ES2342100T3 - Ligandos de afinidad. - Google Patents

Abstract

Método para la unión de afinidad de un polipéptido heterólogo de interés, donde dicho polipéptido se expresa como un polipéptido de fusión de la autoproteasa pestiviral NPro o de sus derivados, y donde dicho polipéptido de fusión se pone en contacto en condiciones caotrópicas con una matriz de afinidad que comprende una fase sólida y un ligando de afinidad que comprende los enlaces peptídicos acoplados a esta fase sólida, donde el ligando de afinidad que comprende el enlace peptídico se selecciona entre el siguiente grupo de ligandos: a) péptidos que comprenden la fórmula X1X2X3X4, donde X1 a X4 son los residuos de aminoácidos y al menos dos de X1 a X4 son W, Y o F; b) péptidos que comprende la fórmula X5X6X7X8, donde X5 a X8 son residuos de aminoácidos, al menos uno de X5 a X8 es W, y al menos uno de X5 a X8 es E o D, y c) poli-aminoácidos que consisten en un monómero de aminoácido del grupo que consiste en R, K, E y D y un monómero de aminoácido del grupo que consiste en S, M y W, preferiblemente poli-KY, poli-KF, poli-KW, poli-RY, poli-RF, poli-RW, poli-EY, poli-DY, poli-EF, poli-EW, poli-DF y poli-DW, con la condición de que los péptidos de acuerdo con a) y b) tendrán una longitud máxima de 35 aminoácidos y que los poli-aminoácidos de acuerdo con c) tienen una longitud mínima de 20 residuos de aminoácidos, y donde dicho polipéptido de fusión se une a dicha matriz en condiciones caotrópicas.

Description

Ligandos de afinidad.

La presente invención se refiere a técnicas y materiales de purificación de afinidad, especialmente para cromatografía de afinidad, y ligandos específicos para su uso en tales técnicas. Más específicamente, la invención se refiere a la captación y purificación de N^{pro}, mutantes de N^{pro}, proteínas de fusión de N^{pro} expresados como cuerpos de inclusión en condiciones de desnaturalización o de proteínas con una alta tendencia a la agregación usando cromatografía de afinidad de péptidos.

La cromatografía de afinidad es una de las técnicas más eficaces para el aislamiento específico de un compuesto a partir de una mezcla compleja, bruta. Los anticuerpos se han aplicado satisfactoriamente como ligandos de afinidad debido a su alta selectividad y su alta afinidad. Un inconveniente de estas matrices de afinidad es su relativa inestabilidad que puede conducir a la lixiviación de los anticuerpos de la matriz de soporte en el producto. Por otro lado la regeneración con tampones alcalinos, que es un procedimiento común en la industria biofarmacéutica, puede conducir a la desnaturalización irreversible y a la pérdida de eficacia de la unión. Los péptidos cortos son capaces de reemplazar a los anticuerpos como ligandos de afinidad. Estas moléculas pequeñas ofrecen alta estabilidad química, eficiencia, selectividad, precio bajo y generalmente no son tóxicos. Estas características se consideran una ventaja frente a ligandos proteicos, especialmente cuando se aplican en un entorno biofarmacéutico. Los péptidos dirigidos contra una molécula diana se pueden identificar a partir de bibliotecas peptídicas combinatorias o bibliotecas biológicas. Las bibliotecas combinatorias sintetizadas químicamente incluyen síntesis pin, bolsita de té, SPOT. Las bibliotecas biológicas incluyen técnicas de presentación en fagos, presentación en bacterias, técnicas
ribosomales.

Por otro lado, una gran cantidad de proteínas muestran una gran tendencia a agregarse en condiciones fisiológicas o su actividad biológica inherente es la agregación como se postuló para las proteínas priónicas o los péptidos amiloides. Con el fin de estudiar estas proteínas éstas tienen que ser solubilizadas en condiciones caotrópicas, mediante la adición de detergentes, en presencia de disoluciones acuosas con pH extremo (ácido o alcalino) y adición de disolventes orgánicos, tales como acetonitrilo, etanol, isopropanol, propanol, piridina. Esto suele ser problemático, si no imposible, especialmente si las proteínas no deben verse perjudicados en su actividad para llevar a cabo nuevas investigaciones después de la solubilización/purificación.

Los materiales comunes aplicados en la cromatografía de afinidad son generalmente compañeros de unión de unión potencial en condiciones cosmotrópicas o fisiológicas, pero no caotrópicas. En consecuencia, los componentes purificados por afinidad con frecuencia eluyen del material de la cromatografía de afinidad mediante la aplicación de condiciones caotrópicas.

La solicitud de patente internacional WO 01/11057 se refiere a un procedimiento para la producción recombinante de una proteína de fusión que comprende una autoproteasa pestiviral N^{pro}.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para la unión de afinidad de un polipéptido heterólogo de interés, donde dicho polipéptido se expresa como polipéptido de fusión de la autoproteasa pestiviral N^{pro} o de sus derivados, y donde dicho polipéptido de fusión se pone en contacto en condiciones caotrópicas con una matriz de afinidad que comprende una fase sólida y un ligando de afinidad que comprende los enlaces peptídicos acoplados a esta fase sólida en la que el ligando de afinidad que comprende el enlace peptídico se selecciona entre el siguiente grupo de ligandos:

1.a)

péptidos que comprenden la fórmula X_{1}X_{2}X_{3}X_{4}, donde X_{1} a X_{4} son residuos de aminoácidos y al menos dos de X_{1} a X_{4} son W, Y o F;

2.b)

péptidos que comprenden la fórmula X_{5}X_{6}X_{7}X_{8}, donde X_{5} a X_{8} son residuos de aminoácidos, al menos uno de X_{5} a X_{8} es W, y al menos uno de X_{5} a X_{8} es E o D, y

3.c)

poli-aminoácidos que consisten en un monómero de aminoácido del grupo que consiste en R, K, E y D y un monómero de aminoácido del grupo formado por Y, F y W, preferiblemente poli-KY, poli-KF, poli-KW, poli-RY, poli-RF, poli-RW, poli-EY, poli-DY, poli-EF, poli-EW, poli-DF y poli-DW,

con la condición de que los péptidos de acuerdo con a) y b) tienen una extensión máxima de 35 residuos de aminoácidos y que los poli-aminoácidos de acuerdo con c) tienen una longitud mínima de 20 residuos de aminoácidos, y donde dicho polipéptido de fusión está unido a dicha matriz en condiciones caotrópicas.

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Preferiblemente, los péptidos de acuerdo con a) y b) (también referidos en la presente memoria como "oligopéptidos"), tienen una longitud de 5 a 12, especialmente de 6 a 8, residuos de aminoácidos. Preferiblemente, está presente al menos un aminoácido cargado positivamente en estos oligopéptidos. Los poli-aminoácidos de acuerdo con c) tienen una longitud preferida de al menos 35 residuos de aminoácidos, más preferida de al menos 50 residuos de aminoácidos, especialmente de al menos 100 residuos de aminoácidos. Los poli-aminoácidos específicamente preferidos son por ejemplo, los poli-aminoácidos disponibles comercialmente para medios de cultivo, tales como poli-KW, 4:1 (PM 20.000 a 50.000 Da; producto SIGMA Núm. P9285), poli-KY, 4:1 (PM 20.000 a 50.000 Da, producto SIGMA Núm. P4695) o poli-KF, 1:1 (PM 20.000 a 50.000 Da, producto SIGMA Núm. P3150).

El ligando de afinidad utilizado en el método de acuerdo con la presente invención puede ser modificado químicamente, especialmente acetilado, esterificado, amidado, oxidado, reducido o provisto de una molécula conectora.

El ligando de afinidad es conectado preferiblemente a la matriz sólida mediante enlaces covalentes. Los ligandos de afinidad y las matrices de acuerdo con la presente invención tienen una alta afinidad para unirse a N^{pro}, sus derivados y sus proteínas de fusión que se pueden expresar como cuerpos de inclusión. Específicamente, estos ligandos o matrices afinidad se unen a N^{pro}, sus derivados y sus proteínas de fusión en condiciones caotrópicas, al menos a la porción N^{pro} por ejemplo de una proteína de fusión. Los ligandos de afinidad de acuerdo con la presente invención ejercen un alto grado de especificidad por su capacidad para unirse selectivamente a N^{pro}, derivados de N^{pro} y sus polipéptidos de fusión en condiciones de desnaturalización. Dentro del alcance de la presente invención, tal ligando de afinidad se dirige contra la parte del polipéptido de fusión de acuerdo con la invención que ejerce la función autoproteolítica. Como material de la fase sólida, todos los materiales que ya se aplican en el presente campo son apropiados. Preferiblemente, la fase sólida se selecciona del grupo que consiste en material cromatográfico, especialmente soportes a base de celulosa, agarosa, acrilamida, poli(estireno-divinilbenceno) o copolímeros de metacrilato de etilenglicol, placas de microtitulación, membranas de nitrocelulosa, microchips, placas de vidrio, o soportes revestidos con metales.

De acuerdo con la presente invención se pueden utilizar diversos tipos de soportes en fase sólida, tales como los soportes a base de celulosa, agarosa (geles Sepharose o Macro-Prep), dextrano (geles Sephadex), acrilamida (geles Sephacryl, Trisacryl), sílice (geles TSK, SW), poli(estireno-divinilbenceno) (geles Source o Poros), copolímeros de metacrilato de etilenglicol (geles Toyopearl HW, TSK, PW, Fractogel EMD) o mezclas, en particular de agarosa y dextrano (gel Superdex). Los soportes aprobados para uso humano o veterinario por las autoridades competentes Estadounidenses (FDA para la alimentación y la administración de fármacos) o los organismos de la Unión Europea serán seleccionados más específicamente. Además, el soporte seleccionado debe estar unido, preferiblemente mediante enlace covalente, al ligando de afinidad de acuerdo con la presente invención (se dice que el soporte está funcionalizado). La matriz en fase sólida puede comprender, como armazón de la matriz, cualquier material sintético o natural y orgánico o inorgánico conocido per se que sea aplicable en la separación en fase sólida de proteínas y otras biomoléculas, por ejemplo, polisacáridos naturales o sintéticos como agar-agar y agarosas; celulosas, éteres de celulosa tales como hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa; almidones; gomas tales como goma guar y goma arábiga, goma ghatti, goma de tragacanto, goma garrofín, goma xantana; pectinas; mucinas; dextranos; quitinas; quitosanos; alginatos; carragenanos; heparinas; gelatinas; polímeros sintéticos, tales como poliamidas, por ejemplo poliacrilamidas y polimetacrilamidas; poliimidas; poliésteres; poliéteres; compuestos poliméricos vinílicos, tales como poli(alcoholes vinílicos) y poliestirenos; polialquenos; materiales inorgánicos, tales como materiales silíceos por ejemplo dióxido de silicio, incluida la sílice amorfa y el cuarzo; sílices; silicatos metálicos, vidrios y cerámicas de poro controlado; óxidos y sulfuros metálicos, o combinaciones de estos materiales naturales o sintéticos y orgánicos o inorgánicos.

El armazón de la matriz se selecciona preferiblemente entre agar-agar, agarosas, celulosas, éteres de celulosa tales como la hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, poliamidas tales como poli(met)acrilamidas, poli(alcoholes vinílicos), sílices y vidrios de poro controlado.

Los materiales en fase sólida especialmente interesantes como armazón de la matriz son, por ejemplo cuentas agar o agarosa tales como las cuentas de Sepharose y Superose de Pharmacia Biotech, Suecia y Biogel A de Biorad, EE.UU.; cuentas con una base de dextrano tales como Sephadex, Biotech Pharmacia; cuentas con una base celulósica y membranas tales como la celulosa Perloza de Secheza, Checoslovaquia; cuentas de material compuesto, tales como Sephacryl y Superdex, Pharmacia Biotech; cuentas de polímeros orgánicos sintéticos como Fractogel de Toso-Haas, EE.UU.; medios POROS de Perceptive Biosystems, EE.UU., Bio-Rex, Bio-Gel P y Macro Prep de Biorad, HEMA y Separon de TESSEK y medios Hyper D y Trisacryl de BioSepra, EE.UU., Enzacryl y Azlactone, 3M, EE.UU.; cuentas de materiales silíceos como el vidrio de poro controlado, PROSEP, de Bioprocesing, Inglaterra y Spherocil, BioSepra; y materiales compuestos de sílice revestidos en forma de cuentas o membranas tales como ACTI-DISK, ACTI-MOD y CycloSep de Arbor Technologies, EE.UU.

