KR100735791B1

KR100735791B1 - 자가 단백질 분해성 절단에 의한 단백질 생산

Info

Publication number: KR100735791B1
Application number: KR1020027001667A
Authority: KR
Inventors: 틸만 뤼메나프; 하인츠-유르겐 틸; 요르그 빈디슈; 프란츠 크나우세더
Original assignee: 산도즈 게엠베하
Priority date: 1999-08-09
Filing date: 2000-08-07
Publication date: 2007-07-06
Also published as: AU6699800A; PL203708B1; JP2003506092A; JP5480458B2; EP1200603B1; HUP0203051A2; TR200200048T2; AU775681B2; CZ2002480A3; HK1047127A1; HUP0203051A3; PL353090A1; MXPA02001425A; WO2001011056A1; CA2380302C; SK288290B6; EP1200603A1; CA2380302A1; NO329246B1; CN1367837A

Abstract

본 발명은 박테리아 숙주 세포에서 명확하게 정해진 균질 N-말단을 가진 목적 이종 폴리펩티드의 생산 방법에 관한 것이며, 상기 목적 이종 폴리펩티드는 페스티바이러스의 자가 단백질 분해효소 N^pro의 자가 단백질 분해 활성을 가진 폴리펩티드 및 이종 폴리펩티드를 포함하는 처음 발현된 융합 단백질로부터 N^pro의 자가 단백질 분해 활성에 의한 자가 단백질 분해에 의해 절단된다.

자가 단백질 분해, Npro, 페스티바이러스, 이종 폴리펩티드, 융합 단백질

Description

자가 단백질 분해성 절단에 의한 단백질 생산{Production of Proteins by Autoproteolytic Cleavage}

단백질의 생산

본 발명은 명확하게 정해진 균질 N-말단을 갖는 목적 이종 폴리펩티드를 박테리아 숙주 세포 내에서 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 목적 이종 폴리펩티드는 페스티바이러스의 자가 단백질 분해효소 N^pro의 자가 단백질 분해 활성을 갖는 펩티드와 이종 폴리펩티드를 포함하는 처음에 발현된 융합 단백질로부터 N^pro의 자가 단백질 분해 활성에 의해 자가 단백질 분해되어 절단된다.

인간 또는 다른 진핵세포 단백질을 박테리아 세포 내에서 발현시키는 것과 같이 이종 생명체 내에서 재조합 단백질을 생산하는 데 있어서, 가능한 거의 100％의 균질성을 갖는 명확하게 정해진 N-말단을 얻기란 대체로 어려운 것이다. 이 문제는 그 아미노산 서열이 인간/동물에서 자연적으로 발생하는 아미노산과 많은 경우 동일하여야 하는 의약용 재조합 단백질의 경우에 특히 그러하다.

예를 들어 인체 내에서의 천연 발현의 경우, 사용되는 대부분의 의약용 단백질은 세포외 공간으로 수송되어, 수송 목적을 위해 전구 단백질에 존재하는 신호 서열이 절단됨으로써 명확하게 정해진 N-말단이 드러나게 된다. 몇 가지 이유로 인해 그러한 균질 N-말단을, 예를 들어 박테리아 세포 등에서 얻기가 항상 쉬운 일은 아니다.

단지 드문 경우에 있어서, 적합한 원핵 또는 진핵세포 신호 서열을 통해 박테리아의 원형질막 주위 공간 (periplasm)으로 분비하는데, 이는 박테리아 분비 기관의 낮은 수송 용량으로 인해 상기 공간에는 단지 극소량의 산물만이 축적될 수 있기 때문이다.

그러나, 박테리아 세포질은 진핵세포의 세포외 공간과는 상당히 다르다. 우선, 박테리아 세포질 내에는 환원 조건이 존재하며, 또한 성숙 단백질을 형성하는 N-말단 리더 서열을 절단하는 기전이 없다. 모든 세포질 단백질의 합성은 적절한 출발 코돈 (ATG = 번역의 개시)에 의해 지정되는 메티오닌으로 시작한다. 이 N-말단의 메티오닌은 대부분 단백질 내에 보존되어 있는 반면, 세포질 내에 존재하는 숙주에 고유한 메티오닌 아미노펩티다제 (methionine aminopeptidase)(MAP)에 의해 절단되는 경우도 있다. 그 절단 효율은 두 매개변수, 즉 (1) 뒤이은 아미노산의 성질 및 (2) 단백질 3차 구조상에서 N-말단의 위치에 의해 본질적으로 결정된다. N-말단 메티오닌은 바람직하게는 뒤이은 아미노산이 세린, 알라닌, 글리신, 메티오닌 또는 발린인 경우, 및 N-말단이 노출된 경우 (즉, 단백질 내에 "숨겨진" 것이 아닌 경우)에 결실된다. 한편, 뒤이은 아미노산이 상기와 다른 경우, 특히 전하를 가진 경우 (글루탐산, 아스파르트산, 리신, 아르기닌) 또는 N-말단이 단백질 내부에 위치하는 경우, 대부분 N-말단의 메티오닌 절단은 일어나지 않는다 (문헌 [Knippers, Rolf (1995) Molekulare Genetik, 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. ISBN 3-13-103916-7] 참조).

심지어 절단을 촉진하는 아미노산이 2번 위치에 존재하는 경우에도 절단은 거의 일어나지 않는다. 상당한 비율 (1-50％)의 메티오닌이 MAP에 의해 영향받지 않은 채 남아있는 것이 일반적이다.

초창기에 박테리아 세포 내에서 의약용 재조합 단백질을 생산하는 과정은 단순히 성숙 (즉, 신호 서열 또는 다른 N-말단 확장 서열이 없이) 단백질에 대한 오픈 리딩 프레임 (ORF) 앞에 메티오닌을 코딩하는 ATG 출발 코돈을 집어넣는 것 뿐이었다. 그렇게 발현된 단백질의 서열은 H₂N-Met-표적 단백질이었다. 단지 일부의 경우에만 숙주 고유의 MAP에 의해 N-말단 메티오닌의 절단이 완결되었다. 이러한 방식으로 생산된 대부분의 단백질은 그 N-말단이 비균질이거나 (Met 형 및 무(無)-Met 형의 혼합물) 또는 모두가 N-말단에 추가의 외래 아미노산 (Met)을 갖는다 (오직 Met 형).

그러나, 비균질 혼합물 또는 천연 서열과 편차가 있는 단백질은 많은 경우 허용불가능한데, 이는 이들 산물이 대체로 다른 면역학적 성질 (예를 들어, 항체 형성의 유도) 및 약리학적 성질 (반감기, 약물동태학)을 나타내기 때문이다. 이러한 이유로, 현재 많은 경우에서 천연 상태와 동일한 (균질하고 N-말단에 외래 아미노산이 없는) 산물을 생산할 필요가 있다. 세포질 발현의 경우, 대부분의 치료제가 표적 단백질의 N-말단에 엔도펩티다제 (예를 들어, Xa 인자, 엔테로키나제, KEX 엔도펩티다제, IgA 단백질 분해 효소) 또는 아미노펩티다제 (예를 들어, 디펩티딜 아미노펩티다제)에 특이적인 절단 서열 (리더 (leader))과 융합되어야 한다. 그러나, 이는 생산물에 대한 추가의 작업, 소위 이후의 공정에 비용과 재료가 소비되는 추가의 단계를 요한다.

