JP2003506092A - 自己タンパク質分解切断によるタンパク質の製造 - Google Patents
自己タンパク質分解切断によるタンパク質の製造Info
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Abstract
Description
の、細菌宿主細胞内での製造方法であって、ペスチウイルスの自己プロテアーゼ
(autoprotease)Nproの自己タンパク質分解活性を有するペプ
チドと該異種ポリペプチドとを含む初めに発現された融合タンパク質から所望の
異種ポリペプチドを該Npro自己タンパク質分解活性により自己タンパク質分
解的に切断することを特徴とする製造方法に関する。
は他の真核生物のタンパク質の発現においては、100%に可能な限り近く均一
な明らかに定められたN末端を得ることは困難な場合が多い。これは、ヒト/動
物に天然で存在するアミノ酸配列と多くの場合に同一であるべきアミノ酸配列を
有する組換え医薬タンパク質の場合に特に言えることである。
細胞外腔内に輸送され、この目的のために前駆体タンパク質内に存在するシグナ
ル配列の切断は、明らかに定められたN末端を与える。いくつかの理由により、
そのような均一なN末端は、例えば細菌細胞内では常に容易に生成されるわけで
はない。
のは、稀な場合にすぎない。なぜなら、細菌輸出装置の低い輸送能のため、通常
は、この場合には非常に少量の産物だけしか蓄積することができないからである
。
は、そこには還元条件が存在し、他方においては、N末端リーダー配列を切断し
て成熟タンパク質を形成するメカニズムが存在しない。すべての細胞質タンパク
質の合成は、適当な開始コドン(ATG=翻訳の開始)により特定されるメチオ
ニンから開始する。このN末端メチオニンは多数のタンパク質内に保持されてい
るが、他のタンパク質においては、それは、細胞質内に存在する該宿主に固有の
メチオニンアミノペプチダーゼ(MAP)により切断される。該切断の効率は、
以下の2つのパラメーターに実質的に左右される:1.後続のアミノ酸の性質、
および2.該タンパク質の三次元構造におけるN末端の位置。N末端メチオニン
は、後続のアミノ酸がセリン、アラニン、グリシン、メチオニンまたはバリンで
ある場合、およびN末端が露出している場合(すなわち、該タンパク質内に「隠
れて」いない場合)に優先的に欠失する。一方、後続のアミノ酸が、異なるアミ
ノ酸、特に荷電アミノ酸(グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、アルギニン
)である場合、またはN末端が該タンパク質の内部に位置する場合には、ほとん
どの場合、N末端メチオニンの切断は生じない(Knippers,Rolf(
1995)Molekulare Genetik,第6版,Georg Th
ieme Verlag,Stuttgart,New York.ISBN
3−13−103916−7)。
に完全ではない。かなりの割合(1〜50%)がMAPにより影響されないまま
であるのが普通である。
単に、メチオニンコード化ATG開始コドンを成熟(すなわち、シグナル配列も
他のN末端伸長も有さない)タンパク質のオープンリーディングフレーム(OR
F)の前に配置するだけであった。したがって、発現されるタンパク質は配列H 2 N−Met−標的タンパク質を有していた。該宿主に固有のMAPによるN末
端メチオニンの完全な切断が達成されうるのは、少数の場合にすぎない。したが
って、このようにして製造されたタンパク質のほとんどはN末端に関して不均一
であるか(Met形態と無Met形態との混合物)、またはそれらのすべてはN
末端に追加的な外来アミノ酸(Met)を有する(Met形態のみ)。
ない。なぜなら、これらの産物は、しばしば、異なる免疫学的(例えば、抗体生
成の誘導)および薬理学的(半減期、薬物動力学)特性を示すからである。これ
らの理由により、ほとんどの場合には、天然と同一の産物(N末端において均一
であり外来アミノ酸を有さないもの)を製造することが現在必要とされている。
細胞質発現の場合には、ここでのほとんどの場合の対処法は、特異的エンドペプ
チドダーゼ(例えば、因子Xa、エンテロキナーゼ、KEXエンドペプチダーゼ