Normalmente, el armazón de la matriz en fase sólida, así como la matriz en fase sólida funcionalizada resultante, puede, por ejemplo, estar en forma de partículas irregulares o cuentas esféricas, membranas o láminas, superficies moldeadas, o bastones. El material en fase sólida puede adicionalmente ser total o parcialmente permeable o completamente impermeable a las proteínas. En una realización especialmente interesante de la presente invención, la matriz está en forma de cuentas irregulares o esférica con tamaños en el intervalo de 1-10000 \mum, preferiblemente de 10-1000 \mum; por ejemplo de 10-60 \mum, para aplicaciones de alto rendimiento y por ejemplo de 50-500 micras, preferiblemente de 50-300 micras, para fines preparativos.

Una forma particularmente interesante de matriz es una matriz de densidad controlada en forma de conglomerado que comprende partículas que controlan la densidad. Estos conglomerados son especialmente aplicables en las operaciones a gran escala para cromatografía de lecho fluidificado o expandido, así como diferentes técnicas de cromatografía por lotes en columnas no cargadas, por ejemplo, adsorción de un lote simple en tanques agitados.

Los ligandos de afinidad para su uso en el método de acuerdo con la presente invención pueden anclarse al material en fase sólida mediante cualquier tipo de enlace covalente conocido per se que sea aplicable para este propósito, ya sea por una reacción química directa entre el ligando de afinidad de acuerdo con la presente invención y el material en fase sólida o por una activación anterior del material en fase sólida o del ligando con un reactivo adecuado conocido per se que haga posible conectar el armazón de la matriz y el ligando. Los ejemplos de tales reactivos activadores adecuados son epiclorhidrina, epibromhidrina, alil-glicidileter; bis-epóxidos tales como diglicidileter de butanodiol; compuestos alifáticos sustituidos con halógeno, tales como di-cloro-propanol, divinilsulfona; carbonildiimidazol; aldehídos tales como dialdehído glutárico; quinonas; bromuro de cianógeno; peryodatos tales como meta-peryodato sódico; carbodiimidas; cloro-triazinas tales como cloruro cianúrico; cloruros de sulfonilo tales como cloruros de tosilo y cloruros de tresilo; N-hidroxisuccinimidas; tolueno-4-sulfonatos de 2-fluoro-1-metilpiridinio; oxazolonas; maleimidas; disulfuros de piridilo e hidrazidas. Entre estos, se prefieren los reactivos activadores que dejan un grupo espaciador SP1 diferente desde un enlace sencillo, por ejemplo, epiclorhidrina, epibromhidrina, alil-glicidileter; bis-epóxidos; compuestos alifáticos sustituidos con halógeno; divinilsulfona; aldehídos; quinonas; bromuro de cianógeno; cloro-triazinas; oxazolonas; maleimidas; disulfuros de piridilo e hidrazidas.

Se cree que los reactivos activadores especialmente interesantes son los compuestos epoxídicos tales como la epiclorhidrina, el alil-glicidileter y el diglicidileter de butanodiol.

Para la cromatografía de afinidad del péptido en el alcance de la presente invención, se puede utilizar cualquier matriz útil para la inmovilización de ligandos peptídicos. Preferiblemente Fractogel epoxi (M), de Merck, Darmstadt, Alemania) o se utiliza "medio cromatográfico monolítico" CIM-epoxi igualmente preferido. Los ligandos pueden ser inmovilizados directamente sobre el armazón activado químicamente de la matriz cromatográfica, o a través de un espaciador o conector. En este último caso se acopla un espaciador a la matriz cromatográfica, dicho espaciador se activa después químicamente, con el fin de permitir la unión del ligando. Preferiblemente se utilizan matrices epoxídicas Fractogel combinadas con espaciadores.

En una realización particularmente preferida de la presente invención el espaciador se genera mediante la reacción de la matriz cromatográfica con diaminodipropilamina (DADPA) y posterior reacción con anhídrido succínico (AS). El grupo carboxi terminal resultante en el espaciador es activado químicamente y conectado preferiblemente a un grupo amino terminal. El ligando se inmoviliza en la matriz o en el espaciador a través de un grupo reactivo que lo comprende. En el caso de los ligandos peptídicos tales grupos reactivos pueden ser el grupo amino, carboxi o sulfhidrilo. Dentro de la presente invención es particularmente preferido el anclaje del péptido sobre la matriz o el espaciador a través de un enlace amino.

Preferiblemente, la matriz de afinidad para su uso en el método de acuerdo con la presente invención, proporcionado especialmente como material cromatográfico de afinidad, exhibe ligandos oligopeptídicos como se ha definido en los apartados a) y b) anteriores o poli-amino ácidos como se ha definido en el apartado c) anterior.

Según se utiliza aquí el término "oligopéptidos" se referirá a compuestos proteináceos, que contienen al menos tres aminoácidos. Por lo general, tales oligopéptidos tienen una longitud de hasta 35 aminoácidos, preferiblemente una longitud de 4 a 20 residuos de aminoácidos.

En consecuencia, en una realización preferida de la presente invención el sistema de cromatografía de afinidad utiliza un ligando oligopeptídico de cinco a doce aminoácidos de longitud, más preferido de seis a ocho aminoácidos de longitud, especialmente que comprende un residuo de triptófano, cuyo ligando se une selectivamente a la parte del polipéptido de fusión que ejerce la función autoproteolítica en condiciones caotrópicas y mantiene la unión durante el cambio hacia, así como en, condiciones cosmotrópicas.

Esta forma de cromatografía de afinidad hace uso de la unión específica de ciertos polipéptidos a otros polipéptidos, como se sabe por ejemplo de los anticuerpos. Los oligopéptidos son susceptibles de servir también como ligandos de afinidad. Estas moléculas ofrecen alta estabilidad química, eficiencia, selectividad, bajo precio y generalmente no son tóxicos. Estas características se consideran una ventaja, especialmente cuando se aplican en un procedimiento biofarmacéutico. Los ligandos peptídicos dirigidos contra una molécula diana se pueden identificar a partir de bibliotecas peptídicas combinatorias o bibliotecas biológicas de un modo conocido por el experto en la técnica. En el contexto de la presente invención, el escrutinio de ligandos peptídicos se realizó en condiciones caotrópicas.

Estos ligandos de afinidad para su uso en el método de acuerdo con la presente invención han resultado estar caracterizados específicamente por su capacidad para unirse a N^{pro} y proteínas de fusión de N^{pro} (y las proteínas que son o comprenden sus mutantes) en condiciones de desnaturalización, por ejemplo, urea 4 M.

Los métodos para la síntesis de péptidos conocidos en la técnica, son adecuados para la preparación de los ligandos oligopeptídicos que son objeto de la presente invención. Preferiblemente sin embargo, los ligandos peptídicos generados por síntesis SPOT, síntesis PIN, síntesis de la bolsita de té, método de mezcla y división, descrito por Ruiwu Liu, et al. Experimental Hematology 31 (2003) 11-30 o el método PELICAN, descrito por Joseph A. Buettner et al. Int. J. Peptide Protein Res. 47 (1996), 70-83. Se pueden aplicar varias químicas conectoras para el anclaje del primer aminoácido. En una realización preferida de la presente invención, los ligandos se generan por separado y después de eso se inmovilizan en la matriz cromatográfica. En otra realización preferida de la presente invención, los ligandos peptídicos se sintetizan directamente sobre la matriz cromatográfica.

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El ligando oligopeptídico ejerce un alto grado de especificidad. Los oligopéptidos que se sintetizan dentro del alcance de la presente invención se caracterizan por su capacidad para unirse selectivamente a N^{pro}, derivados de N^{pro} y sus polipéptidos de fusión en condiciones desnaturalizantes. Dentro del alcance de la presente invención tal ligando oligopeptídico se dirige contra la parte del polipéptido de fusión de acuerdo a la invención que ejerce la función autoproteolítica.

En una realización aún más preferida de la presente invención el ligando oligopeptídico tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en VSIFEW, AVSIEWY, AVSFIWY, VSFIWYK, ASRFWYA, AFYTW
YA, AFYRWYK, AFYRWY, AFYRWYA, AVSIFEWY, AVSRNWY, ASRFWY, AFYRWYAA, AFYRWY, ASRFW
YAA, AFYRWYAA y AFYSWYAA.

Dentro del alcance de la presente invención los ligandos oligopeptídicos se pueden utilizar con un extremo N libre o con un extremo N bloqueado, lográndose el bloqueo, por ejemplo mediante ac(et)ilación.

Es más preferida una realización de la presente invención, donde el derivado N^{pro} de VPPC de origen natural de acuerdo con el SEQ ID NO 5 (puesto que la secuencia de aminoácidos de este mutante tiene un motivo de secuencia "EDDIE" de los residuos 53 a 57 (en lugar de "RGDIR" en el tipo salvaje), este mutante (y otros mutantes que componen este motivo) se denomina mutante "EDDIE" en la presente memoria) se utiliza combinado con un ligando oligopeptídico seleccionado del grupo consistente en ASRFWYA, AFYTWYA, AFYRWYK, AFYRWY y AFYRW
YA.

En consecuencia, los ligandos de afinidad preferidos se seleccionan del grupo formado por VSDDWY, VSEDWY, VSIDWY, VSYDWY, VSVDWY, VSWDWY, VSYDWY, VSFDWY, VSDEWY, VSEEWY, VSIEWY, VSYEWY, VSVEWY, VSWEWY, VSYEWY, VSFEWY, DDDDWY, DDEDWY, DDIDWY, DDYDWY, DDVDWY, DDWDWY, DDYDWY, DDFDWY, VSIFWE, FSIFEW, WSIFEW, VSLIWY, VSLIDW, VSLIEW, VSLIWE, FSLEEW, VSDLD
W, VSDLEW, VSYIDW, VSYIWE (todos estos péptidos se unen a N^{pro} a pH 5,5), VSIDWY, VSIEWY, VSIWWY, VSIIWY, VSYIWY, VSVIWY, VSFIWY, VSFIWE, VSIFEW, VSIFWE, FSIFEW, WSIFEW, VSLIWY, VSLIDW, VSLIEW, VSLIWE, FSLIEW, WSLIEW, FSYFEW, FSFYEW, WSFYEW, FSYIEW, WSYIEW (todos estos péptidos se unen a N^{pro} a pH 7,3), AFYTWYA, AFYRWYK, AFYRWY, AFYRWYA, AFFRWYA, AFGRWYA, AFHRW
YA, AFIRWYA, AFLRWYA, AFMRWYA, AFNRWYA, AFPRWYA, AFQRWYA, AFRRWYA, AFSRWYA, AF
TRWYA, AFVRWYA, AFYRWYA, AFYFWYA, AFYGWYA, AFYLWYA, AFYMWYA, AFYNWYA, AFYPWYA, AFYTWYA, AFYVWYA, AFYWWYA, AFYYWYA, AKWFRYA, VSRNWY, ASRNWYA, ASRFWYA, FSRNW
YA, VFRNWYA, VWRNWYA, VYRNWYA, VSRAWYA, VSRFWYA, VSRWWYA, VSRYWYA, VSRNFYA, VSR
NYYA, VSRNWFA, VSRNWWA (todos estos péptidos tienen una afinidad específicamente alta por los mutantes de N^{pro} con el motivo EDDIE en los residuos aminoácidos 53 a 57), Ac-AFYTWYAK, Ac-AFYRWYKK, Ac-AFYRWYK, Ac-AFYRWYAK, Ac-AFFRWYAK, Ac-AFGRWYAK, Ac-AFHRWYAK, Ac-AFIRWYAK, Ac-AFLR
WYAK, Ac-AFMRWYAK, Ac-AFNRWYAK, Ac-AFPRWYAK, Ac-AFQRWYAK, Ac-AFRRWYAK, Ac-AFSRWY
AK, Ac-AFTRWYAK, Ac-AFVRWYAK, Ac-AFYRWYAK, Ac-AFYFWYAK, Ac-AFYGWYAK, Ac-AFYLWYAK, Ac-AFYMWYAK, Ac-AFYNWYAK, Ac-AFYPWYAK, Ac-AFYTWYAK, Ac-AFYVWYAK, Ac-AFYWWYAK, Ac-AFYYWYAK, Ac-AKWFRYAK, Ac-VSRNWYK, Ac-ASRNWYAK, Ac-ASRFWYAK, Ac-FSRNWYAK, Ac-VFRNWYAK, Ac-VWRNWYAK, Ac-VYRNWYAK, Ac-VSRAWYAK, Ac-VSRFWYAK, Ac-VSRWWYAK, Ac-VSRYWYAK, Ac-VSRNFYAK, Ac-VSRNYYAK, Ac-VSRNWFAK, Ac-VSRNWWAK, YWKA, Ac-YWKAK, YK
YA, Ac-YKYAK, YWRA, Ac-YWRAK, ARWY, Ac-ARWYK, YWRA, Ac-YWRAK (todos estos péptidos han mejorado las capacidades de inmovilización en el sustrato debido a la acetilación N-terminal y la lisinación C-terminal).

