CZ303341B6 - Molekula nukleové kyseliny kódující fúzní protein, který obsahuje polypeptid s autoproteolytickou aktivitou - Google Patents

Abstract

Rešení se týká molekuly nukleové kyseliny kódující fúzní protein, který obsahuje první polypeptid, který má autoproteolytickou funkci autoproteázy N.sup.pro .n.z pestiviru, a druhý polypeptid, který je navázán na první polypeptid na C-konci prvního polypeptidu takovým zpusobem, že druhý polypeptid muže být vyštepen z fúzního proteinu autopoteolytickou aktivitou prvního polypeptidu, pricemž druhý polypeptid je heterologní polypeptid. Dále se vynález týká zpusobu produkce požadovaného heterologního polypeptidu s jasne definovaným homogenním N-koncem v bakteriálních hostitelských bunkách.

Description

Molekula nukleové kyseliny kódující fúzní protein, který obsahuje polypeptid s autoproteolytickou aktivitou

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu výroby požadovaného heterologního polypeptídu sjasně definovaným homogenním N-koncem v bakteriální hostitelské buňce, přičemž požadovaný heterologní polypeptid autoproteolyticky vyštěpen autoproteolytickou aktivitou N^pro z původně exprimovaného fúzního proteinu, který obsahuje peptid s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy N^pro pestiviru a heterologní polypeptid.

Dosavadní stav techniky

Při přípravě rekombinantních proteinů v heterologních organismech jak např. při expresi humánních nebo jiných eukaryotických proteinů v bakteriálních buňkách je často obtížné získat jasně definovaný N-konec, který by byl pokud možno 100% homogenní. Až se týká především rekombinantních farmaceutických proteinů, jejichž aminokyselinová sekvence by v mnoha případech měla být shodná s aminokyselinovou sekvencí proteinů přirozeně se vyskytujících u člověka/zvířete.

Při normální, přirozené expresi, např. u člověka, mnohé farmaceutické proteiny, které se užívají, jsou transportovány do extracelulámího prostoru, přičemž štěpení signální sekvence přítomné v prekurzorovém proteinu právě pro tento účel vede ke vzniku jasně definovaného N-konce. Takový homogenní N-konec není vždy snadné připravit, např. při expresi v bakteriálních buňkách, a až z několika důvodů.

Jen ve výjimečných případech je možný export do bakteriálního periplazmatického prostoru pomocí eukaryotické nebo prokaryotické signální sekvence, protože se zde může akumulovat jen velmi malé množství produktu z důvodu nízké transportní kapacity bakteriálního exportního mechanismu.

Bakteriální cytoplazma se výrazně liší od extracelulámího prostoru eukaryot. Na jedné straně jsou zde redukující podmínky, na druhé straně zde není žádný mechanismus pro odštěpení Nkoncové vedoucí („leader“) sekvence z maturovaného (zralého) proteinu. Syntéza všech cytoplazmatických proteinů začíná methioninem, který je kódován příslušným iniciačním (startovním) kodonem (ATG = iniciace translace). Tento N-koncový methionin je u mnoha proteinů zachován, zatímco u jiných je odštěpen methioninaminopeptidázou (MAP), která je přítomna v cytoplazmě a je vlastní hostiteli. Účinnost štěpení závisí v podstatě na dvou parametrech:

1. Povaha následující aminokyseliny a

2. Lokalizace N-konce v trojrozměrné struktuře proteinu.

N-koncový methionin je přednostně odstraněn, když následující aminokyselinou je serin, alanin, glycin, methionin nebo valin a když N-konec je exponován, tzn. když není „ukryt“ uvnitř proteinu. Na druhé straně, když je následující aminokyselina jiná, především nabitá aminokyselina (kyselina glutamová, kyselina asparagová, lysin, arginin), nebo když je N-konec lokalizován uvnitř proteinu, ve většině případů k odštěpení N-koncového methioninu nedojde (Knippers,

Rolf (1995) Molekulare Genetik, 6^,h edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. ISBN 3-13-103916-7).

Dokonce i když aminoskupina podporující štěpení je přítomna v poloze 2, štěpení je zřídkakdy úplné. Obvykle významné množství (1 až 50%) zůstane neovlivněno MAP.

V časných dobách produkce rekombinantních farmaceutických proteinů v bakteriálních buňkách se jednoduše vkládal methionin-kódující ATG startovní kodon před otevřený čtecí rámec (ORF) pro maturovaný protein (tj. bez signální sekvence nebo jiných extenzí N-konce). Exprimovaný protein pak měl sekvenci „H₂N-Met-cílový protein“. Pouze v několika případech bylo možné dosáhnout úplného odštěpené N-koncového methioninu MAP hostitele. Většina proteinů připravovaných tímto způsobem byla tudíž buďto nehomogenní na svém N-konci (jednalo se o směs Met-formy a formy bez Met) nebo měly všechny molekuly dodatečnou cizorodou aminokyselinu (Met) na svém N-konci (pouze Met-forma).

Tato nehomogenita nebo odchylka od přírodní sekvence je však v mnoha případech nepřijatelná, neboť takové produkty často vykazují odlišné imunologické (např. indukce protilátek) a farmakologické vlastnosti (biologický poločas, farmakokinetika). Z těchto důvodů je nyní nutné produkovat většinou přírodně identické produkty (homogenní a bez cizorodé aminokyseliny na N-konci).

V případě cytoplazmatické exprese je nápravou zpravidla fúze štěpné sekvence („leader“ sekvence) pro specifickou endopeptidázu (např. Faktor Xa, enterokináza, KEX endopeptidázy, IgA proteáza) nebo aminopeptidázu (např. dipeptidylaminopeptidáza) na N-konec cílového proteinu. Avšak až představuje další krok a vynaložení dalších nákladů a materiálu při následném (tzv. downstream) zpracování produktu.