、IgAプロテアーゼ)またはアミノペプチダーゼ(例えば、ジペプチジルアミ
ノペプチダーゼ)の切断配列(リーダー)を標的タンパク質のN末端に融合させ
ることである。しかし、これは、経費および材料の出費を伴う、該産物の更なる
後処理(いわゆる下流プロセシング)中の追加的な工程を必要とする。
ロテアーゼ切断、回復精製など)を伴うことなく均一の所望のN末端を有する標
的タンパク質が製造されうることを意図した、細菌細胞内での標的タンパク質の
製造方法が必要とされている。ペスチウイルス由来のウイルス自己プロテアーゼ
Nproを使用するそのような方法を、本発明の範囲内で開発した。
引き起こす一群の病原体を構成する。届出伝染病の病原体として、古典的豚コレ
ラウイルス(CSFV)は特に重要である。牛ウイルス性下痢症ウイルス(BV
DV)により引き起こされる損害(特に、胎仔の子宮内感染の定常的発生による
もの)も著しい。
ムを有する、エンベロープを有する小さなウイルスであり、該ウイルス遺伝子産
物は細胞質内で該ゲノムから転写される。これは、約4000アミノ酸を含みウ
イルスプロテアーゼおよび細胞プロテアーゼの両方により約12個の成熟タンパ
ク質に分解される単一のポリタンパク質の形態で生じる。
(自己プロテアーゼNproおよびセリンプロテアーゼNS3)が同定されてい
る。N末端プロテアーゼNproはポリタンパク質のN末端に位置し、23kd
の見掛け分子量を有する。それは、それ自身のC末端(Cys168)とヌクレ
オカプシドプロテインCのN末端(Ser169)との間で生じる切断を触媒す
る(R.Starkら,J.Virol.67(1993),7088−709
5)。また、細胞病原性BVDVウイルスにおけるNpro遺伝子の重複が記載
されている。これらにおいては、同様に重複したNS3プロテアーゼのN末端に
Nproの第2のコピーが存在する。この場合にも、該Npro‐NS3タンパ
ク質の自己タンパク質分解切断が観察される(R.Starkら,前記を参照さ
れたい)。
ンビボ)を有する自己プロテアーゼである。それはペスチウイルス(例えば、C
SFV、BDV(ボーダー病ウイルス)またはBVDV)のポリタンパク質にお
ける最初のタンパク質であり、後続のヌクレオカプシドプロテインCからの自己
タンパク質分解切断を受ける(M.Wiskerchenら,J.Virol.
65(1991),4508−4514;Starkら,J.Virol.67
(1993),7088−7095)。この切断は、Nproの配列内の最後の
アミノ酸Cys168の後で生じる。
の際に)保有されることが、本発明の範囲内で見出された。したがって、本発明
は、明らかに定められた均一なN末端を有する所望の異種ポリペプチドの、細菌
宿主細胞内での製造方法であって、ペスチウイルスの自己プロテアーゼNpro の自己タンパク質分解活性を有するペプチドと該異種ポリペプチドとを含む初め
に発現された融合タンパク質から所望の異種ポリペプチドを該Npro自己タン
パク質分解活性により切断することを特徴とする製造方法に関する。本発明は更
に、本発明の製造方法において用いるクローニング手段に関する。
るポリペプチド、またはペスチウイルスの自己プロテアーゼNproの自己タン
パク質分解機能を有するポリペプチドは、特に、ペスチウイルスの自己プロテア
ーゼNpro、または自己タンパク質分解活性を有するその誘導体である。
パク質またはポリタンパク質からペスチウイルスの自己プロテアーゼNproに
より天然では切断されないポリペプチドを意味する。異種ポリペプチドの具体例
としては、産業用酵素(プロセス酵素)、または医薬活性、特にヒト用医薬活性
を有するポリペプチドである。
ン、例えばインターロイキン(例えばIL−6)、インターフェロン、例えば白
血球インターフェロン、例えばインターフェロンα2B、増殖因子、特に造血系
または創傷治癒増殖因子、例えばG−CSF、エリトロポエチンまたはIGF、
ホルモン、例えばヒト成長ホルモン(hGH)、抗体またはワクチンが挙げられ
る。
ーゼNproの自己タンパク質分解機能を有する第1ポリペプチドと該第1ポリ
ペプチドのC末端において該第1ポリペプチドに結合した第2ポリペプチドとを