Una característica específica de la matriz de afinidad para su uso en el método de acuerdo con la presente invención es que se una específicamente a la autoproteasa N^{pro} de pestivirus (N^{pro}) o mutantes de N^{pro}, y proteínas de fusión de N^{pro}. La unión de estas proteínas a las presentes matrices es tan eficaz que las proteínas también se unen usualmente en condiciones no caotrópicas. Por lo tanto, las matrices de acuerdo con la presente invención se diseñan específicamente con respecto a la fase sólida y al ligando de afinidad para permitir una unión eficaz de la autoproteasa N^{pro} de pestivirus (N^{pro}) o los mutantes de N^{pro}, y las proteínas de fusión de N^{pro}, en condiciones caotrópicas y no caotrópicas.

De acuerdo con otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método para la unión de afinidad de una proteína a partir de una preparación de partida líquida, en el que dicha proteína se pone en contacto con una matriz de afinidad de acuerdo con la presente invención en condiciones caotrópicas con lo que dicha proteína se une a dicha matriz y se separa de dicha preparación de partida líquida.

Los términos "cosmotropo" (creador de orden) y "caotropo" (creador de desorden) originalmente denotaban solutos que estabilizaban, o desestabilizaban respectivamente, proteínas y membranas. Más tarde se refirieron a la propiedad aparentemente correlacionada de aumento, o disminución respectivamente, de la estructuración del agua. Tales propiedades pueden variar en función de las circunstancias, el método de determinación o la capa o capas de solvatación investigadas. Un término alternativo utilizado para cosmotropo es "soluto compensador", ya que se ha encontrado que compensa los efectos perjudiciales de los altos contenidos de sales (que destruyen la red natural de enlaces de hidrógeno del agua) en las células sometidas a tensión osmótica. Tanto la extensión como la fuerza de los enlaces de hidrógeno pueden ser cambiadas de forma independiente por el soluto, pero cualquiera de éstas pueden ser, y han sido, utilizadas como medidas de la creación de orden. No obstante, lo que es de suma importancia son los efectos sobre el grado de calidad de los puentes de hidrógeno. Los efectos de ordenamiento de los cosmotropos pueden ser confusos por su rotación difusa, lo que crea zonas unión desorganizada más extensas de mayor desorden con la masa de agua circundante que los caotropos menos hidratados. La mayoría de cosmotropos no ocasionan una red de estructuración a gran escala en el agua.

Los cosmotropos iónicos (o: "anticaotropos" para distinguirlos de cosmotropos no iónicos) deben ser tratados de manera diferente a cosmotropos no iónicos, debido principalmente a los ordenamientos dirigidos y polarizados de las moléculas de agua que los rodean. En general, el comportamiento iónico es paralelo a la serie de Hofmeister. Grandes iones con una sola carga, con baja densidad de carga (por ejemplo, iones SCN^{-}, H_{2}PO_{4}^{-}, HSO_{4}^{-}, HCO_{3}^{-}, Me^{-}, Cl^{-}, NO_{3}^{-}, NH_{4}^{+}, Cs^{+}, K^{+}, (NH_{2})_{3}C^{+} (guanidinio) y (CH_{3})_{4}N^{+} (tetrametilamonio); que exhiben interacciones más débiles con el agua que el agua consigo misma e interfieren de este modo poco en el enlace de hidrógeno del agua circundante), son caotropos mientras que los iones pequeños o con carga múltiple, con alta densidad de carga, son cosmotropos (por ejemplo, SO_{4}^{2-}, HPO_{4}^{2-}, Mg^{2+}, Ca^{2+}, Li^{+}, Na^{+}, H^{+}, OH^{-} y HPO_{4}^{2-}, que exhiben una mayor interacción con las moléculas de agua que el agua consigo misma y por lo tanto son capaces de romper los enlaces de hidrógeno del agua con el agua). Los radios de los iones caotrópicos con una sola carga son mayores de 1,06\ring{A} para los cationes y mayores de 1.78\ring{A} para los aniones. Así, el enlace de hidrógeno entre las moléculas de agua se rompe más en las inmediaciones de los cosmotropos iónicos que de los caotropos iónicos. Reforzando esta conclusión, un estudio espectroscópico Raman de la estructura de enlaces de hidrógeno del agua alrededor de los iones haluro F^{-}, Cl^{-}, Br^{-} e I^{-} indica que la extensión total de enlaces de hidrógeno acuosos aumenta al aumentar el tamaño iónico y un estudio de IR en HDO: D_{2}O mostró una lenta reorientación de los enlaces de hidrógeno en torno a estos iones haluro cada vez más lento con respecto al aumento de tamaño. Es razonable que un soluto pueda reforzar algunos de los enlaces de hidrógeno que lo rodean (formador de la estructura; por ejemplo, los cationes cosmotrópicos reforzarán los enlaces de hidrógeno donados por las moléculas de agua de la cubierta interior), mientras que al mismo tiempo se rompen algunos otros enlaces de hidrógeno (desorganizador de la estructura; por ejemplo, los cationes cosmotrópicos debilitarán los enlaces de hidrógeno aceptados por las moléculas de agua de la cubierta interior). Siendo iguales otros factores, las moléculas de agua son mantenidas con más fuerza por moléculas con una carga neta que por moléculas sin carga neta; como se muestra mediante la diferencia entre los aminoácidos zwitteriónicos y
catiónicos.

Los iones débilmente hidratados (caotropos, K^{+}, Rb^{+}, Cs^{+}, Br^{-}, I^{-}, guanidinio^{+}) pueden ser "empujados" sobre las superficies débilmente hidratadas por interacciones agua-agua fuertes con transición de hidratación iónica fuerte a hidratación iónica débil que ocurre cuando la fuerza de la hidratación ión-agua iguala aproximadamente la fuerza de las interacciones agua-agua en la disolución bruta (siendo Na^{+} limítrofe en el lado fuerte y siendo Cl^{-} limítrofe en el lado débil). Los estudios de difracción de neutrones en dos caotropos importantes (iones tiocianato y guanidinio) muestran su muy escasa hidratación, apoyando la sugerencia de que interactúan preferentemente con la proteína en lugar de con el agua. En contraste con los cosmotropos, hay una pequeña diferencia significativa entre las propiedades de los caotropos iónicos y no iónicos debido a la baja densidad de carga de los primeros.

La estabilización óptima de macromolécula biológica por la sal requiere una mezcla de un anión cosmotrópico con un catión caotrópico.

Los caotropos rompen la red de enlaces de hidrógeno del agua, permitiendo de este modo a las macromoléculas más libertad estructural e incitando la extensión y desnaturalización de la proteína. Los cosmotropos son solutos estabilizadores que aumentan el orden del agua (tales como alcoholes polihidroxilados, trehalosa, N-óxido de trimetilamina, glicina-betaína, ectoína, prolina y otros varios zwitteriones), mientras que los caotropos crean enlaces de hidrógeno más débiles, disminuyendo el orden de agua, aumentando su tensión superficial y desestabilizando las estructuras macromoleculares (tales como cloruro de guanidinio y urea al altas concentraciones). Un trabajo reciente ha demostrado que la urea debilita tanto los enlaces de hidrógeno como las interacciones hidrofóbicas pero la glucosa actúa como cosmotropo, potenciando estas propiedades. Así, cuando las moléculas de urea tienen una hidratación menos que óptima (alrededor de 6 a 8 moles de agua por mol de urea), el hidrógeno de la urea se une con sigo mismo y la proteína (implicando significativamente las conexiones peptídicas) en ausencia de suficiente agua, volviéndose así más hidrófobo y por lo tanto más capaz de interactuar con nuevos sitios sobre la proteína, conduciendo a la desnaturalización localizada inducida por la deshidratación. El guanidinio es un ión planar que puede formar enlaces débiles de hidrógeno alrededor de su margen, pero puede establecer pares de iones unidos mediante hidrógeno mantenidos firmemente con carboxilatos de proteínas, de una manera similar a las conexiones de "sal" arginina-carboxilato estructurales cuaternarias. Además, el guanidinio posee bastantes superficies hidrófobas que pueden interactuar con superficies proteicas similares para posibilitar la desnaturalización de las proteínas. Ambos desnaturalizantes pueden causar la hinchazón y desestructuración de las proteínas mediante el deslizamiento entre los sitios hidrófobos y, el consiguiente arrastre en el agua unida mediante hidrógeno para completar la desnaturalización.

En general, la naturaleza cosmotrópica/caotrópica de un soluto se determina a partir de las propiedades físicas brutas del agua, a menudo a una concentración necesariamente alta. El cambio en el grado de estructuración se puede encontrar, por ejemplo, utilizando RMN o espectroscopia vibracional. Los solutos estabilizadores de proteínas (cosmotropos) aumentan la extensión de los enlaces de hidrógeno (reduciendo los tiempos de relajación espín-retículo de los protones y el O^{17}), mientras que el desplazamiento químico del RMN puede aumentar (mostrando una unión más débil por ejemplo, el cosmotropo zwitteriónico, N-óxido de trimetilamina) o disminuir (mostrando una unión más fuerte por ejemplo, el cosmotropo polihidroxilado, trehalosa). La trehalosa muestra tanto una reducción del desplazamiento químico como del tiempo de relajación, como, en menor medida lo hace el estabilizador de proteínas (NH_{4})_{2}SO_{4},
mientras que el NaCl sólo muestra una reducción del desplazamiento químico y el desestabilizador de proteínas KSCN muestra un aumento del tiempo de relajación y una reducción del desplazamiento químico. La espectroscopia vibracional puede hacer uso de la longitud de onda IR cercana, próxima a 5200 cm^{-1} (combinación v_{2} + v_{3}), que se desplaza hacia longitudes de onda mayores (menor número de onda) cuando los enlaces de hidrógeno son más fuertes.

Uno de los cosmotropos más importante es el azúcar no reductor, \alpha,\alpha-trehalosa. Tal vez hay que señalar que la trehalosa tiene una estructura mucho más estática que los azúcares reductores, debido a su falta de mutarrotación, o el otro disacárido común no reductor, sacarosa, debido a su carencia de un anillo de furano.