Takže existuje stálá potřeba nových způsobů přípravy cílového proteinu v bakteriálních buňkách, kdy by byl cílový protein s požadovaným uniformním N-koncem bez potřeby dalších in vitro kroků (nové svinutí, purifikace, Štěpení proteázou, nová purifikace atd.). Právě takový způsob využívající virové autoproteázy N^pro z pestiviru je předmětem předkládaného vynálezu.

Pešti viry tvoří skupinu patogenů, které způsobují značné ekonomické ztráty v chovech prasat a přežvýkavců po celém světě. Zvláště významným patogenem je klasický virus horečky prasat (CSFV, „Clasical swine fever virus“), který způsobuje přenosné onemocnění a podléhá tudíž ohlašovací povinnosti. Ztráty způsobené virem průjmu hovězího dobytka (BVDV, „bovine viral diarrhoea virus“) jsou také značné, zejména z důvodu pravidelného výskytu intrauterinní infekce plodů.

Pestiviry jsou malé obalové viry, jejichž genom velikosti 12,3 kb působí přímo jako mRNA, ze které jsou v cytoplazmě transkribovány virové produkty. K tomu dochází ve formě jediného polyproteinu, který obsahuje přibližně 4000 aminokyselin a který je naštěpen virovým a buněčnými proteázami na 12 zralých proteinů.

Do nynějška byly identifikovány dvě virově kódované proteázy u pestivirů, a sice autoproteáza N^l)™ a serinová proteáza NS3. N-koncová proteáza N^pr0 je lokalizována na N-konci polyproteinu a má zjevnou molekulovou hmotnost 23000 (D). Katalyzuje štěpení, ke kterému dochází mezi jejím vlastním C-koncem (Cys 168) a N-koncem (Serl69) nukleokapsidového proteinu C (R. Stark et al., J. Virol. 67 (1993), 7088-7095), Navíc duplikace genu N^pr0 byly popsány u cytopatogenních virů BVDV. V nich je druhá kopie N^pro na N-konci podobně duplikované NS3 proteázy. Autoproteolytické štěpení proteinu N^pr°-NS3 bylo pozorováno i v tomto případě (R. Stark et ak, viz výše).

N^pro je autoproteáza délky 168 aminokyselin (aa) a zjevnou M_r 20,000 (D) (in vivo). Je prvním proteinem v polyproteinu pestivirů (jako je např. CSFV, BVDV nebo BDV („border disease virus“)) a podléhá autoproteolytickému odštěpení od následujícího nukleokapsidového proteinu C (M. Wiskerchen et al., J. Virol. 65 (1991), 4508-4514; Stark et al., J. Virol. 67 (1993), 70887095). Toto štěpení se uskutečňuje za poslední aminokyselinou sekvence N^pro, tj. Cys 168.

-2CZ 303341 B6

Podstata vynálezu

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že autoproteolytická funkce autoproteázy N^pro pestiviru je zachována v bakteriálním expresním systému, především při expresi heterologních proteinů. Předkládaný vynález se tudíž týká způsobu výroby požadovaného heterologního polypeptidu s jasně definovaným N-koncem v bakteriální hostitelské buňce, přičemž požadovaný heterologní polypeptid je autoproteolytickou aktivitou N^pro odštěpen z na počátku exprimovaného fúzního proteinu, který obsahuje peptid s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy N^pro pestiviru a heterologní polypeptid. Předkládaný vynález se dále týká prostředků klonování, které se užívají při způsobech podle vynálezu.

Polypeptid s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy N^pr° pestiviru nebo polypeptid s autoproteolytickou funkcí autoproteázy N^pro pestiviru je především autoproteáza N^pr0 pestiviru, nebo její derivát autoproteolytickou aktivitou.

V předkládaném vynálezu termín „heterologní polypeptid“ znamená polypeptid, který není v přírodě odštěpován autoproteázou N^pro pestiviru z přírodě se vyskytujícího fúzního proteinu nebo polyproteinu. K příkladům heterologních polypeptidu patří průmyslové enzymy nebo polypeptidy s farmaceutickou aktivitou, především farmaceutickou aktivitou u člověka.

K příkladům výhodných polypeptidu s humánní farmaceutickou aktivitou patří cytokiny jako jsou interleukiny, např. IL-6, interferony jako jsou leukocytámí interferony, např. interferon a2B, růstové faktory, především růstové faktory účastnící se hematopoezy hojení poranění, jako jsou např. G-CSF, erythropoetin nebo IGF, hormony jako je např. humánní růstový hormon (hGH), protilátky anebo vakcíny.

Jeden aspekt předkládaného vynálezu se týká molekuly nukleové kyseliny, která kóduje fúzní protein, přičemž tento fúzní protein obsahuje první polypeptid, který má autoproteolytickou funkci autoproteázy N^pro pestiviru, a druhý polypeptid, který je spojen s prvním polypeptidem na Ckonci prvního polypeptidu takovým způsobem, že druhý polypeptid může být odštěpen z fúzního proteinu autoproteolytickou aktivitou prvního polypeptidu, a přitom druhý polypeptid je heterologní polypeptid.

Pestivirus je pro účely vynálezu výhodně vybrán ze skupiny obsahuj CSFV, BDV a BVDV, zvláště výhodný je CSFV.