따라서, 추가의 시험관내 단계 (리폴딩 (refolding), 정제, 단백질분해효소 절단, 재정제 등)를 거치지 않고 균일한 목적 N-말단의 표적 단백질을 제조할 수 있도록 박테리아 세포 내에서 표적 단백질을 생산하는 방법이 필요하다. 그와 같은 방법이 페스티바이러스로부터의 바이러스성 자가 단백질 분해효소 N^pro를 이용하여 본 발명의 범위 내에서 개발되었다.

페스티바이러스는 전세계적으로 돼지와 반추동물에 대해서 심각한 경제적 손실을 야기하는 병원체의 일군을 이룬다. 요주의 전염병을 일으키는 병원체로서, 돼지 콜레라 바이러스 (CSFV)가 특히 중요하다. 또한, 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)에 의해, 특히 태아의 자궁내 감염을 통해 통상 감염되어 야기되는 손실도 상당하다.

페스티바이러스는 게놈이 직접 mRNA로서 작용하며, 그 크기는 12.3 kb이고, 바이러스 유전자 산물이 세포질 내에서 전사되는 소형 외피 보유 바이러스이다. 이 유전자 산물은 약 4000개의 아미노산을 포함하는 단일 폴리프로테인의 형태로 나타나며 바이러스 및 세포의 단백질 분해효소 둘 다에 의해 약 12개의 성숙 단백질로 분리된다.

지금까지, 페스티바이러스에서 2개의 바이러스-코딩 단백질 분해효소, 즉 자 가 단백질 분해효소 N^pro 및 세린 단백질 분해효소 NS3이 확인되었다. N-말단 단백질 분해효소 N^pro는 폴리프로테인의 N-말단에 위치하고, 겉보기 분자량은 23 kd이다. N^pro는 그 자신의 C-말단 (Cys168) 및 뉴클레오캡시드 단백질 C의 N-말단 (Ser169) 사이에서 일어나는 절단을 촉매한다 (문헌 [R. Stark et al., J. Virol. 67(1993), 7088-7095] 참조). 또한, 세포 병변 BVDV 바이러스에서의 N^pro 유전자의 복제도 기술된 바 있다. 이 바이러스에서는 유사하게 복제된 NS3 단백질 분해효소의 N-말단에 N^pro의 두번째 카피가 있다. N^pro-NS3 단백질의 자가 단백질 분해성 절단은 이 경우에서도 관찰된다 (상기 문헌 [R. Stark et al.] 참조).

N^pro는 길이가 168 aa이고 겉보기 분자량이 약 20,000 d (생체내)인 자가 단백질 분해효소이다. 이는 페스티바이러스 (예를 들어, CSFV, BDV (국경병 바이러스) 또는 BVDV)의 폴리프로테인 중에서 첫 번째로 생겨나는 단백질로서, 그 이후에 생겨나는 뉴클레오캡시드 단백질 C로부터의 자가 단백질 분해성 절단이 일어난다 (문헌 [M. Wiskerchen et al., J. Virol. 65 (1991), 4508-4514] 및 문헌 [Stark et al., J. Virol. 67 (1993), 7088-7095] 참조). 이 절단은 N^pro의 서열에서 마지막 아미노산인 Cys168 뒤에서 일어난다.

놀랍게도, 페스티바이러스의 자가 단백질 분해효소 N^pro의 자가 단백질 분해 기능이 박테리아 발현 시스템, 특히 이종 단백질의 발현에서 유지되고 있다는 것을 본 발명의 범위 내에서 발견하였다. 따라서, 본 발명은 박테리아 숙주 세포 내에서 명확하게 정해진 균질 N-말단을 갖는 목적 이종 폴리펩티드의 생산 방법에 관한 것이며, 상기 목적 이종 폴리펩티드는 페스티바이러스의 자가 단백질 분해효소 N^pro의 자가 단백질 분해 활성이 있는 펩티드 와 이종 폴리펩티드를 포함하는 처음에 발현된 융합 단백질로부터 N^pro의 자가 단백질 분해 활성에 의해 절단된다. 또한 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 사용되는 클로닝 수단에 관한 것이다.

페스티바이러스의 자가 단백질 분해효소 N^pro의 자가 단백질 분해 활성이 있는 폴리펩티드 또는 페스티바이러스의 자가 단백질 분해효소 N^pro의 자가 단백질 분해 기능이 있는 폴리펩티드는 특히 페스티바이러스의 자가 단백질 분해효소 N^pro 또는 자가 단백질 분해 활성이 있는 그의 유도체이다.

본 발명의 범위 내에서, "이종 폴리펩티드"란 용어는 자연발생 융합 단백질 또는 폴리프로테인으로부터 페스티바이러스의 자가 단백질 분해효소 N^pro에 의해서는 본래 절단되지 않는 폴리펩티드를 의미한다. 이종 폴리펩티드의 예로는 산업용 효소 (공정 효소) 또는 의약용, 특히 인간의 의약용 활성을 가진 폴리펩티드가 있다.

인간의 의약용 활성을 가진 바람직한 폴리펩티드의 예로는 인터루킨과 같은 사이토카인 (예를 들어, IL-6), 백혈구 인터페론과 같은 인터페론 (예를 들어, 인터페론 α2B), 성장 인자, 특히 G-CSF, 에리트로포이에틴 또는 IGF와 같은 조혈 또 는 상처-치료 성장 인자, 인간 성장 호르몬 (hGH)과 같은 호르몬, 항체 또는 백신이 있다.

따라서, 발명의 한 측면에서 본 발명은 페스티바이러스의 자가 단백질 분해효소 N^pro의 자가 단백질 분해 기능이 있는 첫 번째 폴리펩티드와 이 첫 번째 폴리펩티드의 C-말단에서 첫 번째 폴리펩티드와 연결되어 있는 두 번째 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이며, 여기서 두 번째 폴리펩티드는 첫 번째 폴리펩티드의 자가 단백질 분해 활성에 의해 융합 단백질로부터 절단 가능하고 상기 두 번째 폴리펩티드는 이종 폴리펩티드이다.

상기 목적을 위한 페스티바이러스는 CSFV, BDV 및 BVDV의 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, CSFV가 특히 바람직하다.

본 발명의 바람직한 핵산 분자는 융합 단백질의 첫 번째 폴리펩티드가 CSFV의 자가 단백질 분해효소 N^pro의 하기 아미노산 서열 (EMBL 데이터베이스 승인번호 X87939호 참조) (N-말단으로부터 C-말단 방향으로 아미노산 1 내지 168) 또는 자가 단백질 분해 활성이 있는 그의 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 것이다:

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168).