含む融合タンパク質をコードする核酸分子であって、該第2ポリペプチドが該第
1ポリペプチドの自己タンパク質分解活性により該融合タンパク質から切断され
うること、および該第2ポリペプチドが異種ポリペプチドであることを特徴とす
る核酸分子に関する。
VDVよりなる群から選ばれ、CSFVが特に好ましい。
Vの自己プロテアーゼNproのアミノ酸配列:
ある(EMBOデータベースアクセッション番号X87939も参照されたい)
(N末端からC末端への方向に読み取った場合にアミノ酸1−168)。
る誘導体は、突然変異誘発、特にアミノ酸の置換、欠失、付加および/またはア
ミノ酸の挿入により得られた自己プロテアーゼNproである。ただし、これは
、特に、均一のN末端を有する所望のタンパク質の生成に要求される自己タンパ
ク質分解活性が保有されている場合に限られる。そのような誘導体を得るための
方法は当業者によく知られている。自己プロテアーゼNproの活性を、例えば
、切断される種々の異種タンパク質に関して最適化することは、そのような突然
変異により可能である。天然に存在する自己プロテアーゼNproと比較して1
以上の突然変異を示す自己プロテアーゼNpro誘導体を所望の異種タンパク質
の他に含む融合タンパク質をコードする核酸の製造後、該自己タンパク質分解活
性を発現系内で測定することにより、その要求される機能が存在するか否かを確
認する。
とができる。この目的には、該DNA構築物をRNAに転写し、インビトロ翻訳
キットによりタンパク質に翻訳する。場合によっては、該感度を増加させるため
に、得られたタンパク質を放射性アミノ酸の取込みにより標識する。得られたN pro ‐標的タンパク質融合タンパク質は翻訳時および/または翻訳後自己触媒
切断を受け、N末端Npro部分が、その自己タンパク質分解活性により、後続
の標的タンパク質から正しく切断される。得られた切断産物は容易に検出するこ
とができ、該混合物をインビトロ翻訳反応の完了直後に後処理することができる
。ついで該混合物をタンパク質ゲル(例えばLammli SDS−PAGE)
上にローディングし、電気泳動に付す。ついで該ゲルを適当な色素で染色し、ま
たはオートラジオグラフィーに付す。後続の免疫染色を伴うウエスタンブロット
も可能である。該融合タンパク質の切断効率は、得られたタンパク質のバンドの
強度に基づいて評価することができる。
ー内にクローニングし(インビトロ翻訳に関してこれが未だ生じていない場合)
、後者を適当な宿主(例えば大腸菌(E.coli))内に形質転換することが
できる。得られた発現株は、構成的に又は誘導物質の添加後に該融合タンパク質
を発現する。後者の場合、十分な力価の該産物を得るために、該誘導物質の添加
後に更に1時間以上培養する必要がある。ついで、得られる切断断片が、該Np ro 自己プロテアーゼ自体、および定められたN末端を有する標的タンパク質と
なるよう、該Npro自己プロテアーゼが、翻訳時または翻訳後、発現された融
合タンパク質から自己を切断する。この切断反応の効率を評価するために、培養
または誘導期の終了後、サンプルを採取し、前記のとおりにSDS−PAGEに
より分析する。
アミノ酸2−21の領域内の1以上のアミノ酸が欠失し又は置換されたN末端領
域を有する。ただし、これは、得られた誘導体が、自己プロテアーゼNproの
自己タンパク質分解機能を望ましい程度で示し続けている場合に限られる。本発
明の場合、該融合タンパク質において好ましい自己プロテアーゼNpro誘導体
は、例えば、アミノ酸2−16または2−21の欠失を有するCSFVの自己プ
ロテアーゼNproのアミノ酸配列を含む。また、例えば、精製を補助するアミ
ノ酸配列を導入するために、アミノ酸配列を交換または導入することがアミノ酸
の置換または付加により可能である(実施例を参照されたい)。
テアーゼNproのアミノ酸配列Glu22−Cys168または自己タンパク
質分解活性を有するその誘導体を含み、該第1ポリペプチドが更にMetをN末
端として有し、該異種ポリペプチドがCSFVの自己プロテアーゼNproのア
ミノ酸Cys168に直接結合しているものである。
ロテアーゼNproのアミノ酸配列Pro17−Cys168または自己タンパ