Výhodná molekula nukleové kyseliny podle vynálezu je taková molekula, kde první polypeptid fúzního proteinu obsahuje následující aminokyselinovou sekvenci autoproteázy N^pr0 z CSFV (viz také sekvence s přístupovým číslem X87939 v databázi EMBL) (aminokyseliny 1 až 168, čtení ve směru od N-konce do C-konce) (1) -MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTT LRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVT GSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC- (168) , nebo aminokyselinovou sekvenci jejího derivátu, který má autoproteolytickou aktivitu.

Deriváty s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy N^pro pestiviru jsou autoproteázy N^pro připravené mutagenezí, především užitím substitucí, delecí, adicí a/nebo inzercí aminokyselin, pokud je uchována požadovaná autoproteolytická aktivita, především pro vytváření požadovaných proteinů s homogenním N-koncem. Způsoby přípravy takových derivátů mutagenezí jsou odborníkům známy. Takovými mutacemi je možné optimalizovat aktivitu autoproteázy N^pro,

-3CZ 303341 B6 např. ve vztahu k různým heterologním proteinům, které mají být štěpeny. Po přípravě nukleové kyseliny, která kóduje fúzní protein, který kromě požadovaného heterologního proteinu obsahuje derivát autoproteázy N^pro vykazující jednu nebo více mutací vzhledem k přírodně se vyskytující autoproteáza N^⁰, se určí, zda je požadovaná funkce přítomna stanovením autoproteolytické aktivity v expresním systému.

Autoproteolytická aktivita může být na počátku např. detekována v systému in vitro. Pro tento účel je DNA konstrukt transkribován do RNA a pak translatován do proteinu pomocí soupravy pro in vitro translaci. Pro zvýšení citlivosti může být v některých případech výsledný protein označen inkorporací radioaktivních aminokyselin. Výsledný fúzní protein „N^pro-cílový protein“ je podroben kotranslačnímu a/nebo post-translačnímu autokatalytickému štěpení, kdy dojde k přesnému odštěpení N-koncového N^pro úseku od zbytku proteinu jeho vlastní autoproteolytickou aktivitou. Výsledné produkty štěpení lze snadno detekovat a směs může být snadno z pracována ihned po ukončení in vitro translace. Směs se nanese na gel pro analýzu proteinů (SDSPAGE podle LMmmliho) a podrobí se elektroforéze. Pak se gel obarví vhodnými barvivý nebo se provede autoradiografie. Analýza užitím Western přenosu („Western blot“) s následným imunobarvením je také možná. Účinnost štěpení fúzního proteinu může být vyhodnocena na základě intenzity výsledných proteinových pásů,

V dalším kroku fragment nukleové kyseliny pro fúzní protein může být klonován do bakteriálního expresního vektoru (pokud to nebylo provedeno již kvůli in vitro translaci) a ten je pak transformací vnesen do vhodného hostitele (např. E. coži). Vzniklý expresní kmen exprimuje fúzní protein buďto konstitutivně nebo po přidání induktoru. V případě užití induktoru je třeba hostitele po přidání induktoru dále kultivovat 1 až více hodin, aby bylo dosaženo dostatečného titru produktu. N^pro autoproteáza pak sama štěpí ko- nebo post-translačně fúzní protein, takže výsledné fragmenty jsou samotná N^pro autoproteáza a samotný cílový protein s definovaným N-koncem. Pro stanovení účinnosti štěpené reakce je na konci kultivace nebo indukční fáze odebrán vzorek a analyzován SDS-PAGE, jak bylo popsáno výše.

Výhodný derivát autoproteázy N^pro popisovaného fúzního proteinu má např. N-koncový úsek, kde byla jedna nebo několik aminokyselin deletováno nebo substituováno v úsek aminokyselin 2 až 21, pokud vzniklý derivát nadále vykazuje autoproteolytickou funkci autoproteázy N^pro v požadovaném rozsahu.

Výhodný derivát autoproteázy N^pro ve fúzním proteinu obsahuje např. aminokyselinovou sekvenci autoproteázy N^pro z CSFV s delecí aminokyselin 2 až 16 nebo 2 až 21, Je také možné prostřednictvím substituce nebo adice aminokyselin z měnit nebo vložit aminokyselinovou sekvenci, např. se vnese aminokyselinová sekvence, která usnadňuje purifíkaci (viz příklady).

Zvláště výhodná molekula nukleové kyseliny podle vynálezu je taková, kde první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci Glu22 až Cysl68 autoproteázy N^pro z CSFV nebo její derivát s autoproteolyrickou aktivitou, přičemž první polypeptid dále má Met jakožto N-konec a heterologní polypeptid je napojen přímo na aminokyselinu Cysl68 autoproteázy N^pro z CSFV.

Podobně výhodná molekula nukleové kyseliny podle vynálezu je taková, kde první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci Prol7 až Cysl68 autoproteázy N^pro z CSFV nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou, přičemž první polypeptid dále má Met jakožto N-konec a heterologní polypeptid je napojen přímo na aminokyselinu Cysl68 autoproteázy N^pro z CSFV. Molekula nukleové kyseliny podle vynálezu je především ve formě molekuly DNA.

Předkládaný vynález se dále týká klonovacích elementů, především expresních vektorů a hostitelských buněk, které obsahují molekulu nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu. Vynález se dále týká expresního vektoru, který je kompatibilní s předem definovanou bakteriální hostitelskou buňkou, a který obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu a alespoň jed-4CZ 303341 B6 nu sekvencí pro kontrolu exprese. Sekvence pro kontrolu exprese jsou především promotory (např. lac, tac, T3, T7, trp, gac, vhb, lambda pL nebo phoA), vazebná místa ribozomů (např. přirozená vazebná místa ribozomů patřící kvýše zmíněným promotorům, cro nebo syntetická vazebná místa ribozomů), nebo terminátory transkripce (např. rmB T1T2 nebo bia). Hostitelské buňky jsou výhodně bakteriální buňky rodu Escherichia, především £. coli. Avšak mohou být užity i jiné bakteriální buňky. Ve výhodném provedení vynálezu je expresním vektorem podle vynálezu plazmid.