페스티바이러스의 자가 단백질 분해효소 N^pro의 자가 단백질 분해 활성이 있는 유도체는, 특히 균질한 N-말단이 있는 목적 단백질을 생산하기 위해 필요한 자 가 단백질 분해 활성을 보유하는 한도에서 돌연변이 유발, 특히 아미노산 치환, 결실, 부가 및(또는) 아미노산 삽입에 의해 생성된 자가 단백질 분해효소 N^pro이다. 돌연변이 유발에 의해 그러한 유도체를 생성하는 방법은 당업자에게 익숙한 것이다. 그러한 돌연변이 유발에 의해서 자가 단백질 분해효소 N^pro의 활성을 최적화, 예를 들어 다른 이종 단백질을 절단하도록 하는 것이 가능하다. 목적 이종 단백질뿐만 아니라, 자연발생적인 자가 단백질 분해효소 N^pro에 비해서 하나 이상의 돌연변이를 나타내는 자가 단백질 분해효소 N^pro 유도체를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 제조한 후, 발현 시스템 내에서 자가 단백질 분해 활성을 측정함으로써 필요한 기능이 존재하는지를 확인하였다.

자가 단백질 분해 활성은, 예를 들어 시험관내 시스템에 의해서 초기에 검출 가능하다. 상기 목적을 위해, DNA 구조물을 RNA로 전사시키고, 시험관내 번역 키트를 사용하여 단백질로 번역시킨다. 감도를 증가시키기 위해서, 경우에 따라서는 생성된 단백질에 방사성 아미노산을 혼입시켜 표지한다. 생성된 N^pro-표적 단백질 융합 단백질은 번역과 동시 및(또는) 번역 후 과정으로 자가 단백질 분해성 절단을 일으키고, N-말단의 N^pro 부위는 그의 자가 단백질 분해 활성에 의해서 그 이후의 표적 단백질로부터 정확하게 절단된다. 생성된 절단 산물은 용이하게 검출할 수 있고, 혼합물은 시험관내 번역 반응의 완료 직후 검사할 수 있다. 그후 상기 혼합물 을 단백질 겔 (예를 들어, 램리 (Laemmli) SDS-PAGE)에 로딩하여 전기영동을 수행한다. 그후 상기 겔을 적합한 염료로 염색하거나 방사선 사진을 찍는다. 면역 염색에 이은 웨스턴 블롯도 가능하다. 나타난 단백질 밴드의 강도에 근거하여 융합 단백질의 절단 효율을 평가할 수 있다.

추가의 단계에서, (시험관내 번역 단계에서 미리 수행하지 않은 경우) 융합 단백질을 위한 핵산 단편을 박테리아 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있고, 그 클론을 적절한 숙주 (예, 이. 콜라이 (E. coli)) 내로 형질전환시킬 수 있다. 생성된 발현 균주는 구성적으로 또는 유도물질의 첨가 후에 융합 단백질을 발현한다. 후자의 경우, 유도물질 첨가후 한 시간 이상을 추가로 배양하여 충분한 농도의 산물을 얻어야 한다. 그 후 N^pro 자가 단백질 분해효소가 발현된 융합 단백질로부터 그 자신을 번역과 동시 또는 번역 후 과정으로 절단하여 생성된 절단 단편은 그 자체로 N^pro 자가 단백질 분해효소 및 정해진 N-말단을 갖는 표적 단백질이 되도록 한다. 상기 절단 반응의 효율을 평가하기 위해, 배양 또는 유도기 종료 후 샘플을 취하여 상기 기술한 것처럼 SDS-PAGE로 분석한다.

상기 기술된 융합 단백질의 바람직한 자가 단백질 분해효소 N^pro 유도체는, 예를 들어 생성되는 유도체가 목적하는 정도로 자가 단백질 분해효소 N^pro의 자가 단백질 분해 기능을 나타내는 한도에서 하나 이상의 아미노산이 아미노산 2 내지 21번의 영역에서 결실 또는 치환된 N-말단 영역을 갖는다. 본 발명의 목적상, 융합 단백질에 바람직한 자가 단백질 분해효소 N^pro 유도체는 예를 들어 CSFV의 자가 단백질 분해효소 N^pro에서 아미노산 2번 내지 16번 또는 2번 내지 21번이 결실된 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 아미노산 서열을 바꾸거나 도입하기 위해 아미노산을 치환 또는 부가함으로써, 예를 들어 정제를 돕는 아미노산 서열을 도입할 수도 있다 (실시예 참조).

본 발명의 특히 바람직한 핵산 분자는 첫 번째 폴리펩티드가 CSFV의 자가 단백질 분해효소 N^pro 또는 자가 단백질 분해 활성을 가진 그의 유도체의 Glu22 내지 Cys168 아미노산 서열을 포함하고, 또한 N-말단에 Met를 가지며, 이종 폴리펩티드가 CSFV의 자가 단백질 분해효소 N^pro의 Cys168 아미노산에 직접적으로 연결되어 있는 것이다.

유사하게 바람직한 본 발명의 핵산 분자는 첫 번째 폴리펩티드가 CSFV의 자가 단백질 분해효소 N^pro 또는 자가 단백질 분해 활성을 가진 그의 유도체의 Pro17 내지 Cys168 아미노산 서열을 포함하고, 또한 N-말단에 Met를 가지며, 이종 폴리펩티드가 CSFV의 자가 단백질 분해효소 N^pro의 Cys168 아미노산에 직접적으로 연결되어 있는 것이다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 특히 DNA 분자의 형태를 가진다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 클로닝 요소, 특히 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 분자 및 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함하며 미리 정의된 박테리아 숙주 세포에 적합한 발현 벡터에 관한 것이다. 발현 조절 서열은 특히 프로모터 (예를 들어, lac, tac, T3, T7, trp, gac, vhb, 람다 pL 또는 phoA), 리보좀 결합 부위 (예를 들어, 상기 언급한 프로모터에 속하는 자연발생 리보좀 결합 부위, cro 또는 합성 리보좀 결합 부위) 또는 전사 터미네이터 (예를 들어, rrnB T1T2 또는 bla)이다. 상기 숙주 세포는 바람직하게는 에셰리키아 (Escherichia) 속의 박테리아 세포, 특히 이. 콜라이이다. 그러나, 다른 박테리아 세포 (하기 참조)를 사용하는 것도 가능하다. 바람직한 실시 태양에서, 본 발명에 따른 발현 벡터는 플라스미드이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 박테리아 숙주 세포에 관한 것이다. 그러한 박테리아 숙주 세포는, 예를 들어 에셰리키아 종 (예를 들어, 이. 콜라이)과 같은 그람 음성 박테리아, 또는 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 (예를 들어, 슈도모나스 아에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)) 또는 카울로박터 (Caulobacter) 종 (예를 들어, 카울로박터 크레센투스 (Caulobacter crescentus))과 같은 다른 그람 음성 박테리아, 또는 바실러스 (Bacillus) 종 (특히, 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis))과 같은 그람 양성 박테리아의 미생물군으로부터 선택된다. 이. 콜라이가 특히 숙주세포로서 바람직하다.

