未被取代的烷基,即R9和R10中的至少一个是烷基。
术语“酰胺”在本领域中被公认为是被氨基取代的羰基,并且包括可以由以下通式表示的部分:
其中R9和R10如上文所定义。
术语“纳米材料”是指至少有一个维度介于约1纳米与1微米之间的材料。
术语“基于树枝状聚合物的纳米颗粒”或“MDNP”是指纳米级颗粒递送媒剂,包括含树枝状聚合物和疏水性锚定聚合物的外表面和典型地有效载荷分子。有效载荷分子典型地被封入颗粒内。
术语“转化”和“转染”涵盖通过本领域中已知的多种技术将核酸(例如载体)引入到细胞中。
术语“特异性结合”到目标是指在其它生物制剂的非均质群体存在下决定该分子的存在的结合反应。
“定位信号”或“定位序列”或“识别序列”或“靶向信号”或“识别序列”或“识别标签”或“识别多核苷酸”可互换使用,并且是指将分子引导到特定细胞、组织、细胞器或细胞内区域的信号。信号可以是多核苷酸、多肽或碳水化合物部分或可以是足以引导所连接的分子到所希望的位置的有机或无机化合物。
术语“载体”是指核酸分子或多核苷酸,如复制RNA、质粒、噬菌体或粘粒,可以在其中插入另一个核酸序列区段,以便引起所插入区段的复制。所述载体可以是表达载体。
术语“复制RNA”、“repRNA”、“复制子mRNA”、“mRNA复制子”以及“复制子RNA”可互换使用,并且是指不能产生有传染性的子代病毒体的有复制能力的子代缺陷型RNA病毒基因组。经过典型修饰后适用作repRNA的病毒基因组包括‘正链’RNA病毒。这些经过修饰的病毒基因组充当mRNA和复制模板。术语“表达载体”是指包括一个或多个表达控制序列的载体。
术语“核酸”是指任何天然的或合成的核苷酸和核苷的线性和序列阵列,例如DNA,包括互补DNA(cDNA)、复制RNA(repRNA)、信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、转运RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、引导链RNA(sgRNA)、多核苷酸、寡核苷酸、寡核苷以及其衍生物。这类核酸可以统称为“构建体”或“质粒”。核酸的代表性实例包括细菌质粒载体,包括表达、克隆、粘粒和转化载体,例如但不限于病毒载体、来源于噬菌体核酸的载体以及合成的寡核苷酸,如化学合成的DNA或RNA。术语“核酸”另外包括经过修饰或衍生的核苷酸和核苷,例如但不限于卤代核苷酸,例如但又不仅仅是5-溴尿嘧啶,以及衍生的核苷酸,如生物素标记的核苷酸。
术语“基因(gene/genes)”是指经过分离或修饰的核酸序列,包括RNA和DNA两种,其编码用于合成全RNA、全蛋白或这种全RNA或全蛋白的任何部分的遗传信息。不是特定生物体基因组的天然部分的基因被称为“外来基因”、“异源基因”或“外源基因”,而作为特定生物体基因组的天然部分的基因则被称为“内源基因”。如参考基因组DNA所使用的术语“基因”包括间插区、非编码区以及调控区,并且可以包括5'端和3'端。
术语“表达(expressed)”或“表达(expression)”是指从DNA转录到与基因的两条核酸链中的一条的区域至少部分互补的RNA核酸分子。术语“表达(expressed)”或“表达(expression)”还指从该RNA核酸分子翻译,得到蛋白质或多肽或其部分。
术语“抗原”是指任何充当适应性免疫反应的受体的目标的物质(例如肽、蛋白质、核酸、脂质、小分子,如由病原体或癌细胞或癌前细胞表达或以其它方式与病原体或癌细胞或癌前细胞有关的部分)。抗原可以是病原体、癌细胞或癌前细胞的结构组分。
术语“病原体”是指引起疾病的生物体或其它实体。举例来说,病原体可以是朊病毒;病毒;原核生物,如细菌;真核生物,如原生动物和真菌。病原体可以是能够产生针对它的适应性免疫反应的抗原源。
术语“多肽”包括蛋白质和其片段。多肽被描述为氨基酸残基序列。那些序列沿着从氨基(N)端到羧基(C)端的方向从左到右书写。根据标准命名法,氨基酸残基序列用三字母或单字母代码来命名,如下所指示:丙氨酸(Ala,A)、精氨酸(Arg,R)、天冬酰胺(Asn,N)、天冬氨酸(Asp,D)、半胱氨酸(Cys,C)、谷氨酰胺(Gln,Q)、谷氨酸(Glu,E)、甘氨酸(Gly,G)、组氨酸(His,H)、异亮氨酸(Ile,I)、亮氨酸(Leu,L)、赖氨酸(Lys,K)、蛋氨酸(Met,M)、苯丙氨酸(Phe,F)、脯氨酸(Pro,P)、丝氨酸(Ser,S)、苏氨酸(Thr,T)、色氨酸(Trp,W)、酪氨酸(Tyr,Y)以及缬氨酸(Val,V)。
除非另外明确指明,否则术语“抗体”在最广泛的意义上使用。因此,“抗体”可以是天然存在的或人造的,如通过常规融合瘤技术产生的单克隆抗体。抗体包括单克隆和多克隆抗体,以及含有这些抗体的抗原结合结构域和/或一个或多个互补决定区的片段。“抗体”是指任何形式的抗体或其抗原结合片段,并且包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段。
术语“个体”、“个体”、“受试者”和“患者”可互换使用,并且是指哺乳动物,包括但不限于人类;啮齿动物,如小鼠和大鼠;以及其它实验动物。
术语“生物相容性”是指本身对宿主(例如,动物或人类)无毒,也不在宿主中以产生有毒浓度的单体或低聚亚单元或其它副产物的速率降解(如果聚合物降解)的一种或多种材料。
术语“药学上可接受的载剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂以及吸收延迟剂等。这些介质和试剂于药学上活性物质的用途是本领域中众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物都不相容,否则考虑在治疗组合物中使用这些常规介质或试剂。还可以将补充活性化合物并入组合物中。
II.用于将蛋白质、小分子和核酸递送到细胞内部的组合物
已研发出用于增强治疗剂、预防剂和诊断剂到受试者细胞中的递送的组合物。将如核酸的分子递送到细胞内部的功效与克服障碍强烈相关,如抗原呈递细胞的吸收、吞噬体/溶酶体逃逸、核酸解包装(nucleic acid unpackaging)、细胞内易位等。在遗传物质的情况下,还要考虑持续的基因表达。为了能够有效地继续存在于血流中并且能够被靶细胞吸收,递送媒剂必须展现最小的免疫原性。为了在临床上相关,递送媒剂必须施加最小的细胞毒性。
组合物包括封入或封装在无毒、非免疫原性、生物可降解的纳米颗粒内的治疗剂、预防剂和诊断剂并且其大小方便在体内被真核细胞吸收,从而将治疗剂、预防剂和诊断剂有效递送到细胞内空间中。递送媒剂能够保护治疗剂、预防剂和诊断剂不受免疫监视,不在体内降解,而且能够提高所封装的活性剂的血清半衰期。递送媒剂可以任选地包括一个或多个靶向基序来增强靶细胞的特异性和吸收。
A.基于改性树枝状聚合物的纳米颗粒(MDNP)
MDNP是适用于将广泛范围的分子递送到细胞内部的递送媒剂。MDNP是合成的多组分结构,自组装成具有类脂质(lipidoid)样形态的100nm级颗粒。
MDNP是一种球形层状结构,封装有一个或多个核酸,如大复制RNA、mRNA、蛋白质以及小分子。利用MDNP作为容纳核酸、蛋白质和小分子的容器来进行治疗剂、预防剂和诊断剂的细胞内递送的组合物的应用范围很广,包括疫苗试剂、治疗剂以及基础研究工具。
MDNP由以下物质配制:可电离且在低pH下带正电的树枝状聚合物;一种或多种两亲性聚合物;以及一种或多种用于递送到受试者细胞中的治疗剂、预防剂和/或诊断剂。典型地,MDNP是无毒的,非免疫原性的,并且典型地具有方便真核细胞吸收的大小。在一些实施例中,将MDNP的大小设定成可防止或增强特定细胞类型或一组细胞类型的吸收。举例来说,可对MDNP进行工程改造以增强或防止被如巨噬细胞的抗原呈递细胞吸收。单个基于改性树枝状聚合物的纳米颗粒的示范性大小是最长维度在30nm到1,000nm的范围内,举例来说,MDNP的平均大小可以是30nm到450nm且包括端值,例如50nm到300nm且包括端值,更优选是60nm到250nm且包括端值。代替核心树枝状聚合物的烷基链的长度会影响纳米颗粒大小。两亲性聚合物的量和封装剂的大小也会影响纳米颗粒大小。
1.基于可电离的树枝状聚合物的纳米材料
典型地,树枝状聚合物是可电离的并且在低pH值下带正电。树枝状聚合物典型地由从所限定的具有特定数量的反应性基团的核心结构衍生出迭代的层或代数,后续代数连接在所述迭代的层或代数上构建而成。树枝状聚合物可以是零到七代。较高代数的树枝状聚合物具有显著降低的溶解度。树枝状聚合物的结构多样性、代数以及潜在脂质修饰范围联合为药物递送系统的研发提供了非凡的潜力。典型地,基于树枝状聚合物的纳米材料由环氧化物封端的分子配制。
后面每一代树枝状聚合物都能与上一代共价结合。核心结构的反应性基团的数量决定了n-方向性并且限定了能被连接形成下一代的结构的数量。
树枝状结构中的分支的数量取决于包括核心在内的单体构建块的分支价数。举例来说,如果核心是伯胺,那么胺氮就是二价,产生1→2分支基序。
树枝状聚合物优选是烷基化树枝状聚合物,在本文中被称为“烷基化树枝状聚合物”。示范性树枝状聚合物材料包括但不限于聚(酰胺-胺)(PAMAM)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚酯、聚赖氨酸、聚丙烯亚胺(PPI)、二氨基丁烷胺聚丙烯亚胺四胺(DAB-Am 4)、聚丙胺(POPAM)、聚赖氨酸、聚酯、荑(iptycene)、脂族聚(醚)和/或芳族聚醚树枝状聚合物。
树枝状聚合物可以羧酸、胺和羟基封端,并且可以是任何代数,包括但不限于第1代树枝状聚合物(G1)、第2代树枝状聚合物(G2)、第3代树枝状聚合物(G3)、第4代树枝状聚合物(G4)、第5代树枝状聚合物(G5)、第6代树枝状聚合物(G6)、第7代树枝状聚合物(G7)、第8代树枝状聚合物(G8)、第9代树枝状聚合物(G9)或第10代树枝状聚合物(G10)。MDNP还可以是由超过第10代的树枝状聚合物形成。
PAMAM类树枝状聚合物含有内部酰胺键,内部酰胺键可以增强其生物可降解性,就人类治疗应用来说,由此改善耐受性。氨基表面包括极性、高度反应性伯胺表面基团。氨基官能性PAMAM树枝状聚合物的表面带阳离子并且能通过与带负电分子的离子相互作用或使用许多众所周知的用于共价官能化伯胺的试剂而衍生化。
式I:第0代(G0)聚(酰胺-胺)(PAMAM)的分子结构。
当MDNP由PAMAM树枝状聚合物形成时,典型地使用0到7代PAMAM树枝状聚合物。举例来说,MDNP可以由以下形成:第0代PAMAM树枝状聚合物(G0);第1代(G1)PAMAM树枝状聚合物;第2代(G2)PAMAM树枝状聚合物;第3代(G3)PAMAM树枝状聚合物;第4代(G4)PAMAM树枝状聚合物;第5代(G5)PAMAM树枝状聚合物;第6代(G6)PAMAM树枝状聚合物;或第7代(G7)PAMAM树枝状聚合物。下文在流程I中描绘了显示代数逐次增加(G0-G3)的PAMAM树枝状聚合物的结构的示范性流程。
PAMAM可从多个来源购得,包括西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)(目录号597309)。
图2A中提供了0到3代(G0-G3)PAMAM树枝状聚合物的分子结构。
聚乙烯亚胺(也称为聚氮丙啶)是具有胺基和双碳脂族(CH2CH2)间隔基重复单元的聚合物。
式II:聚乙烯亚胺单体和聚(乙烯亚胺)(PEI)单体的重复单元。
当MDNP由PEI树枝状聚合物形成时,典型地使用0到7代PEI树枝状聚合物。举例来说,MDNP可以由以下形成:第0代PEI树枝状聚合物(G0);第1代(G1)PEI树枝状聚合物;第2代(G2)PEI树枝状聚合物;第3代(G3)PEI树枝状聚合物;第4代(G4)PEI树枝状聚合物;第5代(G5)PEI树枝状聚合物;第6代(G6)PEI树枝状聚合物;或第7代(G7)PEI树枝状聚合物。下文在流程II中描绘了代数逐次增加(G1-G3)的PEI树枝状聚合物的结构的示范性流程。
PEI可从多个来源购得,包括西格玛-奥德里奇(目录号482595)。
图2A中提供了1到3代(G1-G3)PEI树枝状聚合物的分子结构。
二氨基丁烷胺聚丙烯亚胺四胺(DAB Am 4)是具有1,4-二氨基丁烷核心(4碳核心)与4个表面伯氨基的聚合物。
式III:第1代(G1)二氨基丁烷胺聚丙烯亚胺四胺(DAB-Am 4)的分子结构。
当MDNP由DAB-AM 4树枝状聚合物形成时,典型地使用0到7代DAB-AM 4树枝状聚合物。举例来说,MDNP可以由以下形成:第0代DAB-AM 4树枝状聚合物(G0);第1代(G1)DAB-AM4树枝状聚合物;第2代(G2)DAB-AM 4树枝状聚合物;第3代(G3)DAB-AM 4树枝状聚合物;第4代(G4)DAB-AM 4树枝状聚合物;第5代(G5)DAB-AM 4树枝状聚合物;第6代(G6)DAB-AM 4树枝状聚合物;或第7代(G7)DAB-AM 4树枝状聚合物。下文在流程III中描绘了代数逐次增加(G1-G3)的DAB-AM 4树枝状聚合物的结构的示范性流程。
DAB-Am 4可从多个来源购得,包括西格玛-奥德里奇(目录号460699)。
图2A中提供了1到4代(G1-G4)DAB-Am 4树枝状聚合物的分子结构。
MDNP可以由一种或多种不同的树枝状聚合物形成。树枝状聚合物复合物的每个树枝状聚合物都可以具有与其它树枝状聚合物类似或不同的化学性质(例如,第一树枝状聚合物可以是PAMAM树枝状聚合物,而第二树枝状聚合物可以是POPAM树枝状聚合物)。在一些实施例中,第一或第二树枝状聚合物可以进一步包括其它试剂。树枝状聚合物复合物可以包括多个树枝状聚合物。举例来说,纳米颗粒可以包括第三树枝状聚合物;其中第三树枝状聚合物与至少一种其它树枝状聚合物复合。第三试剂可以与第三树枝状聚合物复合。在另一个实施例中,第一和第二树枝状聚合物各自与第三树枝状聚合物复合,其中第一和第二树枝状聚合物是PAMAM树枝状聚合物,并且第三树枝状聚合物是POPAM树枝状聚合物。可以并入其它树枝状聚合物。当利用多个树枝状聚合物时,也可以并入多个试剂。典型地,树枝状聚合物上的伯胺和仲胺与末端环氧化物之间的反应产生了被烷基链取代的树枝状聚合物。
a.环氧化物
典型地,树枝状聚合物通过与烷基环氧化物反应来改性。在一些实施例中,烷基环氧化物与树枝状聚合物上存在的氨基反应形成烷基化树枝状聚合物。
环氧化物具有式IV中所示的结构,其中R可以是介于C1与C30之间且包括端值,优选介于C6与C18之间的任何直链烷基。
式IV:具有重复单元的环氧化物的一般结构式,其中R可以是介于C1与C30之间且包括端值的任何直链烷基。
式V:一组代表性环氧化物(C6-C18)的结构式
示范性环氧化物包括2-十三烷基环氧乙烷(C15H30O)和1,2-环氧十二烷(C12H24O)。
下文在流程I中提供了具有环氧化物的树枝状聚合物的示范性改性流程。流程I描绘了树枝状聚合物-脂质通过树枝状聚合物内的伯胺和仲胺与烷基链上的末端环氧化物之间的反应实现的合成途径。典型地,反应需要乙醇溶剂;90℃反应温度;以及在暗处最少72小时的反应时间。
流程I:用于形成基于可电离的树枝状聚合物的纳米材料以用来形成MDNP的示范性反应流程。
2.两亲性聚合物
MDNP包括亲水性-疏水性聚合物,如具有生物相容性、非免疫原性且无毒的PEG-脂质结合物。
a.疏水性组分
非常适合于在疏水性或脂质双层内缔合的一种类型的疏水性组分是磷脂,如磷脂酰乙醇胺(PE)、胆固醇、神经酰胺、溶血脂质、溶血磷脂以及鞘脂。PE与所结合的聚合物之间的键联可以包括酯和/或氨基甲酸酯衍生物。PE可以是饱和或不饱和PE。神经酰胺可以是短链(例如C8)、中链(例如C14)或长链(例如C20)脂肪酰胺或脂肪酸(例如油酸)衍生物。中性和阴离子性脂质包括但不限于磷脂酰胆碱(PC)(如卵PC、大豆PC)、1,2-二酰基-甘油-3-磷酸胆碱;磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇(PI);糖脂;鞘磷脂,如神经鞘磷脂、神经鞘糖脂(也称为1-神经酰胺基葡糖苷),如神经酰胺吡喃半乳糖苷、神经节苷脂和脑苷脂;脂肪酸、含有羧酸基的固醇,如胆固醇或其衍生物;以及1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺,包括1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺或1,2-二油酰基甘油磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-双十六烷基磷酸乙醇胺(DHPE)、1,2-二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)以及1,2-二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)。
三甲基铵盐,也称为TAP脂质,例如作为甲基硫酸盐。合适的TAP脂质包括但不限于DOTAP(二油酰基-)、DMTAP(二肉豆蔻酰基-)、DPTAP(二棕榈酰基-)和DSTAP(二硬脂酰基-)。其它合适的阳离子性脂质包括二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、1,2-二酰氧基-3-三甲基铵丙烷、N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N-二甲基胺(DODAP)。
b.亲水性组分
可以包括各种亲水性聚合物,包括聚β-氨基酯和1,2-氨基醇脂质。在一些实施例中,聚合物是烷基改性的聚合物,如烷基改性的聚(乙二醇)。其它示范性聚合物包括聚(烷二醇)、多糖、聚(乙烯醇)、聚吡咯烷酮、聚氧乙烯嵌段共聚物(例如)、聚乙二醇(PEG)以及其共聚物。优选的亲水性聚合物具有生物相容性(即不会诱导显著的炎症反应或免疫反应)并且是无毒的。合适的亲水性聚合物的实例包括但不限于聚(烷二醇),如聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)以及乙二醇与丙二醇的共聚物;聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚乙烯吡咯烷酮、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、聚(糖)、聚(氨基酸)、聚(羟基酸)、聚(乙烯醇)以及其共聚物、三元共聚物和混合物。
在优选实施例中,一个或多个亲水性聚合物组分含有聚(烷二醇)链。聚(烷二醇)链可含有介于1个与500个之间的重复单元,更优选介于40个与500个之间的重复单元。合适的聚(烷二醇)包括聚乙二醇、聚丙烯1,2-二醇、聚(氧化丙烯)、聚丙烯1,3-二醇以及其共聚物。
在一些实施例中,一种或多种亲水性聚合物组分是含有一个或多个聚氧化乙烯(PEO)嵌段以及一个或多个由其它生物相容性聚合物(例如,聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)或聚己酸内酯)组成的嵌段的共聚物。一个或多个亲水性聚合物链段可以是含有一个或多个PEO嵌段以及一个或多个含有聚氧化丙烯(PPO)嵌段的共聚物。具体实例包括PEO-PPO-PEO的三嵌段共聚物,如POLOXAMERSTM和PLURONICSTM。
聚乙二醇(PEG)。PEG是最常用的屏蔽剂之一。MDNP中所包括的两亲性PEG的大小、相对数量以及分布会影响所得基于改性树枝状聚合物的纳米颗粒(MDNP)的生物物理学特性,如结构特征和电荷密度。
MDNP的物理性质与两亲性PEG(即,聚乙二醇化程度)的大小、相对数量以及分布直接相关。能被修改的示范性性质包括一种或多种类型的真核细胞对MDNP的吸收功效、治疗剂、预防剂和诊断剂的细胞内递送的速度和功效以及MDNP的免疫原性和细胞毒性。在某些实施例中,聚乙二醇化导致MDNP的电荷中和。
典型地,两亲性PEG包括短链低聚乙二醇。示范性低聚乙二醇包括二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、五乙二醇、六乙二醇等。
式VI:短链低聚乙二醇(n=1-6)PEG单体的重复单元。
在一些实施例中,两亲性聚合物是与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)结合的磷脂。在某些实施例中,脂质相关的PEG或mPEG是支链或“多臂”PEG。MDNP可以包括具有至少两个携带巯基或硫吡啶末端基团的分支的多臂聚乙二醇;但也可以使用携带如琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺末端基团的其它末端基团的PEG聚合物。
MDNP可以包括具有不同分子量的聚乙二醇聚合物。举例来说,PEG的分子量可以介于约100Da(即,PEG 100Da)与约12,000kDa(即,PEG 12KDa)之间且包括端值。MDNP可以由两亲性PEG的单一物种或两亲性PEG的两个或更多个不同物种形成。举例来说,MDNP可以由具有不同分子量的脂质锚定的PEG的多个不同物种形成。
MDNP可以使用单一两亲性聚合物物种或多个不同两亲性聚合物物种的混合物形成。两亲性聚合物可用加合物改性。举例来说,两亲性聚合物可用相同或不同的一种或多种不同加合物改性。因此,基于改性树枝状聚合物的纳米颗粒可以使用一种或多种脂质锚定的聚合物形成,任选地包括相同或不同加合物的混合物。
在一些实施例中,MDNP由1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-[甲氧基(聚乙二醇)](C14-MPEG)分子配制。C14-MPEG典型地包括分子量介于350Da与12,000Da之间,更优选介于1,000Da与5,000Da之间,最优选是2,000Da的mPEG组分。
示范性脂质锚定的mPEG是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000],分子结构以式VII示出,(C14-mPEG(2000))。
式VII:1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]的分子结构。
在一些实施例中,MDNP由两亲性聚合物C14-mPEG2000配制。在其它实施例中,MDNP由具有不同分子量mPEG的C14-mPEG分子配制,如C14-mPEG(350);C14-mPEG(550);C14-mPEG(750);C14-mPEG(1000);C14-mPEG(3000);或C14-mPEG(5000)。在一些实施例中,PEG是mPEG5000(即,1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000])。脂质组分可以包括饱和或不饱和脂肪酸部分。
在一些实施例中,MDNP由1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-MPEG)分子配制。DSPE-MPEG典型地包括分子量介于350Da与12,000Da之间,更优选介于1,000Da与5,000Da之间,最优选是2,000Da的mPEG组分。
示范性脂质锚定的mPEG是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000],分子结构以式VIII示出,(DSPE-mPEG(2000))。
式VIII:1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]的分子结构。
在一些实施例中,MDNP由两亲性聚合物DSPE-mPEG配制。在其它实施例中,MDNP由具有不同分子量mPEG的DSPE-mPEG分子配制,如DSPE-mPEG(350);DSPE-mPEG(550);DSPE-mPEG(750);DSPE-mPEG(1000);DSPE-mPEG(2000);DSPE-mPEG(3000);或DSPE-mPEG(5000)。脂质组分可以包括饱和或不饱和脂肪酸部分。
在其它实施例中,MDNP由两亲性聚合物N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)]}(C8MPEG神经酰胺)分子配制。C8MPEG神经酰胺分子典型地包括分子量介于750Da与5,000Da之间,更优选介于1,000Da与5,000Da之间,最优选是2,000Da的mPEG组分。
示范性神经酰胺锚定的mPEG是N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)2000]},分子结构以式IX示出,(C8 MPEG2000神经酰胺)。
式IX:N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)2000]}的分子结构。
在一些实施例中,MDNP由神经酰胺锚定的聚合物C8 MPEG2000神经酰胺配制。在其它实施例中,MDNP由具有不同分子量mPEG的C8 MPEG神经酰胺分子配制,如C8 MPEG750神经酰胺;C16 MPEG750神经酰胺;C8 MPEG2000神经酰胺;C16 MPEG2000神经酰胺;C8 MPEG5000神经酰胺;或C16 MPEG5000神经酰胺。
在一些实施例中,一种或多种两亲性聚合物通过添加一个或多个赋予聚合物不同的结构特性和功能特性的部分来改性。举例来说,在一些实施例中,一种或多种两亲性聚合物通过添加多肽或其它小分子来改性。改性后的脂质结合的聚合物可用于赋予基于改性树枝状聚合物的纳米颗粒(MDNP)一种或多种不同的功能特性或结构特性,相比于没有经过改性的相同MDNP来说。示范性功能特性或结构特性包括基于改性树枝状聚合物的纳米颗粒(MDNP)的流体动力学体积、疏水性、抗原性、受体结合特异性以及血清半衰期的改变。
3.治疗剂、预防剂和诊断剂
MDNP包括一种或多种用于递送到细胞内空间中的治疗剂、预防剂和诊断剂。在一些实施例中,一种或多种治疗剂、预防剂和诊断剂是核酸,如编码外源基因序列的mRNA或repRNA。在一些实施例中,外源基因序列编码一种或多种对病毒、病原体、微生物或癌症具有特异性的抗原。
MDNP保护所封入的治疗剂、预防剂和诊断剂不发生化学降解、光降解和酶促降解。封入MDNP内的RNA分子对核酸酶、羟基自由基、紫外光以及Mg2+介导的内部攻击引起的降解稳定,不需要化学改性来稳定RNA并体内递送到细胞中。MDNP的高稳定性实现了长期储存并且允许广泛范围的应用方法,包括以气雾剂、溶液、粉末等形式分配。
a.核酸
在一些实施例中,封装在MDNP内的治疗剂、预防剂和诊断剂包括一种或多种核酸。核酸治疗剂、预防剂和诊断剂的代表性实例包括DNA质粒载体,如表达载体;RNA分子,如iRNA、siRNA、核酶、适体、repRNA、gRNA/sgRNA(引导RNA/单引导RNA,用于基于CRISPR的基因编辑)以及mRNA。
在一些实施例中,封装在MDNP内的治疗剂、预防剂和诊断剂包括用于表达接受者细胞中的一个或多个基因的一个或多个核酸表达载体。在一些实施例中,基因是宿主生物体的外源基因。在其它实施例中,基因是宿主生物体的天然基因。在某些实施例中,基因是典型地与生物体有关的基因的修饰后变体,如一个或多个等位基因的突变体形式。