Předkládaný vynález se dále týká bakteriální hostitelské buňky, která obsahuje expresní vektor podle vynálezu. Takové bakteriální hostitelské buňky mohou být vybrány ze skupiny obsahující následující mikroorganismy: Gran-negativní baktérie rodu Escherichia. např. E. coli, nebo jiné Gram-negativní baktérie, např. Pseudomonas sp., jako je např, Pseudomonas aeruginosa, nebo Caulobacter sp., jako je např. Caulobacter crescentus, nebo Gram-pozitivní baktérie jako jsou baktérie rodu Bacillus sp., především Bacillus subtilis. Zvláště výhodné hostitelské buňky jsou

E. coli.

Předkládaný vynález se dále týká způsobu výroby požadovaného heterologního polypeptidu, který obsahuje kroky:

(i) kultivace bakteriálních hostitelských buněk podle vynálezu, které obsahují expresní vektor podle vynálezu, který obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu, přičemž kultivace probíhá v podmínkách, které způsobí expresi fuzního proteinu a dále autoproteolytické odštěpení heterologního polypeptidu z fúzního proteinu v hostitelské buňce autoproteolytickou aktivitou prvního polypeptidu, a (ii) izolace odštěpeného heterologního polypeptidu.

Způsob podle vynálezu se provádí v principu počáteční kultivací bakteriálních hostitelských buněk, tj. expresního kmenu těchto buněk, obvyklým mikrobiologickým způsobem, který je odborníkovi znám. Kmen je kultivován z jedné výchozí kolonie na živném médiu, ale je také možné jako výchozího materiálu užít kryoprezervovanou suspenzi buněk (buněčné banky). Kmen se obecně kultivuje v několika stupňovém procesu, aby byla získána dostatečná biomasa pro další zpracování.

V malém měřítku probíhá kultivace v protřepávaných kultivačních lahvích, ve většině případů je možné užít úplné médium (např. LB živné médium). Avšak může se užít také specificky defino35 váné médium (např. citrátové médium). Pro kultivaci se připraví maloobjemová prekultura hostitelského kmenu (inokulovaná jedinou kolonií nebo kryoprezervovanou buněčnou suspenzí), teplota při této kultivaci obvykle není kritická pro pozdější výsledky exprese, takže se rutinně provádí při vyšších teplotách (např, 30 °C nebo 37 °C). Hlavní kultura se nasadí ve větším (např. 500 ml), kde je především nutné zajistit dobré provzdušnění (velký objem kultivační lahve proti objemu obsahu, vysoká rychlost rotace). Vzhledem k úmyslu dosáhnout exprese v rozpustné formě, hlavní kultura se ve většině případů provádí při poněkud nižších teplotách (např. 22 nebo 28 °C). Jak índukovatelné systémy (např. s promotory trp, lac, tac nebo phoA) tak konstitutivní systémy jsou vhodné pro produkci rozpustných proteinů. Po té, co bylo dosaženo pozdní logaritmické fáze (obvykle při optické hustotě 0,5 až 1,0 v třepaných lahvích) se v indukovatelných systémech přidá induktor (např. indolylakrylová kyselina, isopropyl-p-D-thiogalaktopyranosid = IPTG) a inkubace pokračuje dále 1 až 5 hodin. Koncentrace induktoru se v takovém případě volí na spodní hranici, aby se dosáhlo mírné exprese. V průběhu této doby se vytvoří většina fúzního proteinu „N^pr°-cílový protein“ přičemž současné dojde ke ko- nebo post-translačnímu odštěpení úseku N^pro, takže na konci kultivace v kultivačním systému existují dva odštěpené úseky samostatně. Buňky je možné sklidit a dále zpracovat.

Ve velkém měřítku vícestupňový kultivační proces probíhá v řadě bioreaktorů (fermentorů), přičemž je výhodné užít definovaná živná média, aby bylo možné zlepšit ovládání a kontrolu procesu. Kromě toho je možné významně zvýšit nárůst biomasy a tvorbu produktu dávkováním určitých živin („krmná dávka“). Jinak je proces analogický procesu v malém měřítku v třepaných

-5CZ 303341 B6 lahvích. Tak např. se užije fermentor pro předběžnou fázi a fermentor pro hlavní fázi a zvolí se kultivační teploty shodné s teplotami při kultivaci v lahvích. Fermentor pro předběžnou fázi je inokulován inokulem, které se vypěstuje z jediné kolonie nebo z kryokultury v kultivační lahvic. Ve fermentoru je také třeba zajistit dobré provzdušňování a přítomnost dostatečné koncentrace induktoru, zejména pak v hlavní fázi. Indukční fáze však musí být někdy jinak dlouhá než indukce v kultivační lahvi. Výsledné buňky se pak užijí pro další zpracování.

Heterologní cílový protein, který byl odštěpen z fúzního proteinu, může být izolován metodami purifikace proteinů, které jsou odborníkům známy (viz např. Μ. P. Deutscher, in: Methods in io Enzymology: Guide to Protein Purification, Academie Press lne., (1990), 309-392). Postup purifíkace obvykle obsahuje kroky rozrušení buněk, pročištění média (centrifugací nebo mikrofiltrací) a pak různé kroky chromatografie, filtrace a precipitace.