또한, 본 발명은

(i) 본 발명의 발현 벡터, 즉 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 본 발명에 따 른 박테리아 숙주 세포를, 융합 단백질이 발현되며, 추가로 숙주 세포 내에서 첫 번째 폴리펩티드의 자가 단백질 분해 활성에 의해 상기 융합 단백질로부터 이종 폴리펩티드의 자가 단백질 분해성 절단이 일어나는 조건 하에서 배양하는 단계,

(ii) 절단된 이종 폴리펩티드를 단리하는 단계

를 포함하는 목적 이종 폴리펩티드의 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법은 대체로 상기와 마찬가지로 공지된 통상적인 미생물 실험에 따라 박테리아 숙주 세포, 즉 발현 균주를 처음부터 배양함으로서 수행한다. 상기 균주는 일반적으로 영양 배지 상의 단일 콜로니로부터 출발하여 얻지만, 냉동 보관된 세포 현탁액 (세포 은행 (cell bank))을 이용하는 것도 가능하다. 상기 균주는 일반적으로 다단계 과정을 거쳐 배양하여 차후 사용을 위해 충분한 생체량 (bismass)를 얻는다.

소규모인 경우, 실험은 진탕 플라스크 내에서 이루어지며, 대부분의 경우 복합 배지 (예를 들어, LB 브로스)를 사용하는 것이 가능하다. 그러나, 합성 배지 (예를 들어, 시트레이트 배지)를 사용하는 것도 가능하다. 배양을 위해, 숙주 균주를 작은 부피로 예비 배양하며 (단일 콜로니 또는 냉동배양액으로부터의 세포 현탁액을 접종), 상기 배양 온도는 일반적으로 이후의 발현 결과에 중요하지 않기 때문에 상대적으로 높은 온도 (예를 들어, 30℃ 또는 37℃)에서 기계적 절차로 실험을 수행하는 것이 가능하다. 주 배양은 보다 큰 부피 (예를 들어, 500 ㎖)로 착수하며, 특히 원활한 공기 공급을 보장해야 한다 (내용물의 부피에 비해 큰 부피의 플라스크 사용, 고속 회전). 발현물은 가용성 형태로 나타나도록 해야하기 때문에, 주 배양은 대체로 어느 정도 낮은 온도 (예를 들어, 22 또는 28℃)에서 수행될 것이다. 유도 시스템 (예를 들어, trp, lac, tac 또는 phoA 프로모터) 및 구성적 시스템 둘 다 가용성 단백질을 생산하는데 적합하다. 후기 로그기에 다다른 후 (통상적으로 진탕 플라스크 내에서 광학 밀도가 0.5 내지 1.0일 때), 유도 시스템에서는 유도물질 (예를 들어, 인돌아크릴산, 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드 = IPTG)을 첨가하고, 1 내지 5시간 동안 계속 배양한다. 이러한 경우, 가능한 조심스러운 발현을 위해 유도물질의 농도는 하한선에서 선택하도록 한다. 상기 시간동안 N^pro-표적 단백질 융합 단백질의 대부분이 형성되며, N^pro 부분의 번역과 동시 또는 번역 후 절단이 일어나 배양 종료 후 두 개의 절단된 부분이 따로 존재하게 된다. 생성된 세포를 수획하여 추가로 가공할 수 있다.

보다 대규모인 경우, 다단계 시스템이 다수의 생물반응기 (발효기)로 구성되며, 이 경우 공정의 제어를 조작하는 공정을 개선할 수 있도록 하기 위해 합성 영양 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 특정 양분 (회분식 공급)을 계량함으로써 생체량 및 생산물 형성을 크게 증가시키는 것이 가능하다. 그 밖의 공정들은 진탕 플라스크와 유사하다. 예를 들어, 예비 단계 발효기 및 주 단계 발효기가 사용되고, 배양 온도는 진탕 플라스크에서와 유사하게 선택된다. 일반적으로 진탕 플라스크에서 단일 콜로니 또는 냉동 배양액으로부터 배양시킨 소위 접종원을 예비 단계 발효기에 접종한다. 발효기 내에, 특히 주 단계의 경우에 원활한 공기 공급을 보장하고 충분한 농도의 유도물질을 공급해 주어야 한다. 그러나, 발효기에서 배양하는 세포의 유도기는 경우에 따라 진탕 플라스크에서 배양하는 세포의 유도기에 비해 매우 긴 시간 동안 이루어져야 한다. 생성된 세포는 추가의 가공을 위해 다시 한번 옮긴다.

그후 융합 단백질로부터 절단된 이종 표적 단백질은 당업자에게 공지된 단백질 정제 방법으로 단리될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [M.P. Deutscher, in: Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification, Academic Press Inc., (1990), 309-392] 참조). 일반적으로 정제 과정은 세포 파쇄 단계, 청징화 단계 (원심분리 또는 미세여과)와 다양한 크로마토그래피 단계, 여과 및 침전을 포함한다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 그 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.

실시예 1: 박테리아 숙주 내에서 N^pro-C 융합 단백질의 발현 및 생체내 절단

N^pro-C 융합 단백질을 박테리아 숙주에서 발현시키기 위해 NPC-pET 플라스미드를 제작하였다. 사용된 발현 벡터는 pET11a 벡터이었다 (문헌 [F.W. Studier et al. Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-98] 참조). N^pro-C 융합 단백질을 위해 천연 구성 유전자 (CSFV RNA 게놈으로부터 유래)를 상기 발현 벡터로 클로닝하였다. 상기 융합 단백질을 위한 구성 유전자는 바이러스 게놈을 cDNA로 전사 (및 벡터 내로 클로닝)시켜 PCR 증폭에 의해 얻었다. 또한 천연 N^pro-서열의 처음 16개의 아미노산 (MELNHFELLYKTSKQK)을 아미노산 10개 길이의 올리고-히스티딘 정제 보조체 (MASHHHHHHH)로 치환하였다. 생성된 구조물을 NPC-pET로 명명하였다. NPC-pET 상에 코딩된 N^pro 부분의 서열 및 N^pro-C 융합 단백질의 자가 단백질 분해성 절단 부위는 하기의 구조를 가지며, 그 절단 부위는 Cys168 및 Ser(169) 아미노산 사이에 위치하고 있다.

MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC(168)S(169)DDGAS-(뉴클레오캡시드 단백질 C)

상기 서열에서, 천연 N^pro 서열의 17번 프롤린 (융합 단백질의 2번 위치)은 이탤릭체로, C 서열의 출발 부분은 굵은 글씨체로 표기하였다. 융합 단백질은 상대 분자량이 약 32 kd이며, 자가 단백질 분해성 절단 이후 N^pro 부분이 18 kd이고 C 부분이 14 kd이었다.

절단 부위의 첫 아미노산 C-말단의 중요성을 평가하기 위해, 천연 상태에서는 세린으로 존재하는 169번을 지정부위 돌연변이 유발에 의해서 19개의 다른 천연 아미노산으로 치환하였다. 그렇게 생성된 구조물을 NPC-pET-Ala, NPC-pET-Gly 등으로 명명하였다. 이들 플라스미드를 사용하여 발현 균주를 생성시켰다.