核酸表达载体的代表性实例包括DNA质粒载体,如表达、克隆、粘粒和转化载体,例如但不限于病毒载体、来源于噬菌体核酸的载体以及合成的寡核苷酸,包括化学合成的DNA;以及RNA载体,包括复制RNA。一般来说,可以在基于改性树枝状聚合物的纳米颗粒中包括任何能在其中插入基因区段以便引起所插入区段的复制和表达的表达载体,以便递送到受试者的细胞中。
典型地,MDNP的核酸表达载体经过工程改造以在如受试者细胞的靶细胞中表达异源核酸序列,并且包括一个或多个表达控制序列。表达载体可以包括启动子、可操作地连接于启动子的异源核酸序列、可操作地连接于异源核酸序列的真核转录终止子以及复制起点。
一般来说,含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体结合这些宿主使用。载体一般携带复制位点,以及能够在转化后的细胞中提供表现型选择的标记序列。不同的宿主细胞具有特征性和特异性的蛋白质翻译后加工与修饰机制。用于哺乳动物细胞中的表达载体一般包括复制起点(根据需要)、位于待表达基因之前的启动子、以及任何必需的核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点以及转录终止序列。
在某些实施例中,MDNP包括一个或多个核糖核酸(RNA)分子。大量生产RNA的成本很低,并且可以从来自商业上合成的DNA前体的任何指定的已发现序列以几乎同一天的速度产生无内毒素的RNA。因为RNA没有基因组整合风险,而且只要求接近细胞的细胞质来起作用,所以RNA给药比DNA给药更安全、更容易。此外,因为可获得基于α病毒或黄病毒基因组的自我复制型mRNA(repRNA),所以可以用非常低的剂量实现最大的免疫原性和抗原生产水平。
在某些实施例中,MDNP包括一个或多个复制核糖核酸(repRNA),又称为复制子。复制RNA是具有递送基因的潜力的自我扩增型RNA,所述基因包括编码疫苗抗原的基因。RepRNA是不含产生子代病毒体所需的病毒结构蛋白的减毒病毒基因组。但是,repRNA仍然有翻译和复制的能力,因此能够有效地提高mRNA的翻译半衰期。因此,相对于由将相等摩尔量的编码一个或多个外源基因的常规mRNA递送到细胞中产生的外源基因的翻译和表达,将编码一个或多个外源基因的RepRNA递送到细胞中能够有效地提高细胞中的外源基因的翻译和表达。在一些实施例中,RepRNA是非致细胞病变型RepRNA。
α病毒自我扩增型repRNA典型地包括5'帽子;5'非翻译区(5'UTR),在第一开放阅读框、基因组启动子区(例如26S亚基因组启动子)、第二开放阅读框、3'非翻译区(3'UTR)内编码的非结构基因(例如NSP1-4);以及3'多腺苷酸化尾。repRNA分子的长度典型地介于9,000个与20,000个核苷酸之间,这取决于所编码的基因序列的大小(参见图1A到图1C)。
非结构基因编码RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)。典型地,RdRp不耐受用于保护常规mRNA不发生核酸内切酶和自催化降解的传统核苷酸修饰。因此,为了在疫苗平台中有效部署,纳米封装是必需的。repRNA是模块化的并且可以对第二开放阅读框进行工程改造以对如所关注的外源基因(GOI)的完整基因进行测序。
可以使用包括一个或多个所期望的基因序列的repRNA,如在第二开放阅读框内编码的抗原基因。当repRNA沉积到宿主细胞的细胞质中时,由repRNA NS基因编码的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)在细胞内得到表达。然后,RdRp能够复制完整repRNA,或只是repRNA编码的抗原的RdRp拷贝(即,借助于亚基因组启动子)。
复制子RNA提高了RNA介导的基因递送的整体效率,因为repRNA能够合成更多的全长复制子拷贝,以及更多的编码第二开放阅读框内所包括的基因的mRNA的拷贝。宿主细胞核糖体继续翻译全长复制子拷贝或较短的仅抗原mRNA,使得由repRNA编码的基因的表达增强(参见图1A)。
自我复制型RNA能够产生更大的量的能够容易地递送并确保到达靶细胞的正确胞质定位的mRNA模板。repRNA的自我复制性质近似地模拟了天然感染性病毒颗粒的自我复制性质,并且在诱导体液和细胞毒性细胞免疫防御臂方面将更加有效。
单个repRNA可以包括编码一个或多个外源基因的核酸序列。因此,在一些实施例中,MDNP包括一个或多个各自编码一个或多个外源基因序列的repRNA。
来源于不同病毒基因组的repRNA能够赋予不同的功能特性来表达和转录外源基因。举例来说,编码相同外源基因的不同repRNA物种能够产生不同的外源基因转录速率和不同的外源基因转录半衰期。一般来说,可以通过UTR来控制基因的翻译效率(包括翻译的活化或完全抑制)。
在一些实施例中,单个MDNP包括超过一个来源于不同病毒基因组的不同repRNA。当将两个或更多个来源于不同病毒基因组的repRNA封装在同一个MDNP内时,repRNA能够编码相同或不同外源基因中的一个或多个。当将超过一个repRNA封装在单个MDNP内时,repRNA可以是repRNA的相同或不同物种。
典型地,repRNA通过修饰‘正链’RNA病毒产生。修饰后的病毒基因组充当细胞内自我复制的mRNA和模板。这与‘负链’病毒形成对比,‘负链’病毒必须由其自身的聚合酶递送,以促进mRNA模板的初始复制和形成。聚合酶的递送更加依靠于病毒样颗粒的使用,与基于合成颗粒的递送不太相关。示范性repRNA包括属于α病毒属和黄病毒属的病毒的修饰后病毒基因组。
α病毒属于第IV组披膜病毒科病毒。典型地,这些病毒的总基因组长度在11,000个与12,000个核苷酸之间的范围内,包括5'帽子和3'poly-A尾。在基因组5'端的三分之二编码四个非结构蛋白基因。复制发生在宿主细胞的细胞质内。本领域中已成功基于α病毒基因组的修饰形成了repRNA(Atkins等人,《分子医学专家评论》(Expert Rev Mol Med),10:e33(2008);Khromykh,《分子治疗学新见》(Curr Opin Mol Ther),2:555-569(2000);Lundstrom《分子治疗学新见》4:28-34.(2002);以及Rayner,《医学病毒学综述》(RevMedVirol.),12:279-296.(2002))。
在一些实施例中,封装在MDNP内的repRNA来源于修饰后的α病毒物种,包括但不限于委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)(包括卡巴斯欧病毒(Cabassou virus)、沼泽地病毒(Everglades virus)、莫斯达斯佩德拉斯病毒(Mossodas Pedras virus)、穆坎布病毒(Mucambo virus)、帕拉马纳病毒(Paramana virus)、那皮舒纳病毒(Pixuna virus)、里奥内格罗病毒(Rio Negro virus)、特罗卡拉病毒(Trocaravirus)以及委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)亚型);塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus,SFV)(包括贝巴鲁病毒(Bebaru virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、马亚罗病毒(Mayaro virus)、阿尼昂尼昂病毒(O'Nyong Nyongvirus)、罗斯河病毒(Ross River virus)以及塞姆利基森林病毒亚型);辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SV);东方马脑炎病毒(Eastern Equine Encephalosis virus,EEEV);巴马森林病毒(Barmah Forest virus,BFV);米德尔堡病毒(Middelburg virus,MV);恩杜姆病毒(Ndumu virus,NV);以及西方马脑炎(Western equine encephalitis,WEEV),包括奥拉病毒(Aura virus)、巴班肯病毒(Babanki virus)、孜拉加奇病毒(Kyzylagach virus)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、奥克尔布病毒(Ockelbo virus)以及瓦塔罗阿病毒(Whataroa virus)亚型。
黄病毒属于黄病毒科的病毒属。黄病毒是约10,000-11,000个核苷酸的正义单链RNA病毒,包括5'帽子,但不含3'poly-A尾。典型地,黄病毒基因组编码3种结构蛋白和8种非结构蛋白。黄病毒在细胞质中复制和组装并且主要感染哺乳动物宿主,包括人类。本领域中已成功基于黄病毒基因组的修饰形成了repRNA(Kofler等人,《美国国家科学院院刊》,101,1951-1956(2004);McCullough等人,《疫苗》(Vaccines)2014,2,735-754(2004))。
在一些实施例中,封装在MDNP内的repRNA来源于修饰后的黄病毒物种,包括但不限于西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、阿罗阿病毒(Aroa virus);日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus);登革热病毒(Dengue virus,DV)、蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus)以及黄热病毒(Yellow fever virus)。
在一些实施例中,MDNP包括信使核糖核酸序列(mRNA)。mRNA是基因的单链转录物,包括5'帽子;5'非翻译区(5'UTR);编码区,包括翻译起始密码子、完整基因的核苷酸序列、翻译终止密码子;3'非翻译区(3'UTR)poly-A添加位点,包括添加到3'端的100-200个腺嘌呤。mRNA分子的长度典型地介于200个与10,000个核苷酸之间,这取决于所编码的基因序列的大小。
宿主细胞的细胞质内的真核mRNA通过核糖体翻译,并且可以通过UTR控制翻译效率(包括翻译的活化或完全抑制)。与3'或5'UTR结合的蛋白质能够通过介导核糖体与mRNA结合的能力来影响翻译。翻译可以发生在细胞质中自由漂浮的核糖体处,或被信号识别颗粒引导到内质网。
在一些实施例中,封装在MDNP内的治疗剂、预防剂和诊断剂是编码能够在受试者的细胞中表达的基因的mRNA分子。mRNA能够编码外源基因,如肽抗原。可以在单个MDNP内封入编码一个或多个外源基因的一个或多个mRNA。在一些实施例中,MDNP包括两个或更多个相同的mRNA分子。在其它实施例中,MDNP包括两个或更多个不同的mRNA。举例来说,单个MDNP可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、20个或超过20个不同的mRNA。当在单个MDNP内封装两个或更多个不同的mRNA时,这两个或更多个不同的mRNA可以按相等(即1:1)或不相等(即>1:1)的摩尔比存在。举例来说,两个mRNA可以按1:1、2:1、3:1、4:1、10:1或大于10:1的摩尔比存在于MDNP内。
当封装在MDNP内的治疗剂、预防剂和诊断剂包括一个或多个核酸时,如表达载体或mRNA,载体能够编码一个或多个在接受者细胞内表达的基因区域。典型地,基因是靶细胞的外源(即,异源)基因。异源核酸序列可以是任何为了产生一个或多个基因产物和/或调控接受者中的基因表达而编码全RNA的一部分或全蛋白的一部分的合成遗传信息的核酸序列。在一些实施例中,异源核酸编码抗原。在其它实施例中,异源核酸序列编码引发和/或缓和宿主细胞中的生物反应的元件。举例来说,异源蛋白质能够抑制一个或多个基因的表达。
异源核酸序列的示范性列举包括编码以下的基因:抗原、核酶、酶、肽、结构蛋白、结构RNA、shRNA、siRNA、miRNA、gRNA/sgRNA(引导RNA/单引导RNA,用于基于CRISPR的基因编辑)、转录因子、信号分子以及其片段或变体。在一个实施例中,异源序列编码抗原。
异源序列可以任选地含有能够靶向特定位置(例如细胞内的细胞器)的核酸序列(即,靶向序列)。在一些实施例中,异源序列编码抗原。
在某些实施例中,异源核酸序列是功能核酸。描述了抑制靶基因的转录、翻译或功能的功能核酸。
功能核酸是具有特定功能的核酸分子,如结合靶分子或催化特定反应。如下文更详细地论述,功能核酸分子可划分为以下非限制性类别:反义分子、siRNA、miRNA、适体、核酶、三链形成分子(triplex forming molecule)、RNAi以及外部引导序列。功能核酸分子可充当靶分子所具有的比活性的效应物、抑制剂、调节剂和刺激剂,或功能核酸分子可具有独立于任何其它分子的重生活性(de novo activity)。
功能核酸分子可与任何大分子,如DNA、RNA、多肽或碳水化合物链相互作用。因此,功能核酸可与靶多肽的mRNA或基因组DNA相互作用,或其可与靶多肽自身相互作用。功能核酸通常被设计成基于靶分子与功能核酸分子之间的序列同源性与其它核酸相互作用。在其它情况下,功能核酸分子与靶分子之间的特异性识别不是基于功能核酸分子与靶分子之间的序列同源性,而是基于形成允许特异性识别发生的三级结构。因此,组合物可以包括一种或多种被设计成用于降低靶蛋白的表达或功能的功能核酸。
用于所述功能核酸的体内表达的载体的制造和使用方法是本领域中已知的,所述功能核酸如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、miRNA、EGS、gRNA、sgRNA、核酶以及适体。
在某些实施例中,功能核酸是反义分子。反义分子被设计成通过典型或非典型碱基配对与靶核酸分子相互作用。反义分子与靶分子的相互作用被设计成通过例如核糖核酸酶H介导的RNA-DNA混合降解来促进靶分子的破坏。或者,反义分子被设计成中断通常将发生于靶分子上的加工功能,如转录或复制。反义分子可基于靶分子的序列来设计。存在许多通过找到靶分子的最方便进入的区域来优化反义效率的方法。示范性方法包括使用DMS和DEPC的体外选择实验和DNA修饰研究。反义分子优选以小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12的解离常数(Kd)结合靶分子。
在某些实施例中,功能核酸是适体。适体是与靶分子相互作用,优选以特定方式相互作用的分子。典型地,适体是长度在15-50个碱基的范围内的小核酸,其折叠成限定的二级和三级结构,如茎-环或G-四联体。适体能够结合小分子,如ATP和茶碱;以及大分子,如逆转录酶和凝血酶。适体可以小于10-12M的Kd极紧密地与靶分子结合。适体优选以小于10-6、10-8、10-10或10-12的Kd结合靶分子。适体能够以极高程度的特异性结合靶分子。举例来说,已分离出这样的适体,它们在靶分子与另一个仅在分子上的单一位置不同的分子之间的结合亲和力方面具有超过10,000倍的差异。适体与靶分子的Kd优选比与背景结合分子的Kd低至少10、100、1000、10,000或100,000倍。当进行如多肽的分子的比较时,背景分子优选是不同的多肽。
功能核酸可以是核酶。核酶是能够催化分子内或分子间化学反应的核酸分子。核酶优选催化分子间反应。描述了催化核酸酶或核酸聚合酶型反应、基于天然系统中所发现的核酶的不同类型的核酶,如锤头状核酶。还描述了并非在天然系统中发现的,但已经过工程改造以从头催化特定反应的核酶。优选的核酶裂解RNA或DNA底物,并且更优选地裂解RNA底物。核酶典型地通过识别并结合靶底物与后续裂解来裂解核酸底物。这种识别通常大多基于典型或非典型碱基对相互作用。这种特性使得核酶成为了核酸的靶向特异性裂解的尤其良好的候选物,因为对靶底物的识别是基于靶底物序列。
功能核酸可以是三链形成寡核苷酸分子。三链形成功能核酸分子是能够与双链或单链核酸相互作用的分子。当三链分子与靶区域相互作用时,形成一种被称作三链的结构,在三链中,DNA的三条链根据沃森-克里克(Watson-Crick)和胡斯坦(Hoogsteen)碱基配对形成了复合物。因为三链分子能够以高亲和力和特异性结合靶区域,所以三链分子是优选的。三链形成分子优选以小于10-6、10-8、10-10或10-12的Kd结合靶分子。
功能核酸可以是外部引导序列。外部引导序列(external guide sequence,EGS)是结合靶核酸分子形成复合物的分子,该复合物由核糖核酸酶P识别,该核糖核酸酶P接着裂解靶分子。EGS可被设计成特异性靶向所选RNA分子。核糖核酸酶P有助于加工细胞内的转运RNA(tRNA)。可以募集细菌核糖核酸酶P,通过使用EGS,引起靶RNA:EGS复合物模拟天然tRNA底物来裂解几乎任何RNA序列。类似地,真核EGS/核糖核酸酶P引导的RNA裂解可用于裂解真核细胞内的所期望的目标。如何制造和使用EGS分子来促进多种不同靶分子的裂解的代表性实例是本领域中已知的。
在一些实施例中,功能核酸通过RNA干扰(siRNA)诱导基因沉默。可以通过RNA干扰以高度特异性方式使靶基因的表达有效地沉默。
对指定基因具有干扰活性的RNA多核苷酸将通过引起具有相应互补序列的特异性信使RNA(mRNA)的降解并防止产生蛋白质来下调该基因(参见Sledz和Williams,《血液》(Blood),106(3):787-794(2005))。当RNA分子与mRNA形成互补的沃森-克里克碱基对时,它通过辅助蛋白诱导mRNA裂解。RNA的来源可以是病毒感染、转录或从外源来源引入。
基因沉默最初是在添加双链RNA(dsRNA)的情况下观察到的(Fire等人(1998)《自然》(Nature),391:806-11;Napoli等人(1990)《植物细胞》(Plant Cell)2:279-89;Hannon,(2002)《自然》,418:244-51)。一旦dsRNA进入细胞,它就会被称为切丁酶(Dicer)的核糖核酸酶III样酶裂解成长度为21-23个核苷酸的双链小干扰RNA(siRNA),其3'端含有2个核苷酸突出物(Elbashir等人,《基因与发育》(Genes Dev.),15:188-200(2001);Bernstein等人,《自然》,409:363-6(2001);Hammond等人,《自然》,404:293-6(2000);Nykanen等人,《细胞》(Cell),107:309-21(2001);Martinez等人,《细胞》,110:563-74(2002))。iRNA或siRNA的作用或其用途不限于任何类型的机制。
在一个实施例中,siRNA在siRNA与靶RNA之间的序列同一性区域内触发同源RNA分子,如mRNA的特异性降解。可以使用模拟由酶切丁酶产生的siRNA的合成短双链RNA在哺乳动物细胞中实现序列特异性基因沉默(Elbashir等人,《自然》,411:494-498(2001))(Ui-Tei等人,《欧洲生物化学学会联合会快报》(FEBS Lett),479:79-82(2000))。siRNA可以是化学合成或体外合成的或可以是短双链发夹样RNA(shRNA)被处理成细胞内部的siRNA的结果。举例来说,WO 02/44321描述了当与3'突出端进行碱基配对时能够序列特异性降解靶mRNA的siRNA,并且为了这些siRNA的制造方法专门通过引用并入本文中。合成siRNA一般使用算法和常规DNA/RNA合成器来设计。供应商包括安必逊(Ambion)(德克萨斯州奥斯汀(Austin,Texas))、化学基因(ChemGenes)(马萨诸塞州亚什兰(Ashland,Massachusetts))、达尔马肯(Dharmacon)(科罗拉多州拉斐特(Lafayette,Colorado))、格伦研究(GlenResearch)(弗吉尼亚州斯特林(Sterling,Virginia))、MWB生物技术(MWB Biotech)(德国埃伯斯贝格(Esbersberg,Germany))、普罗丽格(Proligo)(科罗拉多州博尔德(Boulder,Colorado))以及凯杰(Qiagen)(荷兰文托(Vento,The Netherlands))。siRNA也可以使用试剂盒,如安必逊的siRNA构建试剂盒体外合成。
因此,在一些实施例中,MDNP包括一个或多个siRNA,或一个或多个表达siRNA的载体。从载体产生siRNA更通常通过短发夹核糖核酸酶(shRNA)的转录进行。用于制造包括shRNA的载体的试剂盒是可获得的,如英格奈克斯(Imgenex)的GENESUPPRESSORTM构建试剂盒和英杰(Invitrogen)的BLOCK-ITTM诱导型RNAi质粒和慢病毒载体。在一些实施例中,功能核酸是siRNA、shRNA或miRNA。
b.抗原
在一些实施例中,外源性核酸序列编码疫苗抗原。抗原可以包括受试者生物体的任何外来蛋白质或肽。优选的抗原可以存在于受试者的抗原呈递细胞(antigenpresenting cell,APC)的表面,以便受到免疫效应细胞的监视,免疫效应细胞例如表达CD4受体的白细胞(CD4 T细胞)和自然杀伤(Natural Killer,NK)细胞。典型地,抗原源自病毒、细菌、原生动物、真菌或动物。在一些实施例中,抗原是癌症抗原。癌症抗原可以是仅在肿瘤细胞上表达和/或是肿瘤细胞存活所必需的抗原。某些抗原被本领域的普通技术人员视为具有免疫刺激性(即,刺激有效的免疫识别)并且为衍生出它们的生物体或分子提供有效免疫。
B细胞抗原可以是肽、蛋白质、多糖、糖、脂质、核酸、小分子(单独或含半抗原)或其组合。T细胞抗原是蛋白质或肽。抗原可以来源于病毒、细菌、寄生虫、植物、原生动物、真菌、组织或转化细胞,如癌细胞或白血病细胞,并且可以是全细胞或其免疫原性组分,例如其细胞壁组分或分子组分。合适的抗原是本领域中已知的,并且可从商业政府和科学来源获得。抗原可以是来源于肿瘤或病毒或细菌来源的经过纯化或部分纯化的多肽。抗原可以是通过表达编码异源表达系统中的多肽抗原的DNA产生的重组多肽。抗原蛋白的全部或一部分可以由用于递送的DNA或RNA分子编码。抗原可作为单一抗原提供或可以组合形式提供。抗原还可以作为多肽或核酸的复杂混合物提供。
病毒抗原
在一些实施例中,抗原是病毒抗原。病毒抗原可以从任何病毒分离,包括但不限于来自以下病毒科中的任一个的病毒:沙粒病毒科(Arenaviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)、星状病毒科(Astroviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、杆状DNA病毒属(Badnavirus)、杆状RNA病毒科(Barnaviridae)、双RNA病毒科(Birnaviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、线形病毒属(Capillovirus)、香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)、花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)、环病毒科(Circoviridae)、黄化丝状病毒属(Closterovirus)、豇豆花叶病毒科(Comoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)(例如冠状病毒属(Coronavirus),如严重急性呼吸综合症(severe acute respiratory syndrome,SARS)病毒)、被脂病毒科(Corticoviridae)、囊状噬菌体科(Cystoviridae)、δ病毒属(Deltavirus)、香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)、豌豆耳突花叶病毒属(Enamovirus)、丝状病毒科(Filoviridae)(例如马尔堡病毒(Marburg virus)和埃博拉病毒(EBOV)(例如扎伊尔(Zaire)、雷斯顿(Reston)、象牙海岸(Ivory Coast)或苏丹(Sudan)病毒株))、黄病毒科(Flaviviridae)(例如丙型肝炎病毒、登革热病毒1、登革热病毒2、登革热病毒3和登革热病毒4)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如人类疱疹病毒1、3、4、5和6和巨细胞病毒)、低毒性病毒科(Hypoviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、光滑病毒科(Leviviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如甲型流感病毒,如H1N1病毒株,以及乙型和丙型流感病毒)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如麻疹、腮腺炎和人类呼吸道合胞病毒)、细小病毒科(Parvoviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、肝病毒和口蹄疫病毒)、痘病毒科(Poxviridae)(例如牛痘和天花病毒)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如轮状病毒)、逆转录病毒科(Retroviridae)(例如慢病毒,如人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)1和HIV2)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如狂犬病病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等)、披膜病毒科(Togaviridae)(例如风疹病毒、登革热病毒等)以及整体病毒科(Totiviridae)。合适的病毒抗原还包括登革热蛋白质M、登革热蛋白质E、登革热D1NS1、登革热D1NS2和登革热D1NS3的全部或部分。病毒抗原可以来源于特定的病毒株,如乳头瘤病毒、疱疹病毒,即单纯疱疹1和2;肝炎病毒,例如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、δ丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)和庚型肝炎病毒(HGV)、蜱传脑炎病毒;副流感、水痘-带状疱疹、巨细胞病毒、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)、轮状病毒、鼻病毒、腺病毒、柯沙奇病毒(coxsackieviruses)、马脑炎、日本脑炎、黄热病、裂谷热(Rift Valley fever)以及淋巴细胞性脉络丛脑膜炎。典型地,由repRNA编码的病毒抗原并不是来源于研发出repRNA的天然病毒基因组。
