JP2008539170A - 親和性リガンド - Google Patents
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Abstract
Description
a)式X1X2X3X4を含むペプチドであって、X1からX4 はアミノ酸残基であり、少なくともX1からX4 の2個がW、YまたはFであるペプチド;
b)式X5X6X7X8を含むペプチドであって、X5 からX8 はアミノ酸残基であり、少なくともX5 からX8 の1個がWであり、そして、少なくともX5 からX8 の1個がEまたはDであるペプチド;および、
c)R、K、EおよびDからなる群のアミノ酸モノマーおよびY、FおよびWからなる群のアミノ酸モノマーからなるポリ−アミノ酸であって、好ましくは、poly-KY、poly-KF、poly-KW、poly-RY、poly-RF、poly-RW、poly-EY、poly-DY、poly-EF、poly-EW、poly-DFおよびpoly-DWであるポリ−アミノ酸、
ただし、a)およびb)に記載したペプチドは、最大、35アミノ酸残基長を有し、c)に記載したポリ−アミノ酸は、最小、20アミノ酸残基長を有する。
、親和性リガンドとして利用できる。これらの分子は、高い化学的安定性、高い効率、高い選択性、低価格を提供し、それらは通常、毒性がない。これらの特徴は、とりわけ、生物薬剤学的工程で適用されるとき、有利であると考えられる。標的分子に対して向けられたペプチドリガンドは、当業者に既知の方法で、コンビナトリアルペプチドライブラリーまたは生物学的ライブラリーから単離できる。本発明との関連で、ペプチドリガンドのスクリーニングは、カオトロピック条件下で行われる。
からなる群から選択される。
配列番号4
B. カオトロピック条件は、交換され、次いで、特異的な化学反応がタンパク質構造を修飾するために行われる。実施例は、アミノ酸側鎖の特異的酸化、リン酸または硫酸の付加、天然または合成ポリマーの付加(例えば、PEG化)、タンパク質分子をn−分枝化(n-branch)するためのペプチド鎖の付加、生理学的溶液または緩衝液に不可溶であるタンパク質への染料の付加である。
本発明は、下記実施例に準拠して記載しているが、それらは、単なる例示であり何ら制限するものではない。特に、実施例は、本発明の好ましい態様に関する。
1.1.1 クロマトグラフィー装置
実施例1でのクロマトグラフィーの稼働は、aeKTA 100 Explorer chromatography system (Amersham Biosciences)で行われる。調製ペプチド親和性吸着剤を、HR 5カラム(5 mm i.d., Amersham Biosciences)にパックする。ゲル容積は、およそ1mlである。
実施例1で使用するオリゴペプチドリガンドを、下記の方法で産生する:
実施例1で使用する親和性マトリックスを、下記の方法で調製する:
実施例1に記載した親和性マトリックスを、下記の方法で活性化する:
ペプチドを、0.15 M NaClを含む100 mM Na2CO3緩衝液pH 10.0に溶解する。CIM-diskを、製造者により提供されたカートリッジに載せ、ペプチド溶液を、室温で48時間、P1ポンプ(Amersham Biosciences)を用いた循環様式で、ディスクを介して注入する。結合産物は、結合前後における試料のRP-HPLCにより決定する。結合後、残りのエポキシ基は、0.5 M エタノールアミン、pH 10.0で、48時間、妨害される。
6×His-タグを有するN−末端オートプロテアーゼNproおよびC−末端融合GFPmut3.1を含む融合ポリペプチドを発現する組み換え E. coli HMS 174 (DE3)を、10 lの発酵槽で培養する。融合ポリペプチドは、下記のアミノ酸配列を含む:
収集後、細胞(850 g湿重量)を、2500 mlの50 mM Tris/HCl、5 mM EDTA、1 %Triton X−100、pH 8.0に懸濁する。冷却した懸濁液を、細胞を破砕するために、800バールで3回、APV-2000高圧ホモジナイザー(Invensys)を通過させる。通過の間、懸濁液を氷上で冷却し、Ultraturraxを用いて破砕する。ホモジネートを低速(JLA 10.500、7500 rpm、30分)で遠心分離し、組み換え融合ポリペプチドを含む封入体を取得する。