Následující příklady slouží k ilustraci a předkládaného vynálezu, aniž by jakkoliv omezovaly jeho rozsah.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Exprese a in vivo štěpení fúzního proteinu N^pr0-C v bakteriálním hostiteli

Plazmid NPC-pET byl konstruován pro expresi N^pro-C fúzního proteinu v bakteriálním hostiteli. Použitý expresní vektor byl vektor pETl la (F. W. Studier et al., Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-89). Přírodní strukturní gen (z RNA genomu CSFV) pro N^pro-C fúzní protein byl klonován do tohoto expresního vektoru. Strukturní gen pro ťuzní protein byl připraven PCR amplifikaci z virového genomu, který byl transkribován do cDNA (a klonován do vektoru). Navíc prvních 16 ami30 nokyselin přírodní N^pro-sekvence (MELNHFELLYKTSKQK) bylo nahrazeno 10 aminokyselin dlouhým oligo-histidinovým úsekem napomáhajícím purifikaci (MASHHHHHHH). Výsledný konstrukt byl označen NPC-pET. Sekvence úseku N^pro a autoproteolytické štěpné místo fúzního proteinu N^pro-C kódované NPC-pET mají následující strukturu, kde štěpné místo je lokalizováno mezi aminokyselinami Cysl68 a Ser(169):

MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDC RSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIY VCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC(168)S (169)DDGAS(nukleokapaidový protein C)

V této sekvenci je prolin 17 (poloha 2 fúzního proteinu) z přírodní N^pro sekvence označena kurzívou, a začátek C sekvence je označen tučně. Fúzní protein má M_r přibližně 32000 (D), kde po autoproteolytickém štěpení úsek N^pro odpovídá asi 18000 (D) a úsek C odpovídá asi 14000 (D).

Aby bylo možné zhodnotit význam první aminokyseliny C-koncově od štěpeného místa, přirozeně se vyskytující šeřin 169 v této poloze byl nahrazen postupně každou z 19 přirozeně se vyskytujících aminokyselin cílenou mutagenezí. Takto připravené konstrukty byly označeny

NPC-pET-Ala, NPC-pET-Gly atd. Z těchto plazmidů pak byly připraveny expresní kmeny.

Kmen Escherichia coli BL2I(D3) byl užit jako Escherichia coli hostitelský kmen pro expresi fúzního proteinu N^pro-C. Tento kmen měl následující genotyp:

E. coli B F~ dem ompT hsdS(r_h'm_h~) gal X(DE3)

-6CZ 303341 Β6

Kmen byl připraven z komerčně dostupných kompetentních buněk (Stratagen). Nese lysogenní fág lambda, v jehož genomu je gen pro T7 RNA polymerázu řízený promotorem lacUV5. Produkce T7 RNA polymerázy a tudíž i cílového proteinu může být indukovaná isopropyl-p-Dthiogaiaktopyranosidem (IPTG). Tento dvoufázový systém dovoluje vysoce specifickou a velmi vysokou expresi mnoha cílových proteinů.

Expresní kmeny BL21(DE3) [MPC-pET], BL21(DE3) [MPC-pET-Ala] atd. byly připraveny transformací příslušných expresních plazmidů do BL21(DE3). Transformace byla provedena podle instrukcí výrobce kompetentních buněk (Stratagen nebo Novagen). Transformační směs byla nanesena na plotny s Luriovým agarem obsahujícím 100 mg/1 ampicilinu. Transformace po inkubaci pres noc ve 37 °C poskytla několik klonů.

Středně velká kolonie s odlišitelnými okraji byly odebrány a staly se základem pro příslušné expresní kmeny. Klony byly kultivovány a pak konzervovány v kryoampulích v teplotě -80 °C (hlavní buněčná banka, MCB, „master cell bank“). Pro běžnou denní práci byl kmen vždy nanesen na plotnu s Luriovým agarem (obsahujícím ampicilin).

Jednotlivý kmen byl použit pro inokulaci předkultury v třepané kultivační lahvi z jediné kolonie na agarové plotně. Alikvot předkultury byl užit k inokulaci hlavní kultury (10 až 200 ml v třepané kultivační lahvi) a ta pak byla kultivována až do dosažení OD₆₀₀ 0,5 až 1,0, Produkce fúzního proteinu pak byla indukována 1,0 mM IPTG (výsledná koncentrace). Kultury byly dále kultivovány 2 až 4 hodiny, dokud nebylo dosaženo ODéoo 1,0 až 2,0. Kultivační teplota byla 30 °C +/- 2 °C, a bylo užito médium LB + 2g/l glukózy + lOOmg/l ampicilin.

Vzorky byly z kultur odebrány před indukcí a v různých časových intervalech po indukci, centrifugovány a pelety byly denaturovány povařením ve vzorkovém pufru a pak analyzovány SDSPAGE a Coomassie barvením nebo Western přenosem („Western blot“). Vzorky byly odebírány za standardizovaných podmínek a rozdíly v hustotě kultur byly kompenzovány objemem nanášecího pufru užitého k resuspendování vzorku.

Pásy, které se objevily po indukci, byly lokalizovány mírně nad 20000 (D) (odpovídá N^pro) a přibližně 14000 (D) (odpovídá C). Účinnost štěpení fúzního proteinu v každém konstruktu byla stanovena na základě intenzity pásů na gelu obarveném Coomassie modří a pak podle Western blotu. Bylo zjištěno, že většina aminokyselin byla tolerována v poloze bezprostředně sousedící C-koncově se štěpícím místem (tj. na N-konci cílového proteinu), tzn. Že docházelo k velmi účinnému autoproteolytickému štěpení.

Tato data ukazují, že je možné v principu úspěšně využít autoproteolytickou aktivitu autoproteázy N^pro ke specifickému štěpení rekombinantního fúzního proteinu v bakteriální hostitelské buňce.