N^pro-C 융합 단백질의 발현을 위한 에셰리키아 콜라이 숙주 균주로서 에셰리키아 콜라이 BL21(DE3)를 사용하였다. 이 균주는 하기의 유전형을 갖는다.

E. coli B F^- dcm omp T hsdS(r_b ^-m_b ^-) galλ(DE3)

상기 균주는 스트라타젠 (Stratagene)에서 콤피텐트 세포 형태로 시판되고 있다. 상기 균주는 용원성 λ파지를 게놈 중에 보유하고 있으며, 게놈에는 lacUV5 프로모터 조절 하의 T7 RNA 폴리머라제가 포함되어 있다. 따라서, T7 RNA 폴리머라제의 생산 및 그에 따른 표적 단백질의 생산은 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 첨가하여 유도할 수 있다. 이러한 2-단계 시스템은 많은 표적 단백질에 대해서 매우 높은 특이성으로 발현 수준 절대량을 얻도록 해준다.

BL21(DE3)로 각각의 발현 플라스미드를 형질전환시켜 BL21(DE3)[MPC-pET], BL21(DE3)[MPC-pET-Ala] 등의 발현 균주를 생성시켰다. 형질 전환은 콤피텐트 세포의 공급업자 (스트라타젠 또는 노바젠 (Novagen))의 지시에 따라 수행하였다. 100 mg/ℓ암피실린을 함유한 루리아 한천 플레이트 상에 형질전환 혼합물을 평판 배양하였다. 상기 형질전환으로 37℃에서 (밤새) 인큐베이션시킨 후 각 경우에 있어서 많은 클론이 생성되었다.

경계가 뚜렷한 중간 크기의 콜로니를 골라 적절한 발현 균주를 위한 근간으로 삼았다. 상기 클론을 배양하고 -80℃의 냉동앰퓰 내에 보존하였다 (마스터 셀 뱅크 MCB). 상기 균주를 루리아 한천 플레이트 (암피실린 함유) 상에 스트리킹하여 일상용으로 사용하였다.

이 특정 균주를 사용하여 한천 플레이트 상에서 2차 배양한 단일 콜로니를 진탕 플라스크 내의 예비 배양액에 접종하였다. 예비 배양액의 분취량을 주 배양 액 (진탕 플라스크 중 10 내지 200 ㎖)에 접종하는데 사용하고 OD₆₀₀ 값이 0.5 내지 1.0이 될 때까지 키웠다. 그후 융합 단백질이 생산되도록 1.0 mM IPTG (최종 농도)로 유도하였다. 상기 배양액을 추가로 2 내지 4시간동안 더 배양하여, OD₆₀₀ 값이 약 1.0 내지 2.0에 도달하였다. 배양 온도는 30℃ +/- 2℃이었고, 사용된 배지는 LB 배지 + 2 g/ℓ 글루코스 + 100 mg/ℓ암피실린이었다.

유도하기 전과 유도 후 다양한 시간대에 상기 배양액으로부터 시료를 채취하여 원심분리하고, 그 침전물을 변성 시료 완충액 중에서 끓이고 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색이나 웨스턴 블롯을 통해 분석하였다. 상기 시료를 표준화된 조건 하에 두고, 재현탁에 사용한 시료 로딩 완충액의 부피를 통해 각 배양액의 밀도에 따른 차이를 보정하였다.

유도 후 나타난 밴드는 20 kd보다 약간 위 (N^pro), 그리고 약 14 kd (C)에 위치하였다. 각 구조물의 융합 단백질에 대한 절단 효율을 쿠마시-염색 겔 및 웨스턴 블롯에서의 밴드 강도에 의해 예측하였다. 이를 통해 대부분의 아미노산이 절단 부위의 바로 C-말단 (즉, 표적 단백질의 N-말단) 위치에서는 유지된다는 것을, 즉 자가 단백질 분해성 절단이 매우 효율적으로 일어남을 발견하였다.

이들 데이터는 박테리아 숙주세포에서 재조합 융합 단백질의 특이적인 절단을 위해 자가 단백질 분해효소 N^pro의 자가 단백질 분해 활성을 성공적으로 사용하는 것이 원칙적으로 가능함을 보여주고 있다.

실시예 2: N^pro 및 인간 인터루킨 6 (hIL6)의 융합 단백질 발현 및 생체내 절단에 의한 균질한 성숙 hIL6의 생산

N^pro-hIL6 융합 단백질의 발현을 위해 NP6-pET 플라스미드를 제작하였다. pET11a (문헌 [F.W. Studier et al. Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-89] 참조)를 발현 벡터로 사용하였다. 우선, N^pro 및 CSFV 뉴클레오캡시드 단백질로 구성된 융합 단백질을 상기 발현 벡터 내로 클로닝하였다 (실시예 1 참조). 상기 융합 단백질의 구성 유전자를 PCR에 의해 얻었다. 이는 천연 N^pro 서열의 처음 16개의 아미노산 (MELNHFELLYKTSKQK)을 아미노산 10개 길이의 올리고-히스티딘 정제 보조체 (MASHHHHHHH)로 치환하는 것을 수반하였다.

지정부위 돌연변이 유발에 의해서 SpeI 절단 부위를 생성된 발현 플라스미드 내의 N^pro 및 뉴클레오캡시드 단백질 사이에 도입하였다. 이는 구성 유전자의 5' 말단 (상기 단백질의 N-말단에 해당)을 SpeI로, 그리고 3' 말단 (상기 단백질의 C-말단에 해당)을 XhoI로 절단하여 벡터로부터 뉴클레오캡시드 단백질을 위한 상기 구성 유전자를 결실시키는 것이 가능하도록 한다. 그에 따라 생성된 선형화된 N^pro-pET11a 벡터를 예비 겔 전기영동을 통해 뉴클레오캡시드 유전자 단편으로부터 수거하였다. 그후 "부착성" SpeI 및 Xho I 말단을 경유하여 hIL6 구성 유전자를 도입하는 것이 가능하였다.

이를 위해 하기 예비 작업이 필요하다. C10-MJ2 세포에서 생산 가능한 hIL6 cDNA 클론으로부터의 구성 유전자를 고정밀 PCR (예를 들어, 로슈 바이오케미칼스 (Roche Biochemicals)의 Pwo 시스템, 공급업자가 지시한 바에 따라 수행)로 증폭하였다. 하기 올리고뉴클레오티드를 상기 목적을 위해 사용하였다.

올리고뉴클레오티드 1 ("N-말단"):

5' - ATAATTACTA GTTGTGCTCC AGTACCTCCA GGTGAAG -3'

올리고뉴클레오티드 2 ("C-말단"):

5´- ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTACATTTGC CGAAGAGCCC TCAGGC -3´

상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 SpeI 절단 부위를 5' 말단에 도입하고, XhoI 절단 부위를 3' 말단에 도입하였다. 또한, 효율적인 번역 종결을 위해 이중 오커 (ochre) 정지 코돈 (TAATAA)을 구성 유전자의 3' 말단에 도입하였다. 앞쪽 말단에 있는 SpeI 절단 부위는 상기 기술한 N^pro-pET11a 벡터와 리딩 프레임에 맞게 리게이션되도록 한다. 뒤쪽 말단의 XhoI 절단 부위는 방향에 맞는 클로닝이 가능하도록 한다.

hIL6의 구성 유전자를 가진 PRC 단편의 서열 (593 bp)이 하기에 도시되어 있다 (N-말단에서 C-말단의 방향으로 읽힘). 제한 효소 절단 부위는 밑줄이 그어져 있고, hIL6의 첫 번째 코돈 (Ala) 및 정지 코돈이 굵은 글씨체로 인쇄되어 있다.