ク質分解活性を有するその誘導体を含み、該第1ポリペプチドが更にMetをN
末端として有し、該異種ポリペプチドがCSFVの自己プロテアーゼNproの
アミノ酸Cys168に直接結合しているものである。
クターおよび宿主細胞に関する。したがって、本発明は更に、本発明の核酸分子
と少なくとも1つの発現制御配列とを含んでなる、所定の宿主細胞に和合性の発
現ベクターに関する。発現制御配列としては、特に、プロモーター(例えば、l
ac、tac、T3、T7、trp、gac、vhb、ラムダpLまたはpho
A)、リボソーム結合部位(例えば、前記プロモーターに属する天然リボソーム
結合部位、cro、または合成リボソーム結合部位)、または転写ターミネータ
ー(例えば、rrnB T1T2またはbla)が挙げられる。前記宿主細胞は
、好ましくは、エシェリキア(Escherichia)属の細菌細胞、特に大
腸菌(E.coli)である。しかし、他の細菌細胞を使用することも可能であ
る(後記を参照されたい)。好ましい実施形態においては、本発明の発現ベクタ
ーはプラスミドである。
のような細菌宿主細胞は、例えば、以下の微生物の群から選ばれうる:グラム陰
性菌、例えばエシェリキア(Escherichia)種、例えば大腸菌(E.
coli)、または他のグラム陰性菌、例えばシュードモナス(Pseudom
onas)種、例えばシュードモナス・エルジノーサ(Pseudomonas
aeruginosa)、またはカウロバクター(Caulobacter)
種、例えばカウロバクター・クレセンツス(Caulobacter cres
centus)、あるいはグラム陽性菌、例えばバシラス(Bacillus)
種、特にバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)。宿主細
胞としては、大腸菌(E.coli)が特に好ましい。
胞を培養すること、該培養は、該融合タンパク質の発現と、更には該第1ポリペ
プチドの自己タンパク質分解活性による該宿主細胞内での該融合タンパク質から
の該異種ポリペプチドの自己タンパク質分解切断とを引き起こす条件下で行い、
(ii)切断された異種ポリペプチドを単離することを含んでなる製造方法に関
する。
細胞、すなわち該発現株を最初に培養することにより行う。該株は、一般には、
単コロニーから成長させるが、凍結保存細胞懸濁液(細胞バンク)を使用するこ
とも可能である。更なる使用のための十分なバイオマスを得るために、一般には
、該株を多段階方法で培養する。
合培地(例えばLBブロス)を使用することが可能である。しかし、規定培地(
例えばクエン酸培地)を使用することも可能である。該培養には、該宿主株(単
コロニーまたは凍結培養由来の細胞懸濁液で接種したもの)の小容積の予備培養
を行う。この培養の温度は、一般には、後続の発現結果に対して決定的なもので
はなく、通常は、比較的高い温度(例えば30℃または37℃)で実施すること
が可能である。主培養は、大容積(例えば500ml)で準備し、この場合、良
好な通気(内容物の容積と比較して大きな容積のフラスコ、高速の回転)を確保
することが特に必要である。発現は可溶性形態で生じると意図されるため、該主
培養は、ほとんどの場合、それよりいくらか低い温度(例えば22または28℃
)で行うことも可能である。誘導系(例えば、trp、lac、tacまたはp
hoAプロモーターによるもの)および構成系の両方が、可溶性タンパク質の製
造に適している。後期対数期(通常は振とうフラスコ内で0.5〜1.0の光学
密度)に達した後、誘導系では誘導物質(例えばインドールアクリル酸、イソプ
ロピルβ‐D‐チオガラクトピラノシド=IPTG)を加え、インキュベーショ
ンを1〜5時間継続する。この場合、厳密な発現を可能にするために、該誘導物
質の濃度は下限に選択される傾向にあるであろう。この時間中に、該Npro−
標的タンパク質融合タンパク質のほとんどが生成し、それらの2つの切断部分が
該培養の終了後に別々に存在するように該Npro部分の翻訳時または翻訳後切
断が生じる。得られた細胞を集め、更に加工することができる。
り、この場合には、該方法のプロセス工学制御を改善するために、規定栄養培地