Příklad 2

Exprese a in-vivo štěpení fúzního proteinu N^pro a humánního interleukinu 6 (hIL6) pro produkci homogenního zralého hIL6

Plazmid NP6—pET byl konstruován pro expresi fúzního proteinu N^pro-hIL6. Jako expresní vektor byl užit pETlla (F. W. Studier et al., Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-89). Nejdříve byl do expresního vektoru klonován fůzní protein sestávající zN^proa nukleokapsidového proteinu CSFV (viz Příklad 1). Strukturní gen pro fúzní protein byl připraven PCR. To umožnilo prvních 16 aa přírodní sekvence N^pro (MELNHFELLYKTSKQK) nahradit 10 aa dlouhou oligo-histidinovou sekvencí (MASHHHHHHH) napomáhající purifikaci.

-7CZ 303341 B6

Štěpné místo Spěl bylo vneseno do výsledného expresního plazmidu v místě spojení mezi N^pro a nukleokapsidovým proteinem cílenou mutagenezí. To umožnilo deletovat strukturní gen pro nukleokapsidový protein z vektoru restrikcí Spěl na 5'-konci (odpovídá N-konci proteinu) a Xhol na 3'-konci (odpovídá C-konci proteinu). Odpovídající linearizovaný vektor N^pro5 pETTla byl oddělen od fragmentu nukleokapsidového genu preparativní gelovou elektroforézou. Pak bylo možné vložit strukturní gen hIL6 prostřednictvím „lepivých“ konců Spěl a Xhol.

Byly potřebné následující přípravné práce. Strukturní gen byl amplifikován pomocí vysoce přesného systému PCR (například Pwo systém od firmy Roche Biochemicals, postup byl proveden io podle pokynů výrobce) hIL6 cDNA klonu, který lze získat z buněk Cl0-MJ2. Pro tento účel byly použity následující oligonukleotidy:

Oligonukleotid 1 („N-koncový“):

₁₅ 5*- ATAATTACTA GTTGTGCTCC AGTACCTCCA GGTGAAG -3

Oligonukleotid 2 („C-koncový“):

5- ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTACATTTGC CGAAGAGCCC TCAGGC -3

Pomocí těchto oligonukleotidů bylo vneseno štěpné místo Spěl na 5-konec, a štěpné místo Xhol bylo vneseno na 3'-konec. Navíc byl na 3'-konec strukturního genu vložen dvojitý stop kodon ochre (TA AT A A) kvůli účinné term i naci translace. Štěpné místo Spěl na předním konci dovoluje ligaci ve shodě se čtecím rámcem vektoru N^pro-pETlla popsaného výše. Štěpné místo Xhol na zadním konci umožňuje přímé klonování.

Sekvence PCR fragmentu (593 bp) se strukturním genem hIL6 je zde dále uvedena (čtena ve směru od N-konce do C-konce), přičemž restrikční místo je podtrženo a první kodon hIL6 (Ala) a stop kodon jsou vyznačeny tučně:

ATAATTACXaaETGTGCTCCAGTACCTCCAGGTGAAGATTCTAAAGATGTAGCCGCCCCACAC

AGACAGCCACTCACCTCTTCAGAACGAATTGACAAACAAATTCGGTACATCCTCGACGGCATC

TCAGCCCTGAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAACATGTGTGAAAGCAGCAAAGAGGCACTG

GCAGAAAACAACCTGAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGATGCTTCCAATCTGGATTC

AATGAGGAGACTTGCCTGGTAAAAATCATCACTGGTCTTTTGGAGTTTGAGGTATACCTAGAG

TACCTCCAGAACAGATTTGAGAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTACAAAA

GTCCTGATCCAGTTCCTGCAGAAAAAGGCAAAGAATCTAGATGCAATAACCACCCCTGACCCA

ACCACAAATGCCAGCCTGCTGACGAAGCTGCAGGCACAGAACCAGTGGCTGCAGGACATGACA

ACTCATCTCATTCTGCGCAGCTTTAAGGAGTTCCTGCAGTCCAGCCTGAGGGCTCTTCGGCAA

ATGTAATAACTCGAGGATCCAATTAT

Konstrukt připravený ligaci s plazmidem N^pro-pETl la byl nazván NP6-pET.

Dále je uvedena Sekvence N^pro-hIL6 fuzního proteinu (347 aminokyselin, z nichž 162 aminokyselin tvoří N^pro a 185 aminokyselin tvoří hIL6), kódovaného NP6-pET, přičemž sekvence hIL6 je vyznačena tučně:

-8CZ 303341 B6

MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDXRTTLRDLPRKGDC

RSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIY

VCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCAFVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERID

KQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIIT

GLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQ

AQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM

Fúzní protein má M_r 39303,76 (D) v redukovaném stavu, a po případném odštěpení úseku N^p,° 5 (redukovaný) by měl Mr 18338,34 (D) a úsek hIL6 (redukovaný) by měl 20983,63 (D). N^pT° obsahuje šest cysteinů a hIL6 čtyři. Je pravděpodobné, že v bakteriální cytoplazmě jsou tyto cysteiny většinou v redukované formě. V průběhu dalšího opracování dochází pravděpodobně alespoň k částečnému vytvoření disulfidických můstků. Je třeba očekávat, že N-koncový methionin ve fúzním proteinu (nebo části N^pro) je většinou štěpen methioninaminopeptidázou (MAP) io vlastní hostiteli, což by redukovalo Mr přibližně o 131 (D) na 39172,76 (D) (fúzní protein) a 18,207,13 (D) (N^pro).

Hostitelský kmen Escherichia coli pro expresi fúzního proteinu N^pro-hIL6 je Escherichia coli

BL21(DE3) (viz Příklad 1).