在一些实施例中,病毒抗原来源于正粘病毒科的一种或多种病毒,例如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、鲑传贫病毒属(Isavirus)、托高土病毒属(Thogotovirus)以及夸兰加病毒属(Quaranjavirus)。示范性甲型流感病毒亚型包括H1N1、H1N2、H3N2、H3N1、H5N1、H2N2和H7N7。示范性流感病毒抗原包括一种或多种蛋白质或糖蛋白,如血凝素,如HA1和HA2亚单位;神经氨酸酶;病毒RNA聚合酶,如PB1、PB2PA和PB1-F2中的一个或多个;逆转录酶;衣壳蛋白;非结构蛋白,如NS1和NEP;核蛋白;基质蛋白,如M1和M2;以及孔蛋白。在一些实施例中,甲型流感病毒抗原包括血凝素(Hemagglutinin,HA)或神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)糖蛋白或HA或NA的片段中的一个或多个,包括血凝素HA1糖蛋白的抗原位点。在一个示范性实施例中,MDNP包括编码流感A/WSN/33HA蛋白的RNA。
在一些实施例中,病毒抗原来源于埃博拉病毒属的一种或多种病毒,例如扎伊尔埃博拉病毒(Zaire ebolavirus,EBOV)、苏丹埃博拉病毒(Sudan ebolavirus,SUDV)、塔伊森林埃博拉病毒(Forest ebolavirus,TAFV)、雷斯顿埃博拉病毒(Reston ebolavirus,RESTV)以及本迪布焦型埃博拉病毒(Bundibugyo ebolavirus,BDBV)。在一个示范性实施例中,MDNP包括RNA,如repRNA,其编码扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白(GP)或扎伊尔埃博拉病毒糖蛋白(GP)的一个或多个片段。
在一些实施例中,病毒抗原来源于黄病毒属的一种或多种病毒,例如寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)。
细菌抗原
在一些实施例中,抗原是细菌抗原。细菌抗原可以源自任何细菌,包括但不限于放线菌属(Actinomyces)、项圈藻属(Anabaena)、杆菌属(Bacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、博德特氏菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、柄杆菌属(Caulobacter)、衣原体属(Chlamydia)、绿菌属(Chlorobium)、色素菌属(Chromatium)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、噬细胞菌属(Cytophaga)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、盐杆菌属(Halobacterium)、螺杆菌属(Heliobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、B型流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzatype B,HIB)、生丝微菌属(Hyphomicrobium)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体病(Leptspirosis)、李斯特菌属(Listeria)、A群、B群和C群脑膜炎双球菌、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属(Myobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、粘球菌属(Myxococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、硝化菌属(Nitrobacter)、颤蓝细菌属(Oscillatoria)、原绿藻(Prochloron)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红螺菌属(Phodospirillum)、立克次体属(Rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、螺菌属(Spirillum)、螺旋体属(Spirochaeta)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、热原体属(Thermoplasma)、硫杆菌属(Thiobacillus)和螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)以及耶尔森氏菌属(Yersinia)。
寄生虫抗原
在一些实施例中,抗原是寄生虫抗原。示范性寄生虫过敏原包括但不限于新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、白色念珠菌(Candida albicans)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、星形诺卡菌(Nocardiaasteroides)、立氏立克次体(Rickettsia ricketsii)、斑疹伤寒立克次体(Rickettsiatyphi)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydial psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydial trachomatis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)以及曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)。这些包括孢子虫抗原、疟原虫抗原,如环子孢子蛋白、子孢子表面蛋白、肝期抗原、顶端膜相关蛋白或裂殖子表面蛋白的全部或部分。
在一些实施例中,寄生虫抗原是来自原生动物的一种或多种抗原,如弓形体属的一种或多种原生动物,例如刚地弓形虫,以及近缘属物种,如新孢子虫属(Neospora)、哈蒙德虫属(Hammondia)、弗伦克虫属(Frenkelia)、等孢子球虫属(Isospora)以及肉孢子虫属(Sarcocystis)。来源于刚地弓形虫的示范性抗原包括GRA6、ROP2A、ROP18、SAG1、SAG2A以及AMA1基因产物。
过敏原和环境抗原
在一些实施例中,抗原是过敏原或环境抗原。
示范性过敏原和环境抗原包括但不限于衍生自天然存在的过敏原的抗原,天然存在的过敏原例如花粉过敏原(树木、草本植物、野草以及禾本科植物的花粉过敏原)、昆虫过敏原(吸入性过敏原、唾液过敏原和毒液过敏原)、动物毛发和皮屑过敏原以及食物过敏原。
来自树木、禾本科植物以及草本植物的重要花粉过敏原源自以下分类学目:壳斗目、木犀目、松杉目和悬铃木科,包括例如桦树(桦属)、桤木(桤木属)、榛木(榛属)、角木(鹅耳枥属)以及橄榄(木犀榄属)、雪松(柳杉属和刺柏属)、悬铃木(悬铃木属);禾本目,包括例如黑麦草属、梯牧草属、早熟禾属、狗牙根属、鸭茅属、绒毛草属、虉草属、黑麦属以及高粱属的禾本科植物;菊目和荨麻目,包括例如豚草属、蒿属和墙草属的草本植物。其它可以使用的过敏原抗原包括来自以下的过敏原:表皮螨属(Dermatophagoides)和嗜霉螨属(Euroglyphus)的屋尘螨;储存尘螨,例如嗜鳞螨属(Lepidoglyphys)、食甜螨属(Glycyphagus)和食酪螨属(Tyrophagus);来自蟑螂、蚊和跳蚤的过敏原,例如小蠊属(Blatella)、大蠊属(Periplaneta)、摇蚊属(Chironomus)和栉头蚤属(Ctenocepphalides);来自如猫、狗和马的哺乳动物的过敏原;来自鸟类的过敏原;毒液过敏原,包括源自叮蛰昆虫或叮咬昆虫的毒液过敏原,叮蛰昆虫或叮咬昆虫例如分类学目膜翅目昆虫,包括蜜蜂(总科蜜蜂科)、黄蜂(总科胡蜂科)以及蚂蚁(总科蚁科)。其它可以使用的过敏原抗原包括来自真菌的吸入过敏原,例如来自链格孢属(Alternaria)和芽枝霉属(Cladosporium)的真菌。
示范性食物过敏原包括牛奶(例如乳糖)、鸡蛋、坚果、贝类、鱼以及豆类(花生和大豆)、水果和蔬菜,如蕃茄。
当抗原是过敏原时,MDNP可以包括一种或多种免疫调节分子,或一种或多种编码免疫调节分子的核酸,以针对所递送的过敏原将免疫反应特异性指向Th1(细胞)或Th2(体液)极化。
肿瘤抗原
在一些实施例中,抗原是肿瘤抗原。存在许多类别的肿瘤抗原,包括但不限于致癌基因表达产物、选择性剪接表达产物、突变基因产物、过表达基因产物、异常表达基因产物、由致癌病毒产生的抗原、癌胚抗原、以及细胞表面糖脂改变的蛋白质和糖基化分布改变的蛋白质。
由MDNP所包括或编码的示范性肿瘤抗原包括肿瘤相关的或肿瘤特异性抗原,例如但不限于α-辅肌动蛋白-4、甲胎蛋白(Alphafetoprotein,AFP)、Bcr-Ab1融合蛋白、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)、CA-125、Casp-8、β-连环蛋白(beta-catenin)、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、上皮肿瘤抗原、EF2、ETV6-AML1融合蛋白、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1、2和3、neo-PAP、I类肌球蛋白、OS-9、pml-RARa融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸丙糖异构酶、Bage-1、Gage 3、4、5、6、7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、黑素瘤相关抗原(Melanoma-associated antigen,MAGE);Mage-A1、2、3、4、6、10、12、Mage-C2、NA-88、NY-Eso-1/Lage-2、SP17、SSX-2和TRP2-Int2、MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、艾伯斯坦-巴尔病毒抗原、EBNA、人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、α-甲胎蛋白、13HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、MUC-1、NB\70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-关联蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP、酪氨酸酶以及TPS。示范性肿瘤抗原是模型黑素瘤肿瘤抗原Trp1。
在某些实施例中,肿瘤抗原是正常在胚胎发生过程中表达并且其在正常成年组织中的表达受到限制的基因的基因产物,如“癌胚”蛋白或正常蛋白质的选择性剪接变体。癌胚抗原是典型地仅存在于胎儿发育过程中,但在患有某些种类的癌症的成年人中也有发现的蛋白质。个体血液中的这些蛋白质常常是可测量的并且可用于肿瘤的诊断和后续治疗。因此,在一些实施例中,MDNP包括或编码一种或多种癌胚蛋白。示范性癌胚蛋白是Hmga2蛋白。
c.其它治疗剂或预防剂
可被封装在MDNP内或与MDNP的表面结合的活性剂的非限制性列举包括抗感染剂、免疫调节剂、激素、抗氧化剂、类固醇、抗增殖剂以及诊断剂。治疗剂可以包括药物或药物的修饰形式,如前药和类似物。在一些实施例中,MDNP用于递送肽药物、染料、抗体或抗体的抗原结合片段。
治疗剂在一些实施例中,MDNP封装一种或多种治疗剂。
可以与MDNP结合的治疗剂的实例包括但不限于β-内酰胺类抗生素(包括青霉素(penicillins),如氨苄青霉素(ampicillin)、头孢菌素(cephalosporins),头孢菌素又选自头孢呋辛(cefuroxime)、头孢克洛(cefaclor)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢羟氨苄(cephydroxil)以及头孢肟酯(cepfodoxime proxetil));四环素类抗生素(多西环素(doxycycline)和米诺环素(minocycline));大环内酯类抗生素(阿奇霉素(azithromycin)、红霉素(erythromycin)、雷帕霉素(rapamycin)和克拉霉素(clarithromycin));氟喹诺酮类(环丙沙星(ciprofloxacin)、恩氟沙星(enrofloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin))诺氟沙星(norfloxacin);抗氧化药物,包括N-乙酰半胱胺酸(NAC);消炎药,如非甾体类药物(例如吲哚美辛(indomethacin)、阿司匹林(aspirin)、醋氨酚(acetaminophen)、双氯芬酸钠(diclofenac sodium)和布洛芬(ibuprofen));甾体消炎药(例如地塞米松(dexamethasone));抗增殖剂(例如紫杉醇(Paclitaxel)(紫杉酚(Taxol))、QP-2长春花新碱(Vincristin)、甲氨蝶呤(Methotrexat)、血管抑肽(Angiopeptin)、丝裂霉素(Mitomycin)、BCP 678、反义c-myc、ABT 578、放线菌素D(Actinomycin-D)、RestenASE、1-氯-脱氧腺苷、PCNA核酶以及塞来昔布(Celecoxib))西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)和ABT-578);紫杉醇和抗肿瘤剂,包括烷化剂(例如环磷酰胺(cyclophosphamide)、氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲基苄肼(procarbazine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、六甲蜜胺(altretamine)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)以及奥沙利铂(oxaliplatin));抗肿瘤抗生素(例如博莱霉素(bleomycin)、放线菌素D、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素C(mitomycinC)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)、拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、表阿霉素(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)和米托蒽醌);抗代谢物(例如脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、2-氯脱氧腺苷、羟基脲、氨甲喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶、卡培他滨(capecitabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinoside)、氮杂胞苷(azacytidine)、吉西他滨(gemcitabine)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)和天冬酰胺酶(aspariginase));抗有丝分裂剂(例如长春花新碱、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、多西他赛(docetaxel)、雌莫司汀(estramustine));分子靶向剂,包括抗体、抗体片段、或碳水化合物/多糖(例如伊马替尼(imatinib)、维甲酸(tretinoin)、贝沙罗汀(bexarotene)、贝伐单抗(bevacizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab ogomicin)和地尼白介素(denileukin diftitox));以及皮质甾类(例如醋酸氟轻松(fluocinolone acetonide)和甲基泼尼松龙(methylprednisolone))。
免疫调节剂
在某些实施例中,MDNP封装一种或多种免疫调节分子或编码免疫调节蛋白质的核酸,产生这些以针对所递送的抗原将免疫反应特异性指向辅助性T细胞1(Th1;细胞)或辅助性T细胞2(Th2,体液)极化。
这可以通过促进与保护相关的Th路径增强对与抗原相关的疾病的功能性免疫,或通过将远离与不当免疫反应相关的Th路径的免疫反应指向抗原来实现耐受性。因此,在一些实施例中,为了减少体液反应,从而治疗过敏,MDNP包括驱动针对过敏原的细胞免疫的分子或编码蛋白质的RNA。此原理可应用于诱导针对负责自身免疫疾病的自身抗原的免疫耐受性,例如通过驱动Th2反应来减少多发性硬化或类风湿性关节炎的Th1相关病理学。示范性免疫调节分子包括合成的受体配体或蛋白质、细胞因子或其它信号分子。
在一些情况下,期望B细胞发生朝向非炎性抗体同型(即,免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白G(IgG4)),并且远离与过敏反应相关的免疫球蛋白E(IgE)同型的类别转换。因此,在一些实施例中,MDNP封入或编码能够驱动B细胞朝向非炎性抗体同型的类别转换的分子。示范性免疫调节分子包括白细胞介素,如IL-10。
4.基于改性树枝状聚合物的复合纳米颗粒
在一些实施例中,MDNP包括超过一种类型的封装剂分子(即,“复合”MDNP)。举例来说,MDNP可以包括超过一个物种的RNA,如mRNA和repRNA。mRNA和repRNA可以编码相同或不同基因。在一些实施例中,复合MDNP经过工程改造包括超过一个物种的repRNA和超过一个物种的mRNA。repRNA和mRNA可以编码相同或不同基因。
当mRNA和repRNA被封入同一个复合MDNP内时,mRNA和repRNA可以经过工程改造含有互补的5'和3'非翻译区(UTR)。举例来说,可将mRNA修饰成包括由repRNA编码的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)识别的UTR(“修饰后mRNA”)。
当包括相同的或互补的UTR的修饰后mRNA和repRNA物种同时沉积到宿主细胞的细胞质中时,由repRNA编码的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)能够通过识别复制子UTR来复制修饰后mRNA。
关于这种策略,将两种类型的可扩增有效载荷共同递送到细胞的细胞质中。含复制子UTR的修饰后mRNA的添加提高了系统的整体效率,因为两个可扩增有效载荷被同时递送到细胞中,而不是一个。因此,repRNA能够合成更多的全长复制子的拷贝或只是repRNA编码的抗原的拷贝(即,借助于亚基因组启动子),或更多的在复合MDNP内所包括的修饰后mRNA的拷贝。
宿主细胞核糖体继续翻译全长复制子拷贝或较短的仅抗原mRNA,使得由修饰后mRNA和repRNA编码的基因的表达增强(参见图1B)。
因此,在一些实施例中,MDNP是同时携带两个或更多个有效载荷类型的复合MDNP。举例来说,MDNP可以携带一个或多个repRNA,和一个或多个并入了复制子的5'和3'非翻译区(UTR)的mRNA。一个或多个repRNA和一个或多个mRNA可以编码相同或不同基因。在一些实施例中,MDNP包括编码两个或更多个不同的肽抗原的两个或更多个基因。
在其它实施例中,复合MDNP可被配制成包括一个或多个repRNA,和一个或多个并入了复制子的5'和3'非翻译区(UTR)的mRNA,其它核酸以及任选地一种或多种额外活性剂,如功能核酸、蛋白质或小分子。
在一些实施例中,复合MDNP被配制成包括编码超过一种原生动物抗原的一个或多个repRNA。在一个示范性实施例中,复合MDNP编码刚地弓形虫的GRA6、ROP2A、ROP18、SAG1、SAG2A以及AMA1基因产物。
在一些实施例中,复合MDNP被配制成包括两个或更多个病毒抗原,这些病毒抗原来源于一种或多种正粘病毒科病毒,例如甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒。在一个示范性实施例中,复合MDNP包括编码来自相同或不同的甲型流感病毒亚型的两个或更多个抗原的RNA,这些病毒亚型包括季节性和大流行性流感病毒株。举例来说,在一些实施例中,复合MDNP包括两个或更多个来自H1N1、H1N2、H3N2、H3N1、H5N1、H2N2和H7N7亚型中的一个或多个的抗原。在一些实施例中,复合MDNP包括两个或更多个来源于H1N1、H1N2、H3N2、H3N1、H5N1、H2N2和H7N7流感病毒亚型中的一个或多个的蛋白质或糖蛋白,如血凝素的HA1亚单位、血凝素的HA2亚单位;神经氨酸酶;病毒RNA聚合酶,如PB1、PB2 PA和PB1-F2中的一个或多个;逆转录酶;衣壳蛋白;非结构蛋白,如NS1和NEP;核蛋白;基质蛋白,如M1和M2;以及孔蛋白。在一些实施例中,复合MDNP包括两个或更多个来自H1N1、H1N2、H3N2、H3N1、H5N1、H2N2和H7N7流感亚型中的两个或更多个的HA抗原。
B.赋形剂、递送媒剂和装置
MDNP可被配制成包括适合将纳米颗粒给予到受试者体内的赋形剂的组合物。
在某些实施例中,在适合通过注射,例如通过肌肉内(i.m.)、静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)注射,或通过皮肤划痕法递送到受试者中的载剂或赋形剂中配制MDNP。典型的载剂是生理盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖溶液以及其它可注射载剂。
因此,描述包括MDNP的配制品含或不含递送媒剂。MDNP可被配制成包括一种或多种药学上可接受的载剂的药物组合物。药物组合物可根据所期望的MDNP的目的和预期用途,针对不同的给药机制进行配制。描述了被配制成通过肠胃外(肌肉内、腹膜内、静脉内(IV)、眼内或皮下注射)、局部或经皮(被动地或使用离子导入疗法或电致孔)给药途径或使用生物蚀解性插入物给药的药物组合物。
1.肠胃外给药
在一些实施例中,MDNP被配制成通过肠胃外注射以水溶液形式给药。配制品还可以呈悬浮液或乳液形式。一般来说,提供这样的药物组合物,其包括有效量的活性剂、靶向部分和任选的递送媒剂,并且任选地包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂和/或载剂。此类组合物包括稀释剂无菌水;具有各种缓冲内容(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的缓冲盐水;和任选地添加剂,如清洁剂和增溶剂(例如也称为聚山梨醇酯20或80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)和防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)和增量物质(例如乳糖、甘露糖醇)。非水溶剂或媒剂的实例是丙二醇;聚乙二醇;植物油,如橄榄油和玉米油;明胶;以及可注射有机酯,如油酸乙酯。配制品可以冻干并在即将使用之前再溶解/再悬浮。配制品可以通过例如细菌截留过滤器过滤、通过将灭菌剂并入到组合物中、通过照射组合物或通过加热组合物加以灭菌。
2.经肺、局部和经粘膜给药
MDNP的组合物可被配制成局部施用、通过滴注或通过吸入施用。在一些实施例中,MDNP被配制成粘膜给药,如肺粘膜、口腔粘膜、眼睛粘膜、肺粘膜、鼻粘膜、口腔粘膜(舌下粘膜、颊粘膜)、阴道粘膜或直肠粘膜。用于粘膜给药的配制品典型地是经过喷雾干燥的药物颗粒,其可并入片剂、凝胶、胶囊、悬浮液或乳液中。标准药物赋形剂可从任何的配方设计师获得。
在一些实施例中,MDNP被配制成用于递送到皮肤,例如通过直接施用到病变的或损伤的或破裂的皮肤表面。因此,在一些实施例中,MDNP被配制成用于递送到伤口或手术部位。被配制成用于局部递送的组合物可以包括一种或多种渗透促进剂。
在一个实施例中,MDNP被配制成用于经肺递送,如鼻内给药或经口吸入。呼吸道是参与大气与血流之间的气体交换的结构。上气道和下气道被称为传导气道。末端细支气管被分成呼吸性细支气管,呼吸性细支气管随后通向最终的呼吸带肺泡或肺的深部。肺的深部或肺泡是所吸入的治疗性气雾剂进行全身性药物递送的主要目标。在肺中具有活性的治疗剂可全身性地给予并且通过肺部吸收来靶向。术语气雾剂是指颗粒的任何细密的薄雾制剂,它可以呈溶液或悬浮液形式,无论它是否使用推进剂产生。气雾剂可以使用标准技术,如超声波或高压处理来产生。
肺用配制品的载剂可以分成用于干粉配制品的载剂和用于以溶液形式给药的载剂。用于将治疗剂递送到呼吸道的气雾剂是本领域中已知的。对于通过上呼吸道给药,可以将配制品配制成溶液,例如水或等张盐水,经过缓冲或未经过缓冲;或配制成悬浮液,作为滴剂或作为喷雾进行鼻内给药。优选地,此类溶液或悬浮液相对于鼻分泌物是等张的并且具有介于例如约pH 4.0到约pH 7.4或pH 6.0到pH 7.0的范围内的大致相同的pH。缓冲液在生理学上应该是相容的并且简单举例来说包括磷酸盐缓冲液。本领域普通技术人员可以容易地确定用于经鼻和/或上呼吸道给药的无害水溶液的合适的盐水含量和pH。
组合物可在被吸入时递送到肺并且在以气雾剂或空气动力学直径小于约5微米的喷雾干燥颗粒形式递送时横越肺上皮衬层到达血流。
具有大粒径的干粉配制品(“DPF”)具有改善的可流动性特征,如较少聚集、较容易气雾化并且吞噬作用可能较小。通常产生的用于吸入疗法的干粉气雾剂的平均直径主要在小于5微米的范围内,不过优选范围是空气动力学直径在1微米与10微米之间。将大“载剂”颗粒(不含药物)与治疗性气雾剂共同递送来帮助实现高效气雾化以及其它可能的益处。可以使用广泛范围的被设计成用于经肺递送治疗产品的机械装置,包括但不限于雾化器、定量吸入器和粉末吸入器,这些全都是本领域的普通技术人员所熟悉的。
III.基于改性树枝状聚合物的纳米颗粒的制造方法
提供MDNP的制造方法。典型地,方法包括在一种或多种治疗剂、预防剂和诊断剂存在下组合烷基化树枝状聚合物与一种或多种两亲性聚合物。
描述了含有如repRNA的封装剂的MDNP的制造方法。这些方法可以用来例如将大的repRNA包装到MDNP中。
一般来说,MDNP的制造方法对于待包装到MDNP内的封装剂的结构没有任何限制。举例来说,封入MDNP内的核酸可以是长的或短的,单链或双链,并且可以具有任何序列。由所述方法产生的含有治疗剂、预防剂和诊断剂的MDNP的纯化不值一提,可能比未包装货物的纯化更简单。