Por consiguiente, el término "condiciones caotrópicas" tiene que ser considerado individualmente, basándose en la naturaleza de la preparación líquida de partida (que puede, por ejemplo, ser una disolución, una suspensión, una emulsión, un sistema líquido de dos o tres fases, etc.), especialmente - en las preparaciones que contienen más de una fase - en la fase acuosa de la preparación. Las condiciones caotrópicas preferidas de acuerdo con la presente invención son aquellas que corresponden a una concentración de urea de 1 a 7 M, especialmente de 2 a 6 M (preferiblemente en una disolución salina tamponada, tal como 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na_{2}HPO_{4}, 0,24 g de KH_{2}PO_{4} en 1000 ml con A. dest., pH 7,4 con HCl). La correspondencia de las condiciones caotrópicas (así como la reducción del carácter caotrópico (condiciones caotrópicas "inferiores" o "menores")) se puede determinar fácilmente mediante los métodos mencionados anteriormente, así como mediante la aplicación de las enseñanzas de la serie de Hofmeister. La adición de diversas sustancias al líquido de partida ha de comprobarse en cada caso con el fin de proporcionar condiciones de unión/no agregación óptimas. Por ejemplo, el uso de agentes reductores debería ser optimizado para corresponder a una cantidad de 0,05 a 50 mM de ditiotreitol (DTT), especialmente de 0,1 a 10 mM de DTT. Por otra parte, también la adición de detergentes puede, como se ha descrito anteriormente, influir en el carácter caotrópico de la preparación de partida.

Preferiblemente, la proteína unida a la matriz se transforma adicionalmente mientras está unida a dicha matriz. Tal transformación adicional puede ser preferiblemente una derivatización química, una complejación, una degradación, etc., especialmente (en el caso de una proteína de fusión con una fracción autocatalítica) autoproteolisis. Este tratamiento adicional también puede llevarse a cabo preferiblemente en condiciones que son menos caotrópicas que en la sustancia de partida. Por lo general, las condiciones óptimas para estas etapas de transformación adicionales dependen de las condiciones óptimas para la propia reacción de transformación equilibrada con las necesidades de mantenimiento de la afinidad de la proteína unida a la matriz de afinidad al ligando de afinidad.

Para proporcionar la proteína unida y opcionalmente transformada en forma soluble, la proteína tiene que ser eluida de nuevo del portador o - si se proporciona como una proteína de fusión que comprende una porción autoproteolítica y una porción proteica diana - al menos la porción proteica diana de la proteína de fusión. Esto se puede realizar de muchas maneras. En el caso de una proteína de fusión con una fracción autocatalítica, la elución se lleva a cabo mediante la reacción autoproteolítica. En este caso, al fracción autoproteasa permanece en la matriz de afinidad. En otros casos, la proteína unida a la matriz o dicha proteína transformada se mantiene en la matriz, preferiblemente aun cuando se aplique un tampón de elución con un menor carácter caotrópico como preparación líquida de partida. Preferiblemente, al menos la porción autoproteolítica de la proteína de fusión se mantiene unida a la matriz.

En otros casos, la proteína se puede mantener en la matriz de afinidad y se utiliza como un producto inmovilizado, por ejemplo, para proporcionar enzimas inmovilizadas. Debido a la unión no covalente, pero sin embargo fuerte, de la proteína a la superficie sólida, la enzima inmovilizada se puede utilizar en procedimientos industriales, especialmente proporcionando (enzimáticamente, catalíticamente) superficies activas, si la proteína inmovilizada tiene actividades enzimáticas.

De acuerdo con la presente invención, la proteína es un polipéptido recombinante heterólogo que comprende una fracción autoproteolítica y una fracción que consiste en una proteína de interés que es escindible autoproteolíticamente en condiciones no caotrópicas por dicha fracción autoproteolítica, donde la fracción autoproteolítica es la autoproteasa N^{pro} de pestivirus (N^{pro}) o mutantes de N^{pro}, y proteínas de fusión de N^{pro} expresados como cuerpos de inclusión en condiciones de desnaturalización.

De acuerdo con una realización preferida del procedimiento descrito anteriormente, el polipéptido de fusión comprende un derivado de una autoproteasa N^{pro} del VPPC, donde además de la sustitución de al menos un residuo de cisteína como se ha descrito anteriormente, al menos un residuo de aminoácido alcalino se sustituye por un residuo de aminoácido ácido.

Además se da un preferencia adicional a un derivado de una autoproteasa N^{pro} del VPPC, donde además de la sustitución de al menos un residuo de cisteína como se ha descrito anteriormente, se intercambian también al menos uno de los siguientes aminoácidos: H5, K16, N35, R53, G54, R57, L143, K145 y R150. Un ejemplo preferido es un derivado en el que se intercambian los siguientes aminoácidos: la arginina (R) 53 por el ácido glutámico (E), la glicina (G) 54 por el ácido aspártico (D), la arginina (R) 57 por el ácido glutámico (E), y la leucina (L) 143 por la glutamina (Q).

Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere con una preferencia adicional a un procedimiento como el descrito anteriormente, en el que el polipéptido de fusión comprende un derivado de una autoproteasa N^{Pro} del VPPC, donde además de la sustitución de al menos un residuo de cisteína como se ha descrito anteriormente, se intercambian los siguientes aminoácidos: la arginina (R) 53 por el ácido glutámico (E), la glicina (G) 54 por el ácido aspártico (D), la arginina (R) 57 por el ácido glutámico (E) y la leucina (L) 143 por la glutamina (Q).

En otra realización preferida de la presente invención un derivado de la autoproteasa N^{pro} del VPPC comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Así, en otro aspecto la presente invención se refiere también a un procedimiento como el descrito anteriormente, en el que el polipéptido de fusión comprende un derivado de una autoproteasa N^{pro} de VPPC que tiene una secuencia de acuerdo con el SEQ ID NO 3.

En otro aspecto más la presente invención se refiere a un derivado de N^{pro} de origen natural de un Pestivirus que muestra, además de una reducción de la agregación y un pI más neutro, un aumento adicional de la solubilidad en comparación con N^{pro} de origen natural de un Pestivirus.

La solubilidad se determina como se ha descrito anteriormente.

En consecuencia, la presente invención se refiere a un derivado de una autoproteasa N^{pro} del VPPC, donde, además de la sustitución de al menos un residuo de cisteína como se ha descrito anteriormente, se sustituye al menos un residuo de aminoácido hidrófobo por un residuo hidrófilo.

Así, en otro aspecto la presente invención se refiere también a un procedimiento como el descrito anteriormente, en el que el polipéptido de fusión comprende un derivado de una autoproteasa N^{pro} del VPPC, donde además de la sustitución de al menos un residuo de cisteína como se ha descrito anteriormente, se sustituye al menos un residuo de un aminoácido hidrófobo por un residuo hidrófilo.

En la presente invención se prefiere un derivado de una autoproteasa N^{pro} del VPPC, donde además de la sustitución de al menos un residuo de cisteína como se ha descrito antes se sustituyen también al menos uno de los siguientes aminoácidos: V24, A27, L32, G54, L75, A109, V114, V121, L143, I155 y F158. Un ejemplo preferido es un derivado en el que se intercambian los siguientes aminoácidos por treonina (T): alanina (A) 109, valina (V) 114, isoleucina (I) 155 y fenilalanina (F) 158.

Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere preferiblemente a un procedimiento como el descrito anteriormente, en el que el polipéptido de fusión comprende un derivado de una autoproteasa N^{pro} del VPPC, donde además de la sustitución de al menos un residuo de cisteína como se ha descrito anteriormente, los siguientes aminoácidos se sustituyen por treonina (T): alanina (A) 109, valina (V) 114, isoleucina (1) 155 y fenilalanina (F) 158. Otro derivado más preferido dentro de la presente invención de una autoproteasa N^{pro} del VPPC, comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Así, en otro aspecto la presente invención se refiere más preferiblemente a un procedimiento como el descrito anteriormente, en el que el polipéptido de fusión comprende un derivado de una autoproteasa N^{pro} del VPPC que tiene una secuencia de acuerdo con el SEQ ID NO 4.

Aún más preferido en la presente invención es un derivado de una autoproteasa N^{pro} del VPPC, donde además de la sustitución de al menos un residuo de cisteína como se ha descrito anteriormente, se han intercambiado los siguientes aminoácidos: la alanina (A) 109, la valina (V) 114, la isoleucina (I) 155 y la fenilalanina (F) 158 por treonina (T), la arginina (R) 53 por ácido glutámico (E), la glicina (G) 54 por ácido aspártico (D), la arginina (R) 57 por ácido glutámico (E) y la leucina (L) 143 por glutamina (Q).

Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere aún más preferiblemente a un procedimiento como el descrito anteriormente, en el que el polipéptido de fusión comprende un derivado de una autoproteasa N^{pro} del VPPC, donde además de la sustitución de al menos un residuo de cisteína como se ha descrito anteriormente se han intercambiado los siguientes aminoácidos: la alanina (A) 109, la valina (V) 114, la isoleucina (I) 155 y la fenilalanina (F) 158 por treonina (T); la arginina (R) 53 por ácido glutámico (E), la glicina (G) 54 por ácido aspártico (D), la arginina (R) 57 por ácido glutámico (E) y la leucina (L) 143 por glutamina (Q).

Muy preferiblemente el derivado de una autoproteasa N^{pro} del VPPC de acuerdo con la presente invención comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

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Así, en otro aspecto muy preferido la presente invención se refiere también a un procedimiento como el descrito anteriormente, en el que el polipéptido de fusión comprende un derivado de una autoproteasa N^{pro} del VPPC que tiene una secuencia de acuerdo con el SEQ ID NO 5.

En otro aspecto igualmente preferido la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de proteínas heterólogas como se ha descrito anteriormente, donde el polipéptido de fusión comprende un derivado de una autoproteasa N^{pro} del VPPC que tiene una secuencia de acuerdo con el SEC. ID NO. 5, donde además la asparagina (N) 35 se sustituye por treonina (T) y la treonina (T) 158 se sustituye por serina (S).

En otro aspecto preferido la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de proteínas heterólogas como se ha descrito anteriormente, en el que el polipéptido de fusión comprende un derivado de un autoproteasa N^{pro} del VPPC que tiene una secuencia de acuerdo con el SEC. ID NO. 32, donde además la alanina (a) 28 se sustituye por ácido glutámico (E), la serina (S) 71 se sustituye por fenilalanina (F) y la arginina (R) 150 se sustituye por histidina (H).

Preferiblemente en el procedimiento de acuerdo con la presente invención el derivado de una autoproteasa N^{pro} del VPPC se utiliza en la fusión con una proteína que contiene al menos los tres primeros aminoácidos de la proinsulina, más preferiblemente con la proinsulina, incluso más preferiblemente con la proinsulina humana, muy preferiblemente con proinsulina humana recombinante, para la producción de proinsulina.

Es preferible de acuerdo con la presente invención, que el derivado de una autoproteasa N^{pro} del VPPC tenga, además de la sustitución de al menos un residuo de cisteína como se ha descrito anteriormente, intercambiados al menos uno de los siguientes aminoácidos: la arginina (R) 53, la glicina (G) 54, la arginina (R) 57, la treonina (T) 109, 114, 155, 158 y la leucina (L) 143. Los derivados preferidos de la autoproteasa N^{pro} del VPPC de acuerdo con la presente invención tienen, además de la sustitución de al menos un residuo de cisteína como se ha descrito anteriormente, intercambiados los siguientes aminoácidos: la arginina (R) 53 por el ácido glutámico (E), la glicina (G) 54 por ácido aspártico (D), la arginina (R) 57 por el ácido glutámico (E), la treonina (T) 109, 114, 155, 158 por serina (S) y la leucina (L) 143 por glutamina (Q) o asparagina (N) o ácido aspártico (D) o serina (S) o histidina. En otras realizaciones, especialmente cuando la proteína de fusión debe estar unida a la matriz de afinidad de acuerdo con la presente invención también en condiciones no caotrópicas, la porción autoproteolítica de la proteína de fusión debe estar inactiva o ser suministrada en forma no escindible. Después se utiliza sólo por sus propiedades de afinidad y no debido a sus propiedades autoproteolíticas; sin embargo, también los derivados de N^{pro} del VPPC que lo hacen - por sí mismos o por su unión a la porción molécula diana de la proteína de fusión - no exhiben una actividad autoproteolítica cuando se unen a la matriz de afinidad de acuerdo con la presente invención - ni siquiera en condiciones no caotrópicas (fisiológicas, "normales"), también son referidos como (fracción) "autoproteolítica".