Expresní kmen BL21(D3) [MP6-pET] byl připraven transformací expresního plazmidu MP6pET popsaného výše do BL21(DE3), jak bylo popsáno v příkladu 1.

Kmen BL21(DE3) [MP6-pET] byl inokulován z jediné kolonie na agarovou plotnu, která pak 20 byla užita k inokulaci předkultur do L média (Luna Broth) obsahujícího 100 mg/1 ampicilinu (200 ml v 1 1 kultivační lahvi s míchacími přepážkami). Predkultura byla třepána pri 250 rpm a 30 °C po 14 hodin až dosáhla OD₆oo přibližně 1,0. 10 ml alikvoty předkultuiy byly užity k inokulaci hlavní kultury (330 ml Luria Broth v 1 1 kultivační lahvi s míchacími přepážkami) (3% inokulum). Hlavní kultury byly udržovány na 30 °C (250 rpm) do dosažení ODeoo 0,8, a pak byla produkce fúzního proteinu indukována 0,5 nebo 1,0 mM IPTG (výsledná koncentrace). Kultury byly dále kultivovány při 30 °C a 250 rpm po 3 hodiny, OD₆oo dosáhla přibližně 1,0 až 2,0.

Pak byly kultury přeneseny do sterilních 500 ml centrifugačních kyvet a centrifugovány 30 minut pri 10 000 g. Supematant byl zcela odstraněn a pelety byly zamraženy v -80 °C až do dalšího zpracování.

Výskyt nových proteinových pásů v úplném lyzátu byl snadno detekován Coomassie barvením po provedení SDS-PAGE. Pásy v lyzátu BL21(DE3) [MP6-pET] odpovídaly zjevné molekulové hmotnosti přibližně 19000 (D), 21000 (D) a 4000 (D). Analýzy exprese užitím protilátek anti35 hIL6 nutně potvrdila výsledky získané Coomassie barvením.

Pro optimalizaci N^pro-hIL6 štěpení byla provedena indukce pri různých teplotách a koncentracích

IPTG a výsledné produkty byly analyzovány barvením gelů a Western blotem. Téměř úplné štěpení N^pro-IL6 bylo pozorováno pri kultivaci v teplotě 22 °C.

Tento experiment také ukázal, že heterologní proteiny mohou být fúzovány k C-konci N^pro v bakteriálním expresním systému, kde dochází k velmi účinnému štěpení. Změna N-koncové aminokyseliny následného proteinu (alanin místo šeřinu) také nemá žádný nepříznivý účinek. Tento systém podle předkládaného vynálezu je tudíž vhodný k produkci rekombinantních proteinů s homogenním autentickým N-koncem, zejména v heterologním expresním systému jako je např. bakteriální expresní systém, bez nutnosti dalších kroků zpracování.

-9CZ 303341 B6

Příklad 3

Exprese a in-vivo štěpení fúzní ho proteinu sestávajícího z N^pro a humánního interferonu ct2B (IFNa2B) pro produkci homogenního zralého IFNa2B

Postup klonování IFNa2B až po přípravu vektoru NPI-pET odpovídal postupu užitému pro hIL6 v příkladu 2. Strukturní gen byl amplifikován PCR s vysokou přesností (například Pwo systém od firmy Roche Biochemicals, postup podle pokynů výrobce). Jako templát byl použit IFNa2BcDNA klon, který byl připraven z humánních leukocytů standardním odborníkům známým postupem. Alternativní možností by bylo provést syntézu úplného genu. Sekvenci strukturního genu je možné získat v elektronické formě z databáze Genbank pod přístupovým číslem V00548. Pro amplifikaci byly užity následující oligonukleotidy:

Oligonukleotid 1 („N-koncový“):

5- ATAATTACTA GTTGTTGTGA TCTGCCTCAA ACCCACAGCC -3*

Oligonukleotid 2 („C-koncový“):

5'-ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTATTCCTTA CTTCTTAAAC TTTCTTGCAA G-3

Sekvence PCR fragmentu (533 bp) se strukturním genem IFNa2B je uvedena níže. Štěpná místa pro restrikční enzymy jsou podtržena a první kodon IFNa2B (Cys) a stop-kodon jsou vyznačeny tučně:

ATAATTACIAGTTGTTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATG

CTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGA

TTTCCCCAGGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAG

ATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACC

CTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATA

CAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAA

TACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTT

GTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGT

AAGGAATAATAACTCGAGGATCCAATTAT

Konstrukt připravený ligací k plazmidu N^pTO-pETl la byl označen NPI-pET.

Sekvence fúzního proteinu N^pro-IFNa2B (celkem 327 aa, z toho 162 aa je N^pro a 165 aa je IFNa2B) kódovaného NPI-pET je uvedena dále, přičemž sekvence IFNa2B je vyznačena tučně (znázorněna ve směru od N-konce k C-konci):

-10CZ 303341 B6

MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDC

RSGNHLGPVSGXYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRXGRVTGSDGKLYHIY

VCVIX3CIIXLKIAKRGTPRTLKWIRNFTOCPLWVTSCCDI.PQTHSLGSRRTLMLI*AQMRRISLF gCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIIQÍLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQ

QLNDLEACVXQGVGVTETPLMKEDSILAVRXYFQRITLYLKEKKYSPCAWEWRAEIMRSFSL

STNLQESLRSKH

Fúzní protein má M_r 37591,44 (D) v redukovaném stavu a po možném rozštěpení by N^pro část (redukovaná) měla Mr 18338,34 (D) a IFNa2B část (redukovaná) by měla 19271,09 (D). Ν'⁰ má šest cysteinových zbytků a IFNa2B má čtyři. Je pravděpodobné, že tyto cysteinové zbytky jsou v bakteriální cytoplazmě z větší části v redukovaném stavu. V průběhu následného opracování pravděpodobně dochází k alespoň částečnému vytváření disulfidických můstků. Je nutno počítat s tím, že N-koncový methionin ve fúzním proteinu (nebo v části N^pro) je většinou odštěpen methioninaminopeptidázou (MAP) vlastní hostiteli, což by snížilo Mr o 131 (D) na 37460,23 (D) (fúzní protein) a 18207,13 (D) (N^pr0).