ATAATTACTAGTTGTGCTCCAGTACCTCCAGGTGAAGATTCTAAAGATGTAGCCGCCCCACACAGACAGCCACTCACCTCTTCAGAACGAATTGACAAACAAATTCGGTACATCCTCGACGGCATCTCAGCCCTGAGAAAGGAGACATGTAACA AGAGTAACATGTGTGAAAGCAGCAAAGAGGCACTGGCAGAAAACAACCTGAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGATGCTTCCAATCTGGATTCAATGAGGAGACTTGCCTGGTAAAAATCATCACTGGTCTTTTGGAGTTTGAGGTATACCTAGAGTACCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTACAAAAGTCCTGATCCAGTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAATCTAGATGCAATAACCACCCCTGACCCAACCACAAATGCCAGCCTGCTGACGAAGCTGCAGGCACAGAACCAGTGGCTGCAGGACATGACAACTCATCTCATTCTGCGCAGCTTTAAGGAGTTCCTGCAGTCCAGCCTGAGGGCTCTTCGGCAAATGTAATAACTCGAGGATCCAATTAT

N^pro-pET11a 플라스미드와 리게이션시켜 제조한 구조물은 NP6-pET로 명명하였다.

NP6-pET 상에 코딩된 N^pro-hIL6 융합 단백질의 서열 (아미노산 347개 중 아미노산 162개는 N^pro 부분이고 아미노산 185개는 hIL6 부분임)이 하기 도시되어 있고, hIL6서열은 굵은 글씨체로 인쇄되어 있다.

MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM

융합 단백질은 환원 상태에서 상대 분자량이 39,303.76 d이고, 가능한 절단 이후에는 N^pro 부분 (환원 상태)의 상대 분자량이 18,338.34 d, 그리고 hIL6 부분 ( 환원 상태)이 20,983.63 d이었다. N^pro에는 6개의 시스테인이, hIL6에는 4개의 시스테인이 있다. 이들 시스테인은 박테리아 세포질에서 대부분이 환원된 형태인 듯 하다. 이후 과정동안 아마도 최소한 부분적인 이황화 결합 형성이 있을 것이다. 융합 단백질 (또는 N^pro 부분)의 N-말단 메티오닌은 숙주 고유의 메티오닌 아미노펩티다제 (MAP)에 의해 대부분 절단되어 상대 분자량이 각각의 경우마다 39,172.76 d (융합 단백질) 및 18,207.13 d (N^pro)으로 약 131 d까지 감소할 것으로 예상된다.

N^pro-hIL6 융합 단백질을 발현시키기 위한 에셰리키아 콜라이 숙주 균주는 에셰리키아 콜라이 BL21(DE3)이었다 (실시예 1 참조).

실시예 1에서 기술한 것처럼 상기 기술한 MP6-pET 발현 플라스미드를 BL21(DE3) 내로 형질전환시켜 발현 균주 BL21(DE3)[MP6-pET]를 제조하였다.

BL21(DE3)[MP6-pET] 균주를 단일 콜로니로부터 한천 플레이트 상으로 계대배양하고, 그후 루리아 브로스 + 100 mg/ℓ암피실린이 함유된 예비 배양액 (1 ℓ배플 플라스크에 200 ㎖)으로 접종하는데 사용하였다. 상기 예비 배양액을 250 rpm으로 30℃에서 14시간동안 진탕시키고, 그 동안 OD₆₀₀값이 약 1.0에 다다랐다. 예비 배양액 10 ㎖을 사용하여 주 배양액에 접종하였다 (1 ℓ배플 플라스크마다 루리아 브로스 330 ㎖) (3％ 접종원). OD₆₀₀ 값이 0.8로 증가할 때까지 주 배양액을 30℃ (250 rpm)에서 배양하고, 그후 0.5 또는 1.0 mM IPTG (최종 농도)로 융합 단백질의 생산을 유도하였다. 상기 배양액을 30℃에서 250 rpm으로 3시간동안 추가로 더 배양하 여, OD₆₀₀ 값이 약 1.0 내지 2.0에 이르렀다.

상기 배양액을 살균된 500 ㎖ 원심분리 통에 옮겨 넣고 10,000g에서 30분동안 원심분리시켰다. 원심분리된 상청액을 완전히 버리고 다음 과정까지 침전물을 -80℃에서 냉동시켰다.

완전히 파쇄된 용해물에서 SDS-PAGE 이후 쿠마시 염색을 통해 새로운 단백질 밴드의 출현을 용이하게 검출할 수 있다. BL21(DE3)[MP6-pET]의 용해물에서 나타난 밴드는 외견상 분자량이 약 19 kd, 21 kd 및 40 kd이었다. 상기 발현을 특이적인 항-hIL6 항체로 분석하여 쿠마시 염색 후 얻은 결과를 본질적으로 확증하였다.

N^pro-hIL6 절단을 최적화하기 위해, 다양한 온도 및 IPTG 농도에서 유도를 수행하고, 염색 겔 및 웨스턴 블롯 둘 다에 의해서 다시 분석하였다. 22℃의 배양 온도에서 N^pro-IL6가 거의 완전히 절단되는 것을 관찰하였다.

상기 실험은 박테리아 발현 시스템에서 이종 단백질이 N^pro의 C-말단에 융합될 수 있으며, 매우 효율적인 절단이 일어남을 보여주었다. 뒤이은 단백질의 N-말단 아미노산에서의 변화 (세린 위치의 알라닌)는 부작용을 나타내지 않았다. 따라서, 본 발명에 따라 상기 시스템은 균질하며 진정한 N-말단을 가진 재조합 단백질을, 특히 박테리아 발현 시스템과 같은 이종 발현 시스템 내에서 추가의 진행 과정 없이 생산하는데 적합하다.

실시예 3: N^pro 및 인간 인터페론 α2B(IFNα2B)의 융합 단백질 발현 및 생체 내 절단에 의한 균질한 성숙 IFNα2B의 생산

IFNα2B를 클로닝하여 NPI-pET 벡터를 생산하는 방법은 실시예 2에서 hIL6에 대해 기술한 방법과 일치한다. 고정밀 PCR (예를 들어, 로슈 바이오케미칼스의 Pwo 시스템, 공급업자가 지시한 바에 따라 수행)로 구성 유전자를 증폭시켰다. 사용된 템플레이트는 당업자에게 공지된 표준 방법에 의해 인간 백혈구에서 생산 가능한 IFNα2B-cDNA 클론이었다. 별법으로 상기 유전자의 전합성을 수행하는 것도 가능하다. 상기 구성 유전자의 서열은 젠뱅크 (Genbank) 데이터베이스를 통해 승인번호 V00548호의 전자 서식으로 얻었다. 증폭을 위해 하기 올리고뉴클레오티드가 사용되었다.