Preferiblemente, la fracción autoproteolítica se selecciona del grupo que consiste en

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Una gran cantidad de proteínas muestran una gran tendencia a agregarse en condiciones fisiológicas o su actividad biológica inherente es la agregación, como se postula para las proteínas priónicas o los péptidos amiloides. Con el fin de estudiar estas proteínas, éstas tienen que ser solubilizadas en condiciones caotrópicas, mediante la adición de detergentes, en presencia de disoluciones acuosas con pH extremo (ácido o alcalino) y la adición de disolventes orgánicos tales como acetonitrilo, etanol, isopropanol, propanol, piridina etc. Los péptidos amiloides con alta tendencia a la agregación están implicados en un gran número de enfermedades. Un resumen de las principales amiloidosis y de las proteínas o péptidos implicados (Las afecciones que afectan el sistema nervioso central están escritos en cursiva):

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Otra clase de proteínas de las proteínas de membrana se asocian con la denominada bicapa membranosa. Las membranas biológicas cumplen funciones vitales como interfases con el mundo exterior, como interfases entre las células, y como límites de los compartimentos intracelulares. Así, las membranas biológicas están relacionadas con numerosas enfermedades tales como la hiperinsulinemia, la diabetes insípida nefrogénica, la insuficiencia cardíaca congestiva, la cirrosis hepática, la fibrosis quística, la hiper e hipotensión, el edema pulmonar, la epilepsia, y las cataratas. Alrededor del 30% de los genes secuenciados codifican proteínas de membrana. Sin embargo, sólo 30 estructuras únicas de proteínas de membrana se han resuelto con resolución atómica en comparación con las 3000 estructuras cristalinas únicas de las proteínas solubles, porque es difícil de producir cristales tridimensionales (3D) adecuados para los análisis de rayos X de las proteínas de membrana solubilizadas con detergente. Entre las 67 estructuras de proteínas de membrana depositadas en la base de datos de proteínas, 52 son de origen bacteriano, lo que sugiere que las proteínas de membrana bacterianas son más fáciles de producir, purificar y cristalizar que las de plantas o animales. El reto ahora es resolver la estructura de las proteínas de membrana de los organismos superiores y estudiar su función, dinámica e interacción con los ligandos. Las proteínas de membrana constituyen una diana terapéutica importante para una gran variedad de enfermedades. Preferiblemente, estas proteínas ("proteínas diana") están unidas como proteínas de fusión a la matriz de afinidad. Si las proteínas diana se deben proporcionar o utilizar en forma inmovilizada, la parte autoproteolítica de la molécula de fusión se deberá proporcionar en forma inactiva o no escindible. La porción autoproteolítica sólo sirve a continuación como asa o etiqueta de afinidad para inmovilizar la proteína diana en la matriz de afinidad también en condiciones no caotrópicas.

Las enfermedades priónicas, como la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob variante (ECJv) en las personas y la tembladera en ovinos, se caracterizan por el depósito de PrP^{Sc}, una proteína amiloide anormal, en el cerebro. Al cambiar la conformación de la PrP^{c}, la PrP^{Sc} se propaga por todo el cerebro de las personas y animales infectados, causando neurodegeneración y muerte. Con los años, se han desarrollado muchos anticuerpos para su uso en la investigación básica y el diagnóstico que reconocen PrP^{c} sola o PrP^{c} y PrP^{Sc}. Sin embargo, los anticuerpos específicos de PrP^{Sc} han sido más esquivos.

Las proteínas de membrana (Proteínas transmembrana (proteínas integrantes)): las proteínas de membrana en barril beta se producen en las membranas externas de las bacterias Gram-negativas, las mitocondrias y los cloroplastos. Las secuencias que abarcan la membrana de las proteínas de membrana en barril \beta son menos hidrófobas que las proteínas de membrana en hélice \alpha, lo que probablemente es la razón principal de su plegamiento completamente diferente y de que las rutas de ensamblaje con la membrana hayan evolucionado para estas dos clases de proteínas de membrana. Algunas proteínas de membrana en barril \beta se pueden replegar de forma espontánea en membranas modelo de la bicapa lipídica in vitro. También pueden tener esta capacidad in vivo a pesar de que los lípidos y las proteínas chaperonas probablemente ayudan a su ensamblaje en las membranas diana apropiadas. Otras proteínas de membrana importantes son los superantígenos.

El presente método es muy adecuado para proporcionar proteínas intactas purificadas (y opcionalmente inmovilizadas) que usualmente tienen (en condiciones fisiológicas) una alta tendencia a agregarse y por lo tanto no pueden purificarse por métodos convencionales, especialmente por técnicas de purificación de afinidad. Puesto que las matrices de afinidad de acuerdo con la presente invención tienen la capacidad de unirse a proteínas en condiciones caotrópicas, el presente método puede ser utilizado para purificar por afinidad tales proteínas difíciles, especialmente aquellas proteínas que están relacionadas con enfermedades humanas. En consecuencia, en una realización preferida de la presente invención la proteína que se va a unir a la presente matriz de afinidad es o comprende una proteína o fracción proteica que tiene una gran tendencia a agregarse en condiciones fisiológicas, en especial una proteína seleccionada del grupo que consiste en Péptidos A\beta, Proteína priónica Tau, \alpha-sinucleína, Tau, Péptido ADan, Péptido ABri, Cistatina C, Péptidos A\beta, Superóxido dismutasa, Atrofina 1, Huntingtina, Ataxinas, Receptor de andrógenos, Proteína de unión a la caja TATA, Cadenas ligeras de Ig, Apolipoproteína A, Transtiretina, Transtiretina, Microglobulina \beta2, Apolipoproteína A-1, Gelsolina, Polipéptido amiloide pro-islotes, Procalcitonina, Factor natriurético atrial, Lisozima, Insulina, Fibrinógeno, proteínas completas o fragmentos específicos, mutantes, variantes o sus expansiones poliQ.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el método actual se utiliza para la preparación de un polipéptido heterólogo, donde dicho polipéptido se expresa como polipéptido de fusión de la autoproteasa pestiviral N^{pro} o de sus derivados, y donde dicho polipéptido de fusión se pone en contacto en condiciones caotrópicas con un péptido que ejerce en tales condiciones específicas la unión a la autoproteasa pestiviral N^{pro} o sus derivados, y donde dicho péptido se une a una fase sólida. Preferiblemente, tal procedimiento comprende adicionalmente la purificación de dicho polipéptido.

Los ligandos de afinidad (las matrices de afinidad) para su utilización en el método de acuerdo con la presente invención tienen la propiedad de unirse de forma selectiva en condiciones caotrópicas a la autoproteasa N^{pro} de pestivirus (N^{pro}) o mutantes de N^{pro}, y polipéptidos de fusión de N^{pro} de los dos primeros, y para mantener esta unión específica durante el cambio hacia, así como en, condiciones cosmotrópicas. El rasgo característico de los ligandos de afinidad de acuerdo con la presente invención es su especificidad de unión a las proteínas, especialmente Npro, mutantes de Npro, polipéptidos de fusión y proteínas altamente agregantes, en condiciones caotrópicas. Este rasgo las hace útiles en cualquier tipo de entorno experimental que requiera la unión específica de proteínas en condiciones caotrópicas. Además, la unión específica se puede mantener durante un cambio hacia y en condiciones cosmotrópicas. De ello se deduce que los péptidos descritos antes se pueden utilizar en los entornos experimentales que requieren unión de la molécula diana desnaturalizada y el mantenimiento de la unión durante el replegamiento y la renaturalización de la proteína. En consecuencia los péptidos anteriormente descritos pueden ser utilizados por ejemplo en la captura y purificación de N^{pro} en condiciones desnaturalizantes, usando cromatografía de afinidad para péptidos, o bien para otras formas de purificación de afinidad o de análisis de afinidad que implican la interacción de un ligando y la proteína en condiciones caotrópicas.

Por ejemplo, una proteína con alta tendencia a la agregación se fusiona con N^{pro} o un mutante de N^{pro} y después se proporciona la proteína de fusión purificada o un extracto crudo a partir de la expresión en condiciones caotrópicas y se incuba con una superficie revestida (inmovilizada) con un ligando de afinidad de acuerdo con la presente invención. Después las condiciones caotrópicas se sustituyen posteriormente por las condiciones que son adecuadas para los procedimientos de reacción o análisis adicionales, por ejemplo:

1.A.

Las condiciones caotrópicas se remplazan por un tampón fisiológico y luego se realiza una reacción inmunológica utilizando un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo dirigidos a un cierto dominio de la proteína. Esta estrategia permite la reacción inmunológica de una proteína que tiene una gran tendencia a agregarse.

2.B.

Las condiciones caotrópicas se remplazan y luego se realiza una reacción química específica para modificar la estructura de la proteína. Los ejemplos son la oxidación específica de una cadena lateral de aminoácido, la adición de fosfatos o sulfatos, la adición de un polímero natural o sintético (por ejemplo, PEGilación), la adición de una cadena peptídica con el fin de n-ramificar la molécula de proteína, la adición de colorantes a las proteínas que no son solubles en disoluciones o tampones fisiológicos.

3.C.

La reconstitución de una sola molécula de una proteína de membrana, mediante la fusión de la proteína N^{pro} o un mutante de N^{pro}. El asa molecular se inmoviliza con un ligando de afinidad de acuerdo con la presente invención frente a la proteína de fusión y se une en presencia de urea 4 M. La urea es eliminada con posterioridad por el detergente y la bicapa lipídica.

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Cuando se ha logrado la unión del polipéptido de fusión con el sistema de cromatografía, los componentes contaminantes no unidos se pueden eliminar fácilmente mediante lavado de la columna. Estos compuestos contaminantes podría ser, por ejemplo polipéptidos y ácidos nucleicos de la célula anfitriona, los cuales fueron ocluidos en o adsorbidos sobre los cuerpos de inclusión, y permanecen en la disolución del polipéptido después de la solubilización, así como componentes residuales de una ruptura celular enzimática. Después de lavar sólo el polipéptido de fusión permanece unido a la columna para que los siguientes pasos se lleven a cabo en un sistema purificado.

La unión del polipéptido de fusión se establece en condiciones caotrópicas, inactivadoras. Con el fin de inducir el replegamiento, las condiciones se cambian a cosmotrópicas.

En una realización preferida la etapa de replegamiento del polipéptido de fusión se lleva a cabo mediante el cambio de las condiciones caotrópicas a cosmotrópicas a través del intercambio del tampón.

Los tampones se pueden intercambiar alternativamente de forma gradual o de forma instantánea a condiciones cosmotrópicas. En una realización preferida de la presente invención el intercambio de tampón caotrópico por tampón cosmotrópico se lleva a cabo de forma instantánea, mediante la aplicación del tampón como un tapón. En otra realización igualmente preferida de la presente invención el intercambio de tampones se lleva a cabo de forma gradual.

La unión del polipéptido de fusión a la columna y/o el replegamiento y la escisión de dicho polipéptido de fusión podría ser más fácil si el intercambio de tampón se acompaña de un ajuste de temperatura. Esto puede, por ejemplo, ser introducido por una camisa refrigeradora/calefactora. Por lo tanto, en una realización preferida, se aplica una camisa refrigeradora/calefactora para el ajuste de la temperatura; más preferiblemente, el tampón se lleva a la temperatura deseada antes de su aplicación. De esta manera se logra tal ajuste de temperatura.