ペレットを、50 mM Tris/HCl、5 mM EDTA、1 %Triton X-100、pH 8.0で懸濁し、遠心分離する。この段階を繰り返す。水洗浄段階後、ペレットを水で懸濁する。取得した封入体懸濁液を、さらなる使用のため20 ℃で貯蔵する。封入体懸濁液を、室温で、50 mM Tris/HCl、10 M ウレア、50 mM DTT、pH 7.3 で1:5に希釈する。不可溶成分は、遠心分離により除去される。約15 mg/mlのポリペプチド濃度が得られる。ポリペプチド溶液は、約2 mg/mlのポリペプチド濃度に達するように、50 mM Tris/HCl、100 mM NaCl、4 M ウレア、pH 7.3で希釈する。
0.5 mlのポリペプチド溶液を、Fractogel-DADPA-SA-VSFIWYK (0.5×5 cm)マトリックスに適用し、それにより、それぞれのペプチドの調製およびカップリングが、上記したとおり(1.1.2および1.1.3)行われる。カラムは、50 cm/hの直線流速で、50 mM Tris/HCl、100 mM NaCl、4 M ウレア、pH 7.3で平衡化される。流速を、試料注入後、150 cm/hまで増やす。
非結合成分を、平衡緩衝液の5カラム容積で洗浄する。リフォールディング緩衝液、具体的には、0.5 M Tris/HCl、2 mM EDTA、3 % グリセロール、5 mM DTT、pH 7.3への緩衝液交換は、4.5カラム容積で行う。
カオトロピックからコスモトロピックへ条件を変えた後、融合ポリペプチドは、流れを止めることにより、クロマトグラフィーレジンで25時間リフォールドされる。活性化オートプロテアーゼは、C−末端融合GFPmut3.1を切断する。流速50cm/hのリフォールディング緩衝液を用いた次の溶出は、精製した本来のGFPmut3.1を生じ、蛍光測定およびSDS-PAGEにより確認される。
クロマトグラフィーレジンの再生は、流速50cm/hで、0.1 M NaOHで行う。
2.1 ペプチド親和性マトリックスの調製
チオール基を有するマトリックス(Fractogel-DADPA-IT)の上に、ヨード酢酸無水物で誘導体化された、C末端リシンを介した結合を有するペプチド親和性マトリックスの調製
3.1 NproEDDIE-6His封入体抽出物NproEDDIE-6Hisの精製:
50 mM Tris、100 mM NaCl、4 M ウレア、10 mM MTG、pH 7.3 中の夾雑なNproEDDIE−6His封入体抽出物を、直線流速がそれぞれ25および150 cm/hで、50 mM Tris、100 mM NaCl、4 M ウレア、pH 7.3で先に平衡化したFractogel−ポリ−KW (0.5×5 cm)に載せた。約2 mg/mlのタンパク質濃度で、5 mlの量の試料を適用した。150 cm/hの直線流速で平衡化緩衝液の5カラム容積(CV)を用いて非結合成分を洗浄した後、50 mM Tris、1 M NaCl、8 M ウレア、pH 7.3の10 CVを用いた溶出を、同じ流速条件下で行った。カラムの再生を、0.2 M NaOHの10 CVを用いて行った。宿主細胞化合物の欠損は、SDS-PAGEにより確認した。
GFPmut3.1産生E. coli HMS 174 (DE3)細胞ホモジネートでスパイクした(spiked)夾雑なNproEDDIE-6His封入体抽出物の親和性クロマトグラフィーを、上記したとおりのFractogel-DADPA-IT-AFYRWYAKで行った。流れて、溶出した試料を収集し、SDS-PAGEにより標的タンパク質および混入内容物に関して、解析した。
この検出系は、Npro-EDDIEに結合する、共有結合で固定化されるか、または膜上で合成されたペプチドリガンドによる、Npro-EDDIE融合タンパク質のための一般的な検出系を表している。融合タンパク質は、ペプチドを含む膜に結合し、融合パートナーは、その内因的な特徴、例えば、GFPの自家蛍光、融合パートナーに対する抗体、融合パートナーの結合特性により検出できる。(本発明に記載した親和性マトリックスの好ましい例として)この膜は特に、水溶液に溶解しないか、または少しだけ溶解し、検出するのが困難なタンパク質を結合するのに適している。好ましくは、ウレアは、本発明に記載したそのようなタンパク質を溶解するために使用する。
この検出系は、ビオチン化ペプチドを膜結合NPro-EDDIE融合タンパク質と結合することによる、Npro-EDDIE融合タンパク質のための一般的な検出系を表している。検出は、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体を用いて行われる。