当在MDNP内封入核酸时,核酸可以是至少80%纯的。在其它实施例中,核酸是至少85%纯的、至少90%纯的或至少95%纯的。典型地,一个MDNP含有至少一个核酸分子。
在一个实施例中,RNA以约5:1的改性树枝状聚合物/RNA摩尔比包装在MDNP内。
A.基于改性树枝状聚合物的纳米颗粒的组装
一般来说,通过混合可电离的树枝状聚合物、亲水性锚定聚合物以及治疗剂、预防剂和诊断剂来配制MDNP。混合可以通过本领域中已知的任何合适的手段进行,如使用微流体混合(Khan等人,《纳米快报》(Nano Lett),doi:10.1021/nl5048972(2015);Khan等人,《应用化学》(Angewandte Chemie)53,14397-14401,doi:10.102/anie.201408221(2014))。
改性树枝状聚合物和两亲性聚合物可以使用合适的溶剂组合,如乙醇。当RNA分子作为货物包括于MDNP内时,可以在如柠檬酸盐缓冲液(pH 2-4)的低pH缓冲液中稀释RNA。
B.MDNP的纯化
因为MDNP独特的大小、特性以及高稳定性,所以很容易在组装之后从底物中纯化出MDNP。由所述方法产生的含有一系列治疗剂、预防剂和诊断剂的MDNP的纯化是简单直接的,并且可以使用本领域中已知的标准方法进行,如快速蛋白液相色谱(fast proteinliquid chromatography,FPLC)、过滤、沉降、蔗糖梯度分离、亲和标签色谱以及场流分级-多角度光散射(flow-field fractionation multiangle light scattering,FFF-MALS)。在一些实施例中,可以通过过滤来纯化纳米颗粒,例如使用0.2微米聚(醚砜)过滤器。
纯化后的纳米颗粒可以使用本领域中已知的任何技术表征,如光散射。
在一些实施例中,可以在成熟颗粒的动电电位或ζ电位的基础上表征和/或分离颗粒。ζ电位能衡量颗粒之间的静电或电荷排斥/吸引的量值。在PBS中完全形成的颗粒的ζ电位可以在约-2mV到约-25mV的范围内且包括端值,例如-5mV到-20mV。测量颗粒的ζ电位的方法和在ζ电位的基础上分离颗粒的方法是本领域中已知的。
在一些实施例中,可以在成熟颗粒的分子量和/或流体动力学体积的基础上表征和/或分离颗粒。取决于配制颗粒的核心时所用的代数大小,完全形成的颗粒的分子量可以在约2,000Da到约80,000Da的范围内且包括端值。测量颗粒的分子量的方法和在分子量的基础上分离颗粒的方法是本领域中已知的。
MDNP可以配制成含有不同质量比的改性树枝状聚合物:疏水性锚定聚合物。典型地,MDNP所包括的改性树枝状聚合物的质量大于疏水性锚定聚合物。举例来说,MDNP可以配制成包括质量比在2:1与20:1之间的改性树枝状聚合物:疏水性锚定聚合物,如5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1或大于15:1。在某个实施例中,MDNP具有质量比11.5:1的改性树枝状聚合物:疏水性锚定聚合物。封装在MDNP内的治疗剂、预防剂和诊断剂的最终浓度可以通过理论质量平衡计算确定。典型地,MDNP所包括的改性树枝状聚合物的质量大于治疗剂、预防剂和诊断剂。举例来说,MDNP可以配制成包括质量比在2:1与10:1之间的改性树枝状聚合物:治疗剂、预防剂和诊断剂,如3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或大于10:1。在封装剂包括RNA的某个实施例中,MDNP具有质量比5:1的改性树枝状聚合物:RNA。
在封装剂包括DNA和/或mRNA的一些实施例中,MDNP具有质量比在2:1与10:1之间的范围内且包括端值的改性树枝状聚合物:RNA。
IV.使用方法
提供MDNP的使用方法。已确定,MDNP为向受试者的细胞递送包括大核酸和/或多肽的封装剂提供了有效的、生物相容性且无毒的媒剂。MDNP还是非免疫原性的,并且能够在受试者的血清中停留较长一段时间,如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、数周或数月。举例来说,可以设计MDNP来避开宿主免疫监视,从而提高MDNP的血清半衰期,引起吞噬体内的内化和/或非吞噬细胞类型的溶酶体分隔。
MDNP容易被许多细胞类型吸收并能够将所封入的治疗剂、预防剂和诊断剂有效地递送到生物靶区。举例来说,当MDNP易位到宿主细胞的细胞质中时,核酸、小分子以及蛋白质封装剂能够沉积到细胞质空间中。当封装剂包括外源基因时,基因可以在宿主细胞中表达,产生生物效应功能,如免疫调节。
因此,MDNP的使用方法可以包括给予受试者有效量的包括MDNP的组合物来向受试者的细胞递送一种或多种外源基因或多肽。典型地,细胞不是专职抗原呈递细胞。
MDNP能够在接受者的细胞中诱导生物作用,如免疫调节作用。举例来说,可以使用MDNP在受试者中刺激对所期望抗原的免疫反应。在一些实施例中,MDNP是RNA新抗原的安全有效的递送媒剂,RNA新抗原充当用于引起针对疾病的免疫反应的免疫原。
还提供了用于防止、降低或抑制受试者中的靶基因的表达或功能的方法。
A.核酸和多肽的递送方法
已确定,MDNP能够将包括大repRNA的核酸治疗剂、预防剂和诊断剂有效递送到细胞内部,引起外源基因在靶细胞中的表达增强。典型地,由repRNA编码的基因在受试者中的表达当在MDNP内递送repRNA时比当RNA单独递送时要大。举例来说,向细胞递送封装在MDNP内的编码一个或多个外源基因的repRNA相比于单独给予等量的纯repRNA或相比于向细胞递送封装在MDNP内的非复制mRNA,能够增强外源mRNA序列在细胞内的翻译并维持外源肽的长时间表达。
在颗粒被内化到宿主细胞中之前MDNP能保护核酸不被降解。内化可能是通过广义的内吞作用使MDNP内化到细胞中。MDNP能够在体内或体外将外源性核酸和多肽递送到真核生物细胞中。典型地,递送要求靶细胞接触并内化MDNP。内化可以通过一种或多种不同的机制发生。可以在体内或体外诱导在MDNP与靶细胞之间发生接触。一般来说,接触发生在体内。
因此,在一些实施例中,给予受试者MDNP。在一些实施例中,MDNP直接给予到受试者的身体上的特定位置。在其它实施例中,给药途径使MDNP直接靶向特定器官。
包括MDNP的药物组合物可以按各种方式给予,这取决于希望是局部给药还是全身给药,并且取决于待治疗的区域。可注射的配制品可以按常规形式制备,以液体溶液或悬浮液形式、以适合于在注射之前在液体中形成悬浮液的溶液的固体形式、或以乳液形式。在某些实施例中,组合物局部给予,例如通过直接注射到待治疗的部位。在一些实施例中,局部递送能够减少与全身递送相关的副作用或毒性,并且会因为局部剂量增加而引起结果增强。
组合物可以直接注射或以其它方式给予到一个或多个手术部位。典型地,局部注射引起MDNP组合物的浓度局部增大,此浓度大于通过全身性给药所能实现的浓度。
在一些实施例中,全身性给予的MDNP在血流中存留一段时间并在这段时间内将封装剂释放到靶细胞。优选稳定释放,将靶细胞中的外源性核酸或多肽保持在所期望的浓度。
可以在疾病症状发作之前、发作期间或发作之后的一段时间内,或在一种或多种疾病症状发作之前、发作期间或发作之后的各段时间的任何组合,给予MDNP的组合物。举例来说,可以在疾病症状发作之前(即,在预测发作之前)每1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35或48天给予受试者一个或多个剂量的组合物。个体可在疾病症状发作之后每1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35或48天给予一种或多种剂量的组合物。在一些实施例中,在疾病病况明显改善之前,给予多个剂量的组合物。举例来说,在一些实施例中,在疾病或病况明显改善之前1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35或48天或周的时间内,受试者接受1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35或48个剂量。
因此,可以取决于递送到靶细胞的核酸或多肽的所期望的作用,相对于诊断、预后、手术或损伤,在不同时间给予包括一个或多个MDNP的组合物。MDNP给药开始的时间选择应该根据受试者的需要来确定,并且可以相应地改变。
在一些实施例中,以一个或多个大丸剂剂量(bolus dose)向受试者递送单个剂量的MDNP以将MDNP的血液浓度或MDNP的有效载荷的血液浓度升高到所期望的水平。大丸剂可以通过任何手段给予,如通过注射。大丸剂剂量的放置可以取决于所期望的作用和待治疗的靶器官或靶组织而不同。在一个具体实施例中,在给予其它剂型之前给予大丸剂。
举例来说,MDNP可以经过工程改造以在血流中有不同的滞留时间,例如通过修改靶向部分、聚乙二醇化、聚合物表面密度等中的一个或多个。因此,可以使用视需要同时给予或在一段时间内按一系列给药给予的配制品的组合,将MDNP的所期望的血液浓度保持所期望的一段时间。
B.疫苗接种
在一些实施例中,MDNP能够向受试者递送外源性蛋白质和/或核酸以在受试者中刺激出所期望的免疫反应。通过MDNP递送抗原能够赋予针对如病毒和细菌的感染物的保护性免疫。改性树枝状聚合物具有非免疫原性,即使在比抗埃博拉攻击的剂量高50倍的剂量下(Khan等人《纳米快报》,doi:10.1021/nl5048972(2015);Khan等人《应用化学》53,14397-14401(2014)),该特性仍热有利于有效转基因表达,因为对先天免疫的任何刺激都只是因为mRNA有效载荷的表达。
提供使用被封入MDNP内的大型自我扩增型RNA复制子进行疫苗接种的方法,这类方法能够有力地、持续性地向免疫系统呈递抗原,但不会在注射后很早就刺激IFN反应。强烈的IFN反应可能会妨碍α病毒的复制,从而随着时间限制抗原剂量。(Zhang等人,《病毒学杂志》(J Virol)81,11246-11255,(2007);White等人,《病毒学杂志》75,3706-3718(2001))。
用包括编码OVA肽、HA抗原和EBOV GP抗原肽的repRNA的MDNP进行的实验(下文所论述)证明,MDNP能够将repRNA递送到细胞,产生针对一系列病毒并且也针对OVA肽的强免疫反应。
可以用其它蛋白质取代这些肽。这些蛋白质可以包括来自如病毒、细菌、真菌、原生动物的病原性微生物的蛋白质,以及癌症抗原。因此,MDNP能够充当疫苗试剂的安全有效的递送平台,疫苗试剂如靶向许多不同病原性微生物的RNA编码的抗原和新抗原。
典型地,MDNP介导将外源性抗原递送到受试者的细胞产生了能够识别并中和抗原的抗体和其它生物分子。已排列在抗原呈递细胞(APC)的表面上的抗原可以呈递给“辅助性”T细胞,如抗原特异性初始CD4+ T细胞。这类呈递通过T细胞受体(T cell receptor,TCR)递送信号,指导T细胞引发对所呈递的抗原具有特异性的免疫反应。
因此,MDNP可用于引发、缓和或增强对所编码抗原的体液和/或细胞免疫。举例来说,MDNP递送可有效诱导、增强或以其它方式缓和免疫细胞的生物活性的量的外源性核酸和/或蛋白质,免疫细胞例如巨噬细胞、B细胞、T细胞、树突状细胞以及NK细胞。
在一些实施例中,给予受试者包括编码抗原的核酸序列的MDNP赋予了该受试者对抗原的免疫。免疫可以表现为在受试者中产生了记忆T细胞(即,记忆CD8+ T细胞)和/或抗原特异性B细胞的储存库,足以对抗原的重复暴露提供快速免疫细胞和/或体液免疫反应。优选地,给予包括编码抗原的核酸序列的MDNP能够赋予针对由衍生出抗原的生物体引起的感染或疾病的保护。
典型地,向受试者给予包括编码抗原的核酸序列的MDNP相对于单独给予等量的抗原或编码抗原的核酸而言,增强了受试者的抗原的吸收和对抗原呈递细胞的递送。因此,通过MDNP给予受试者抗原相对于单独给予等量的抗原或编码抗原的核酸而言,能够增强受试者对抗原的免疫反应。举例来说,MDNP能够增加、延长或以其它方式增强所编码的抗原在受试者的抗原呈递细胞表面处的呈递。
可以预防性地或治疗性地给予疫苗。还可以根据疫苗方案给予疫苗。疫苗方案是一系列的疫苗接种,包括所有给药的时间选择。为了使有效性达到最大,产生足够的初始免疫反应或加强随时间减弱的反应,许多疫苗需要多次给药。疫苗计划是本领域中已知的,并且被设计成用于实现最大的有效性。针对MDNP中所递送的一个或多个抗原的适应性免疫反应可以使用本领域中已知用于测量疫苗接种方案的有效性的方法来监测。
在一些实施例中,MDNP向受试者递送外源性蛋白质和/或核酸并刺激特异性针对由宿主细胞表达和生物学加工的抗原的免疫反应。因此,使用由MDNP递送的编码抗原的核酸进行疫苗接种的方法能够提供对抗原,包括对宿主受试者具有特异性的翻译后修饰的免疫。举例来说,使用由MDNP递送的编码抗原的核酸进行疫苗接种能够提供对含有宿主的天然翻译后修饰的蛋白质的免疫,这些翻译后修饰例如糖基化、脂化(包括豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化)、硫酸化、氧化、磷酸化、腺苷酰化、甲基化以及酰胺化。受试者对这些经过翻译后修饰的肽抗原产生的免疫反应可以与在相同宿主中针对相同抗原肽的非天然表达或翻译后修饰形式出现的免疫反应相同或不同。
1.多个repRNA的疫苗接种策略
如上所述,MDNP可以包括两个或更多个不同的repRNA。两个或更多个不同的repRNA可以经过工程改造成表达相同或不同的外源性免疫原性抗原。
在一些实施例中,纳米颗粒疫苗包括RNA的不同物种的组合,如mRNA和repRNA,各自具有不同的抗原产生动力学。通过“复合”具有不同动力学的RNA,MDNP/RNA疫苗可以工程改造成在给药后的不同时间表达一个或多个抗原。复合MDNP/RNA疫苗可以包括不同MDNP的混合物,各自封入了不同的RNA物种,或者每个MDNP可以工程改造成包括超过一个RNA物种。
当MDNP被工程改造成包括一个RNA物种,如编码单个抗原的单个repRNA物种时,可以通过混合所期望的量的每种MDNP产生具有所期望的表达动力学的组合MDNP疫苗来设计疫苗。
因为编码外源性抗原的RNA在受试者细胞中的存留时间有限,所以基于MDNP的RNA疫苗具有自限性并且只在宿主消除RNA和身体清除掉所有疫苗产物之前的有限时间内产生抗原。抗原产生发生在宿主细胞的细胞质中,而细胞的细胞核中的遗传物质则从不被操控。repRNA固有的自我扩增可以允许少量提高疫苗剂量,引起抗原产生发生非线性增加。因此,在一些实施例中,包括两个或更多个表达相同抗原的不同repRNA的MDNP可以用来以不同的表达动力学诱导接受者的细胞中的抗原的表达。举例来说,递送两个或更多个表达相同抗原的不同repRNA能够得到表达产物的不同血清半衰期。
举例来说,repRNA能够诱导相同抗原在接受者细胞内以不同速率表达。因此,当不同repRNA以不同速率引起相同抗原的表达时,抗原的总血清半衰期相对于只递送一种repRN物种时会延长。
在一些实施例中,MDNP的封装剂被工程改造成包括超过一个RNA物种,用于在给药之后较长的或规定的一段时间内表达抗原。举例来说,MDNP可以包括mRNA和一个或多个编码相同或不同抗原的repRNA,在受试者内提供截然不同的抗原表达动力学。
在一些实施例中,MDNP向受试者递送货物,如RNA新抗原,在受试者中提供两个或更多个不同的抗原表达阶段。举例来说,mRNA和/或编码抗原的repRNA可以产生抗原的与一个RNA物种的翻译相关的第一“表达阶段”,引起抗原的血清浓度增加。随着抗原表达减少和抗原血清浓度降低,相同或不同抗原的与第二RNA物种的翻译相关的第二“表达阶段”引起抗原的血清浓度继续增加。因此,当使用包括两个或更多个不同的表达抗原的repRNA的MDNP进行疫苗接种时,可能需要对MDNP治疗剂、预防剂和诊断剂进行工程改造,使得仅基于MDNP疫苗的单次给药就能提供抗原血清浓度的第一(即,“初免(prime)”)增加,然后是抗原血清浓度的第二或后续其它(即,“加强免疫(boost)”)增加。举例来说,封入了超过一种repRNA的MDNP能够提供“自加强型”疫苗(参见图10A到图10B)。
repRNA基因组的选择会影响由repRNA编码的抗原的表达。举例来说,在MDNP/repRNA疫苗给药后的指定时间点的抗原血清浓度可能与特定repRNA基因型(参见图5A到图5G和图6A到图6G)有关。
可以对与所编码的基因产物的表达的改变相关的repRNA的核酸序列使用修饰来帮助设计工程改造后能提供所期望的表达动力学的修饰后repRNA。在一些实施例中,根据特定抗原或一组抗原的血清浓度和血清半衰期的测定结果,将repRNA设计成包括在复合疫苗内。
因此,包括在“自加强型”MDNP介导的疫苗内的对所编码的抗原具有不同表达动力学的repRNA可以通过改变repRNA的核酸序列来研发。举例来说,当使用α病毒衍生的repRNA在宿主细胞中递送外源性抗原时,改变repRNA的一个或多个非结构蛋白会影响由repRNA编码的外源基因的表达。
在其它实施例中,MDNP媒剂可以设计成以某种速率进入细胞并递送治疗剂、预防剂和诊断剂,例如通过修改MDNP的组成来改变MDNP的体内血清半衰期。
在其它实施例中,例如通过相同或不同的给药途径,将MDNP递送到超过一个身体位置,使MDNP产生不同的血清半衰期和细胞吸收动力学,并且引起了抗原表达的位置和速率的后续差异。
在一些实施例中,当使用MDNP在受试者的细胞中递送repRNA来表达抗原时,在受试者中产生相同的抗原特异性免疫反应所需的repRNA的摩尔量小于由MDNP递送的用于产生相同的抗原特异性免疫反应的mRNA的摩尔量。一般来说,在受试者中产生抗原特异性免疫反应所需要的包括repRNA的MDNP的量会小于包括蛋白质抗原或编码相同抗原的mRNA的MDNP的量。因此,可以使用包括repRNA的MDNP在受试者中诱导抗原特异性免疫反应,减少与将MDNP引入受试者中相关的任何不当作用。
还提供了由MDNP递送的不同疫苗试剂的筛选方法。典型地,方法包括给受试者疫苗接种包括一个或多个不同抗原或编码抗原的核酸的MDNP并评定受试者的免疫反应。针对MDNP中所递送的一个或多个抗原的适应性免疫反应可以使用本领域中已知用于测量疫苗接种方案的有效性的方法来监测。举例来说,抗原特异性T细胞活化的持续时间和程度可以用作抗原表达动力学的标志。还可以使用抗原血清浓度来测定抗原表达动力学。
将结果与对照进行比较,对照例如使用相同或不同的递送媒剂、相同或不同的方案、疫苗接种计划或给药,接种了不同抗原或抗原组合的受试者。在一些实施例中,合适的对照是未接种疫苗的受试者。
2.接种疫苗所针对的病原体/疾病
MDNP能够向受试者递送有效量的蛋白质和核酸抗原,给受试者接种疫苗以预防一种或多种疾病和病症。MDNP可以充当各种微生物病原体的疫苗接种平台,如细菌、病毒、真菌以及原生动物病原体。
在一些实施例中,关于癌症治疗,疫苗的目标可能是某种类型的癌细胞。或者,目标可能是大量微生物病原体中的任一种。疫苗接种所针对的示范性疾病包括当前疫苗所针对的疾病。替代地或另外,MDNP可以充当用于诱导受试者对一种或多种过敏原,如食物过敏原和环境过敏原的免疫耐受性的平台。
a.癌症
在某些实施例中,MDNP可用于使受试者对癌症免疫。MDNP可以给予诊断患有癌症的受试者(即,作为治疗性疫苗),或给予有患上癌症的倾向或风险的受试者(即,作为预防性疫苗)。在一些实施例中,向癌症患者给予MDNP组合物外加一种或多种额外治疗剂。
为了产生理想的癌症疗法,使用生物信息学对每个患者的独特的肿瘤外显子组进行测序以鉴别新抗原。然后,使用这些新抗原的相应mRNA产生形成免疫所必需的抗原。最后,使用无佐剂纳米技术递送平台来递送这些mRNA,该递送平台能够活化免疫系统的细胞毒性T细胞和体液臂,以便针对新肿瘤生长和转移形成持久的长期保护。
在一些实施例中,MDNP包括一种或多种肿瘤抗原或一种或多种表达肿瘤抗原的核酸。MDNP可用于提供针对位于肿瘤或肿瘤环境内的肿瘤细胞和非肿瘤细胞的免疫和治疗活性。MDNP可被配制成用于提供针对血液的实体肿瘤和癌症的保护和/或治疗活性。示范性肿瘤细胞包括但不限于癌症的肿瘤细胞,癌症包括:白血病,包括但不限于急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病,如成髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性、红白血病白血病以及骨髓发育不良综合征,慢性白血病,例如但不限于慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病;真性红细胞增多症;淋巴瘤,例如但不限于霍奇金病(Hodgkin's disease)、非霍奇金病;多发性骨髓瘤,例如但不限于郁积性多发性骨髓瘤、非分泌型骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤以及髓外浆细胞瘤;瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom'smacroglobulinemia);意义未明的单克隆丙种球蛋白病;良性单克隆丙种球蛋白病;重链疾病;骨骼和结缔组织肉瘤,例如但不限于骨骼肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing'ssarcoma)、恶性巨细胞瘤、骨骼纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤;脑肿瘤,包括但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非神经胶质肿瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、成松果体细胞瘤、原发性脑淋巴瘤;乳腺癌,包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、管内癌、乳腺髓样癌、乳腺粘液癌、乳腺小管癌、乳腺乳头状癌、佩吉特氏病(Paget's disease)以及炎性乳腺癌;肾上腺癌,包括但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌;甲状腺癌,例如但不限于乳头状或滤泡性甲状腺癌、甲状腺髓样癌和未分化甲状腺癌;胰腺癌,包括但不限于胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、血管活性肠肽瘤、生长抑素分泌肿瘤以及类癌或胰岛细胞肿瘤;垂体癌,包括但不限于库欣氏病(Cushing's disease)、催乳素分泌肿瘤、肢端肥大症和尿崩症;眼癌,包括但不限于眼黑素瘤,如虹膜黑素瘤、脉络膜黑素瘤和睫状体黑素瘤以及成视网膜细胞瘤;阴道癌,包括但不限于鳞状细胞癌、腺癌和黑素瘤;外阴癌,包括但不限于鳞状细胞癌、黑素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤以及佩吉特氏病(Paget's disease);子宫颈癌,包括但不限于鳞状细胞癌和腺癌;子宫癌,包括但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤;卵巢癌,包括但不限于卵巢上皮癌、交界性肿瘤、生殖细胞肿瘤和间质瘤;食道癌,包括但不限于鳞状癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌以及燕麦细胞(小细胞)癌;胃癌,包括但不限于腺癌、蕈样(fungating)(息肉样)、溃疡性、浅表扩散性、弥漫扩散性、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤;结肠癌;直肠癌;肝癌,包括但不限于肝细胞癌瘤和肝胚细胞瘤;胆囊癌,包括但不限于腺癌;胆管癌,包括但不限于乳头状、结节性和弥漫性;肺癌,包括但不限于非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌;睾丸癌,包括但不限于胚组织瘤、精原细胞瘤、间变性、经典(典型的)、精细胞性、非精原细胞瘤、胚胎性癌、畸胎瘤、绒膜癌(卵黄囊肿瘤);前列腺癌,包括但不限于腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤;阳茎癌;口腔癌,包括但不限于鳞状细胞癌;基底细胞癌;唾液腺癌,包括但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌;咽癌,包括但不限于鳞状细胞癌和疣;皮肤癌,包括但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌;和黑素瘤,浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、小痣恶性黑素瘤、肢端雀斑样痣性黑素瘤;肾癌,包括但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤;移行细胞癌(肾盂和/或子宫);韦尔姆斯氏瘤(Wilms'tumor);膀胱癌,包括但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。能够被MDNP预防、治疗或以其它方式减弱的癌症包括粘液肉瘤、成骨肉瘤、内皮肉瘤、淋巴内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌以及胃癌(关于这类病症的综述,参见Fishman等人,1985,《药物》(Medicine),第2版,J.B.费城李平科特公司(J.B.Lippincott Co.,Philadelphia)和Murphy等人,1997,知情决策:癌症诊断、治疗和恢复的完整著作(Informed Decisions:The Complete Book of Cancer Diagnosis,Treatment,and Recovery),美国维京企鹅图书公司(Viking Penguin,PenguinBooksU.S.A.,Inc.,United States of America))。在一些实施例中,MDNP可用于使受试者对一种或多种癌症免疫,这一种或多种癌症没有替代疫苗可用。
b.传染病
MDNP能够向受试者递送有效量的APC抗原,给受试者接种疫苗以预防一种或多种由各种微生物病原体引起的传染病,微生物病原体如细菌、病毒、真菌和原生动物病原体。
在一些实施例中,疫苗的目标可以是大量微生物病原体中的任一种。可以接种疫苗的示范性疾病包括目前已有疫苗的疾病,包括炭疽;由人类乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV)引起的疾病(例如,子宫颈癌、食道癌);白喉;甲型肝炎;乙型肝炎;乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib);流感病毒(Flu);日本脑炎(Japanese encephalitis,JE);莱姆病(Lyme disease);麻疹;脑膜炎球菌;猴痘;腮腺炎;百日咳;肺炎球菌;骨髓灰质炎;狂犬病;轮状病毒;风疹;带状疱疹(Shingles)(带状疱疹(Herpes Zoster));天花;破伤风;弓形虫病;伤寒;结核病(Tuberculosis,TB);水痘(Varicella)(水痘(Chickenpox));黄热病。