올리고뉴클레오티드 1 ("N-말단"):

5´- ATAATTACTA GTTGTTGTGA TCTGCCTCAA ACCCACAGCC -3´

올리고뉴클레오티드 2 ("C-말단"):

5´- ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTATTCCTTA CTTCTTAAAC TTTCTTGCAA G -3´

IFNα2B의 구성 유전자를 가진 PRC 단편의 서열 (533 bp)이 하기에 도시되어 있다. 제한 효소 절단 부위는 밑줄이 그어져 있고, IFNα2B의 첫 번째 코돈 (Cys) 및 정지 코돈은 굵은 글씨체로 인쇄되어 있다.

ATAATTACTAGTTGTTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGA AGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATAATAACTCGAGGATCCAATTAT

N^pro-pET11a 플라스미드에 리게이션시켜 생성된 구조물을 NPI-pET로 명명하였다.

NPI-pET 상에 코딩된 N^pro-IFNα2B 융합 단백질의 서열 (아미노산 327개, 162개는 N^pro, 165개는 IFNα2B)이 하기 도시되어 있고, IFNα2B 서열은 굵은 글씨체로 인쇄되어 있다 (N-말단에서 C-말단의 방향으로 도시함).

MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE

융합 단백질은 환원 상태에서 상대 분자량이 37,591.44 d이고, 가능한 절단 후 N^pro 부분 (환원 상태)의 상대 분자량은 18,338.34 d이며 IFNα2B 부분 (환원 상태)은 19,271.09 d이다. N^pro에는 6개의 시스테인이, IFNα2B에는 4개의 시스테인이 있다. 이들 시스테인은 박테리아 세포질에서 대부분이 환원된 형태인 듯 하다. 이후 과정동안 아마도 최소한 부분적인 이황화 결합 형성이 있을 것이다. 융합 단 백질 (또는 N^pro 부분)의 N-말단 메티오닌은 숙주 고유의 메티오닌 아미노펩티다제 (MAP)에 의해 대부분 절단되어 상대 분자량이 각각의 경우마다 37,460.23 d (융합 단백질) 및 18,207.13 d (N^pro)으로 약 131 d까지 감소할 것으로 예상된다.

N^pro-IFNα2B 융합 단백질을 발현시키기 위한 에셰리키아 콜라이 숙주 균주는 에셰리키아 콜라이 BL21(DE3)이었다 (실시예 1 참조).

실시예 1에서 기술한 것처럼 상기 기술한 NPI-pET 발현 플라스미드를 BL21(DE3) 내로 형질전환시켜 발현 균주 BL21(DE3)[NPI-pET]를 제조하였다.

BL21(DE3)[NPI-pET] 균주를 단일 콜로니로부터 한천 플레이트 상으로 계대배양하고, 그후 루리아 브로스 + 100 mg/ℓ암피실린이 함유된 예비 배양액 (1 ℓ배플 플라스크에 200 ㎖)으로 접종하는데 사용하였다. 상기 예비 배양액을 250 rpm으로 30℃에서 14시간동안 진탕시키고, 그 동안 OD₆₀₀값이 약 1.0에 다다랐다. 예비 배양액 10 ㎖을 사용하여 주 배양액에 접종하였다 (1 ℓ배플 플라스크마다 루리아 브로스 330 ㎖) (3％ 접종원). OD₆₀₀ 값이 0.8로 증가할 때까지 주 배양액을 30℃ (250 rpm)에서 배양하고, 그 후 0.5 또는 1.0 mM IPTG (최종 농도)로 융합 단백질의 생산을 유도하였다. 상기 배양액을 30℃에서 250 rpm으로 3시간동안 추가로 더 배양하여, OD₆₀₀ 값이 약 1.0 내지 2.0에 이르렀다.

완전히 파쇄된 용해물에서 SDS-PAGE 이후 쿠마시 염색을 통해 새로운 단백질 밴드의 출현을 용이하게 검출할 수 있다. BL21(DE3)[MP6-pET]의 용해물에서 나타난 밴드는 분자량이 약 38 kd 및 19 kd이었다. SDS-PAGE에 의해서는 IFNα2B 밴드와 N^pro 밴드가 분리될 수 없었다.

상기 시료를 특이적인 항-IFNα2B 항체로 분석하여 절단된 IFNα2B 밴드의 존재를 확증하였다.