10 mlの
−上記したとおりのIBから抽出した、融合タンパク質6HisNPro-SGT-GFPmut.3.l溶液
−上記したとおりのIBから抽出した、6HisNPro溶液、および
−上記したとおりのIBから抽出した、6HisNPro-EDDIE溶液
を、50 mM Tris、100 mM NaCl、4 M ウレア緩衝液pH 7.3で、各々先に平衡化した、
−Fractogel-DADPA-SA-VSIFEWカラム
−Fractogel-DADPA-SA-AVSIEWYカラム
−Fractogel-DADPA-SA-AVSFIWYカラム、および
−Fractogel-DADPA-SA-VSFIWYKカラム
に載せた。ロード後、カラムを、15カラム容積の平衡化緩衝液で洗浄した。溶出は、500 mM NaClを加えた、平衡化緩衝液で行った。クロマトグラフィーの間に収集したフラクションをSDS-PAGEで解析し、BSAおよびリゾチームをコントロールタンパク質として使用する。
6His-タグを有するN−末端オートプロテアーゼNproおよびGFPmut3.1を含む、融合タンパク質を発現している組み換え E. coli HMS 174 (DE3)(上記1.1.5を参照のこと)を、10 l発酵槽で培養した。収集後、細胞(850 g 湿重量)を500 mlの50 mM Tris、5 mM EDTA、I %Triton X-100、pH 8.0で懸濁した。冷却した懸濁液を、細胞を破砕するために、800バールで3回、APV-2000高圧ホモジナイザー(Invensys)を通過させる。通過の間、懸濁液を氷上で冷却し、Ultraturraxを用いて破砕する。ホモジネートを低速(JLA 10.500、7500 rpm、30分)で遠心分離し、組み換え融合ポリペプチドを含む封入体を取得する。ペレットを、50 mM Tris/HCl、5 mM EDTA、1 %Triton X-100、pH 8.0で懸濁し、遠心分離する。この段階を繰り返す。水洗浄段階後、ペレットを水で懸濁する。8.9 % の乾燥質量を有する580 mlの封入体懸濁液を取得し、さらなる使用のため−20 ℃で貯蔵する。封入体懸濁液を、室温で、50 mM Tris/HCl、10 M ウレア、50 mM DTT、pH 7.3 で1:5に希釈する。不可溶成分は、遠心分離により除去される。約15 mg/mlのタンパク質濃度が得られる。ポリペプチド溶液は、約2 mg/mlのタンパク質濃度に達するように、50 mM Tris/HCl、100 mM NaCl、4 M ウレア、pH 7.3で希釈する。
Claims (18)
- 固相およびこの固相に結合するペプチド結合を含む親和性リガンドを含む親和性マトリックスであって、ペプチド結合を含む親和性リガンドが、下記のリガンド群:
a)式X1X2X3X4を含むペプチドであって、X1からX4 はアミノ酸残基であり、少なくともX1からX4 の2個がW、YまたはFであるペプチド;
b)式X5X6X7X8を含むペプチドであって、X5 からX8 はアミノ酸残基であり、少なくともX5 からX8 の1個がWであり、そして、少なくともX5 からX8 の1個がEまたはDであるペプチド;および、
c)R、K、EおよびDからなる群のアミノ酸モノマーおよびY、FおよびWからなる群のアミノ酸モノマーからなるポリ−アミノ酸であって、好ましくは、poly-KY、poly-KF、poly-KW、poly-RY、poly-RF、poly-RW、poly-EY、poly-DY、poly-EF、poly-EW、poly-DFおよびpoly-DWであるポリ−アミノ酸、
ただし、a)およびb)に記載したペプチドは、最大、35アミノ酸残基長を有し、c)に記載したポリ−アミノ酸は、最小、20アミノ酸残基長を有する、
から選択される、親和性マトリックス。 - a)およびb)に記載したペプチドが、5〜12、とりわけ6〜8アミノ酸残基長を有する、請求項1に記載の親和性マトリックス。