在一些实施例中,MDNP可用于使受试者对没有替代疫苗可用的传染病或病原体免疫,该传染病或病原体如疾病,包括但不限于疟疾、链球菌、埃博拉扎伊尔、HIV、疱疹病毒、丙型肝炎、中东呼吸综合征(Middle East Respiratory Syndrome,MERS)、昏睡病、严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS)、鼻病毒、水痘、亨德拉(hendra)、NIPA病毒、寨卡病毒等。
在一些实施例中,疾病是能感染如鸟类的非哺乳动物受试者的病原体。示范性禽类受试者包括被驯养的鸟类(即,家禽),如鸡、鸭、鹅、野鸡以及其它商业家禽或宠物鸟,如长尾小鹦鹉和鹦鹉。举例来说,细菌混合载体可能适用于给鸟类接种疫苗以预防传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease,IBD)。IBD又称为甘保罗病(Gumboro disease),是一种影响幼年雏鸡的法氏囊(Bursa of Fabricius)的病毒性疾病。可以使用所述细菌混合载体进行疫苗接种的其它家禽疾病和病症包括流感瑞尼凯特(Ranikhet);马立克病(Mareksdisease)、禽痘、家禽霍乱、产蛋下降综合征、传染性鼻炎、球虫病、禽类脑炎、禽流感、鸡传染性贫血以及沙门氏菌(salmonella)。
c.过敏
在某些实施例中,MDNP可用于使受试者对过敏原免疫。MDNP可以给予诊断有过敏的受试者或具有过敏倾向的受试者。在一些实施例中,向具有过敏的患者给予MDNP组合物外加一种或多种额外治疗剂。
过敏是免疫系统对本来无害的物质发生的异常反应。过敏是一类免疫反应,其中免疫系统通过产生能够结合至过敏原的特异性抗体对外来微生物或颗粒作出反应,过敏原例如花粉、灰尘、动物毛发等。能够治疗的过敏反应包括迟发型超敏反应和速发型超敏反应。
能够治疗的过敏包括皮肤过敏反应,如皮炎;上气道和眼睛的过敏反应,如过敏性鼻炎、枯草热、哮喘以及结膜炎(红眼病);胃肠道过敏反应,如食物过敏;以及血流过敏反应,如荨麻疹(urticaria)和荨麻疹(hives)、血管性水肿、过敏反应或异位性皮肤炎。
C.基因靶向
可在基因靶向策略中使用MDNP来递送对特定靶生物体内的特定靶基因具有干扰活性的RNA(iRNA)。在一些实施例中,iRNA能够诱导靶多核苷酸的表达或翻译的序列特异性沉默,从而下调或防止基因表达。举例来说,可使用MDNP递送iRNA来诱导靶基因的表达的完全缺乏。在一些实施例中,iRNA能够使靶基因的表达水平降低到低于未处理对照的表达水平。
在一些实施例中,使用MDNP递送的RNA是双链小干扰RNA(siRNA)多核苷酸。典型地,小干扰RNA的长度介于21个与23个核苷酸之间。siRNA能够在宿主细胞内表达。
在其它实施例中,使用MDNP递送微小RNA(miRNA)多核苷酸。miRNA是采用发夹构象的小RNA。miRNA能够通过例如切丁酶和切丁酶样酶的内源性细胞酶的活性在靶细胞内裂解成生物活性dsRNA。在其它实施例中,RNA多核苷酸是长双链RNA分子(dsRNA),长度是至少24个核苷酸。dsRNA通过例如切丁酶和切丁酶样酶的内源性细胞酶的活性在靶生物体内被加工成21-23个核苷酸的生物活性siRNA。dsRNA含有与一个或多个待靶向下调的基因互补的核苷酸序列。
一个或多个靶基因可以具有任何所期望的序列。在一些实施例中,RNA的序列与靶基因的序列100%互补。在其它实施例中,RNA与靶基因小于100%互补。在某些实施例中,RNA与靶基因的核苷酸序列至少95%、至少90%、至少85%或至少80%互补,使得能够耐受例如可能因为遗传突变、进化趋异和品系多形现象而发生的序列变异。
在一些实施例中,可在基因靶向策略中使用MDNP。举例来说,可使用MDNP递送在靶细胞的基因组中诱导单链或双链断裂的试剂。在靶细胞的基因组中诱导单链或双链断裂的示范性系统是CRISPR/Cas系统。CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复,ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是含有碱基序列的多个短定向重复的DNA基因座的首字母缩略词。原核CRISPR/Cas系统已经调适用作基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)用于真核生物中(参见例如Cong,《科学》(Science),15:339(6121):819-823(2013);和Jinek等人,《科学》,337(6096):816-21(2012))。通过给细胞转染包括Cas基因且尤其是所设计的CRISPR的所需元件,生物体的基因组可以在任何所期望的位置切割和修饰。
一般来说,“CRISPR系统”概括性地指参与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或活性指导的转录物和其它元件,包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(在内源性CRISPR系统的情况下包含“定向重复”)和tracrRNA加工的部分定向重复)、引导序列(在内源性CRISPR系统的情况下又称为“间隔子”)或来自CRISPR基因座的其它序列和转录物。可操作地连接于引导序列(例如定向重复-间隔子-定向重复)的一个或多个tracr配对序列还可以被称作核酸酶加工前的pre-crRNA(pre-CRISPR RNA)或核酸酶加工后的crRNA。
在一些实施例中,tracrRNA与crRNA连接并形成嵌合crRNA-tracrRNA杂交体,其中成熟crRNA与部分tracrRNA通过合成的茎环融合,模拟天然crRNA:tracrRNA双链体,如Cong,《科学》,15:339(6121):819-823(2013);和Jinek等人,《科学》,337(6096):816-21(2012)中所述。单融合的crRNA-tracrRNA构建体还可以被称作引导RNA或gRNA(或单引导RNA(sgRNA))。在sgRNA内,crRNA部分可被鉴别为是‘靶序列’并且tracrRNA常常被称为‘骨架(scaffold)’。因此,在一些实施例中,MDNP用于递送sgRNA。
D.其它活性剂的递送
在一些实施例中,MDNP用于将如小分子治疗剂的其它活性剂递送到受试者的细胞中来治疗疾病或病症。在某些实施例中,MDNP用于选择性靶向受试者的一个或多个特定细胞类型来向该细胞类型递送治疗剂、预防剂和诊断剂。
因此,在一些实施例中,MDNP能够提供针对传染病、癌症、炎症性疾病等的有效治疗策略。
E.剂量和有效量
在一些体内方法中,MDNP的组合物以治疗有效量给予受试者。术语“有效量”或“治疗有效量”意指足以治疗、抑制或缓解待治疗病症的一种或多种症状或以其它方式提供所期望的药理和/或生理作用的剂量。精确剂量将根据各种因素而改变,如受试者因变量(例如年龄、免疫系统健康等)、疾病或病症以及待进行的治疗。
关于所描述的所有化合物,随着进一步研究的进行,将呈现关于用于治疗不同患者的不同病况的恰当剂量水平的信息,并且考虑接受者的治疗背景、年龄和一般健康状况,普通技术人员将能够确定恰当的剂量。所选择的剂量取决于所期望的治疗作用、给药途径和所期望的治疗持续时间。
一般来说,每天向受试者给予介于0.001与100mg/kg体重之间的剂量水平,受试者例如哺乳动物,最优选是人类。一般来说,关于静脉内注射或输注,剂量可以更低。优选地,将组合物配制成用于实现介于约1与约1000μM之间的修改后的原核细胞血清水平。
举例来说,MDNP可以呈能够有效地将抗原递送给受试者并诱导B细胞、T细胞的增殖和克隆扩增或诱导巨噬细胞的迁移或趋化活性的量。因此,在一些实施例中,包括封装剂的MDNP呈能够在受试者中有效刺激对抗原的初次免疫反应的量。在一个优选实施例中,与未处理的对照受试者相比,有效量的MDNP不会在受试者的细胞中诱导显著的细胞毒性。优选地,与未处理的对照相比,MDNP的量能够有效地预防或减少受试者的疾病或病症的感染或发作。
在另一个实施例中,MDNP呈能够有效降低靶基因的表达量或能够预防或降低受试者中的靶基因产物的血清浓度的量。
在一个具体实施例中,MDNP呈能够有效诱导抗原呈递细胞对抗原的呈递的量。举例来说,MDNP可以呈能够有效地响应于由MDNP递送给受试者细胞的基因编码的外源多肽而诱导T细胞活化的量。在另一个实施例中,一个或多个MDNP呈能够有效降低在受试者中针对抗原刺激出稳定的或保护性免疫反应所需的抗原量的量。MDNP能够有效地诱导针对由MDNP编码的抗原的产生或抗体。
因此,MDNP能够有效提高受试者中的抗原特异性免疫细胞的量。举例来说,受试者中的抗原特异性免疫细胞的量相对于未处理对照中的量增加。举例来说,MDNP能够有效诱导控制细胞免疫活性的若干信号通路,包括细胞增殖、趋化性以及肌动蛋白重组。优选地,有效量的MDNP不会引起细胞毒性。用于提供针对所编码抗原或过敏原的适应性免疫的有效量的MDNP不应该引起炎性细胞因子的产生出现显著全身性增加,炎性细胞因子包括IFN。
在一些实施例中,可以使用MDNP,仅用单个剂量就能使受试者对癌症、传染病或过敏原免疫。因此,在一些实施例中,只需要单次给药,不需要加强免疫。在其它实施例中,当使用一个或多个额外剂量来加强第一或前一给药的免疫反应时,实现了增强的或延长的免疫,如保护性免疫。
典型地,体内没有对纳米颗粒递送媒剂的细胞因子反应就不会产生抗载体免疫。因此,在一些实施例中,可以使用相同或不同剂量的MDNP,这些MDNP含有相同或不同的编码抗原的RNA,重复进行MDNP给药,例如用于在同一个受试者中提供针对各种不同抗原或过敏原的免疫。
F.对照
可以将MDNP的作用与对照进行比较。合适的对照是本领域中已知的并且包括例如未经处理的细胞或未经处理的受试者。在一些实施例中,对照是来自经处理受试者或未经处理受试者的未经处理的组织。优选地,对照的细胞或组织来源于与经处理细胞或组织相同的组织。在一些实施例中,未经处理的对照受试者患有与经处理受试者相同的疾病或病况或有患该疾病或病况的风险。举例来说,在一些实施例中,未经处理的对照受试者不会发起对抗原的免疫反应。
G.组合
MDNP可以单独给予,或与一种或多种额外活性剂组合给予,作为治疗性或预防性治疗方案的一部分。MDNP可以与第二活性剂在同一天或不同天给予。举例来说,包括MDNP的组合物可以在第一、第二、第三或第四天或其组合给予。
术语“组合(combination)”或“组合(combined)”用于指伴随性、同时或依次给予两种或更多种药剂。因此,组合可以伴随地(例如,以混合物形式)、单独但同时地(例如,通过单独的静脉内管线进入同一受试者中)或依次地(例如,首先给予化合物或药剂中的一种,接着是第二种)给予。
在一些实施例中,额外的预防剂或治疗剂可以是针对特定抗原的疫苗。该抗原可以与由MDNP编码的抗原相同或不同。
在一些实施例中,MDNP适用作这样的药剂,相对于在不存在MDNP递送媒剂的情况下对某种抗原发起的免疫反应而言,该药剂能增强受试者对相同抗原的免疫反应。
当使用MDNP来诱导例如针对由封装在MDNP内的RNA编码的一个或多个抗原或过敏原的免疫反应时,有效量的MDNP的给药不需要共同给予佐剂来引起所期望的免疫反应。因此,在一些实施例中,给予MDNP时不需要佐剂或免疫刺激分子。
实例
实例1.构建适用作疫苗的含有RNA分子的MDNP
材料和方法
质粒和克隆
无化学改性或稳定UTR的常规mRNA通过以下产生:在切除侧接有那些限制序列的eGFP编码序列之后,将相关抗原克隆到哺乳动物表达质粒pcDNA3-EGFP(由Doug Golenbock惠赠(Addgene质粒编号13031))的多个克隆位点中的HindIII和XbaI位点中。使用In-Fusion(Clontech Laboratories Inc.)克隆试剂盒插入含有Kozak共有序列(Kozakconsensus sequence)(Kozak,M.《核酸研究》(Nucleic Acids Res)15,8125-8148(1987))、接着是所期望的抗原编码序列的PCR产物。
委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)
VEEV复制子RNA载体通过以下产生:将抗原克隆到由Tasuku Kitada(麻省理工学院的韦斯实验室(Weiss Lab,MIT))好心提供的基于野生型TRD品系的VEEV复制子质粒pTK126中,替换掉位于VEEV亚基因组启动子序列下游的mVenus编码序列。Tasuku Kitada(麻省理工学院的韦斯实验室)还提供了表达荧光素酶的VEEV复制子pTK158。
塞姆利基森林病毒(SFV)
SFV复制子RNA载体通过以下产生:将抗原克隆到改良版质粒pSFV1(Liljestrom,P.和Garoff,H.《生物技术》(Biotechnology)(NY)9,1356-1361(1991))中,改良版质粒pSFV1称作pSFV1-JC1,它通过以下构建:在位点HindIII和XbaI限制消化pSFV1-GFP(由苏黎世联邦理工学院生物化学研究所(ETH Zurich,Institute of Biochemistry)AriHelenius实验室的Giuseppe Balistreri好心提供),接着在紧接着该片段的上游添加定制克隆位点连接子来连接横跨位置8,145到9,226的PCR片段,重新构建初始的但是携带独特的BamHI限制位点来代替亚基因组启动子下游的eGFP编码序列的质粒,该BamHI限制位点充当抗原编码序列的插入位点。
流感病毒(HA)抗原
流感HA编码序列从市售表达简易甲型流感H1N1(A/WSN/33)cDNA克隆、密码子优化、全长ORF(北京义翘神州生物科技有限公司(Sino Biological Inc.)的产品VG11692-C)扩增。
埃博拉扎伊尔病毒(EBOV)抗原
EBOV GP和VP40编码序列分别从pWRG7077-GP和pWRG7077-VP40扩增。
卵白蛋白(cOVA)抗原
细胞质限制的卵白蛋白(cOVA)编码序列通过PCR从Maria Castro(Addgene质粒编号25097)惠赠的载体pCI-neo-cOVA(Yang等人,《美国国家科学院院刊》107,4716-4721,doi:10.1073/pnas.0911587107)扩增,并且使用In-Fusion克隆试剂盒,根据制造商的说明书,克隆到pcDNA3或pSFV1-JC1中。
卵白蛋白(OVA)和荧光素酶
用于研究组织培养物中的荧光素酶和cOVA表达以及体内OT-1刺激的RNA由线性化质粒载体通过用MEGAscript试剂盒(生命技术公司(Life Technologies))体外转录产生,使用ScriptCap m7G加帽系统试剂盒(CellScript Inc.)进行5'加帽以产生帽-0结构7-甲基鸟苷酸化5'端,并且使用A-Plus Poly(A)聚合酶加尾试剂盒(CellScript Inc.)进行3'poly(A)加尾,全部根据制造商的方案进行。至于所有其它实验,基本上按相同的方式合成RNA,但在加帽步骤中改为纳入2'-O-甲基转移酶(来自CellScript Inc.的ScriptCapTM 2'-O-甲基转移酶试剂盒,根据所提供的方案)使邻近RNA的5'核苷酸的帽子甲基化,从而产生帽-1结构并且确保更有效的蛋白质翻译。常规mRNA是在用SacI线性化之后,使用T7 RNA聚合酶,从携带被克隆到HindIII/XbaI位点中的抗原的pcDNA3衍生质粒合成。这些mRNA除了短载体衍生间隙之外,几乎不含5'或3'UTR序列,该短载体衍生间隙插入于起始密码子处的T7启动子与Kozak共有序列之间,以及终止密码子与用于线性化的SacI限制位点的下游的限制位点之间。基于SFV的RNA复制子是在用SpeI线性化之后,使用Sp6RNA聚合酶转录,由pSFV1-JC1衍生质粒构建。
改性树枝状聚合物合成
通过在室温下连续搅拌下,向二氯甲烷(BDH)中的2×摩尔过量的3-氯过苯甲酸(西格玛(Sigma))中逐滴添加1-十五烯(TCI)来合成2-十三烷基环氧乙烷。反应8小时后,用相等体积的超饱和硫代硫酸钠水溶液(西格玛)洗涤反应混合物三次。在每次洗涤之后,使用分液漏斗收集有机层。类似地,然后用1M NaOH(西格玛)洗涤有机层三次。向有机相中添加无水硫酸钠并搅拌过夜以去除任何剩余的水。在真空下浓缩有机层,产生浅黄色透明油性液体。真空蒸馏(约50毫托,约80℃))此液体,产生透明无色的2-十三烷基环氧乙烷。然后使具有乙二胺核心的第1代聚(酰胺胺)树枝状聚合物(Dendritech,Inc.)与2-十三烷基环氧乙烷反应。2-十三烷基环氧乙烷的化学计算量等于树枝状聚合物内的胺反应位点的总数(伯胺的2个位点和仲胺的1个位点)的1.5×。在经过清洁的20mL琥珀色玻璃小瓶中组合反应物。在小瓶中装上200酒精纯度(proof)的乙醇作为溶剂,并在90℃下在暗处在持续搅拌下反应7天,确保反应完成。将粗产物安装在CeliteTM 545(VWR)前置柱上并通过快速色谱,使用含RediSep黄金分辨率硅胶柱(Teledyne Isco)的CombiFlash Rf机器纯化,其中洗脱梯度是从100%CH2Cl2到75:22:3CH2Cl2/MeOH/NH4OHaq(按体积计),历时40分钟。使用薄层色谱(TLC),使用87.5:11:1.5CH2Cl2/MeOH/NH4OHaq(按体积计)溶剂系统,针对改性树枝状聚合物的存在测试洗脱部分。具有不同取代水平的改性树枝状聚合物在TLC板上以不同的条带出现。舍弃含有未反应的2-十三烷基环氧乙烷和聚(酰胺胺)树枝状聚合物的部分。将剩余部分合并,在逐渐上升的高真空下干燥12小时并储存在干燥惰性气氛下直至使用。所有产物都含有构象异构体的混合物。
含有RNA的MDNP的组装和纯化
如Khan等人,《纳米快报》,doi:10.1021/nl5048972(2015);Khan等人,《应用化学》53,14397-14401,doi:10.102/anie.201408221(2014)所述,使用微流体混合装置配制纳米颗粒。
简单来说,在乙醇中组合改性树枝状聚合物与1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](阿凡提极性脂质公司(Avanti Polar Lipids))。用无脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶、无内毒素的超纯蒸馏水(英杰公司(Invitrogen))和无菌100mM pH 3.0QB柠檬酸盐缓冲液(天惠华公司(Teknova,Inc.))将RNA稀释到10mM的最终柠檬酸盐浓度。将乙醇和柠檬酸盐流加载到气密玻璃注射器(汉密尔顿公司(HamiltonCo.))中并使用微流体混合装置,将乙醇和柠檬酸盐流以1:3的体积流速比组合并混合(组合后的总流速等于5.3mL/min),产生纳米颗粒。使用在1.0M NaOH(西格玛)中洗涤24小时以去除内毒素并在蒸汽高压釜中灭菌的玻璃器皿,使用20,000MWCO Slide-A-Lyzer G2透析卡相对于无内毒素的无菌PBS透析纳米颗粒。透析后的纳米颗粒使用0.2微米聚(醚砜)过滤器(Genesee Scientific)进行无菌过滤并用Zetasizer NanoZS机器(马尔文公司(Malvern))表征。RNA的浓度通过理论质量平衡计算确定并通过NanoDrop测量(赛默科技(Thermo Scientific))确认。最终纳米颗粒含有质量比11.5:1的改性树枝状聚合物:1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]和质量比5:1的改性树枝状聚合物:RNA。通过动态光散射和透射电子显微镜检查评定MDNP的大小分布。
结果
研发一种MDNP疫苗平台,使用无佐剂的纳米技术递送系统,将如复制RNA(repRNA)的分子递送到受试者的细胞。针对此目标,通过使用可电离的改性两亲性树枝状聚合物,研发出了一种用于大型自我扩增型mRNA递送的独特高效递送方法(参见图1A到图1C和图2A到图2C)。MDNP的透射电子显微镜检查和纳米颗粒的大小分布分析指示,使用此方法通常产生低多分散性颗粒(图2D)。
此MDNP疫苗平台是非常灵活的,并且可以按照天数,针对每个患者的独特需要迅速做出调整。展现了在宿主细胞中同时产生多个抗原(复合)的能力。
由复制子组成的MDNP可用于疫苗接种(即,作为改性树枝状聚合物疫苗(MDV)平台)。MDV是一个三组分系统,包括基于可电离树枝状聚合物的纳米材料、两亲性PEG以及RNA,它们组合形成最终的疫苗纳米颗粒。
MDNP部署策略
作为疫苗,MDNP可以按广泛范围的不同方式部署。在一个实例中,MDNP包括一种类型的可扩增有效载荷:复制子(图1A)。一旦释放到细胞的细胞质内部,复制子就被核糖体翻译,产生RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)和抗原。RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)制造了更多的全长复制子的拷贝,或借助于亚基因组启动子,只是抗原的拷贝。核糖体继续翻译全长复制子拷贝或较短的仅抗原(常规)mRNA。关于这种策略,一种类型的可扩增有效载荷被递送到细胞的细胞质中。
在另一种策略中,MDNP同时携带两种类型的可扩增有效载荷:复制子和含有复制子的3'和5'非翻译区(UTR)的mRNA(图1B)。在此策略中,RdRp可以在复制子的开头或在亚基因组启动子处开始拷贝。首先是复制子。其次是并入了复制子的5'和3'非翻译区(UTR)的mRNA。通过复制子的核糖体翻译产生的RdRp能够按三种方式起作用:(1)复制整个复制子;(2)通过在复制子的亚基因组启动子处开始,只复制mRNA;以及(3)复制含复制子UTR的修饰后mRNA。关于这种策略,将两种类型的可扩增有效载荷共同递送到细胞的细胞质中。在亚基因组启动子处制得的短mRNA只能通过核糖体翻译,不能通过RdRp拷贝,因为它缺乏复制子UTR。但是,RdRp能够复制含复制子UTR的mRNA。因此,纳入含复制子UTR的mRNA能提高系统的整体效率,因为两个可扩增有效载荷被同时递送到细胞中,而不是一个。
MDNP能够活化免疫系统的细胞毒性T细胞和体液臂,以便针对一个或多个靶抗原形成持久的长期保护。MDNP疫苗在大约几天之内迅速地产生,这与常规疫苗生产需要数个月形成了对比。因为MDNP平台的灵活性,所以MDNP平台能够容易地利用易于从胰腺癌、结肠癌和白血病的肿瘤细胞模型获得的外显子组序列数据(Bhadury等人,《瘤形成》(Oncogenesis)2,e44,doi:10.1038/oncsis.2013.8),用于快速产生定制的癌症疫苗。
实例2.改性树枝状聚合物RNA纳米颗粒在血清中在37℃下和在4℃下是稳定的。
材料和方法
统计学分析
通过ANOVA,伴随图基(Tukey)多重比较校正来比较平均值。关于存活率曲线,使用Mantel-Cox检验。P值低于0.05被认为是统计学上显著的。
原代细胞和细胞系
将C2C12小鼠成肌细胞(ATCC CRL-1772)和L6大鼠成肌细胞(ATCC CRL-1458)维持在补充有10%FBS的DMEM中。关于分化,使C2C12细胞生长到汇合,然后维持在补充有10%马血清(西格玛)的DMEM中五天,五天后,大部分单层展现大的相邻的融合的肌管样结构。将DC2.4细胞维持在补充有10%灭活FBS、1%L-谷氨酰胺以及60μM2-巯基乙醇的RPMI中。小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)从龙沙(Lonza)获得并维持在补充有10%FBS的DMEM中。将人类包皮成纤维细胞(Human foreskin fibroblast,HFF)维持在补充有10%FBS、2mM谷氨酰胺、10mMHepespH7.5以及20μg/mL庆大霉素(gentamicin)的DMEM中。通过在96孔培养皿中每孔以70-90%汇合细胞单层涂覆400ng所封装的RNA并在24小时之后通过荧光素酶分析(参见正文材料和方法)进行分析来进行MDNP处理实验。
组织培养蛋白质表达分析
使用Steady-Glo荧光素酶分析系统(普洛麦格公司(Promega Corporation)),根据制造商的方案测量经过纳米颗粒处理的细胞中的荧光素酶基因表达。通过免疫印迹法分析经过RNA转染的BHK21细胞中的cOVA、流感HA和EBOV GP的表达。裂解细胞,并在RIPA-核酸酶缓冲液(20mM Tris(pH 8)、137mM NaCl、0.5mM EDTA、10%甘油、1%Nonidet P-40、0.1%SDS、1%脱氧胆酸盐、2mM MgCl2、25U/μl核酸酶[EMD密理博(EMD Millipore)]、蛋白酶抑制剂[cOmplete,Mini,无EDTA,罗氏生命科学(Roche Life Science),根据制造商的建议使用])中进行蛋白质提取,并通过SDS-PAGE分离,然后转移到PVDF膜上进行免疫印迹。将膜用含10%牛奶的TBS-T封闭并与以下检测用抗体一起在封闭缓冲液中在室温下孵育2-4小时:关于cOVA检测,兔多克隆卵白蛋白、HRP结合的ab20415(Abeam plc),1:3000稀释;关于HA检测,单链羊驼纳米抗体VHH68(Dougan等人,《自然》503(7476):406-409(2013)),1:1000稀释,然后是抗5-His(penta-His)HRP结合物(凯杰(Qiagen)),1:5000稀释;关于EBOV GP检测,小鼠单克隆6D8,1:1000稀释,然后是抗小鼠HRP,1:10000稀释。使用WesternLightning-ECL试剂盒(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer Inc.))进行增强型基于鲁米诺(luminol)的检测。通过胰蛋白酶消化解离转染后的细胞单层,在生长培养基中洗涤一次,并在冰上用PBS中的Alexa Fluor 647结合的VHH68染色15分钟,分析流感HA的细胞表面表达。细胞用PBS洗涤两次并通过FACS在BD LSR II流式细胞仪(BD生物科学(BDBiosciences))上测量表面染色。
通过FRET进行纳米颗粒拆卸的实时分析
使用荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)来估计纳米颗粒在模拟肌肉内条件下的稳定性。从Integrated DNA Technologies购得经过脱盐、HPLC纯化的RNA双链体,在有义链的5'端用Alexa Fluor594或Alexa Fluor647染料标记。配制含有等摩尔量的两种类型的RNA的纳米颗粒,并稀释到最终RNA浓度为2μg/mL。当紧密接触(即在完整MNDP内)时,RNA充当荧光共振能量转移(FRET)对。