Después del cambio de las condiciones en el lecho empaquetado, el polipéptido de fusión empieza a replegarse y la parte que ejerce la función autoproteolítica se vuelve activa. Como resultado, el polipéptido fusionado C-terminalmente de interés se escinde en un sitio distinto definido por la especificidad de la parte autoproteolítica, produciendo de ese modo un extremo N homogéneo del polipéptido de interés. Dependiendo del tiempo requerido para el replegamiento del polipéptido de fusión, la velocidad de la fase móvil con el tampón cosmotrópico se reduce o se detiene cuando todo el tampón caotrópico es desplazado del lecho empaquetado. Después de completar el replegamiento, el polipéptido liberado de interés se lava fuera del lecho empaquetado introduciendo adicionalmente más tampón cosmotrópico. La porción autoproteolítica N-terminal del polipéptido de fusión así como el polipéptido de fusión no escindido se hacen eluir por medios convencionales, por ejemplo alta concentración de sal, cambio de pH o NaOH, para regenerar el material cromatográfico. Para la regeneración del lecho empaquetado se lava con un tampón que desprende la autoproteasa del adsorbente. Dichos tampones comprenden disoluciones ácidas o alcalinas o disolventes orgánicos. Después del reequilibrado con el tampón de partida/tampón caotrópico el lecho empaquetado está listo para el siguiente ciclo.

Por otra parte, se pueden proporcionar proteínas de fusión que después del replegamiento correcto permanecen autocatalíticamente inactivas, por ejemplo, mediante un conector adecuado entre la porción autoproteolítica y la porción proteica diana de la proteína de fusión o mediante un mutante inactivado, por ejemplo, un mutante de autoproteasa con o sin reducción de la actividad autoproteolítica. Por ejemplo, se puede proporcionar un conector tripeptídico (aminoácidos 1, 2 y 3) entre las dos porciones que tiene en la posición 1 y preferiblemente también en las posiciones 2 y 3 aminoácidos alcalinos (R, K, H), ácidos (D, E), grandes hidrófobos (V, L, IM) o aromáticos (M, Y, W) para prevenir la escisión autoproteolítica. Los ejemplos de los derivados autoproteasa inactivos son

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Con tales realizaciones, las proteínas diana se pueden proporcionar en una forma activa funcionalmente inmovilizada con estructura "de tipo nativa", pero por supuesto sin el riesgo de agregación no deseada. Tales proteínas diana inmovilizadas o capturadas se pueden utilizar para estudios científicos, para análisis inmunológicos, intrínsecos, de fluorescencia o para análisis de interacción con otras moléculas fisiológicas o farmacéuticamente interesantes.

Cuando sea necesario, porque el porcentaje de escisión podría no ser tan alto como se desee, se puede reintroducir el polipéptido de fusión no escindido que se separa mediante lavado de la columna durante la etapa de regeneración en otro círculo del procedimiento de cromatografía de acuerdo con la presente invención.

El polipéptido liberado de interés se puede obtener opcionalmente a través de la elección de los tampones respectivos, ya sea en un estado parcialmente o completamente replegado. Dentro del alcance de la presente invención, el polipéptido de interés en el efluente está replegado parcialmente o preferiblemente totalmente. En una realización de la presente invención, el replegamiento de la porción activa autoproteolítica del polipéptido de fusión puede ser completo, mientras que el polipéptido de interés permanece parcialmente desplegado. Esta situación puede ocurrir por ejemplo cuando el polipéptido de interés tiene una conformación muy compleja, por ejemplo, una di- o trimerización, o comprende un grupo prostético o un cofactor. Estos polipéptidos de intereses podrían requerir condiciones particulares a fin de completar el replegamiento. Así pues, en tales casos el replegamiento se puede completar en una etapa separada, donde se pueden generar condiciones especiales, por ejemplo fuerza protónica y pH o extracción completa de los detergentes, que normalmente se añaden durante el replegamiento.

Dentro del alcance de la presente invención, las condiciones se pueden cambiar a cualquier estado donde el polipéptido de fusión permanece adsorbido en la columna.

La presente invención se describe adicionalmente, con referencia a los ejemplos siguientes, que son sólo ilustrativos y no limitantes. En particular, los ejemplos se refieren a realizaciones preferidas de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Cromatografía de afinidad 1.1.1 Equipo cromatográfico

Las rondas cromatográficas del ejemplo 1 se realizan en un sistema de cromatografía AKTA 100 Explorer (Amersham Biosciences). Los adsorbentes de afinidad para péptidos preparados se empaquetan en columnas HR 5 (5 mm d.i., Amersham Biosciences). El volumen de gel es de aproximadamente 1 ml.

1.1.2 Preparación de ligandos oligopeptídicos

Los ligandos oligopeptídicos utilizados en el ejemplo 1 se producen de la siguiente manera:

La Síntesis Peptídica en Fase Sólida se realiza en un sintetizador de péptidos 433A (Applied Biosystems, Viena, Austria) con activación mediante 1-hidroxi-1H-benzotriazol/N,N'-diciclohexilcarbodiimida (HOBt/DCC) de los aminoácidos protegidos con Fmoc (Bachem, Bubendorf, Suiza). Los péptidos son sintetizados en una resina de 4-hidroximetil-fenoximetil-copoliestireno-divinilbenceno al 1% (resina HMP, resina de Wang). Los grupos protectores de las cadenas laterales son terc-butilo (t-Bu) para la tirosina, la serina y la treonina, OtBu para el ácido glutámico y el ácido aspártico, terc-butoxicarbonilo (Boc) para la lisina y el triptófano y tritilo (Trt) para la cisteína, la histidina, la asparagina y la glutamina. Para el acoplamiento del primer aminoácido se utiliza 4-dimetilaminopiridina (DMAP) como catalizador. Para el acoplamiento del primer aminoácido, se realiza una etapa de protección terminal mediante el uso de anhídrido benzoico. La desprotección del grupo Fmoc se realiza con piperidina al 20%. La desprotección de la cadena lateral y la escisión de la resina se llevan a cabo mediante reacción con una mezcla de escisión que contiene 95% de ácido trifluoroacético (TFA), 2,5% de agua y 2,5% triisopropilsilano (TIS). Tras el lavado con diclorometano (DCM), el péptido bruto se purifica mediante precipitación con éter repetida seguida de liofilización. Los péptidos son nuevamente purificados mediante RP-HPLC en una columna Luna 15 \mu C18(2) de 250 x 21,2 mm (Phenomenex, Torrence, California, EE.UU.) con bombas P 3500 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia), utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo vs. agua de 5-50% (TFA al 0,1%) a 30 ml/min. La pureza es confirmada mediante análisis de RP-HPLC con un cromatógrafo de líquidos HP 1090 (Hewlett Packard, EE.UU.) con una columna Luna 3 \mu C18 (2) de 100 x 4,6 mm (Phenomenex) con un gradiente lineal de acetonitrilo al 1% por minuto. La homogeneidad y la identidad son verificadas por espectrometría de masas de ionización/desorción mediante láser asistida por matriz - tiempo de vuelo (ThermoBioanalysis, Hempstead, Reino Unido).

1.1.3 Preparación de la matriz de afinidad

Las matrices de afinidad utilizadas en el ejemplo 1 se preparan de la siguiente manera:

Se hacen reaccionar 10 g de epoxi Fractogel (M) (Merck, Darmstadt, Alemania) con 50 ml de Diaminodipropilamina 1 M (DADPA) durante 48 horas a temperatura ambiente. Después de la reacción el gel se lava con 50 ml de HCl 10 mM y 3 veces con 50 ml de agua. El gel se resuspende en agua, se ajusta el pH a 7,0 mediante la adición de NaOH 0,1 M y se añaden 2 g de anhídrido succínico. Después de 30 minutos de agitación suave se ajusta el pH a 7,0 mediante la adición de NaOH 10 M y se añaden otros 2 g de anhídrido succínico. Después de agitar otros 30 minutos el gel se lava con 50 ml de NaOH 0,1 M, 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), 3 veces con 50 ml de agua y etanol al 20%. Después de secado por succión el gel se conserva a 4ºC.

1.1.4 Activación del grupo carboxi e inmovilización de los péptidos

Las matrices de afinidad según el ejemplo 1 se activan de la siguiente manera:

Se modifica 1 g de Fractogel húmedo con un espaciador DADPA-SA como se describe en el capítulo 1.1.3 y se lava dos veces con 5 ml de acetonitrilo. La activación se realiza con 3 ml de tricloroetilcarbonato de succinimidilo 0,1 M y trietilamina 0,1 M disueltos en acetonitrilo durante 3 horas. El gel se lava con posterioridad con acetonitrilo y HCl 1 mM. El péptido AFYRWYA se disuelve en PBS a una concentración de 3 mg/ml. Se añaden rápidamente 5 ml de la disolución del péptido al gel y se hacen reaccionar durante 24 horas. El péptido VSFIWYK, se disuelve en dimetilformamida (DMF) conteniendo trietilamina 0,1 M. Se añaden rápidamente al gel 5 ml de la disolución del péptido al gel y se hacen reaccionar durante 24 horas. El rendimiento acoplado se determina mediante RP-HPLC de las muestras antes y después del acoplamiento.

Inmovilización de péptidos sobre CIM-epoxi

Los péptidos son disueltos en tampón Na_{2}CO_{3} 100 mM de pH 10,0 conteniendo NaCl 0,15 M. Los discos CIM se montan en un cartucho suministrado por el fabricante y la disolución del péptido se bombea lentamente a través del disco utilizando una bomba P1 (Amersham Biosciences) en modo circulación durante 48 horas a temperatura ambiente. El rendimiento acoplado se determina mediante RP-HPLC de las muestras antes y después del acoplamiento. Después de acoplamiento los grupos epoxi restantes se bloquean con etanolamina 0,5 M, pH 10,0 durante 48 horas.

1.1.5 Expresión del polipéptido de fusión

La E. coli HMS 174 (DE3) recombinante que expresa un polipéptido de fusión que comprende la autoproteasa Npro N-terminal con una etiqueta 6xHis y un GFPmut3.1 fusionado C-terminalmente se cultivan en un fermentador de 10 l. El polipéptido de fusión comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

9

La célula bacteriana anfitriona, es decir, la cepa de expresión, se cultiva de acuerdo con la práctica microbiológica conocida per se. La cepa se desarrolla generalmente a partir de una sola colonia en un medio nutriente, pero también es posible emplear suspensiones celulares crioconservadas (bancos de células). La cepa se cultiva por lo general en un procedimiento de varias etapas con el fin de obtener suficiente biomasa para su uso posterior.

A pequeña escala, esto puede llevarse a cabo en matraces de sacudimiento, siendo posible emplear en la mayoría de los casos un medio complejo (por ejemplo, caldo LB). Sin embargo, también es posible utilizar los medios definidos (por ejemplo medio con citrato). Para el cultivo, se hace crecer un precultivo de pequeño volumen de la cepa anfitriona (inoculada con una sola colonia o con la suspensión celular de un crio-cultivo), la temperatura para este cultivo por lo general no es crítica para el posterior resultado de la expresión, así que es posible operar rutinariamente a temperaturas relativamente altas (por ejemplo 30ºC o 37ºC). El cultivo principal se establece en un volumen mayor (por ejemplo 500 ml), donde es necesario en particular para garantizar una buena aireación (gran volumen de matraz en comparación con el volumen de contenidos, alta velocidad de rotación). Dado que se pretende que la expresión tenga lugar en forma de cuerpos de inclusión insolubles, el cultivo principal en la mayoría de los casos también se llevará a cabo a una temperatura relativamente alta (por ejemplo 30 o 37ºC). Los sistemas inducibles son particularmente adecuados para la producción de cuerpos de inclusión (por ejemplo, con promotores trp, lac, tac o Phoa). Después de alcanzar la fase logarítmica tardía (por lo general a una densidad óptica de 0,5 a 1,0 en matraces de sacudimiento), en estos casos se agrega la sustancia inductora (por ejemplo ácido indolacrílico, isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido = IPTG) y la incubación se prolonga de 1 a 5 horas. Durante este tiempo, la mayor parte del polipéptido de fusión de Npro se deposita en forma de cuerpos de inclusión en el citoplasma bacteriano. Las células resultantes se pueden cosechar y tratar adicionalmente.