- 親和性リガンドが化学的に修飾され、とりわけアセチル化され、エステル化され、アミド化され、酸化され、還元されているか、またはリンカー分子と共に提供される、請求項1または2に記載の親和性マトリックス。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の親和性マトリックスであり、ここで、固相がクロマトグラフィー材料、とりわけ、セルロース、アガロース、アクリルアミド、ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)またはエチレングリコール−メタクリル酸塩コポリマーに基づく支持体、またはマイクロタイタープレート、ニトロセルロース膜、マイクロチップ、ガラスプレートまたは金属被膜支持体からなる群から選択されるマトリックス。
- 親和性リガンドが固相と共有結合している、請求項1〜5のいずれか1項に記載の親和性マトリックス。
- 液体出発調製物からのタンパク質の親和性結合に関する方法であって、該タンパク質を、請求項1〜6のいずれか1項に記載の親和性マトリックスとカオトロピック条件下で接触させ、それにより該タンパク質が該マトリックスに結合し、そして、該液体出発調製物から分離される、方法。
- マトリックスに結合した該タンパク質が、該マトリックスに結合したままさらに加工される、請求項7に記載の方法。
- マトリックスに結合した該タンパク質または該加工タンパク質が、好ましくは、液体出発調製物として低カオトロピシティを有する溶出緩衝液を適用することにより、マトリックスから溶出される、請求項7または8に記載の方法。
- 請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法であって、該タンパク質が、自己タンパク質分解部分、および該自己タンパク質分解部分により非カオトロピック条件下で、自己タンパク質分解的に切断できる対象タンパク質からなる部分を含む、異種組み換えポリペプチド、とりわけ自己タンパク質分解部分が、ペスチウイルスのオートプロテアーゼNpro(Npro)または、Npro変異体である融合タンパク質、および変性条件下で封入体として発現するNpro融合タンパク質である、方法。
- 請求項7〜10のいずれか1項に記載の方法であって、ここで、該タンパク質が、生理学的な条件下で高い凝集傾向を有するタンパク質またはタンパク質の部分であるか、または含み、ここで、とりわけ、タンパク質が、Aβペプチド、Tauプリオンタンパク質、α−シヌクレイン、Tau、ADanペプチド、ABriペプチド、シスタチン C、Aβペプチド、スーパーオキシドジスムターゼ、アトロピン 1、ハンチントン、アタキシン、アンドロゲン受容体、TATA box−結合タンパク質、Ig軽鎖、血清アミロイドA、Transthyretin、Transthyretin、β2−ミクログロブリン、アポリポタンパク質A-1、ゲルソリン、Pro−isletアミロイドポリペプチド、プロカルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、リゾチーム、インスリン、フィブリノーゲン、完全長タンパク質または特異的断片からなる群から選択されるタンパク質、変異体、変異型またはそのポリQ伸張である、方法。
- 請求項7に記載した結合を行うことを含む、異種ポリペプチドの製造方法。
- さらに該ポリペプチドの精製を含む、請求項13に記載の方法。
- 対象異種ポリペプチドの親和性結合に関する方法であって、該ポリペプチドが、ペスチウイルスオートプロテアーゼNproまたはその誘導体の融合ポリペプチドとして発現しており、そして、ここで、該融合ポリペプチドを、カオトロピック条件下で、そのような条件下でペスチウイルスオートプロテアーゼNproまたはその誘導体への特異的な結合を発揮するペプチドと接触させ、そして、ここで、該ペプチドが固相に結合する、方法。
- 親和性精製、とりわけ、ペスチウイルスのオートプロテアーゼNpro (Npro)またはNpro変異体、およびNpro融合タンパク質の結合に関する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の親和性リガンドの使用。
- ペスチウイルスのオートプロテアーゼNpro(Npro)またはNpro-変異体、およびNpro融合タンパク質の結合に関する親和性リガンドであり、好ましくは、リガンドが、請求項1a)およびb)、2ならびに5で定義したとおりである、リガンド。
- ペスチウイルスのオートプロテアーゼNpro(Npro)またはNpro-変異体、およびNpro融合タンパク質の結合に関する親和性マトリックスであり、好ましくは、請求項1〜6に記載のマトリックス。
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