在四链体中,向不透明的黑色96孔板的每个孔中添加100μL经过稀释的纳米颗粒。向每个孔中添加100μL已在PBS中稀释过的50%AB人血清(英杰公司)。阴性对照孔含有游离siRNA。阳性对照孔含有PEI纳米颗粒。PEI纳米颗粒通过用移液管重复移取10wt%蔗糖溶液中含RNA的800MW PEI(西格玛)而形成,其中PEI:RNA质量比是5:1。将培养板用透明粘性板密封剂密封并放置到设定在37℃的Tecan Infinite M200微孔板读板仪(microplatereader)中。当MDNP拆卸时,释放出来的RNA将不再靠得那么近,不会再产生FRET信号。为了测量FRET,在540nm下激发样品并且每5分钟在690和620nm下读取荧光强度,持续2小时。按690nm/620nm荧光强度信号比计算FRET。阴性对照是游离RNA。PBS用于测定背景水平。将FRET信号针对完全破裂的纳米颗粒的值归一化,该值是在添加辛基β-D-吡喃葡萄糖苷(西格玛)至最终孔内浓度达到2wt%并在37℃下混合1小时之后测定的。
分析在4℃下储存之后的纳米颗粒拆卸
为了测定在4℃下的疫苗稳定性,产生含有荧光素酶复制子RNA的纳米颗粒并在4℃储存很长一段时间。用固定量的纳米颗粒处理HeLa细胞并在14小时后分析荧光素酶表达。
结果
基于纳米颗粒的疫苗应该能引起稳定的抗原表达,保护RNA有效载荷不受环境核糖核酸酶活动的影响,并在较长的储存期内保持这些特性,理想地不需要冷链。
为了测试MDNP是否展现这些特性,选择编码萤火虫荧光素酶的VEEV复制子RNA作为模型纳米封装货物。选择荧光素酶是因为在组织培养物中VEEV驱动的表达是所测试的三个RNA载体(常规mRNA、VEEV复制子和SFV复制子)中最强的(图2E)。因此,在使用基于微流体的制造方法(Khan等人《纳米快报》,doi:10.1021/nl5048972(2015);Khan等人《应用化学》53,14397-14401,doi:10.1002/anie.201408221(2014))配制MDNP时使用VEEV复制子RNA。
针对肌肉内注射优化的单分散颗粒(平均直径100-150nm,如通过动态光散射所评定)常规是通过这种方法产生的。通过纳米封装FRET对标记的RNA,接着在50%人血清中在37℃下孵育2小时来估计MDNP的稳定性。破裂的颗粒释放出其经过标记的RNA有效载荷,这降低了FRET信号强度。
更稳定的MDNP纳米材料使用2-十三烷基环氧乙烷合成,而不太稳定的对照MDNP则使用1,2-环氧十二烷。以MDNP纳米封装提供了良好的保护,因为纳米颗粒在全人血清中时保持完整且不会释放出其RNA有效载荷。因为这种稳定性,所以避免了RNA有效载荷被核酸内切酶降解。
MDNP保持稳定并且当相比于化学破裂的MDNP、游离RNA以及纳米封装在阳离子聚合物聚乙烯亚胺中的RNA时,维持强FRET信号(图2F)。
还测试了纳米颗粒在4℃下长期储存的稳定性。对培养物中的HeLa细胞施用所储存的MDNP制剂来测量荧光素酶表达。当使用在4℃下储存了1、3、20或30天的颗粒时,观察到生物发光没有统计学上显著的变化(图2G)。因此,在最少储存30天之后,通过ANOVA分析(伴随图基多重比较校正)检测到荧光素酶转染效率没有统计学上显著的变化,指示颗粒保持稳定,并且RNA有效载荷完整。
改性树枝状聚合物是全合成的并经过纯化,并且RNA有效载荷是在完全不存在细胞的情况下产生的。已建立了MDNP纳米材料以避免在数量级大于用于Khan等人,《应用化学》53(52):14397-14401(2014);Khan等人,《纳米快报》15(5):3008-3016(2015)中所述的免疫的剂量下,体内炎性细胞因子全身性增加。这些研究中所用的颗粒制剂不含传染性污染物并且几乎不含内毒素(<0.228EU/mL,它比病毒载体/非病毒载体可接受的内毒素负荷低40倍)(Brito等人,《药物科学杂志》(J Pharm Sci)100(1):34-37(2011))。
实例3.含有RNA的MDNP选择性靶向和杀死癌细胞
材料和方法
使用MDNP平台产生抗癌疫苗并使用涉及cOVA表达肿瘤细胞的癌症肿瘤模型来评定抗癌疫苗。使用MDNP平台,用常规cOVA表达mRNA或塞姆利基森林病毒(SFV)复制子或Trp1表达VEEV复制子对小鼠进行疫苗接种。
RNA设计和表达
为了产生理想的癌症疗法,使用生物信息学对每个患者的独特的肿瘤外显子组进行测序以鉴别“新抗原”。使用这些新抗原的相应mRNA产生形成免疫所必需的抗原。表达模型抗原OVA的肿瘤细胞充当用于测试针对在肿瘤中表达的非野生型蛋白质序列的免疫的模型系统。还可以针对没有突变,但是在癌细胞类型中选择性富集的抗原(例如黑素瘤中的Trp1)进行免疫。使用已知方法,通过递归式PCR构建一个或多个基因或从cDNA或基因组文库克隆一个或多个基因。这些基因连同启动子和终止子一起是被设计成用来表达所期望的mRNA的DNA序列。可以在大肠杆菌(Escherichia coli)中以高产量产生基本上任何长度和序列的DNA。具有任何所期望的序列的mRNA或repRNA可以通过本领域中沿用已久的体外转录技术由DNA模板产生。
小鼠
从杰克逊实验室(Jackson Laboratory)获得野生型雌性C57BL/6小鼠并使用5周龄与8周龄之间的小鼠。将小鼠圈养在怀特黑德生物医学研究所(Whitehead Institutefor Biomedical Research)并且根据经过麻省理工学院动物护理委员会(MIT Committeeon Animal Care)批准的方案进行维持。
肿瘤细胞系
cOVA和Trp1表达肿瘤细胞(B16细胞)维持在培养物中在37℃和5%CO2下并且在含有10%FBS的DMEM中。为了产生肿瘤,将500,000个cOVA表达细胞皮下注射到野生型雌性BL/6小鼠的背部。注射约300,000个细胞进行Trp1研究。
策略
在第0天和第16天,用4μg剂量的改性树枝状聚合物纳米颗粒(MDNP)复制子疫苗对动物进行疫苗接种。在第28天,将250,000个肿瘤细胞注射到小鼠中用于肿瘤发展,如图3中所示。关于Trp1免疫,在攻击前四周,给予单次40μg剂量。
疫苗接种
用8μg组合剂量的裸cOVA mRNA(裸mRNA)、裸cOVA SFV复制子(裸SFV rep)、cOVAmRNA改性树枝状聚合物纳米颗粒疫苗(mRNA MDNP)或SFV cOVA改性树枝状聚合物纳米颗粒疫苗(SFV MDNP)处理小鼠(每组2只)。未免疫小鼠不接受处理。在疫苗接种之后,给小鼠注射500,000个cOVA表达肿瘤细胞(B16-OVA)。在1个月的疗程内,所有利用改性树枝状聚合物平台的处理都没有发展出肿瘤。
在更严密的实验中,用40μg裸的或由MDNP递送的表达模型黑素瘤肿瘤抗原Trp1的VEEV复制子给每组10只小鼠免疫一次。用300,000个天然表达内源性Trp1的肿瘤细胞(野生型B16细胞)攻击小鼠。
结果
未免疫小鼠以及用裸mRNA免疫的小鼠显示出侵袭性肿瘤发展,迫使让小鼠安乐死。裸SFV复制子注射产生不同结果,因为有一只动物完全不显示肿瘤发展。相比之下,所有通过MDNP平台用常规cOVA mRNA和SFV cOVA复制子进行疫苗接种的动物都不显示肿瘤发展并且显示100%存活率(图4A到图4B)。关于代表着更实际的肿瘤疫苗接种模型的更严密的Trp1免疫研究,通过MDNP递送的Trp1 VEEV复制子的单次大丸剂注射带来了存活时间的显著改善(p=0.022,Mantel-Cox检验)。
MDNP是可用于许多类型的疫苗接种的多平台技术。可用它以仅一个剂量产生针对致命病毒感染的免疫。未来的癌症疫苗研究将利用MDNP的复合和超复合能力,通过并入能同时产生针对许多不同癌症特异性抗原的免疫的RNA有效载荷。
实例4.纳米封装在改性树枝状聚合物中的RNA体内刺激抗原特异性T细胞。
材料和方法
策略
在成功递送之后,RNA载体编码的蛋白质的翻译结合体外转录的外源RNA活化细胞模式识别受体的能力应该能引起转基因衍生肽在I类MHC分子上呈递并刺激CD8+ T细胞,细胞模式识别受体包括Toll样受体(TLR)(Heil等人《科学》,303,1526-1529(2004);Kariko等人,《生物化学杂志》(J Biol Chem),279,12542-12550(2004))、酸诱导基因1(RIG-I)(Pichlmair等人《科学》,314,997-1001(2006))以及RNA依赖性蛋白激酶(PKR)(Levin等人,《生物化学杂志》256,7638-7641(1981))。选择细胞质表达的卵白蛋白片段(cOVA)(Yang等人,《美国国家科学院院刊》,107,4716-4721(2010))作为模型细胞内抗原,并且产生常规mRNA、VEEV复制子和SFV复制子RNA来表达这种蛋白质。
细胞系
将所有细胞维持在37℃和5%CO2下。BHK21细胞由Tasuku Kitada(麻省理工学院的韦斯实验室)好心提供并维持在补充有5%FBS和2mM丙酮酸钠的EMEM中。除非另外说明,否则使用TransIT-mRNA转染试剂盒(Mirus Bio LLC),根据制造商的方案转染50-75%汇合度的对数期生长的BHK21细胞。将HeLa细胞维持在含10%FBS的DMEM中。
小鼠
从杰克逊实验室获得野生型雌性C57BL/6和Balb/cJ小鼠并使用5周龄与8周龄之间的小鼠。C57BL/6 Ptprca小鼠充当过继细胞转移的接受者,维持在室内,并使用5周龄与8周龄之间的小鼠。OT-1/Rag2-/-小鼠通过购自泰克里克(Taconic)的创始禽的近亲繁殖维持在室内。
将小鼠圈养在怀特黑德生物医学研究所并且根据经过麻省理工学院动物护理委员会批准的方案进行维持。在第0天和第21天,给小鼠肌肉内疫苗接种所指示的MDNP。
IFN信号报告基因分析
B16细胞携带在组合的IFN-α/β诱导ISG54启动子和ISRE调控元件的控制下的SEAP报告基因并且缺少IFN-γ受体活性[“I型”报告细胞(B16-BLUETM IFN-α/β细胞;Invivogen)],或携带相同报告构建体并且缺乏I型IFN受体活性[“II型”报告细胞(B16-BLUETM IFN-γ细胞;Invivogen)],使用TransIT-mRNA试剂,用作为对照的经过5-甲基胞苷/假尿苷碱基修饰的mRNA(5meC/ΨmRNA;Trilink)或VEEV复制子RNA进行转染。在转染后20小时,通过比色分析定量培养基中的SEAP活性。20小时后,通过在透明的平底96孔培养皿中添加180μL Quantiblue试剂(Invivogen)并显色30分钟来分析20μL培养物上清液中的SEAP活性。在650nm下测量吸光度。VEEV复制子在小鼠细胞中刺激I型IFN反应。
四聚体染色分析
通过颊部采血到K2EDTA microtainer收集小瓶(BD生物科学)中从经过免疫的小鼠获得100μL血液,并且使用VersaLyse缓冲液(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))使红细胞在室温下裂解10分钟。PE结合的SIINFEKL特异性四聚体(MBL国际(MBLInternational))染色连同APC结合的抗CD8克隆53-6.7(BD生物科学)一起在室温下在PBS+1%灭活FBS中进行30分钟。洗涤细胞并通过FACS分析,如正文中所述。关于MDNP mRNA免疫实验,对六只小鼠进行免疫并将其随机分成两组,每组3只;一组在第4天和第12天抽血,另一组在第8天和第16天抽血,从而防止在小于一周的跨度内多次收集。
定量组织中的mRNA水平
在免疫后11天,通过CO2窒息使小鼠安乐死。紧接着收集器官和组织,并冷冻在液氮中。粉碎冷冻组织,形成粉末,并在补充有0.5mg/mL蛋白酶K(Epicentre)的组织和细胞裂解缓冲液(Epicentre)中制备组织裂解液。将混合物在65℃下以1400RPM混合2小时并且在16,000RCF下离心以去除任何残渣。使用QuantiGene 2.0基于发光的分支DNA分析试剂盒和针对cOVA和Gapdh的QuantiGene 2.0探针(昂飞(Affymetrix)),根据制造商的方案定量上清液(溶解产物)中的mRNA水平。用Tecan Infinite 200 PRO读板仪测量发光信号。为了避免信号饱和和确保所有发光信号留在其线性区域内,使用来自经过PBS处理的小鼠的样品构建每个组织和靶基因的标准曲线,从而确定分析样品的最佳稀释。通过计算靶基因发光与Gapdh管家基因(housekeeper gene)发光的比率确定处理组的相对表达。将所有值针对经过PBS处理的小鼠的靶基因:管家基因比归一化。
T细胞的细胞内细胞因子染色分析
在40μg MDNP免疫之后9天从小鼠中分离出脾细胞,并在生长培养基(除非另外指明,否则所有组分全部来自生命技术公司:含GlutaMAX的RPMI 1620,补充有8%FBS、1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES、50μM 2-巯基乙醇(西格玛)以及青霉素/链霉素)中培养。通过细胞内细胞因子染色和FACS分析,分析响应于用免疫显性H-2Kb限制的I类MHCOVA衍生肽SIINFEKL(InvivoGen)或EBOV GP衍生的WEI5肽(WIPYFGPAAEGIYTE)刺激的细胞因子表达,基本上如Martins等人《公共科学图书馆·综合》(PLoS One)9(2):e89735(2014)所述。简单来说,在IL-2(10U/ml)、抗CD28+抗CD49d(各自0.5μg/mL;BioLegend)以及BFA(最终2μg/mL;西格玛)存在下,在存在或不存在2μg/ml肽的情况下,培养1×107个脾细胞/mL。关于用SIINFEKL刺激,省略IL-2、抗CD28和抗CD49d,因为OVA疫苗接种小鼠对这种肽的脾反应即使没有外源共刺激也很明显。使用经过0.1μg/mL PMA和1μg/mL伊屋诺霉素(ionomycin)非特异性刺激的培养物作为FACS分析的单色抗体染色对照。在培养6小时之后,使用BD cytofix/cytoperm试剂盒(BD生物科学)根据制造商的方案,用FITC结合的抗CD8(Biolegend)、APC结合的抗CD4(Biolegend)、PE结合的抗IFNg(BD生物科学)以及太平洋蓝结合的IL-2(Biolegend)给细胞染色。通过FACS在BD LSR II流式细胞仪(BD生物科学)上分析染色后的样品。
过继转移和OT-1增殖分析
从转基因6-12周龄OT-1/Rag2-/-C57BL/6小鼠的肠系膜和腹股沟淋巴结和脾脏中分离出OT-1细胞,并将其再悬浮于PBS中。在室温下用CFSE(西格玛)以5μM的最终浓度标记细胞5分钟,然后在补充有10%FBS的RPMI中洗涤一次,然后再悬浮于PBS中用于注射。4-8周龄的野生型CD45.1小鼠通过静脉内注射接受150万个带标记的OT-1细胞。在过继转移之后四天,解剖腹股沟淋巴结并分离出淋巴细胞用于FACS分析。用7-AAD(BD生物科学)、AlexaFluor 700或APC结合的抗CD45.1、PE-Cy7或APC-Cy7结合的抗CD45.2以及太平洋蓝或PE结合的抗CD8给细胞染色。通过FACS在BD LSR II流式细胞仪(BD生物科学)上分析染色后的样品。
T细胞活化分析
从小鼠中分离出脾细胞并在单独的生长培养基(除非另外指明,否则所有组分全部来自生命技术公司:含GlutaMAX的RPMI 1620,补充有8%FBS、1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES、50μM2-巯基乙醇(西格玛)以及青霉素/链霉素)或含2μg/ml OVA衍生肽的生长培养基存在下,以1000万个细胞/毫升的密度涂在96孔培养板中。所用肽是免疫显性H-2Kb限制的I类MHC OVA衍生肽SIINFEKL(InvivoGen)或H-2 I-Ab II类MHC限制肽MHCISQAVHAAHAEINEAGR(InvivoGen)。在培养5天之后,使用IFNγELISA试剂盒(BD生物科学)定量经过1:20稀释的上清液IFNγ的浓度。
结果
MDNP封装的RNA成功在培养物中在广泛各种细胞类型中表达,包括人类上皮细胞系HeLa、鼠类和人类原代成纤维细胞、小鼠树突状细胞系DC2.4、鼠类和大鼠骨骼成肌细胞细胞系C2C12和L6以及来源于C2C12细胞系的已分化的小鼠肌管(参见表1)。观察到肌肉内注射MDNP能够轻易在体内驱动注射位点处的可检测的基因表达。
表1:MDNP递送编码萤火虫荧光素酶的mRNA有效载荷至培养中的多个细胞类型
通过如SI材料和方法中所述的荧光素酶分析测量表达,并且以三个生物复制的RLU±SD报告。HFF,人类包皮成纤维细胞;MEF,小鼠胚胎成纤维细胞;RLU,相对光单位。
*未观察到未修饰mRNA的信号,因此使用碱基修饰(5-甲基-胞苷和假尿苷)mRNA。
为了测试是否能用MDNP系统诱导免疫反应,使用细胞质表达的卵白蛋白片段(cOVA)作为模型细胞内抗原。产生常规mRNA、VEEV复制子RNA和SFV复制子RNA来表达这种蛋白质。
cOVA蛋白含有由CD8和CD4 T细胞识别的显性表位(Yang等人,《美国国家科学院院刊》,107,4716-4721(2010))。通过使用常规TransIT转染试剂进行免疫印迹来确认BHK21细胞中在转染后14小时的cOVA表达的表达,并证明VEEV复制子是最有效的。
为了判定使用MDNP进行抗原表达是否足以体内活化CD8+ T细胞,使用OT-1Rag1-KO C57BL/6小鼠,一种表达H-2Kb限制的OVA特异性T细胞受体(TCR)的转基因系,作为过继实验中的淋巴细胞供体。
通过两侧肌肉内注射给予已接受OT-1 T细胞的小鼠未包装的(“裸的”)RNA或以MDNP封装的相同RNA。在免疫后三天(转移后四天),通过CFSE稀释分析OT-1 T细胞的增殖(图5A到图5G、图8A)。用裸RNA免疫的小鼠没有引起OT-1细胞的增殖。在通过MDNP接受RNA的小鼠中,检测到至少6轮增殖。在用含mRNA的MDNP免疫的小鼠中观察到最强增殖。
给药剂量是基于所注射RNA的等效质量,因此基于分子量的差异,注射相对于复制子RNA约10倍摩尔过量的常规mRNA。高出十倍剂量的经过包装的VEEV复制子RNA实际上得到的OT-1增殖曲线与树枝状聚合物包装的mRNA的OT-1增殖曲线类似。在转移后4天/用40μgVEEV-cOVA MDNP免疫后3天进行的OT-1增殖分析的结果显示于图7A到图7B中。
为了确定单个剂量的MDNP递送的RNA是否能够产生有效抗原呈递,用裸或MDNP免疫C57BL/6小鼠,并在10天后过继转移CFSE标记的OT-1细胞。
在转移后四天(即,免疫后14天),如上所述分析增殖(图6A到图6G)。裸mRNA免疫没有诱导OT-1 T细胞的增殖。mRNA MDNP引起2/3的已免疫小鼠低但是可检测的OT-1增殖。用裸复制子免疫造成了OT-1 T细胞的不同增殖。用裸SFV免疫的小鼠也展现出非常不同的结果。然而,通过MDNP系统,VEEV复制子RNA造成了大部分免疫小鼠(在20-50%的范围内,六只动物中有五只)中的OT-1 T细胞的可再现的且一致的增殖(图8B)。MDNP递送的SFV复制子RNA没有诱导OT-1增殖。可能是因为两个不同α病毒复制子的表达谱的差异以及纳米封装的短期作用。
因此,考虑将MDNP递送的VEEV复制子作为候选疫苗。为了确认VEEV MDNP能够刺激内源性T细胞反应,用高(40μg)剂量的cOVA VEEV MDNP免疫C57BL/6小鼠。9天后,测量经过免疫显性H2-Kb I类MHC限制的OVA肽SIINFEKL体外刺激的脾细胞中的细胞内IFN-γ和IL-2产生。在两个独立实验中,在肽刺激之后,已免疫小鼠中>1%的内源性CD8+脾细胞含有强IFN-γ+细胞的离散群体。在免疫后十八天,如通过四聚体染色所检测,在经过类似免疫的小鼠中观察到丰富的对MHC I类结合的SIINFEKL具有TCR特异性的循环CD8+ T细胞。为了比较,在使用mRNA作为有效载荷的类似独立实验中,在研究过程中检测到较少的循环四聚体阳性细胞,并且截止第16天,循环四聚体阳性细胞水平几乎不可检测。这些观察结果结合α病毒复制子诱导强效I型IFN反应(图8C)这一事实以及由树突状细胞引起的细胞凋亡和抗原吸收进一步证明选择VEEV作为候选有效载荷对各种靶抗原进行进一步实验是合理的。应注意,在经过MDNP VEEV免疫的动物中,截止第11天,可在引流腹股沟淋巴结中检测到编码抗原的RNA,这增加了由MDNP递送的复制子的免疫原性作用可能不限于注射位点的可能性,虽然注射位点可能是实际体内抗原产生的主要来源。
评定MDNP递送的VEEV复制子构建体(VEEV MDNP)作为另一种病毒结构性多蛋白HIV1 Gag的候选疫苗的活性,如通过在用HIV1 Gag特异性山羊多克隆IgG vT-20(圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology,Inc.))转染后14小时进行的免疫印迹所测定。VEEV复制子引起了HIV-1 Gag的清楚可见的表达,而mRNA和SFV介导的转染则没有引起可见表达。
为了确认VEEV MDNP能够获得内源性T细胞反应,用递增剂量的表达cOVA的VEEMDNP免疫C57BL/6小鼠。9天后,测量经过免疫显性H2-Kb I类MHC限制的I OVA肽SIINFEKL体外刺激的脾细胞中的IFNg产生(图9)。
对照小鼠或经过40μg编码不相关抗原的VEE MDNP免疫的小鼠的脾细胞没有在肽处理之后产生IFNγ。从经过40μg表达cOVA的VEEV MDNP免疫的小鼠获得的脾细胞显示响应于肽,IFNγ增加8-14倍。经过0.4μg或4μg的VEEV MDNP免疫的小鼠显示的增加较少。
实例5.单个剂量的表达HA的VEEV复制子RNA纳米颗粒能避开致死性流感攻击
材料和方法
抗HA IgG ELISA
高结合表面处理的聚苯乙烯96孔微量培养板(康宁(Corning))用含0.5μg/ml重组A型流感H1N1 WSN/33蛋白(北京义翘神州生物科技有限公司)的PBS在4℃下涂布过夜。在室温下用封闭缓冲液(含10%FBS的PBS)封闭培养板2小时,并且一式两份地向孔中施加在封闭缓冲液中1:100稀释的血清,并在室温下孵育2小时。用洗涤缓冲液(含0.05%Tween-20的PBS)洗涤培养板,在室温下与在封闭缓冲液中1:3000稀释的抗小鼠IgG-HRP(通用电气医疗集团(GE Healthcare))一起孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤5轮之后,用TMB底物(西格玛)使培养板显色20-30分钟,并且通过添加一体积的1M HCl停止反应,然后读取450nm下的吸光度。
流感攻击
用编码不相关抗原(cOVA)的VEE MDNP作为对照或编码HA蛋白的VEE MDNP来免疫Balb/cJ小鼠(n=3),并在14天后用致死剂量的流感A/WSN/33攻击它们。通过鼻内给予致死剂量(5×104CEID50)的流感A/NWS/33(H1N1)(ATCC)来给已免疫小鼠接种,该剂量不到9天就杀死了100%的已感染Balb/c小鼠。每天监测体重,并且当观测到减少超过20%时,使小鼠安乐死。当超过了感染前的体重时,认为小鼠恢复了,并且再监测3周健康状况,以确保不再观察到临床感染征象。在怀特黑德研究所的经过批准的检疫室内圈养A/WSN/33感染动物。
结果
为了确定基于纳米颗粒的疫苗是否能够引起针对致死性病毒攻击的免疫,产生了驱动流感A/WSN/33 HA蛋白的表达的RNA。
就所获得的表达水平来说,VEEV复制子RNA胜过组织培养实验中的其它构建体。即使是3'UTR稳定的mRNA变体(Warren,L.等人《细胞-干细胞》(Cell Stem Cell)7,618-630,2010),也是产生了与VEEV复制子相当的HA水平。VEEV RNA表达的HA蛋白的正确加工和到细胞表面的往复运动(shuttling)通过用HA特异性单链抗体进行表面免疫染色来确认(Dougan等人《自然》503,406-409,(2013))(图11A)。
截止第7天,对照小鼠死于感染,而表达HA的纳米颗粒免疫的小鼠则在攻击下存活了至少3周,在实验结束时没有剩余的临床感染征象(图11B)。在免疫后7天的小鼠血清中或在处死时(感染后6天或7天)的对照小鼠中没有检测到抗HA IgG(图11C)。在攻击后7天,很容易在经过编码HA的VEEV复制子纳米颗粒免疫的存活小鼠中检测到HA反应性IgG(图11C到图11D),说明用改性树枝状聚合物mRNA疫苗初免增强了体液反应。
实例6.改性树枝状聚合物纳米颗粒递送的VEE复制子RNA保护小鼠不被致死性ZEBOV攻击
材料和方法
选择埃博拉糖蛋白(GP)作为用于产生针对活的扎伊尔埃博拉病毒的免疫的抗原。比较VEE-GP和VEE-GP/VP40 MDNP候选疫苗保护小鼠不被致死性EBOV攻击的能力。
cOVA MDNP编码不相关抗原并被用作阴性对照。未包装的裸的GP复制子被用作无纳米颗粒的对照。
EBOV GP免疫
通过两侧肌肉内(i.m.)注射,用4μg纳米封装在改性树枝状聚合物中的RNA对每组10只小鼠(VEE-GP或VEE-GP/VP40,各自的n=10)进行疫苗接种,并在第21天用相同剂量加强免疫。在第14天、第35天和第48天收集血清,通过ELISA测量循环EBOV GP特异性IgG滴度。
为了测量细胞因子产生,在第25天使每组三只小鼠安乐死,分离出脾细胞用于ELISpot分析和细胞内细胞因子染色。在第49天,通过腹膜内(i.p.)注射,用小鼠适应的EBOV攻击其余7只小鼠。
EBOV GP血清ELISA
用含2μg/ml重组哺乳动物埃博拉GP的PBS涂布ELISA板,在4度下过夜。用PBS-T(PBS,0.1%Tween-20)洗涤板3×,然后用PBS-T 5%无脂牛奶在室温下封闭2小时。通过以1:100开始的半对数稀释来稀释血清,并在涂有GP的板上孵育1小时。然后用PBS-T洗涤板3×,与指定第二HRP-抗体一起孵育45分钟,然后用PBS-T洗涤3×。使用TMB底物/停止溶液使ELISA显色并在Tecan读板仪上测量。吸光度截止值定为背景+0.2O.D.。
EBOV攻击
给小鼠接种目标滴度1,000pfu的ma-EBOV(Kuhn JH等人《病毒学文献》(ArchVirol),158(6):1425-1432(2013))。所有研究都是在USAMRIID4级生物安全隔离防护设施(containment facility)中进行的。在第0天开始并继续整个生命期,记录临床观察结果并密切监测动物的疾病进展。基于机构认可的临床评分,使濒死动物安乐死。
剂量反应实验
为了测试对不同剂量疫苗的反应,小鼠在第0天、第21天接种疫苗,并在第49天用活病毒攻击。关于只有高剂量初免的实验,小鼠在第0天接种疫苗并在第28天用活病毒攻击。
结果
cOVA对照不显示针对致死性埃博拉攻击的保护。此外,大部分免疫小鼠中对EBOVGP具有特异性的血清IgG截止第14天可忽略不计,如通过ELISA针对ZEBOV VLP所测定,并在第48天保持在类似水平(图12A)。
在攻击之后,截止感染后第7天,所有对照(未免疫)小鼠全都死于感染,而免疫组(VEE-GP或VEE-GP/VP40)只有1/7死亡。经过VEEV GP或VEEV GP/VP40混合物免疫的组的七只小鼠中的六只在整个研究期间都没有出现临床感染征象(图12B)。