を使用することが好ましい。また、特に栄養を計量供給することにより(フェド
・バッチ)、著しくバイオマスおよび産物の生成を増加させることが可能である
。その他の点では、該方法は該振とうフラスコの場合と同様である。例えば、予
備段階の発酵槽および主段階の発酵槽を使用し、該培養温度は該振とうフラスコ
の場合と同様に選択する。該予備段階の発酵槽には、振とうフラスコ内の凍結培
養または単コピーから一般に増殖させたいわゆる接種物を接種する。該発酵槽に
おいては及び特にその主段階においては、良好な通気および十分な誘導物質濃度
も確保されなければならない。しかし、いくつかの場合には、該誘導期を、該振
とうフラスコの場合より著しく長く行わなければならない。得られた細胞をもう
一度、更なる加工に付す。
知のタンパク質精製方法により単離することができる(例えば、M.P.Deu
tscher,Methods in Enzymology:Guide t
o Protein Purification,Academic Pres
s Inc.,(1990),309−392)を参照されたい)。一連の精製
は、一般には、細胞破壊工程、清澄化工程(遠心分離または精密濾過)および種
々のクロマトグラフィー工程、濾過および沈殿を含む。
のではない。
を構築する。使用する発現ベクターはpET11a(F.W.Studierら
,Methods.Enzymol.185(1990),60−89)である
。該Npro−C融合タンパク質用の天然構造遺伝子(CSFV RNAゲノム
由来のもの)をこの発現ベクター内にクローニングする。この融合タンパク質用
の構造遺伝子は、cDNAに転写され(ベクター内にクローニングされ)たウイ
ルスゲノムからPCR増幅により得られる。さらに、該天然Npro−配列の最
初の16アミノ酸(MELNHFELLYKTSKQK)を10アミノ酸長のオ
リゴ−ヒスチジン精製補助体(MASHHHHHHH)により置換する。得られ
た構築物はNPC−pETと称される。該NPC−pET上にコードされる該N pro −部分の配列および該Npro−C融合タンパク質の自己タンパク質切断
部位は以下の構造を有し、該切断部位は、アミノ酸Cys168とSer(16
9)との間に位置する:
位)は斜字体で示されており、該C配列の出発部分は太字で示されている。該融
合タンパク質は約32kdのMrを有し、該Npro部分が18kdを占め、該
C部分が14kdを占める(自己タンパク質切断後)。
天然に存在するセリン169を、標的化突然変異誘発により、19個の他の天然
に存在するアミノ酸により置換する。それにより得られた構築物はNPC−pE
T−Ala、NPC−pET−Glyなどと称される。これらのプラスミドを使
用して、該発現株を得る。
li)宿主株として使用する。この株は以下の表現型を有する: 大腸菌(E.coli)BF− dcm ompT hsdS(rb −mb −)
galλ(DE3)。
能である。それは、lacUV5プロモーターの制御下でT7 RNAポリメラ
ーゼの遺伝子を含むゲノム内に溶原性ラムダファージを保持する。したがって、
該T7 RNAポリメラーゼの産生およびそれに続く該標的タンパク質の産生は
、イソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加により誘導
されうる。この2段階の系は、多数の標的タンパク質の、非常に高い特異的で完
全な発現レベルの達成を可能にする。
−pET−Ala]などは、それぞれの発現プラスミドをBL21(DE3)内
に形質転換することにより得る。該形質転換は、該コンピテント細胞の製造業者
(StratageneまたはNovagen)の説明書に従い行う。該形質転
換混合物を、100mg/L アンピシリンと共にルリア寒天プレート上にプレ
ーティングする。この形質転換は、37℃でのインキュベーション(一晩)後、
それぞれの場合に多数のクローンを与える。
礎となる。該クローンを培養し、凍結アンプル内で−80℃で保存する(マスタ
ー細胞バンクMCB)。日常的な使用のために、該株をルリア寒天プレート(ア
ンピシリンを含有するもの)上にストリークする。
をインキュベートするために、個々の株を使用する。該予備培養のアリコートを
