KR20080036545A

KR20080036545A - 친화성 리간드

Info

Publication number: KR20080036545A
Application number: KR1020077024887A
Authority: KR
Inventors: 알로이스 융바우어; 라이너 한; 발트라우트 카르; 미카엘 사이퍼트; 베른하드 아우어; 클레멘스 아크뮐러; 필립프 베크너
Original assignee: 산도즈 아게; 베링거 인겔하임 오스트리아 게엠베하
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-25
Publication date: 2008-04-28
Also published as: US20090306343A1; US20120107869A1; WO2006113957A2; KR101289728B1; EP2366719A2; AU2006239722A1; JP2008539170A; JP5101492B2; DK1874933T3; SI1874825T1; CA2605140A1; CA2605149A1; US20090203069A1; PT1874932E; JP5909172B2; WO2006113957A3; WO2006113958A8; ES2399031T3; EP1874825A2; US8163890B2

Abstract

본 발명은 고체상 및 상기 고체상에 연결된 펩티드 결합을 갖는 친화성 리간드를 포함하는 친화성 매트릭스로서: 상기 펩티드 결합을 갖는 친화성 리간드는 하기 리간드의 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 친화성 매트릭스에 관한 것이다.

a) 일반식 X₁X₂X₃X₄을 포함하는 펩티드로서, X₁~X₄가 아미노산 잔기이고, 또한 X₁~X₄ 중 2개 이상이 W, Y 또는 F인 펩티드; b) 일반식 X₅X₆X₇X₈을 포함하는 펩티드로서, X₅~X₈가 아미노산 잔기이고, X₅~X₈ 중 1개 이상이 W이고, 또한 X₅~X₈ 중 1개 이상이 E 또는 D인 펩티드; c) R, K, E 및 D로 이루어진 군의 아미노산 모노머 및 Y, F 및 W로 이루어진 군의 아미노산 모노머로 이루어진 폴리-아미노산, 바람직하게는 폴리-KY, 폴리-KF, 폴리-KW, 폴리-RY, 폴리-RF, 폴리-RW, 폴리-EY, 폴리-DY, 폴리-EF, 폴리-EW, 폴리-DF 및 폴리-DW, 단, a) 및 b)에 기재된 펩티드는 35개 아미노산 잔기의 최대 길이를 갖고 c)에 기재된 폴리-아미노산은 20개 아미노산 잔기의 최소 길이를 갖는다.

친화성 리간드

Description

친화성 리간드{AFFINITY LIGANDS}

본 발명은 친화성 정제 기술 및 재료, 특히 친화성 크로마토그래피 및 이러한 기술에 사용되는 특정 신규의 리간드에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 펩티드 친화성 크로마토그래피를 사용하여 N^pro, N^pro-돌연변이, 변성조건하에서 봉입체로서 발현되는 N^pro융합 단백질 또는 높은 응집 경향을 갖는 단백질을 포획 및 정제하는 것에 관한 것이다.

친화성 크로마토그래피는 미정제물, 복합 혼합물로부터 특정 화합물의 분리를 위한 가장 효과적인 기술 중 하나이다. 항체는 이들의 높은 선택성 및 높은 친화성에 의해 친화성 리간드로서 성공적으로 적용되어 왔다. 이들 친화성 매트릭스의 결점은 지지 매트릭스로부터 생성물로 항체의 침출을 유발할 수 있는 상대적인 불안정성이다. 또한 생물약제학 산업에서 통상의 과정인 알칼리성 완충제를 사용한 재생에 의해서 비가역적 변성 및 결합 효율의 손실이 초래될 수 있다. 짧은 페티드는 친화성 리간드로서 항체를 대신할 수 있다. 이들 저분자는 높은 화학 안정성, 효율성, 선택성, 저비용을 제공하고, 이들은 보통 유독성이 아니다. 이들 특징은 특히 생물약제학적 환경에 적용했을 때 단백질성 리간드를 능가하는 장점으로 생각 된다. 표적 분자에 대항하는 펩티드는 조합 펩티드 라이브러리 또는 생물학적 라이브러리로부터 확인할 수 있다. 화학적으로 합성되는 조합 라이브러리로는 핀(pin)-합성, 티백(teabag), SPOT 등이 열거되고; 생물학적 라이브러리로는 파지디스플레이(phage display) 기술, 박테리아 디스플레이, 리보좀 기술 등이 열거된다.