在剂量反应实验中,cOVA MDNP对照没有观测到抗体滴度。2×40μg裸GP复制子组显示与低剂量2×0.4μg GP MDNP剂量类似的滴度(图13A)。观测到接受2个剂量MDNP的动物有抗体滴度剂量反应。
值得注意的是,单个剂量的40μg GP MDNP以极佳精确度(低标准差)产生高抗体滴度。
截止第7天,cOVA MDNP组中的所有小鼠全都死亡。2×4μg、2×40μg以及1×40μg的GP MDNP组显示100%存活率。接受2×40μg裸GP复制子的组显示与接受2×0.4μg GP MDNP剂量的组类似的存活动力学(图13B)。
综合而言,保护数据证明MDNP在两个小鼠致死性病毒感染模型中均能起到保护。改性树枝状聚合物具有非免疫原性,即使在比抗埃博拉攻击的剂量高50倍的剂量下(图12B)(Khan等人《纳米快报》,doi:10.1021/nl5048972(2015);Khan等人《应用化学》53,14397-14401,doi:10.1002/anie.201408221(2014)),该特性仍热有利于有效转基因表达,因为对先天免疫的任何刺激都只是因为mRNA有效载荷的表达。这种方法与大型自我扩增型RNA复制子相容并且能够有力地、持续性地向免疫系统呈递抗原,但不会在注射后很早就刺激IFN反应。强烈的IFN反应可能会妨碍α病毒的复制,从而随着时间限制抗原剂量。(Henriksen-Lacey等人《分子药剂学》8,153-161(2011);Zhang等人,《病毒学杂志》,81,11246-11255(2007))。
RNA载体(无论是常规的还是复制子)的选择是确定抗原表达的强度和持久性的关键参数。基于α病毒科的RNA病毒的复制子,包括SFV、EEV、VEE和SIN,都能充当疫苗载体,因为其大小相对较小,容易遗传操控,并且有在宿主细胞的细胞质中在所有结构基因都不存在的情况下自主复制的能力。
当以复制缺陷型假病毒颗粒形式递送时,这些载体在细胞培养系统中需要结构基因的互补。(Ying等人,《自然·医学》(Nat Med)5,823-827(1999))。阳离子脂质体可以充当嵌合SIN/VEEV复制子疫苗的合成的体内递送方法(Geall等人,《美国国家科学院院刊》109,14604-14609(2012);Bogers等人《传染病杂志》(J Infect Dis),doi:jiu522[pii]10.1093/infdis/jiu522(2014)),尽管针对致死性病原体攻击的保护尚未报道。复制子的快速递送限制了先天免疫活化。复制可能稳健地进行,直到抗原的单循环限制细胞内产生触发足以清除复制子的免疫反应。(Liljestrom和Garoff,《生物技术》(N Y)9,1356-1361(1991))。
MDNP递送系统的全合成性质是关键优势。它不需要取决于活细胞来产生的步骤,并且原则上允许快速筛选多个单独的候选疫苗。在小鼠中安全有效的剂量(高达至少40μg)的数量级大于实现显著保护性免疫所需剂量的数量级(图13A到图13B)。
抗原组合物的复合应该是可能的,使得若干个别抗原可以经过配制产生广谱多价疫苗。容易纯化和可扩展性以及不需要冷链有利于进一步研发合成的基于纳米颗粒的平台。
实例7.改性树枝状聚合物纳米颗粒递送的VEE复制子RNA保护小鼠不被致死性刚地弓形虫攻击
材料和方法
如先前所述制备由Jeroen J.P.Saeij实验室惠赠的刚地弓形虫寄生虫的野生型PRU-δHXGPRT品系。给小鼠接种速殖子。监测动物的临床疾病征象,包括体重减轻、理毛行为较差、嗜睡、斜视、脱水以及体温下降。如果小鼠出现超过10%的体重减轻、严重脱水、严重嗜睡和/或体温显著下降,那么使小鼠安乐死。
结果
作为MDNP具有大有效载荷能力的证明,产生一种针对刚地弓形虫的六重疫苗。刚地弓形虫是顶复门原生动物,通过污染食物感染世界上三分之一的群体,能够在免疫功能不全的个体中引起脑弓形体病,而且虽然有致力于通过注射活的/减毒的寄生虫、DNA和肽来产生免疫,但是还没有审批通过的人类疫苗(Zhang等人,《疫苗专家评论》(ExpertReview of Vaccines),12(11):1287-1299(2013))。在美国,这种疾病的年费用估计是30亿美元(Hoffmann等人,《食品保护杂志》(Journal of Food Protection),75(7):1292-1302(2012))。在确认了同时表达被共同配制成单个MDNP的多个复制子的能力之后,产生了复合刚地弓形虫MDNP疫苗。六种刚地弓形虫特异性抗原GRA6、ROP2A、ROP18、SAG1、SAG2A和AMA1被编码到VEEV复制子中并且按等摩尔量共同配制成MDNP。选择这些抗原是因为它们代表了在寄生虫生命周期的多个阶段表达的蛋白质并且在多个品系和类型内都是保守的。用单个40μg剂量的疫苗对动物进行疫苗接种(6.67μg/复制子,该剂量在为埃博拉所建立的有效剂量范围内,在图12A和图12B中)。作为对照,用匹配剂量的携带VEEV HA作为不相关抗原的MDNP处理动物。免疫后32天,用致死剂量的刚地弓形虫II型品系PRU攻击动物(图14A到图14B)。截止第12天,所有对照动物全都死于感染。其余用六重MDNP疫苗进行疫苗接种的动物存活超过六个月,没有临床指示。在类似的用于测试单剂量功效的长期实验中,当在接受一个40μg刚地弓形虫疫苗之后32天攻击小鼠时,观察到100%保护(图14C、图14D)。这是第一次证明刚地弓形虫的完全保护性单剂量mRNA复制子纳米颗粒疫苗。
实例8.改性树枝状聚合物纳米颗粒递送的VEEV复制子RNA引起针对寨卡病毒的体液和细胞适应性免疫反应
材料和方法
选择不同病原体寨卡病毒的抗原组分作为用于产生针对寨卡病毒肽的免疫的另一种抗原。比较候选疫苗在小鼠中引起针对寨卡病毒的体液和细胞适应性免疫反应的能力。使用针对扎伊尔埃博拉病毒的MDNP配制品(参见以上实例6)作为阴性对照疫苗。
结果
相比于用对照疫苗(针对扎伊尔埃博拉病毒的NP配制品)给小鼠接种疫苗,在100%的NP疫苗接种小鼠中,针对寨卡病毒的体液(图15A)和细胞(图15B)适应性免疫反应升高。
总结
基于基因的疫苗方法具有许多优于常规方法的潜在优点,因为它们是全合成的,能迅速定制,并且可以按无佐剂制剂产生(Srivastava等人,《内科学年鉴》(Annals ofinternal medicine),138(7):550-559(2003))。目前基于病毒的疫苗生产方法是耗时的;这些方法需要超过5个月的前置时间,并且因为规模放大和产率问题,所以输出可能是复杂的,如在2009年H1N1流感大流行中所出现的(Partridge等人,《疫苗》(Vaccine)28(30):4709-4712(2010))。基于如腺病毒、rVSV、AAV或CMV的病毒载体进行基因递送的疫苗面临着预先存在的或诱导出来的抗载体免疫的额外挑战,该挑战妨碍重复给药。MDNP平台因为其灵活性、安全性和有效性,所以能对突然爆发、进化的病原体以及个别患者需要作出较佳反应。通过这个平台,从初始获取相关DNA序列到毫克级可立即注射的MDNP疫苗的生产时间线只有7天。通过促进复制子递送到细胞溶质,MDNP驱动内源性抗原产生,刺激T细胞和抗体反应。此外,因为纳米封装是RNA序列无关的,所以可以产生各自编码独特抗原的各种不同复制子并共同封装(图10A、图10B)。可达到的剂量(高达至少40μg)的数量级大于实现显著保护性免疫所需剂量的数量级(图12A、图12B、图13A、图13B、图14A、图14B、图15A、图15B)。假定这个范围的治疗指数翻译至人类,有可能将多个不同抗原并入单个配制品中。
作为免疫载体,研究过mRNA并取得了不同程度的成功,尤其是在癌症免疫疗法领域(Van Lint等人《疫苗专家评论》,14(2):235-251(2015))。若干因素使基于mRNA的治疗变得复杂并限制了其功效:(1)RNA分子容易发生细胞内和细胞外降解;(2)mRNA表达是短暂的;以及(3)可能响应于RNA病毒:细胞受体和其底物的RNA(Baum A和Garcia-Sastre A(2010))诱导I型干扰素而发生翻译阻遏(Baum和Garcia-Sastre,《氨基酸》(Amino Acids),38(5):1283-1299(2010);Heil等人《科学》303(5663):1526-1529(2004);Kariko等人,《生物化学杂志》(The Journal of biological chemistry)279(13):12542-12550(2004);Pichlmair等人《科学》314(5801):997-1001(2006);Levin等人,《生物化学杂志》256(14):7638-7641(1981))。尽管如此,当直接注射到淋巴结中时,编码抗原的裸mRNA给药能够带来抗肿瘤免疫(Kreiter等人《癌症研究》,70(22):9031-9040(2010);Van Lint等人,《癌症研究》,72(7):1661-1671(2012))。可用以通过更经得起检验的途径部署疫苗的递送化合物的免疫原性和/或毒性造成了额外的复杂情况。在一些应用中有效(Geall等人,《美国国家科学院院刊》109(36):14604-14609(2012);Bogers等人《传染病杂志》(The Journal ofinfectious diseases)(2014))的阳离子脂质当以较高剂量使用时并且如果不完全复合,是有毒的(Hofland等人,《美国国家科学院院刊》,93(14):7305-7309(1996);Cullis等人,《先进药物递送评论》(Advanced drug delivery reviews)32(l-2):3-17(1998);Lv等人,《控释杂志》(J.Control.Release),114(1):100-109(2006))。此外,阳离子脂质可能是免疫原性的,免疫原性会限制转基因表达和引发安全问题(Henriksen-Lacey M等人,《分子药剂学》8(1):153-161(2011))。响应于脂质复合的mRNA产生IFN会限制基于mRNA的疫苗的功效(Pollard C等人,《分子疗法:美国基因疗法学会杂志》(Molecular therapy:the journalof the American Society of Gene Therapy),21(1):251-259(2013))。各种纳米颗粒形式已经通过皮内(Hoerr等人,《欧洲免疫学杂志》30(1):1-7(2000))、脾内(Zhou等人,《人类基因疗法》10(16):2719-2724(1999))、皮下(PollardC等人《分子疗法:美国基因疗法学会杂志》21(1):251-259.(2013))、静脉内(Hoerr等人,《欧洲免疫学杂志》30(1):1-7(2000);Mockey等人,《癌症基因疗法》14(9):802-814(2007))、甚至鼻内(Phua等人,《科学报告》4:5128(2014))给药途径,展现出不同的功效水平。与抗原呈递细胞的离体转染无关的基于纳米颗粒的RNA疫苗在动物模型中的成功应用有限(综述于(Ulmer等人,《疫苗》30(30):4414-4418(2012)和(Weiner,《分子疗法:美国基因疗法学会杂志》21(3):506-508(2013))中),并且这类方法中只有少数几种进入了临床试验。虽然有报道过在人类中的免疫保护的相关联系,但是临床功效令人失望(Weide等人,《免疫疗法杂志》31(2):180-188(2008);Weide等人,《免疫疗法杂志》,32(5):498-507(2009);Rittig等人,《分子疗法:美国基因疗法学会杂志》19(5):990-999(2011);Kreiter等人,《免疫学新见》,23(3):399-406(2011))。基于α病毒科的RNA病毒的复制子,如SFV、EEV和SIN,都能充当疫苗载体,通常以通过细胞培养物中的结构基因的互补产生的复制缺陷型假病毒颗粒形式递送(Lundstrom,《病毒》(Viruses)7(5):2321-2333(2015))。
先前,研究过PRINT蛋白颗粒进行mRNA复制子的非病毒性体外递送(Xu等人《分子药剂学》10(9):3366-3374(2013))。然而,只报道了两种非病毒性体内递送方法。这些包括阳离子纳米乳液,包含用MF59佐剂的组分乳化的阳离子脂质DOTAP(Brito等人《分子疗法》22(12):2118-2129(2014);Bogers等人《传染病杂志》211(6):947-955(2015)),和DLinDMA中心脂质纳米颗粒(HekeleA等人《新出现的微生物和感染》(Emerging Microbes andInfections)2(2013);Geall等人,《美国国家科学院院刊》109(36):14604-14609(2012)),它们均是5组分系统。虽然这些已被用作嵌合SIN/VEEV复制子疫苗的合成的体内递送方法,但是它们尚未显示出针对致死性病原体攻击的保护(Hekele A等人《新出现的微生物和感染》2(2013);Geall等人,《美国国家科学院院刊》109(36):14604-14609(2012))。相比之下,MDNP方法,一种利用可电离递送材料、脂质锚定的PEG和复制子的全合成3组分系统,在小鼠致死性病毒和原生动物感染模型中赋予保护作用。这是第一种能够在致死性攻击模型中产生针对广泛多种病原体的保护性免疫的全合成的基于RNA的复制子系统。这项研究还证明,RNA有效载荷(无论是常规mRNA还是复制子)的选择会显著影响抗原表达的强度和持久性(图2F到图2G、图8a到图8b)。
MDNP递送技术当使用比埃博拉和刚地弓形虫保护所需的剂量高500倍的剂量时,并不会引起包括IFN的炎性细胞因子的产生出现全身性增加(Khan OF等人,《应用化学》53(52):14397-14401(2014);Khan OF等人《纳米快报》15(5):3008-3016(2015))。这是很有用的,因为早期强烈的IFN反应会妨碍α病毒复制,从而随着时间限制抗原的剂量(White等人,《病毒学杂志》75(8):3706-3718(2001);Zhang等人,《病毒学杂志》81(20):11246-11255(2007))。此外,在不存在佐剂的情况下,在两种疾病模型中实现了完全保护并延长了抗原特异性T细胞反应(疫苗接种后至少10天),佐剂常被用来提高炎症反应(Schijns等人,《疫苗专家评论》(Expert Rev Vaccines)10(4):539-550(2011))。
没有对纳米颗粒递送媒剂的全身性细胞因子反应还可以预防抗载体免疫(Ulmer等人,《疫苗》30(30):4414-4418(2012))。抗载体免疫发生于免疫系统对递送媒剂作出反应并灭活递送媒剂时,在例如病毒介导的递送平台中观察到过抗载体免疫(Small等人,《病毒学新见》(Current Opinion in Virology)1(4):241-245(2011);Lopez-Gordo E等人,《人类基因疗法》25(4):285-300(2014))。这种特性还免除了进行同源加强免疫的需要,在当前人类试验过程中对于基于rVSV的系统来说,建议同源加强免疫是必需的(Fuchs等人《传染病开放论坛》(Open Forum Infectious Diseases)2(3)(2015))。这使得能够使用同一种递送技术针对各种疾病对患者重复给药。
为了更好地对进化的病原体、突然爆发和个别患者需要作出反应,需要一种能够在护理点附近快速产生的灵活、安全且有效的疫苗平台。本文所研发的平台通过提供一种合成系统解决了这种需要,该合成系统能够:1)在目标鉴别之后,非常快速的产生;2)需要极少的产生后纯化;3)污染过敏原的可能性低;4)允许相对较大的有效载荷,允许封装多个产生抗原的RNA,包括复制子;5)不需要使用额外佐剂,佐剂可能诱导不利免疫反应和减轻内源性mRNA产生并减少复制子自我扩增(Gupta等人,《疫苗》11(3):293-306(1993);Pollard C等人《分子疗法:美国基因疗法学会杂志》21(1):251-259(2013);White等人,《病毒学杂志》75(8):3706-3718(2001);Zhang等人,《病毒学杂志》81(20):11246-11255(2007));6)诱导适当的抗体产生和CD8+ T细胞反应;以及最后7)用单个剂量产生保护性免疫,提高患者依从性,减小健康护理工作人员的负担。
实例9.改性树枝状聚合物纳米颗粒递送的复制子RNA针对非小细胞肺癌的发展预防性接种疫苗
为了证明这种疫苗接种模式可用于产生预防性癌症疫苗,使用假定的NSCLC相关癌胚抗原Hmga2合成复制子。
材料和方法
使用编码Hmga2的复制子形成纳米颗粒疫苗,并且用编码Hmga2的MDNP免疫小鼠。免疫后两周,将Hmga2+或Hmga2-KP肿瘤细胞通过气管内注射原位移植到小鼠肺部中。N=5。
结果
可以使用所建立的涉及Kras致癌基因和p53肿瘤遏制基因的肺特异性突变的肺腺癌模型(“KP”肺癌模型)来检查非小细胞肺癌的进展,该模型利用Cre重组酶的病毒性给药来活化Kras的潜在致癌等位基因并使肿瘤遏制因子p53缺失(DuPage等人,《自然·实验手册》(Nat Protoc.);4(7):1064-1072(2009))。在其它应用中,KP模型已被用以追踪肺肿瘤细胞中的分化标记随时间的逐渐缺失以及蛋白质的后续上调,该蛋白质的表达通常与胚胎发生相关,如Hmga2。(Winslow等人,《自然》,473(7345),101-104(2011))。
在利用移植的小鼠肿瘤衍生细胞系的试点研究中,接受者小鼠的预防性疫苗接种遏制了大的和中等大小的肿瘤的发展,同时还明显减少了小肿瘤的数量。用Hmga2+ KP肿瘤细胞诱导的肿瘤显示肿瘤数量和大小(图16A)相比于Hmga2-肿瘤(图16B)减小,指示了抗原特异性作用。重要的是,这种保护作用取决于移植细胞的抗原表达,这是特异性的指示。
Claims (38)
1.一种用于向受试者递送治疗剂、预防剂和/或诊断剂的改性树枝状聚合物纳米颗粒,包含:
一种或多种零到七代烷基化树枝状聚合物;
一种或多种两亲性聚合物;以及
一种或多种封装于其中的治疗剂、预防剂和/或诊断剂。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒,其中一种或多种烷基化树枝状聚合物选自由聚(乙烯亚胺)、聚(丙烯亚胺)、二氨基丁烷胺聚丙烯亚胺四胺以及聚(酰胺胺)组成的群组。
3.根据权利要求1到2中任一权利要求所述的纳米颗粒,其中所述烷基化树枝状聚合物选自由第1代树枝状聚合物、第2代树枝状聚合物以及第3代树枝状聚合物组成的群组。
4.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的纳米颗粒,其中所述树枝状聚合物通过添加环氧化物封端的烷基链来改性,所述环氧化物封端的烷基链的大小介于1个碳与30个碳之间且包括端值,优选介于6个碳与16个碳之间且包括端值。
5.根据权利要求1到4中任一权利要求所述的纳米颗粒,其中所述两亲性聚合物包含选自由聚氧化烯和其嵌段共聚物组成的群组的亲水性组分。
6.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的纳米颗粒,其中两亲性分子包含聚氧化烯,优选是分子量介于120Da与25,000Da之间且包括端值、最优选是2,000Da的聚乙二醇。
7.根据权利要求6所述的纳米颗粒,其中所述聚氧化烯是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。
8.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的纳米颗粒,其中所述两亲性聚合物包含选自由脂质和磷脂组成的群组的疏水性组分。
9.根据权利要求1到8中任一权利要求所述的纳米颗粒,其中树枝状聚合物与所述两亲性聚合物的亲水性组分的质量比介于20:1与5:1之间,优选是11.5:1。
10.根据权利要求1到9中任一权利要求所述的纳米颗粒,其中所述治疗剂、预防剂和诊断剂选自由蛋白质、肽、碳水化合物、寡核苷酸、脂质、小分子以及其组合组成的群组。
11.根据权利要求10所述的纳米颗粒,其中核酸选自由以下组成的群组:互补DNA(cDNA)、复制RNA(repRNA)、信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、转运RNA(tRNA)、引导链RNA(sgRNA)、微小RNA(miRNA)以及其组合。
12.根据权利要求11所述的纳米颗粒,其中核酸包含一个或多个长度介于约10个与20,000个碱基之间且包括端值的核糖核酸序列。
13.根据权利要求11所述的纳米颗粒,其中核酸包含一个或多个长度介于约9,000个与15,000个碱基之间且包括端值的核糖核酸序列。
14.根据权利要求11所述的纳米颗粒,其中所述复制RNA包含修饰后的α病毒复制子RNA。
15.根据权利要求11所述的纳米颗粒,其中所述纳米颗粒包含一个或多个能够引起针对相应靶基因的干扰活性的RNA分子,
其中一个RNA分子选自由以下组成的群组:微小RNA(miRNA);短干扰RNA(siRNA);以及长度是至少24个核苷酸的双链RNA(dsRNA)。
16.根据权利要求11到15中任一权利要求所述的纳米颗粒,其中所述纳米颗粒包含两个或更多个复制RNA,其中所述复制RNA独立地编码一个或多个来自感染物、寄生虫或如癌症的异常增殖病症的抗原。
17.根据权利要求11到16中任一权利要求所述的纳米颗粒,其中树枝状聚合物与核糖核酸的质量比介于10:1与1.5:1之间且包括端值,优选是5:1。
18.根据权利要求1到17中任一权利要求所述的纳米颗粒,其中药剂是或编码来自感染物、寄生虫或如癌症的异常增殖病症的抗原。
19.根据权利要求18所述的纳米颗粒,其中所述感染物选自由病毒和细菌组成的群组。
20.根据权利要求18所述的纳米颗粒,其中药剂是或编码癌症抗原。
21.根据权利要求11到20中任一权利要求所述的纳米颗粒,其中所述纳米颗粒包含一个或多个复制RNA和一个或多个信使RNA,其中所述信使RNA经过修饰以包括所述复制RNA的5'和3'非翻译区。
22.根据权利要求1到21中任一权利要求所述的纳米颗粒,其中所述纳米颗粒的大小介于30nm与450nm之间且包括端值,优选介于60nm与250nm之间且包括端值。
23.一种用于向受试者递送治疗剂、预防剂或诊断剂的方法,包含向所述受试者给予根据权利要求1到25中任一权利要求所述的纳米颗粒。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述纳米颗粒递送一个或多个复制RNA,并且其中所述复制RNA在受试者细胞中表达一种或多种蛋白质。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述一个或多个复制RNA在所述受试者细胞中表达两种或更多种蛋白质,并且
其中所述复制RNA以不同速率表达所述蛋白质。
26.一种疫苗,包含根据权利要求1到22中任一权利要求所述的纳米颗粒,
其中所述纳米颗粒包含抗原或编码蛋白质抗原的核酸,
其中所述纳米颗粒呈能够有效地在受试者的抗原呈递细胞中诱导对抗原的免疫反应的量。
27.根据权利要求26所述的疫苗,进一步包含一种或多种免疫调节剂。
28.根据权利要求27所述的疫苗,其中所述免疫调节剂呈能够有效地将对抗原的免疫反应指向细胞或体液反应路径的量。
29.根据权利要求28所述的疫苗,其中所述免疫调节剂驱动针对抗原的细胞免疫以便减少对所述抗原的体液反应。
30.根据权利要求28到29中任一权利要求所述的疫苗,其中所述免疫调节剂选自由以下组成的群组:合成的受体配体、蛋白质、细胞因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子以及其组合。
31.根据权利要求28到30中任一权利要求所述的疫苗,其中所述抗原选自由以下组成的群组:肿瘤抗原、微生物抗原、过敏原以及其组合。
32.根据权利要求31所述的疫苗,其中所述肿瘤抗原选自由以下组成的群组:致癌基因表达产物、选择性剪接蛋白质、突变基因产物、过表达基因产物、异常表达基因产物、由致癌病毒产生的抗原、癌胚抗原、细胞表面糖脂改变的蛋白质以及其组合。
33.根据权利要求32所述的疫苗,其中所述癌胚抗原是Hmga2蛋白。
34.根据权利要求31所述的疫苗,其中所述微生物抗原来源于选自由细菌、病毒、真菌、原生动物以及其组合组成的群组的病原体。
35.根据权利要求34所述的疫苗,其中病毒抗原来源于选自由流感病毒、埃博拉病毒(Ebola virus)、寨卡病毒(Zika Virus)以及其组合组成的群组的病毒。
36.根据权利要求34所述的疫苗,其中原生动物抗原来源于刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)。
37.根据权利要求28到36中任一权利要求所述的疫苗,进一步包含一种或多种治疗剂、预防剂或诊断剂。
38.根据权利要求28到36中任一权利要求所述的疫苗,进一步包含用于向所述受试者给药的药学上可接受的赋形剂。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562222515P | 2015-09-23 | 2015-09-23 | |
US62/222,515 | 2015-09-23 | ||
PCT/US2016/053520 WO2017053851A1 (en) | 2015-09-23 | 2016-09-23 | Compositions and methods for modified dendrimer nanoparticle vaccine delivery |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108601823A true CN108601823A (zh) | 2018-09-28 |
Family
ID=57138121
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201680067059.XA Pending CN108601823A (zh) | 2015-09-23 | 2016-09-23 | 用于改性树枝状聚合物纳米颗粒疫苗递送的组合物和方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10548959B2 (zh) |
EP (1) | EP3352785A1 (zh) |
JP (2) | JP6991977B2 (zh) |
CN (1) | CN108601823A (zh) |
AU (2) | AU2016326695B2 (zh) |
CA (1) | CA2999916C (zh) |
IL (1) | IL258055B (zh) |
WO (1) | WO2017053851A1 (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110448695A (zh) * | 2019-08-23 | 2019-11-15 | 中山大学肿瘤防治中心 | 一种mRNA疫苗递送载体及其制备方法 |
CN110885855A (zh) * | 2018-11-02 | 2020-03-17 | 深圳益世康宁生物科技有限公司 | 一种携带精子蛋白17抗原基因的重组腺相关病毒载体及其应用价值 |