使用して、主培養(振とうフラスコ内の10〜200ml)に接種し、該OD6 00 が0.5〜1.0になるまでそれをリンスする。ついで該融合タンパク質の
産生を1.0mM IPTG(最終濃度)で誘導する。該培養物を更に2〜4時
間培養すると、約1.0〜2.0のOD600に達する。該培養温度は30℃+
/−2℃であり、使用する培地はLB培地+2g/L グルコース+100mg
/L アンピシリンである。
分離し、該ペレットを変性サンプルバッファー中で煮沸し、SDS−PAGEお
よびクーマシーブルー染色またはウエスタンブロットにより分析する。該サンプ
ルは標準的条件下で採取し、該培養の密度の相違を、再懸濁に使用するサンプル
ローディングバッファーの容積により埋め合わせる。
(C)に位置する。各構築物での該融合タンパク質の切断効率を、クーマシー染
色ゲル内およびウエスタンブロット内のバンドの強度に基づき評価する。これよ
り、ほとんどのアミノ酸が該切断部位の直ぐC末端(すなわち、該標的タンパク
質のN末端)に認められること、すなわち、非常に効率的な自己タンパク質分解
切断が生じることが判明している。
特異的切断のために自己プロテアーゼNproの自己タンパク質分解活性を成功
裏のうちに用いることが可能であることを示している。
Tを構築する。pET11a(F.W.Studierら,Methods.E
nzymol.185(1990),60−89)を発現ベクターとして使用す
る。まず、NproとCSFVヌクレオカプシドタンパク質とよりなる融合タン
パク質を、この発現ベクター内にクローニングする(実施例1を参照されたい)
。この融合タンパク質の構造遺伝子はPCRにより得られる。これにより、天然
Npro配列の最初の16アミノ酸(MELNHFELLYKTSKQK)が1
0アミノ酸長のオリゴ−ヒスチジン精製補助体(MASHHHHHHH)により
置換される。
結合部に、標的化突然変異誘発により、SpeI切断部位を導入する。これは、
5’末端(該タンパク質のN末端に対応する)におけるSpeIでの及び3’末
端(該タンパク質のC末端に対応する)におけるXhoIでの制限酵素処理によ
る該ベクターからの該ヌクレオカプシドタンパク質の構造遺伝子の欠失を可能に
する。対応する線状化Npro−pET11aベクターを、分取ゲル電気泳動に
より該ヌクレオカプシド遺伝子断片から取り出す。ついで、「付着」SpeIお
よびXhoI末端を介してhIL6構造遺伝子を導入することが可能である。
2細胞から得られうるhIL6 cDNAクローンから高精度PCR(例えば、
Roche BiochemicalsのPwo系;手順は該製造業者により記
載されているとおり)により増幅する。この目的には、以下のオリゴヌクレオチ
ドを使用する:
リゴヌクレオチドを介して導入する。また、翻訳の効率的な終結のために、二重
ochre終結コドン(TAATAA)を該構造遺伝子の3’末端に導入する。
前端のSpeI切断部位は、前記のNpro−pET11aベクターとリーディ
ングフレームが合った連結を可能にする。後端のXhoI切断部位は定方向のク
ローニングを可能にする。
(N末端からC末端への方向に読まれる)。該制限切断部位は下線で示されてお
り、hIL6の最初のコドン(Ala)および終結コドンは太字で示されている
。
pETと称される。
347アミノ酸を有し、そのうちの162アミノ酸はNpro部分に、185ア
ミノ酸はhIL6部分に対応する)の配列を以下に示す。該hIL6配列は太字
で示されている。
切断の後では、Npro部分(還元型)は18,338.34dのMrを、hI
L6部分(還元型)は20,983.63dを有するであろう。Nproは6個
のシステインを有し、hIL6は4個のシステインを有する。これらのシステイ
ンの大部分は細菌細胞質内では還元型であると考えられる。後続のプロセシング
中に、おそらく、ジスルフィド架橋の少なくとも部分的な形成が生じるのであろ
う。該融合タンパク質内(またはNpro部分内)のN末端メチオニンは、主と
して、該宿主に固有のメチオニンアミノペプチダーゼ(MAP)により切断され
、それは各場合においてMrを約131減少させて39,172.76d(融合
タンパク質)および18,207.13d(Npro)にすると予想されるに違