Hostitelský kmen Escherichia coli pro expresi fúzního proteinu N^pro-IFNa2B byl Escherichia coli BL21(DE3) (viz Příklad 1).

Expresní kmen BL21(DE3) [NPI-pET] byl připraven transformací expresního plazmidu NPIpET popsaného výše do BL21(DE3), jak bylo popsáno v příkladu l.

Kmen BL21(DE3) [NPI-pET] byl inokulován zjediné kolonie na agarovou plotnu, která pak byla užita k inokulaci předkultur do L média (Luna Broth) obsahujícího 100 mg/1 ampicilinu (200 ml v 1 1 kultivační lahvi s míchacími přepážkami). Předkultura byla třepána při 250 rpm a 30 °C po 14 hodin až dosáhla OD₆₀₀ přibližně 1,0. 10 ml alikvoty předkultury byly užity k inokulaci hlavní kultury (330 ml Luria Broth v 1 1 kultivační lahvi s míchacími přepážkami) (3% inokulum). Hlavní kultury byly udržovány na 30 °C (250 rpm) do dosažení OD^o 0,8, a pak byla produkce fúzního proteinu indukována 0,5 nebo 1,0 mM IPTG (výsledná koncentrace). Kultury byly dále kultivovány při 30 °C a 250 rpm po 3 hodiny, OD₆₀₀ dosáhla přibližně 1,0 až 2,0.

Pak byly kultury přeneseny do sterilních 500 ml centrifugaČních kyvet a centrifugovány 30 minut při 10000 g. Supematant byl zcela odstraněn a pelety byly zamraženy v -80 °C až do dalšího zpracování.

Výskyt nových proteinových pásů v úplném lyzátu byl snadno detekován Coomassie barvením po provedení SDS-PAGE. Pásy v lyzátu BL21(DE3) [MP6-pET] odpovídaly zjevné molekulové hmotnosti přibližně 38000 (D) a 19000 (D). Pás IFNa2B nebylo možné technikou SDS-PAGE oddělit od pásu N^pr0.

Analýzy exprese užitím protilátek anti-IFNa2B potvrdily přítomnost vy štěpeného pásu IFNct2B.

Pro optimalizaci štěpení N^pro-IFNa2B byla také v tomto případě provedena indukce při různých teplotách a koncentracích IPTG a výsledné produkty byly opět analyzovány barvením gelů a Western blotem. Bylo také zjištěno, že k úplnému štěpení došlo při snížené teplotě (22 až 23 °C).

Claims (13)

1. Molekula nukleové kyseliny kódující fúzní protein, který obsahuje první polypeptid, který má autoproteolytickou funkci autoproteázy N^pro z pestiviru, a druhý polypeptid, který je navázán na první polypeptid na C-konci prvního polypeptidu takovým způsobem, že druhý polypeptid může být vyštěpen z fúzního proteinu autoproteolytickou aktivitou prvního polypeptidu, přičemž druhý polypeptid je heterologní polypeptid.

2. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde pestivirus je vybrán ze skupiny obsahující CSFV, BDV a BVDV.

3. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 2, kde pestivirus je CSFV.

4. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, kde první polypeptid obsahuje následující sekvenci aminokyselin:

{1) -MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTT LRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRI GRVT GSDGKLYHIYVCTDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC- (168) , nebo aminokyselinovou sekvenci, která je derivátem uvedené sekvence a má autoproteolytickou aktivitu.

5. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, kde první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci Glu22 až Cysl68 z autoproteázy N^pr0 z CSFV nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou, přičemž první polypeptid navíc má Met jakožto N-konec a heterologní polypeptid je navázán přímo na aminokyselinu Cysl68 autoproteázy N^pro z CSFV.

6. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, kde první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci Pro 17 až Cysl68 z autoproteázy N^pro z CSFV nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou, přičemž první polypeptid navíc má Met jakožto N-konec a heterologní polypeptid je navázán přímo na aminokyselinu Cysl 68 autoproteázy N^pro z CSFV.

7. Molekula nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, přičemž molekula nukleové kyseliny je molekula DNA.

8. Expresní vektor kompatibilní s předem určenými bakteriálními hostitelskými buňkami, který obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 a alespoň jednu sekvenci řídicí expresi.

9. Expresní vektor podle nároku 8, kde bakteriální hostitelské buňky jsou buňky E. coli.

10. Expresní vektor podle nároku 8 nebo 9, přičemž expresní vektor je plazmid.

11. Bakteriální hostitelská buňka obsahující vektor podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10.

12. Bakteriální hostitelská buňka podle nároku 11, přičemž bakteriální hostitelská buňka je buňka E. coli.

13. Způsob produkce požadovaného heterologního polypeptidu, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy

- 12CZ 303341 B6 (I) kultivují se bakteriální hostitelské buňky podle nároku 11 nebo 12 za podmínek, které vedou k expresi fúzního proteinu a k autoproteolytickému vyštěpení heterologního polypeptidu z fúzního proteinu v hostitelské buňce autoproteolytickou aktivitou prvního polypeptidu, a (II) izoluje se vyštěpený heterologní polypeptid.