CN112245575A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-01-22 | 上海杏禾医疗科技有限公司 | 含支化聚合物和mRNA的核壳结构的抗肿瘤疫苗及其用途 |
CN114712493A (zh) * | 2022-04-29 | 2022-07-08 | 华南理工大学 | 一种疫苗递送载体及其制备方法和应用 |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10384488B2 (en) | 2016-04-19 | 2019-08-20 | Mark Henry Peterman | Multiple layer foam insert for tires |
WO2017189308A1 (en) | 2016-04-19 | 2017-11-02 | The Broad Institute Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
WO2017184786A1 (en) | 2016-04-19 | 2017-10-26 | The Broad Institute Inc. | Cpf1 complexes with reduced indel activity |
CN110382692A (zh) | 2016-04-19 | 2019-10-25 | 博德研究所 | 新型crispr酶以及系统 |
US11352647B2 (en) | 2016-08-17 | 2022-06-07 | The Broad Institute, Inc. | Crispr enzymes and systems |
CN110312799A (zh) | 2016-08-17 | 2019-10-08 | 博德研究所 | 新型crispr酶和系统 |
WO2018191750A2 (en) | 2017-04-14 | 2018-10-18 | The Broad Institute Inc. | Novel delivery of large payloads |
WO2018227012A1 (en) * | 2017-06-07 | 2018-12-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Polymer-lipid materials for delivery of nucleic acids |
MY201967A (en) | 2017-09-23 | 2024-03-27 | Boehringer Ingelheim Pharma | Paramyxoviridae expression system |
US20210363260A1 (en) | 2017-11-13 | 2021-11-25 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for treating cancer by targeting the clec2d-klrb1 pathway |
AU2019207761A1 (en) * | 2018-01-11 | 2020-07-02 | BioNTech SE | Formulation for administration of RNA |
US10982210B2 (en) | 2018-03-02 | 2021-04-20 | Sixfold Bioscience Ltd. | Compositions for delivery of cargo to cells |
EP3898958A1 (en) | 2018-12-17 | 2021-10-27 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-associated transposase systems and methods of use thereof |
US20210330600A1 (en) * | 2018-12-21 | 2021-10-28 | Tiba Biotech Llc | Nanoparticle compositions for efficient nucleic acid delivery and methods of making and using the same |
WO2020191102A1 (en) | 2019-03-18 | 2020-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Type vii crispr proteins and systems |
WO2020236972A2 (en) | 2019-05-20 | 2020-11-26 | The Broad Institute, Inc. | Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems |
WO2021050974A1 (en) | 2019-09-12 | 2021-03-18 | The Broad Institute, Inc. | Engineered adeno-associated virus capsids |
US11904006B2 (en) | 2019-12-11 | 2024-02-20 | University Of Iowa Research Foundation | Poly(diaminosulfide) particle-based vaccine |
EP4077689A1 (en) * | 2019-12-17 | 2022-10-26 | Universiteit Gent | Non-viral vectors comprising polypropyleneimine |
WO2021216467A1 (en) * | 2020-04-20 | 2021-10-28 | The Regents Of The University Of California | A nano-enabled vaccination approach for coronavirus disease (covid-19) and other viral diseases |
WO2021220053A2 (en) | 2020-04-27 | 2021-11-04 | Sixfold Bioscience Ltd. | Compositions containing nucleic acid nanoparticles with modular functionality |
US20230293678A1 (en) * | 2020-08-21 | 2023-09-21 | Aliasger K. Salem | Cationic nanoparticle adjuvants |
RU2771605C2 (ru) * | 2020-10-26 | 2022-05-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) | Пептиды для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот |
US20220226465A1 (en) | 2021-01-18 | 2022-07-21 | ConserV Bioscience | Coronavirus Immunogenic Compositions, Methods and Uses Thereof |
CA3211496A1 (en) | 2021-03-19 | 2022-09-22 | Tiba Biotech Llc | Artificial alphavirus-derived rna replicon expression systems |
WO2022232684A1 (en) * | 2021-04-30 | 2022-11-03 | Trustees Of Tufts College | Lipidoid nanoparticles for the treatment of diseases and disorders |
WO2023004367A2 (en) | 2021-07-20 | 2023-01-26 | The Broad Institute, Inc. | Engineered targeting compositions for endothelial cells of the central nervous system vasculature and methods of use thereof |
WO2023079528A1 (en) * | 2021-11-05 | 2023-05-11 | King Abdullah University Of Science And Technology | Compositions suitable for use in a method for eliciting cross-protective immunity against coronaviruses |
WO2023196818A1 (en) | 2022-04-04 | 2023-10-12 | The Regents Of The University Of California | Genetic complementation compositions and methods |
WO2023215616A2 (en) * | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Aion Healthspan, Inc. | Nanomaterial-stem cell compositions and methods of use |
WO2024016003A2 (en) | 2022-07-14 | 2024-01-18 | The Broad Institute, Inc. | Aav capsids that enable cns-wide gene delivery through interactions with the transferrin receptor |
WO2024076728A1 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Cyclic nucleotides and uses thereof |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5714166A (en) * | 1986-08-18 | 1998-02-03 | The Dow Chemical Company | Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates |
CN1671851A (zh) * | 2001-11-26 | 2005-09-21 | 昆士兰大学 | 黄病毒疫苗输送系统 |
WO2006040579A1 (en) * | 2004-10-14 | 2006-04-20 | The University Court Of The University Of Glasgow | Bioactive polymers |
US20080114077A1 (en) * | 2005-03-21 | 2008-05-15 | Anp Technologies, Inc. | Symmetrically Branched Polymer Conjugates and Microarray Assays |
WO2010115046A2 (en) * | 2009-04-01 | 2010-10-07 | University Of Miami | Vaccine compositions and methods of use thereof |
CN101861165A (zh) * | 2007-10-12 | 2010-10-13 | 麻省理工学院 | 疫苗纳米技术 |
US20140255472A1 (en) * | 2011-08-31 | 2014-09-11 | Andrew Geall | Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CZ302719B6 (cs) | 2000-12-01 | 2011-09-21 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Izolovaná molekula dvouretezcové RNA, zpusob její výroby a její použití |
-
2016
- 2016-09-23 JP JP2018534517A patent/JP6991977B2/ja active Active
- 2016-09-23 US US15/274,954 patent/US10548959B2/en active Active
- 2016-09-23 EP EP16782125.5A patent/EP3352785A1/en active Pending
- 2016-09-23 AU AU2016326695A patent/AU2016326695B2/en active Active
- 2016-09-23 CN CN201680067059.XA patent/CN108601823A/zh active Pending
- 2016-09-23 CA CA2999916A patent/CA2999916C/en active Active
- 2016-09-23 WO PCT/US2016/053520 patent/WO2017053851A1/en active Application Filing
-
2018
- 2018-03-13 IL IL258055A patent/IL258055B/en unknown
-
2019
- 2019-11-22 US US16/692,624 patent/US20200155660A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-02-21 AU AU2020201268A patent/AU2020201268B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2021
- 2021-03-10 US US17/198,037 patent/US20210338789A1/en active Pending
- 2021-09-09 JP JP2021146627A patent/JP2021193114A/ja active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5714166A (en) * | 1986-08-18 | 1998-02-03 | The Dow Chemical Company | Bioactive and/or targeted dendrimer conjugates |
CN1671851A (zh) * | 2001-11-26 | 2005-09-21 | 昆士兰大学 | 黄病毒疫苗输送系统 |
WO2006040579A1 (en) * | 2004-10-14 | 2006-04-20 | The University Court Of The University Of Glasgow | Bioactive polymers |
US20080114077A1 (en) * | 2005-03-21 | 2008-05-15 | Anp Technologies, Inc. | Symmetrically Branched Polymer Conjugates and Microarray Assays |
CN101861165A (zh) * | 2007-10-12 | 2010-10-13 | 麻省理工学院 | 疫苗纳米技术 |
WO2010115046A2 (en) * | 2009-04-01 | 2010-10-07 | University Of Miami | Vaccine compositions and methods of use thereof |
US20140255472A1 (en) * | 2011-08-31 | 2014-09-11 | Andrew Geall | Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna |
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
ANDREW J GEALL等: ""Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines"", 《PNAS》 * |
JIEPIN YANG等: ""Surface-Engineered Dendrimers in Gene Delivery"", 《CHEMICAL REVIEWS》 * |
JING XU等: ""RNA Replicon Delivery via Lipid-Complexed PRINT Protein Particles"", 《MOLECULAR PHARMACEUTICS》 * |
OMAR F. KHAN等: ""Dendrimer-Inspired Nanomaterials for the in Vivo Delivery of siRNA to Lung Vasculature"", 《NANO LETTERS》 * |
OMAR F. KHAN等: ""Ionizable Amphiphilic Dendrimer-Based Nanomaterials with Alkyl-Chain-Substituted Amines for Tunable siRNA Delivery to the Liver Endothelium In Vivo"", 《ANGEW. CHEM. INT. ED》 * |
胡青莲: ""高分子纳米材料作为核酸和药物载体用于肿瘤治疗的研究"", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)工程科技Ⅰ辑》 * |
苏志会等: ""小干扰RNA非病毒递送载体的研究进展"", 《药物生物技术》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110885855A (zh) * | 2018-11-02 | 2020-03-17 | 深圳益世康宁生物科技有限公司 | 一种携带精子蛋白17抗原基因的重组腺相关病毒载体及其应用价值 |
CN110448695A (zh) * | 2019-08-23 | 2019-11-15 | 中山大学肿瘤防治中心 | 一种mRNA疫苗递送载体及其制备方法 |
CN112245575A (zh) * | 2020-10-26 | 2021-01-22 | 上海杏禾医疗科技有限公司 | 含支化聚合物和mRNA的核壳结构的抗肿瘤疫苗及其用途 |
CN114712493A (zh) * | 2022-04-29 | 2022-07-08 | 华南理工大学 | 一种疫苗递送载体及其制备方法和应用 |
CN114712493B (zh) * | 2022-04-29 | 2024-05-28 | 华南理工大学 | 一种疫苗递送载体及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20170079916A1 (en) | 2017-03-23 |
US20210338789A1 (en) | 2021-11-04 |
JP2021193114A (ja) | 2021-12-23 |
US20200155660A1 (en) | 2020-05-21 |
US10548959B2 (en) | 2020-02-04 |
CA2999916A1 (en) | 2017-03-30 |
CA2999916C (en) | 2021-07-20 |
JP2018528274A (ja) | 2018-09-27 |
IL258055A (en) | 2018-05-31 |
AU2020201268A1 (en) | 2020-03-12 |
AU2016326695B2 (en) | 2019-11-28 |
EP3352785A1 (en) | 2018-08-01 |
AU2020201268B2 (en) | 2022-02-24 |
AU2016326695A1 (en) | 2018-05-10 |
IL258055B (en) | 2021-07-29 |
JP6991977B2 (ja) | 2022-02-03 |
WO2017053851A1 (en) | 2017-03-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108601823A (zh) | 用于改性树枝状聚合物纳米颗粒疫苗递送的组合物和方法 | |
Xu et al. | mRNA vaccine era—mechanisms, drug platform and clinical prospection | |
Chaudhary et al. | mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation | |
Goswami et al. | Mannosylation of LNP results in improved potency for self-amplifying RNA (SAM) vaccines | |
Zhang et al. | Advances in mRNA vaccines for infectious diseases | |
Reichmuth et al. | mRNA vaccine delivery using lipid nanoparticles | |
Machhi et al. | A role for extracellular vesicles in SARS-CoV-2 therapeutics and prevention | |
Ruseska et al. | Use of protamine in nanopharmaceuticals—A review | |
Avila et al. | Gene delivery and immunomodulatory effects of plasmid DNA associated with Branched Amphiphilic Peptide Capsules | |
Li et al. | Enhancing the immunogenicity of lipid-nanoparticle mRNA vaccines by adjuvanting the ionizable lipid and the mRNA | |
Zhao et al. | Dendrigraft poly-L-lysines delivery of DNA vaccine effectively enhances the immunogenic responses against H9N2 avian influenza virus infection in chickens | |
Atalis et al. | Nanoparticle-delivered TLR4 and RIG-I agonists enhance immune response to SARS-CoV-2 subunit vaccine | |
WO2016019126A1 (en) | System and method for delivering genetic material or protein to cells | |
Li et al. | Advances in mRNA vaccines | |
Lin et al. | Enhanced immune responses to mucosa by functionalized chitosan-based composite nanoparticles as a vaccine adjuvant for intranasal delivery | |
McCullough et al. | Functional RNA delivery targeted to dendritic cells by synthetic nanoparticles | |
Shinde et al. | The mRNA vaccine heralds a new era in vaccinology | |
Gholap et al. | Harnessing nanovaccines for effective immunization─ a special concern on COVID-19: facts, fidelity, and future prospective | |
Gu et al. | Building a Better Silver Bullet: Current Status and Perspectives of Non‐Viral Vectors for mRNA Vaccines | |
Moser et al. | Influenza virosomes as antigen delivery system | |
Han et al. | Non-invasive vaccines: challenges in formulation and vaccine adjuvants | |
AU2007202629A1 (en) | Nasal-administered vaccines | |
US20240181070A1 (en) | Nanovaccines for treatment of viral diseases | |
Mbatha et al. | Future prospects in mRNA vaccine development | |
US20100278846A1 (en) | Nasal-administered vaccines using multi-screened nalt-targeting and phagocytic polypeptide transport sequences |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1260012 Country of ref document: HK |