A mayor escala, el sistema de etapas múltiples consiste en una pluralidad de biorreactores (fermentadores), prefiriéndose emplear medios nutrientes definidos en este caso con el fin de poder mejorar el control de diseño procedimental del procedimiento. Además, es posible incrementar en gran medida la biomasa y la formación de producto mediante la medición de determinados nutrientes (lotes alimentados). Por otra parte, el procedimiento es análogo al matraz sacudido. Por ejemplo, se utilizan un fermentador en fase preliminar y un fermentador en fase principal, eligiéndose la temperatura del cultivo de manera similar a la del matraz sacudido. Al fermentador en etapa preliminar se le inocula el denominado inóculo que generalmente se desarrolla a partir de una sola colonia o un criocultivo en un matraz sacudido. También debe garantizarse una buena ventilación y una concentración de inductor suficiente en el fermentador - y especialmente en su fase principal. La fase de inducción se debe hacer, sin embargo, en algunos casos claramente más larga en comparación con el matraz sacudido. Las células resultantes son liberadas una vez más para su posterior transformación.

1.1.6 Aislamiento de los cuerpos de inclusión

Después de la cosecha, las células (850 g de peso húmedo) se suspenden en 2500 ml de Tris/HCl 50 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 1%, pH 8,0. La suspensión refrigerada se pasa por un homogenizador de alta presión APV-2000 (Invensys) por tres veces a 800 bares para romper las células. Entre los pases la suspensión se refrigera en hielo y se homogeneiza utilizando Ultraturrax. El producto homogeneizado se centrifuga a baja velocidad (JLA 10.500, 7500 rpm, 30 min) para obtener los cuerpos de inclusión que contienen el polipéptido recombinante de fusión.

1.1.7 Solubilización de los cuerpos de inclusión

El sedimento se suspende en Tris/HCl 50 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 al 1%, pH 8,0 y se centrifuga. Este paso se repite. Después de una etapa de lavado con H_{2}O el sedimento se suspende en H_{2}O. La suspensión de los cuerpos de inclusión obtenida se almacena a -20ºC para su posterior utilización. La suspensión de los cuerpos de inclusión se diluye 1 : 5 con Tris/HCl 50 mM, urea 10 M de, DTT 50 mM, pH 7,3 a temperatura ambiente. Los componentes insolubles se eliminan mediante centrifugación. Se obtiene una concentración de polipéptido de aproximadamente 15 mg/ml. La disolución del polipéptido se diluye con Tris/HCl 50 mM, NaCl 100 mM, urea 4 M, pH 7,3 para alcanzar una concentración de polipéptido de alrededor de 2 mg/ml.

1.1.8 Unión del polipéptido de fusión a la columna cromatográfica

Se aplican 0,5 ml de la disolución del polipéptido a una matriz Fractogel-DADPA-SA-VSFIWYK (0,5 x 5 cm), mediante lo cual se llevan a cabo la preparación y el acoplamiento del péptido respectivo según se ha descrito antes en los puntos 1.1.2 y 1.1.3. La columna se equilibra con Tris/HCl 50 mM, NaCl 100 mM, urea 4 M, pH 7,3 con un flujo lineal de 50 cm/h. La velocidad de flujo se incrementa a 150 cm/h después de la inyección de la muestra.

1.1.9 Lavado de material contaminante no unido

Los componentes no unidos se separan lavando con 5 volúmenes de la columna de tampón de equilibrado. Se realiza un intercambio de tampón a tampón de replegamiento, específicamente a Tris/HCl 0,5 M, EDTA 2 mM, glicerol al 3%, DTT 5 mM, pH 7,3, con 4,5 volúmenes de la columna.

1.1.10 Replegamiento, escisión y elución

Después de cambiar las condiciones de caotrópicas a cosmotrópicas, se permite que el polipéptido de fusión se repliegue durante 25 h sobre la resina cromatográfica deteniendo el flujo. La autoproteasa activa rompe GFPmut3.1 fusionado C-terminalmente. La posterior elución con tampón de replegamiento a una velocidad de flujo de 50 cm/h da como resultado GFPmut3.1 nativo purificado, como se confirma por mediciones de fluorescencia y SDS-PAGE.

1.1.11 Regeneración

La regeneración de la resina cromatográfica se realiza con NaOH 0,1 M, con una velocidad de flujo de 50 cm/h.

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Ejemplo 2 Preparación de las matrices de afinidad 2.1 Preparación de una matriz de afinidad para péptidos con acoplamiento a través de la lisina C-terminal derivatizada con anhídrido yodoacético en una matriz con grupos tiol (Fractogel-DADPA-IT)

Se disolvieron 300 mg de péptido N-acetilado Ac-AFYRWYAK en 3 ml de dimetilformamida (DMF) que contenía diisopropiletilamina 65 \mul. La disolución se enfrió después en hielo. A continuación, se disolvieron 130 mg de anhídrido yodoacético en 1,5 ml de DMF y se añadieron a la disolución del péptido. La reacción se detuvo después de un minuto mediante la adición de 1 ml de ácido fórmico. La disolución se diluyó después con agua hasta una concentración final de DMF del 30%. La disolución se purificó luego mediante RP-HPLC preparativa como se ha descrito antes. Las fracciones se liofilizaron y se analizaron mediante espectrometría de masas. Se prepararon 10 g de Fractogel-DADPA como se ha descrito anteriormente. El gel se lavó posteriormente 3 veces con tampón PBS. El gel se hizo reaccionar después con 10 mg/ml de iminotiolano (TI) disuelto en una disolución tampón PBS durante 2 horas. Se disolvieron 250 mg del derivado de péptido-ácido yodoacético en 15 ml de tampón MES 20 mM, pH 6,0 que contenía 30% de DMF. Esta disolución se hizo reaccionar a continuación con el gel durante 3 horas. El rendimiento de acoplamiento se determinó mediante el análisis de la muestras antes y después del acoplamiento con RP-HPLC. Los grupos tiol restantes en el gel se bloquearon con una disolución yodoacetamida de 1 mg/ml durante 2 horas. La matriz preparada de este modo es referida como Fractogel-DADPA-IT-AFYRWYAK.

2.2 Elaboración de una matriz de afinidad con ligandos de poli(lisina, triptófano)

Diez gramos de Fractogel epoxi se lavaron 3 veces con tampón de acoplamiento, un tampón de carbonato sódico 20 mM, que contenía cloruro de sodio 150 mM y trietilamina 10 mM, pH 11,0. Se disolvieron 100 mg de Poli(lisina, triptófano), 4:1 (PolyKW, Sigma) en 10 ml de tampón de acoplamiento y se hicieron reaccionar con el gel durante 48 horas. La eficiencia de acoplamiento se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm de la disolución de Poli(lisina, triptófano antes y después) del acoplamiento. El gel se hizo reaccionar después con etanolamina 0,5 M para bloquear los grupos epoxi restantes. La matriz preparada de este modo es referida como Fractogel-polyKW.

Alternativamente el procedimiento descrito se lleva a cabo con epoxi Actigel B Ultraflow 4. La matriz preparada de este modo es referida como Actigel-polyKW.

Además, el procedimiento descrito se lleva a cabo con Epoxy Sepharose 6B. La matriz preparada de este modo es referida como Sepharose-polyKW.

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Ejemplo 3 Cromatografía de afinidad 3.1 Purificación de extractos del cuerpo de inclusión NproEDDIE-6His

NproEDDIE-6His:

10

Se cargaron extractos de cuerpos de inclusión NproEDDIE-6His brutos en Tris 50 mM, NaCl 100 mM, urea 4 M, \alpha-monotioglicerol 10 mM (MTG), pH 7,3 en Fractogel-DADPA-IT-AFYRWYAK (0,5 x 5 cm) previamente equilibrado con Tris 50 mM, NaCl 100 mM, urea 4 M, pH 7,3 a una velocidad de flujo lineal de 25 y 150 cm/h, respectivamente. Se aplicó una cantidad de muestra de 5 ml a una concentración de proteínas aproximada de 2 mg/ml. Después del lavado de los componentes no unidos con 5 volúmenes de la columna (VC) de tampón de equilibrado a una velocidad lineal de flujo de 150 cm/h se realizó la elución con 10 VC de Tris 50 mM, NaCl 1 M, urea 8 M, pH 7,3 bajo las mismas condiciones de flujo. La regeneración de la columna se realizó con 10 VC de NaOH 0,2 M. El agotamiento de los compuestos de la célula huésped fue confirmado mediante SDS-PAGE.

3.2 Purificación de los extractos de cuerpos de inclusión NproEDDIE-6His

Los extractos de cuerpos de inclusión NproEDDIE-6His brutos en Tris 50 mM, NaCl 100 mM, urea 4 M, MTG 10 mM, pH 7,3 se cargaron en Fractogel-poli-KW (0,5 x 5 cm) previamente equilibrado con Tris 50 mM, NaCl 100 mM, urea 4 M, pH 7,3 a una velocidad de flujo lineal de 25 y 150 cm/h, respectivamente. Se aplicó una cantidad de muestra de 5 ml a una concentración de proteínas aproximada de 2 mg/ml. Después de la separación mediante lavado de los componentes no unidos con 5 VC de tampón de equilibrado a una velocidad lineal de flujo de 150 cm/h se realizó la elución con 10 VC de Tris 50 mM, NaCl 1 M, urea 8 M, pH 7,3 bajo las mismas condiciones de flujo. La regeneración de la columna se realizó con 10 VC de NaOH 0,2 M. El agotamiento de los compuestos de la célula anfitriona fue confirmado mediante SDS-PAGE.

3.3 Purificación de los extractos de cuerpos de inclusión NproEDDIE-6His

Se realizó la cromatografía de afinidad de los extractos de cuerpos de inclusión NproEDDIE-6His brutos reforzados con producto homogeneizado celular de E. coli HMS 174 (DE3) que produce de GFPmut3.1 en Fractogel-DADPA-IT-AFYRWYAK como se ha descrito anteriormente. Se recogieron las muestras de flujo directo y de elución y se analizaron en busca de la proteína objetivo y el contenido de contaminantes mediante SDS-PAGE.

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Ejemplo 4 Sistema de Detección

Este sistema de detección representa un sistema de detección genérico para las proteínas de fusión de Npro-EDDIE por medio de un ligando peptídico, que se une a Npro-EDDIE, inmovilizada covalentemente o sintetizada en una membrana. La proteína de fusión se une a la membrana que comprende el péptido y el compañero de fusión se puede detectar por sus características intrínsecas, p. ej. autofluorescencia de GFP, anticuerpos contra el compañero de fusión, propiedades de unión del compañero de fusión. Esta membrana (como un ejemplo preferido de la matriz de afinidad de acuerdo con la presente invención) es específicamente adecuado para las proteínas de unión que no son o que son sólo ligeramente solubles en disolución acuosa y son difíciles de detectar. Preferiblemente, la urea se utiliza para solubilizar tales proteínas de acuerdo con la presente invención.

En caso de que se utilice la autoproteasa de acuerdo con la presente invención, la actividad de ésta se puede inhibir por ejemplo, mediante conectores, mutantes inactivos o tampones desactivadores o componentes de tampones (que se pueden añadir en el momento deseado en el tiempo.

Las membranas con péptidos inmovilizados AFR*WYA, donde * representa cada uno de los 20 aminoácidos proteinogénicos, se incubaron con extractos de cuerpos de inclusión 6xHis-NproEDDIE-GFPmut3.1 brutos a una concentración de 1 mg/ml en Tris 50 mM, NaCl 300 mM, urea 4 M, ditiotreitol (DTT) 12,5 mM, pH 7,3 durante 1 h. Después de un lavado de 5 minutos con tampón de incubación, las condiciones se cambiaron a Tris 1 M, sacarosa 0,25 M, EDTA 2 mM, DTT 10 mM, pH 7,3 para permitir el replegamiento de GFPmut3.1 fusionado. La fluorescencia GFP de las aplicaciones de péptido se detecta con un escáner Typhoon (Amersham Biosciences) a una longitud de onda de excitación de 488 nm y emisión a 520 nm a diferentes voltajes de los fotomultiplicadores de 315, 350 y 400 V.