いない。
icia coli)宿主株は、大腸菌(Eschericia coli)B
L21(DE3)である(実施例1を参照されたい)。
前記の発現プラスミドMP6−pETをBL21(DE3)内に形質転換するこ
とにより得る。
継代培養し、ついでこれを使用してルリアブロス+100mg/L アンピシリ
ン(1Lのバッフルフラスコ内の200ml)内の予備培養に接種する。該予備
培養を250rpm、30℃で14時間振とうすると、この間に約1.0のOD 600 に達する。ついで予備培養の10ml部分を使用して該主培養(それぞれ
1Lのバッフルフラスコ内の330mlのルリアブロス)(3% 接種物)に接
種する。該OD600が0.8に増加するまで該主培養を30℃(250rpm
)で行い、ついで該融合タンパク質の産生を0.5または1.0mM IPTG
(最終濃度)で誘導する。該培養物を更に、30℃、250rpmで3時間培養
すると、該OD600は約1.0〜2.0に達する。
分離する。該遠心分離上清を完全に廃棄し、該ペレットを更なる加工まで−80
℃で凍結する。
AGE後のクーマシー染色により容易に検出することができる。約19kd、2
1kdおよび40kdの見掛け分子量を有するバンドが、BL21(DE3)[
MP6−pET]のライセートにおいて出現する。特異的抗hIL6抗体を使用
するこの発現の分析は、クーマシー染色後に得られた結果を実質的に証明してい
る。
TG濃度で行い、染色ゲルおよびウエスタンブロットの両方において再分析する
。Npro−hIL6のほぼ完全な切断は、22℃の培養温度で認められる。
ること、および非常に効率的な切断が生じることを示している。また、後続のタ
ンパク質のN末端アミノ酸の変化(セリンの代わりにアラニン)は悪影響を及ぼ
さない。したがって、この系は、本発明において、更なる加工工程を伴わない均
一な真正なN末端を有する組換えタンパク質の製造(特に、細菌発現系などの異
種発現系におけるもの)に適している。
施例2にhIL6に関して記載されている方法に対応している。該構造遺伝子を
、高精度PCR(例えば、Roche BiochemicalsのPwo系;
手順は該製造業者により記載されているとおり)により増幅する。使用する鋳型
は、当業者に公知の標準的な方法によりヒト白血球から得たIFNα2B−cD
NAクローンである。また、もう1つの可能性は、該遺伝子の完全な合成を行う
ことである。該構造遺伝子の配列は、Genbankデータベースを介してアク
セッション番号V00548で電子形態で入手可能である。以下のオリゴヌクレ
オチドを該増幅に使用する:
示す。制限切断部位は下線で示されており、IFNα2Bの最初のコドン(Cy
s)および終結コドンは太字で示されている。
pETと称される。
れは327アミノ酸を有し、そのうちの162アミノ酸はNproに対応し、1
65アミノ酸はIFNα2Bに対応する)の配列を以下に示す(N末端からC末
端への方向に示されている)。IFNα2B配列は太字で示されている。
切断の後では、Npro部分(還元型)は18,338.34dのMrを、IF
Nα2B部分(還元型)は19,271.09dを有するであろう。Nproは
6個のシステインを有し、IFNα2Bは4個のシステインを有する。これらの
システインの大部分は細菌細胞質内では還元型であると考えられる。後続のプロ
セシング中に、おそらく、ジスルフィド架橋の少なくとも部分的な形成が生じる
のであろう。該融合タンパク質内(またはNpro部分内)のN末端メチオニン
は、主として、該宿主に固有のメチオニンアミノペプチダーゼ(MAP)により
切断され、それは各場合においてMrを約131減少させて37,460.23
d(融合タンパク質)および18,207.13d(Npro)にすると予想さ
れるに違いない。
ericia coli)宿主株は、大腸菌(Eschericia coli
)BL21(DE3)である(実施例1を参照されたい)。
、前記の発現プラスミドNPI−pETをBL21(DE3)内に形質転換する
ことにより得る。
継代培養し、これを使用してルリアブロス+100mg/L アンピシリン(1
Lのバッフルフラスコ内の200ml)内の予備培養に接種する。該予備培養を