한편, 많은 단백질은 생리학적 조건하에서 높은 응집 경향을 보이거나 또는 이들의 본래 생물학적 활성이 프리온 단백질 또는 아밀로이드 펩티드에 대해 가정된 바와 같이 응집적이다. 이들 단백질을 연구하기 위해서는, 이들은 극단의 pH(산 또는 염기)를 갖는 수용액의 존재하에서 세정제의 첨가, 및 아세토니트릴, 에탄올, 이소프로판올, 프로판올, 피리딘 등의 유기 용제의 첨가에 의해 카오트로픽(chaotropic) 조건하에서 가용성으로 되어야 한다. 이것이 불가능하다면, 특히 상기 단백질의 활성을 손상시키지 않고, 가용화/정제 후의 연구를 더 행하면, 이것이 문제가 되는 경우가 있다.

친화성 크로마토그래피에 적용되는 통상의 재료는 보통 코스모트로픽(kosmotrophic) 또는 생리학적인 조건하에서 결합가능한 결합 파트너이지만 카오트로픽 조건하에서는 그렇지 않다. 따라서, 카오트로픽 조건을 적용함으로써 친화성 정제 성분이 친화성 크로마토그래피 재료로부터 용리되는 경우가 있다.

그러므로, 본 발명의 목적은 카오트로픽 조건하에서 친화성 파트너가 결합할 수 있는 친화성 리간드 또는 친화성 재료를 제공하는 것이다. 바람직하게는, 이 재료는 카오트로픽 조건에서 샘플 또는 출발 재료로부터 단백질, 특히 N^pro, N^pro-돌연변이, 변성조건하에서 봉입체로 발현되는 N^pro융합 단백질, 또는 생리학적 조건하에서 높은 응집 경향을 보이는 단백질의 친화성 정제에 사용될 수 있어야 한다.

그러므로, 본 발명은 고체상을 포함하는 친화성 매트릭스 및 이 고체상에 연결된 펩티드 결합을 갖는 친화성 리간드를 제공하고, 여기서 펩티드 결합을 갖는 친화성 리간드는 하기 리간드의 군에서 선택된다:

a) 일반식 X₁X₂X₃X₄을 포함하는 펩티드로서, X₁~X₄가 아미노산 잔기이고, 또한 X₁~X₄ 중 2개 이상이 W, Y 또는 F인 펩티드;

b) 일반식 X₅X₆X₇X₈을 포함하는 펩티드로서, X₅~X₈가 아미노산 잔기이고, X₅~X₈ 중 1개 이상이 W이고, 또한 X₅~X₈ 중 1개 이상이 E 또는 D인 펩티드;

c) R, K, E 및 D로 이루어진 군의 아미노산 모노머 및 Y, F 및 W로 이루어진 군의 아미노산 모노머로 이루어진 폴리-아미노산, 바람직하게는 폴리-KY, 폴리-KF, 폴리-KW, 폴리-RY, 폴리-RF, 폴리-RW, 폴리-EY, 폴리-DY, 폴리-EF, 폴리-EW, 폴리-DF 및 폴리-DW, 단, a) 및 b)에 따른 펩티드는 35개 아미노산 잔기의 최대 길이를 갖고 c)에 따른 폴리-아미노산은 20개 아미노산 잔기의 최소 길이를 갖는다.

a) 및 b)에 따른 펩티드(이하 "올리고펩티드"라고도 함)는 바람직하게는 5~12개, 특히 바람직하게는 6~8개 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 바람직하게는, 적어도 하나의 양전하로 하전된 아미노산이 이들 올리고펩티드에 존재한다. c)에 따른 폴리-아미노산은 바람직하게는 35개 이상의 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 50개 이상의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 100개 이상의 아미노산 잔기의 길이를 갖는다. 구체적으로 바람직한 폴리-아미노산으로는, 예를 들면 폴리-KW, 4:1 (MW 20,000 - 50,000 Da; SIGMA사 제품번호 P9285), 폴리-KY, 4:1 (MW 20,000 - 50,000 Da; SIGMA사 제품번호 P4695) 또는 폴리-KF, 1:1 (MW 20,000 - 50,000 Da; SIGMA사 제품번호 P3150) 등의 시판의 배양 배지용 폴리-아미노산이 있다.