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Ejemplo 5 Sistema de detección con péptido Anti-Npro biotinilado

Este sistema de detección representa un sistema de detección genérico para las proteínas de fusión de Npro-EDDIE por medio de la unión de un péptido biotinilado a una proteína de fusión de NPro-EDDIE unida a membrana. La detección se realiza con un producto conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante.

La expresión en exceso de una proteína de fusión que comprende Npro-EDDIE y un polipéptido fusionado C-terminalmente en E. coli es detectada por un péptido marcado dirigido contra Npro-EDDIE: se prepara un producto homogeneizado celular mediante tratamiento de un caldo de fermentación de E. coli con una disolución que contiene urea 10 M. El producto homogeneizado se aplica a una membrana de nitrocelulosa. Posteriormente la membrana se seca y se bloquea con lisozima al 3% en tampón fosfato durante 1 hora. La membrana se incuba después con una disolución de 10 \mug/ml de un producto conjugado AFYRWYAK-biotina durante 1 hora. La Estreptavidina-HPO disuelta en PBS que contenía cloruro de sodio 1 M se añade durante 15 minutos seguido de 3 lavados con tampón de incubación y posterior detección con un sistema de detección de quimioluminiscencia Super Signal® West Pico (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) y LumiImager® (Boehringer, Mannheim, Alemania).

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Ejemplo 6 Preparación de las proteínas de fusión mutantes de Npro

10 ml de

\bullet

una disolución de proteína de fusión 6HisNPro-EST-GFPmut.3.1 extraída de IBs como se ha descrito anteriormente,

\bullet

disolución de 6HisNPro extraída de IBs como se ha descrito anteriormente, y

\bullet

disolución de 6HisNPro-EDDIE extraída de Ibs como se ha descrito anteriormente,

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se cargaron en

\bullet

una columna Fractogel-DADPA-SA-VSIFEW,

\bullet

una columna Fractogel-DADPA-SA-AVSIEWY,

\bullet

una columna Fractogel-DADPA-SA-AVSFIWY, y

\bullet

una columna Fractogel-DADPA-SA-VSFIWYK,

cada una equilibrada previamente con tampón Tris 50 mM, NaCl 100 mM, urea 4 M de pH 7,3. Después de cargar, la columna se lavó con 15 volúmenes de la columna de tampón de equilibrado. La elución se llevó a cabo con un tampón de equilibrado añadido con NaCl 500 mM. Las fracciones recogidas durante la cromatografía se analizaron mediante SDS-PAGE. Se utilizan BSA y lisozima como proteínas de control.

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Preparación de los cuerpos de inclusión

Se cultivaron E. coli HMS 174 (DE3) recombinantes que expresan una proteína de fusión que comprende la autoproteasa Npro N-terminal con una etiqueta 6His y GFPmut3.1 (véase 1.1.5 supra) en un fermentador de 10 l. Después de la cosecha, las células (850 g de peso húmedo) se suspendieron en 2500 ml de Tris 50 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 AL 1%, pH 8,0. La suspensión refrigerada se pasó por un homogeneizador APV-2000 de alta presión (Invensys) tres veces a 800 bares para romper las células. Entre los pases la suspensión se refrigeró en hielo y se homogeneizó utilizando Ultraturrax. El producto homogeneizado se centrifugó a baja velocidad (JLA 10.500, 7500 rpm, 30 mm) para obtener los cuerpos de inclusión que contienen la proteína de fusión recombinante. El sedimento se suspendió en Tris 50 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 al 1%, pH 8,0 y se centrifugó. Esta etapa se repitió. Después de una etapa de lavado con H_{2}O el sedimento se suspendió en H_{2}O. Se obtuvieron 580 ml de una suspensión de cuerpos de inclusión con una masa seca de 8,9% y se almacenaron a -20ºC para su posterior utilización. La suspensión de cuerpos de inclusión se diluyó 1:5 con Tris 50 mM, urea 10 M, DTT 50 mM, pH 7,3 a temperatura ambiente. Los componentes insolubles se eliminaron mediante centrifugación. Se obtuvo una concentración de proteínas de alrededor de 15 mg/ml. La disolución de la proteína se diluyó con Tris 50 mM, NaCl 100 mM, de urea 4 M, pH 7,3 para alcanzar una concentración de proteínas de alrededor de 2 mg/ml.

Claims (12)

1. Método para la unión de afinidad de un polipéptido heterólogo de interés, donde dicho polipéptido se expresa como un polipéptido de fusión de la autoproteasa pestiviral N^{Pro} o de sus derivados, y donde dicho polipéptido de fusión se pone en contacto en condiciones caotrópicas con una matriz de afinidad que comprende una fase sólida y un ligando de afinidad que comprende los enlaces peptídicos acoplados a esta fase sólida, donde el ligando de afinidad que comprende el enlace peptídico se selecciona entre el siguiente grupo de ligandos:

a)

péptidos que comprenden la fórmula X_{1}X_{2}X_{3}X_{4}, donde X_{1} a X_{4} son los residuos de aminoácidos y al menos dos de X_{1} a X_{4} son W, Y o F;

b)

péptidos que comprende la fórmula X_{5}X_{6}X_{7}X_{8}, donde X_{5} a X_{8} son residuos de aminoácidos, al menos uno de X_{5} a X_{8} es W, y al menos uno de X_{5} a X_{8} es E o D, y

c)

poli-aminoácidos que consisten en un monómero de aminoácido del grupo que consiste en R, K, E y D y un monómero de aminoácido del grupo que consiste en S, M y W, preferiblemente poli-KY, poli-KF, poli-KW, poli-RY, poli-RF, poli-RW, poli-EY, poli-DY, poli-EF, poli-EW, poli-DF y poli-DW,

con la condición de que los péptidos de acuerdo con a) y b) tendrán una longitud máxima de 35 aminoácidos y que los poli-aminoácidos de acuerdo con c) tienen una longitud mínima de 20 residuos de aminoácidos,

y donde dicho polipéptido de fusión se une a dicha matriz en condiciones caotrópicas.

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2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde los péptidos de acuerdo con a) y b) tienen una longitud de 5 a 12, especialmente de 6 a 8, residuos de aminoácidos.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde el ligando de afinidad está químicamente modificado, especialmente acetilado, esterificado, amidado, oxidado, reducido o provisto de una molécula conectora.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la fase sólida se selecciona del grupo que consiste en material cromatográfico, especialmente soportes con una base de celulosa, agarosa, acrilamida, poli(estireno-divinilbenceno) o copolímeros de metacrilato de etilenglicol, placas de microtitulación, membranas de nitrocelulosa, microchips, placas de vidrio o soportes revestidos con metal.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el ligando de afinidad se selecciona del grupo que consiste en VSDDWY, VSEDWY, VSIDWY, VSYDWY, VSVDWY, VSWDWY, VSYDWY, VSFDWY, VSDEWY, VSEEWY, VSIEWY, VSYEWY, VSVEWY, VSWEWY, VSYEWY, VSFEWY, DDDDWY, DDEDWY, DDIDWY, DDYDWY, DDVDWY, DDWDWY, DDYDWY, DDFDWY, VSIFWE, FSIFEW, WSIFEW, VSLIWY, VS
LIDW, VSLIEW, VSLIWE, FSLEEW, VSDLDW, VSDLEW, VSYIDW, VSYIWE, VSIDWY, VSIEWY, VSIWWY, VSIIWY, VSYIWY, VSVIWY, VSFIWY, VSFIWE, VSIFEW, VSIFWE, FSIFEW, WSIFEW, VSLIWY, VS
LIDW, VSLIEW, VSLIWE, FSLIEW, WSLIEW, FSYFEW, FSFYEW, WSFYEW, FSYIEW, WSYIEW, AFYTWYA, AFYRWYK, AFYRWY, AFYRWYA, AFFRWYA, AFGRWYA, AFHRWYA, AFIRWYA, AFLRWYA, AFMRWYA, AFNRWYA, AFPRWYA, AFQRWYA, AFRRWYA, AFSRWYA, AFTRWYA, AFVRWYA, AFYRWYA, AFYFW
YA, AFYGWYA, AFYLWYA, AFYMWYA, AFYNWYA, AFYPWYA, AFYTWYA, AFYVWYA, AFYWWYA, AF
YYWYA, AKWFRYA, VSRNWY, ASRNWYA, ASRFWYA, FSRNWYA, VFRNWYA, VWRNWYA, VYRNW
YA, VSRAWYA, VSRFWYA, VSRWWYA, VSRYWYA, VSRNFYA, VSRNYYA, VSRNWFA, VSRNWWA, Ac-AFYTWYAK, Ac-AFYRWYKK, Ac-AFYRWYK, Ac-AFYRWYAK, Ac-AFFRWYAK, Ac-AFGRWYAK, Ac-AFH
RWYAK, Ac-AFIRWYAK, Ac-AFLRWYAK, Ac-AFMRWYAK,- Ac-AFNRWYAK, Ac-AFPRWYAK, Ac-AFQRW
YAK, Ac-AFRRWYAK, Ac-AFSRWYAK, Ac-AFTRWYAK, Ac-AFVRWYAK, Ac-AFYRWYAK, Ac-AFYFWYAK, Ac-AFYGWYAK, Ac-AFYLWYAK, Ac-AFYMWYAK, Ac-AFYNWYAK, Ac-AFYPWYAK, Ac-AFYTWYAK, Ac-AFYVWYAK, Ac-AFYWWYAK, Ac-AFYYWYAK, Ac-AKWFRYAK, Ac-VSRNWYK, Ac-ASRNWYAK, Ac-AS
RFWYAK, Ac-FSRNWYAK, Ac-VFRNWYAK, Ac-VWRNWYAK, Ac-VYRNWYAK, Ac-VSRAWYAK, Ac-VSR
FWYAK, Ac-VSRWWYAK, Ac-VSRYWYAK, Ac-VSRNFYAK, Ac-VSRNYYAK, Ac-VSRNWFAK, Ac-VSRNW
WAK, YWKA, Ac-YWKAK, YKYA, Ac-YKYAK, YWRA, Ac-YWRAK, ARWY, Ac-ARWYK, YWRA y Ac-YW
RAK.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el ligando de afinidad se une covalentemente a la fase sólida.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho polipéptido de fusión en una preparación líquida de partida se pone en contacto con dicha matriz de afinidad en condiciones caotrópicas por medio de lo cual dicho polipéptido de fusión se une a dicha matriz de afinidad y se separa de dicha preparación líquida de partida.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho polipéptido de fusión unido a la matriz de afinidad se transforma adicionalmente mientras está unido a dicha matriz de afinidad.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde dicho polipéptido de fusión se une a la matriz de afinidad o dicho polipéptido de fusión transformado se hace eluir de la matriz de afinidad, preferiblemente aplicando un tampón de elución con un menor carácter caotrópico como preparación líquida de partida.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho polipéptido de fusión se expresa como cuerpos de inclusión en condiciones desnaturalizantes.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la autoproteasa N^{Pro} pestiviral o dicho derivado de la misma se selecciona del grupo que consiste en

11

120

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde dicho polipéptido de fusión comprende una proteína o fracción proteica que tiene una gran tendencia a agregarse en condiciones fisiológicas, en especial una proteína seleccionada del grupo que consiste en Péptidos A\beta, Proteína priónica Tau, \alpha-sinucleína, Tau, Péptido ADan, Péptido ABri, Cistatina C, Péptidos A\beta, Superóxido dismutasa, Atrofina 1, Huntingtina, Ataxinas, Receptor de andrógenos, Proteína de unión a la caja TATA, Cadenas ligeras de Ig, Amiloide del Suero A, Transtiretina, Transtiretina, Microglobulina \beta2, Apolipoproteína A-1, Gelsolina, Polipéptido amiloide pro-islotes, Procalcitonina, Factor natriurético atrial, Lisozima, Insulina, Fibrinógeno, proteínas completas o fragmentos específicos, mutantes, variantes o expansiones polyQ.