250rpm、30℃で14時間振とうすると、この間に約1.0のOD600 に達する。ついで予備培養の10ml部分を使用して該主培養(それぞれ1Lの
バッフルフラスコ内の330mlのルリアブロス)(3% 接種物)に接種する
。該OD600が0.8に増加するまで該主培養を30℃(250rpm)で行
い、ついで該融合タンパク質の産生を0.5または1.0mM IPTG(最終
濃度)で誘導する。該培養物を更に、30℃、250rpmで3時間培養すると
、その間に該OD600は約1.0〜2.0に達する。
分離する。該遠心分離上清を完全に廃棄し、該ペレットを更なる加工まで−80
℃で凍結する。
AGE後のクーマシー染色により容易に検出することができる。約38kdおよ
び約19kdの分子量が、BL21(DE3)[MP6−pET]のライセート
において出現する。該IFNα2Bバンドは、SDS−PAGEでは該Npro バンドから分離することができない。
IFNα2Bのバンドの存在を証明している。
導を種々の温度およびIPTG濃度で行い、染色ゲルおよびウエスタンブロット
の両方において再分析する。この場合においても、低下した温度(22〜30℃
)で、最適な切断が生じることが判明している。
Claims (13)
- 【請求項1】 ペスチウイルスの自己プロテアーゼNproの自己タンパク
質分解機能を有する第1ポリペプチドと該第1ポリペプチドのC末端において該
第1ポリペプチドに結合した第2ポリペプチドとを含む融合タンパク質をコード
し、該第2ポリペプチドは該第1ポリペプチドの自己タンパク質分解活性により
該融合タンパク質から切断されうるものであり、および該第2ポリペプチドは異
種ポリペプチドである核酸分子。 - 【請求項2】 該ペスチウイルスが、CSFV、BDVおよびBVDVより
なる群から選ばれる、請求項1記載の核酸分子。 - 【請求項3】 該ペスチウイルスがCSFVである、請求項2記載の核酸分
子。 - 【請求項4】 該第1ポリペプチドがアミノ酸配列: 【化1】 または自己タンパク質分解活性を有するその誘導体のアミノ酸配列を含む、請求
項3記載の核酸分子。 - 【請求項5】 該第1ポリペプチドがCSFVの自己プロテアーゼNpro のアミノ酸配列Glu22−Cys168または自己タンパク質分解活性を有す
るその誘導体を含み、該第1ポリペプチドが更にMetをN末端として有し、該
異種ポリペプチドがCSFVの自己プロテアーゼNproのアミノ酸Cys16
8に直接結合している、請求項3記載の核酸分子。 - 【請求項6】 該第1ポリペプチドがCSFVの自己プロテアーゼNpro のアミノ酸配列Pro17−Cys168または自己タンパク質分解活性を有す
るその誘導体を含み、該第1ポリペプチドが更にMetをN末端として有し、該
異種ポリペプチドがCSFVの自己プロテアーゼNproのアミノ酸Cys16
8に直接結合している、請求項3記載の核酸分子。 - 【請求項7】 該核酸分子がDNA分子である、請求項1〜6のいずれか1
項記載の核酸分子。 - 【請求項8】 請求項1〜7のいずれか1項記載の核酸分子と少なくとも1
つの発現制御配列とを含んでなる、所定の細菌宿主細胞に和合性の発現ベクター
。 - 【請求項9】 該細菌宿主細胞が大腸菌(E.coli)細胞である、請求
項8記載の発現ベクター。 - 【請求項10】 該発現ベクターがプラスミドである、請求項8または9記
載の発現ベクター。 - 【請求項11】 請求項8〜10のいずれか1項記載のベクターを含んでな
る細菌宿主細胞。 - 【請求項12】 該宿主細胞が大腸菌(E.coli)細胞である、請求項
11記載の細菌宿主細胞。 - 【請求項13】 (i)請求項11または12記載の細菌宿主細胞を培養す
ること、該培養は、該融合タンパク質の発現と、該第1ポリペプチドの自己タン
パク質分解活性による該宿主細胞内での該融合タンパク質からの該異種ポリペプ
チドの自己タンパク質分解切断とを引き起こす条件下で行い、 (ii)切断された異種ポリペプチドを単離すること、を含んでなる所望の異種
ポリペプチドの製造方法。
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