N^pro-IFNα2B 절단을 최적화하기 위해, 역시 이 경우에서도 다양한 온도 및 IPTG 농도에서 유도를 수행하고, 염색 겔 및 웨스턴 블롯 둘 다에 의해서 다시 분석하였다. 이 경우에서도 낮은 온도 (22 내지 30℃)에서 최적화된 절단이 일어나는 것을 발견하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Biochemie Gesellschaft m.b.H. <120> Production of proteins <130> G-31109/A/BCK <140> PCT/EP00/07642 <141> 2000-08-07 <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 168 <212> PRT <213> Pestivirus sp. <400> 1 Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30 Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45 His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60 Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80 Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95 Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gln Phe Cys 100 105 110 Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125 Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 130 135 140 Lys Arg Gly Thr Pro Arg Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn 145 150 155 160 Cys Pro Leu Trp Val Thr Ser Cys 165 <210> 2 <211> 168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligo-histidine purification aid combined with sequence of Pestivirus <400> 2 Met Ala Ser His His His His His His His Pro Val Gly Val Glu Glu 1 5 10 15 Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu Phe Gly Asn Pro Ser Glu 20 25 30 Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro His Asp Arg Gly Arg Gly 35 40 45 Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro Arg Lys Gly Asp Cys Arg 50 55 60 Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly Ile Tyr Ile Lys Pro Gly 65 70 75 80 Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro Val Tyr His Arg Ala Pro 85 90 95 Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gln Phe Cys Glu Val Thr Lys Arg Ile 100 105 110 Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu Tyr His Ile Tyr Val Cys 115 120 125 Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala Lys Arg Gly Thr Pro Arg 130 135 140 Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn Cys Pro Leu Trp Val Thr 145 150 155 160 Ser Cys Ser Asp Asp Gly Ala Ser 165 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Pestivirus sp. <400> 3 Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gln Lys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligo-histidine purification aid <400> 4 Met Ala Ser His His His His His His His 1 5 10 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 5 ataattacta gttgtgctcc agtacctcca ggtgaag 37 <210> 6 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 6 ataattggat cctcgagtta ttacatttgc cgaagagccc tcaggc 46 <210> 7 <211> 593 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ataattacta gttgtgctcc agtacctcca ggtgaagatt ctaaagatgt agccgcccca 60 cacagacagc cactcacctc ttcagaacga attgacaaac aaattcggta catcctcgac 120 ggcatctcag ccctgagaaa ggagacatgt aacaagagta acatgtgtga aagcagcaaa 180 gaggcactgg cagaaaacaa cctgaacctt ccaaagatgg ctgaaaaaga tggatgcttc 240 caatctggat tcaatgagga gacttgcctg gtaaaaatca tcactggtct tttggagttt 300 gaggtatacc tagagtacct ccagaacaga tttgagagta gtgaggaaca agccagagct 360 gtgcagatga gtacaaaagt cctgatccag ttcctgcaga aaaaggcaaa gaatctagat 420 gcaataacca cccctgaccc aaccacaaat gccagcctgc tgacgaagct gcaggcacag 480 aaccagtggc tgcaggacat gacaactcat ctcattctgc gcagctttaa ggagttcctg 540 cagtccagcc tgagggctct tcggcaaatg taataactcg aggatccaat tat 593 <210> 8 <211> 347 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligo-histidine purification aid combined with sequences of Pestivirus and Homo sapiens <400> 8 Met Ala Ser His His His His His His His Pro Val Gly Val Glu Glu 1 5 10 15 Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu Phe Gly Asn Pro Ser Glu 20 25 30 Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro His Asp Arg Gly Arg Gly 35 40 45 Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro Arg Lys Gly Asp Cys Arg 50 55 60 Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly Ile Tyr Ile Lys Pro Gly 65 70 75 80 Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro Val Tyr His Arg Ala Pro 85 90 95 Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gln Phe Cys Glu Val Thr Lys Arg Ile 100 105 110 Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu Tyr His Ile Tyr Val Cys 115 120 125 Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala Lys Arg Gly Thr Pro Arg 130 135 140 Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn Cys Pro Leu Trp Val Thr 145 150 155 160 Ser Cys Ala Pro Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala 165 170 175 Pro His Arg Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile 180 185 190 Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn 195 200 205 Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn 210 215 220 Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly 225 230 235 240 Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu 245 250 255 Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu 260 265 270 Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe 275 280 285 Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro 290 295 300 Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp 305 310 315 320 Leu Gln Asp Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe 325 330 335 Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met 340 345 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 9 ataattacta gttgttgtga tctgcctcaa acccacagcc 40 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 10 ataattggat cctcgagtta ttattcctta cttcttaaac tttcttgcaa g 51 <210> 11 <211> 533 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ataattacta gttgttgtga tctgcctcaa acccacagcc tgggtagcag gaggaccttg 60 atgctcctgg cacagatgag gagaatctct cttttctcct gcttgaagga cagacatgac 120 tttggatttc cccaggagga gtttggcaac cagttccaaa aggctgaaac catccctgtc 180 ctccatgaga tgatccagca gatcttcaat ctcttcagca caaaggactc atctgctgct 240 tgggatgaga ccctcctaga caaattctac actgaactct accagcagct gaatgacctg 300 gaagcctgtg tgatacaggg ggtgggggtg acagagactc ccctgatgaa ggaggactcc 360 attctggctg tgaggaaata cttccaaaga atcactctct atctgaaaga gaagaaatac 420 agcccttgtg cctgggaggt tgtcagagca gaaatcatga gatctttttc tttgtcaaca 480 aacttgcaag aaagtttaag aagtaaggaa taataactcg aggatccaat tat 533 <210> 12 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligo-histidine purification aid combined with sequences of Pestivirus and Homo sapiens <400> 12 Met Ala Ser His His His His His His His Pro Val Gly Val Glu Glu 1 5 10 15 Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu Phe Gly Asn Pro Ser Glu 20 25 30 Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro His Asp Arg Gly Arg Gly 35 40 45 Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro Arg Lys Gly Asp Cys Arg 50 55 60 Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly Ile Tyr Ile Lys Pro Gly 65 70 75 80 Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro Val Tyr His Arg Ala Pro 85 90 95 Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gln Phe Cys Glu Val Thr Lys Arg Ile 100 105 110 Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu Tyr His Ile Tyr Val Cys 115 120 125 Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala Lys Arg Gly Thr Pro Arg 130 135 140 Thr Leu Lys Trp Ile Arg Asn Phe Thr Asn Cys Pro Leu Trp Val Thr 145 150 155 160 Ser Cys Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr 165 170 175 Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu 180 185 190 Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln 195 200 205 Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln 210 215 220 Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu 225 230 235 240 Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp 245 250 255 Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu 260 265 270 Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile 275 280 285 Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val 290 295 300 Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln 305 310 315 320 Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu 325

Claims

페스티바이러스의 자가 단백질 분해효소 N^pro의 자가 단백질 분해 기능이 있는 첫 번째 폴리펩티드, 및 이 첫 번째 폴리펩티드의 자가 단백질 분해성 활성에 의해 융합 단백질로부터 절단될 수 있도록 첫 번째 폴리펩티드 C-말단에서 첫 번째 폴리펩티드와 연결된 이종 폴리펩티드인 두번째 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
제1항에 있어서, 상기 페스티바이러스는 돼지 콜레라 바이러스 (CSFV), 국경병 바이러스 (BDV) 및 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV)의 군으로부터 선택된 것인 핵산 분자.
제2항에 있어서, 상기 페스티바이러스는 CSFV인 핵산 분자.
제3항에 있어서, 첫 번째 폴리펩티드가 하기 아미노산 서열 또는 자가 단백질 분해 활성을 가진 그의 유도체의 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168)
제3항에 있어서, 첫 번째 폴리펩티드는 CSFV의 자가 단백질 분해효소 N^pro 또는 자가 단백질 분해 활성을 지닌 그의 유도체의 Glu22 내지 Cys168 아미노산 서열을 포함하고 추가로 N-말단에 Met를 가지며, 이종 폴리펩티드는 CSFV의 자가 단백질 분해효소 N^pro의 Cys168 아미노산에 직접적으로 연결되어 있는 것인 핵산 분자.
제3항에 있어서, 첫 번째 폴리펩티드는 CSFV의 자가 단백질 분해효소 N^pro 또는 자가 단백질 분해 활성을 지닌 그의 유도체의 Pro17 내지 Cys168 아미노산 서열을 포함하고 추가로 N-말단에 Met를 가지며, 이종 폴리펩티드는 CSFV의 자가 단백질 분해효소 N^pro의 Cys168 아미노산에 직접적으로 연결되어 있는 것인 핵산 분자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 DNA 분자인 핵산 분자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 및 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함하며, 미리 정해진 박테리아 숙주 세포에 적합한 발현 벡터.
제8항에 있어서, 상기 박테리아 숙주 세포가 이. 콜라이 (E. coli) 세포인 발현 벡터.
제8항에 있어서, 상기 발현 벡터가 플라스미드인 발현 벡터.
제8항에 따른 벡터를 포함하는 박테리아 숙주 세포.
제11항에 있어서, 상기 숙주 세포가 이. 콜라이 세포인 박테리아 숙주 세포.
(i) 제11항 또는 제12항에 따른 박테리아 숙주 세포를, 융합 단백질이 발현되며, 숙주 세포 내에서 첫 번째 폴리펩티드의 자가 단백질 분해 활성에 의해 상기 융합 단백질로부터 이종 폴리펩티드의 자가 단백질 분해성 절단이 일어나는 조건 하에서 배양하는 단계, 및

(ii) 절단된 이종 폴리펩티드를 단리하는 단계

를 포함하는 목적 이종 폴리펩티드의 생산 방법.