본 발명에 따른 친화성 리간드는 화학적으로 변성, 특히 아세틸화, 에스테르화, 아미드화, 산화, 환원되거나 또는 연결 분자가 제공되어도 좋다.

친화성 리간드는 공유결합에 의해 고체 매트릭스에 연결되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 친화성 리간드 및 매트릭스는 여기서 기술하는 오토프로테아제 분자에 대해 높은 친화성을 갖고, 특히 N^pro, 이것의 유도체 및 봉입체로서 발현될 수 있는 그 융합 단백질에 결합된다. 구체적으로, 이들 리간드 또는 친화성 매트릭스는 카오트로픽 조건하에서, 또한 코스모트로픽(비카오트로픽, 생리학적, 정상) 조건하에서도 N^pro, 이것의 유도체 및 그 융합 단백질, 적어도 예를 들면 융합 단백질의 N^pro-부분에 결합된다. 본 발명에 따른 친화성 리간드는 변성조건하에서 N^pro, N^pro유도체 및 그 융합 폴리펩티드에 선택적으로 결합하기 위해서 이들의 능력에 대한 고도의 선택성을 발휘한다. 본 발명의 범위 내에서, 이러한 친화성 리간드는 자가단백분해 기능을 발휘하는 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드의 부분에 대해 적용된다. 고체상 재료로서, 본 분야에서 이미 적용된 모든 재료가 적절하다. 바람직하게는, 고체상은 크로마토그래피 재료, 특히 셀룰로오스, 아가로스, 아크릴아미드, 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 또는 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 코폴리머를 기초로 한 지지체, 마이크로티터 플레이트, 니트로셀룰로오스 멤브레인, 마이크로칩, 유리판 또는 금속 도포 지지체로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명에 따르면, 셀룰로오스, 아가로스(세파로스 또는 Macro-Prep 겔), 덱스트란(세파덱스 겔), 아크릴아미드(세파크릴, 트리아크릴 겔), 실리카(TSK, SW 겔), 폴리(스티렌-디비닐벤젠)(소스(Source) 또는 포로스(Poros) 겔), 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 코폴리머(토요펄(Toyopearl) HW, TSK, PW, 프락토겔 EMD 겔) 또는 혼합물, 특히 아가로스와 덱스트란(Superdex 겔)의 혼합물 등의 여러가지 종류의 고체상 지지체를 사용할 수 있다. 관할 미국 기관(FDA, 식품의약국) 또는 유럽연합기구에 의해 인간 또는 동물 용도로 승인된 지지체 중에서 특별히 더 선택될 수 있다. 또한, 선택된 지지체는 본 발명에 따른 친화성 리간드에 바람직하게는 공유결합에 의해 결합되어야 한다(지지체가 관능화되었다고 함). 고체상 매트릭스는 매트릭스 백본으로서 단백질 및 다른 생체분자의 고체상 분리에 그 자체를 적용가능하다고 공지된 임의의 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 재료, 예를 들면 아가-아가 및 아가로스 등의 천연 또는 합성 다당류; 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 등의 셀룰로오스 에테르; 전분; 구아 검, 아라비아검, 가티검, 트래거캔스검, 로커스트콩검, 크산탄검 등의 검; 펙틴; 뮤신; 덱스트란; 키틴; 키토산; 알지네이트; 카라기난; 헤파린; 젤라틴; 폴리아크릴아미드 및 폴리메타크릴아미드 등의 폴리아미드 등의 합성 폴리머; 폴리이미드; 폴리에스테르; 폴리에테르; 폴리비닐알콜 및 폴리스티렌 등의 폴리머 비닐 화합물; 폴리알켄; 비결정질 실리카 및 석영을 포함하는 실리콘 디옥시드와 같은 규산질 재료 등의 무기 재료; 실리카; 금속 실리케이트, 제어 공극 유리 및 세라믹; 산화 금속 및 황화물, 또는 이들 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 재료의 조합을 포함해도 좋다.

매트릭스 백본은 아가-아가, 아가로스, 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스 등의 셀룰로오스 에테르, 폴리(메타)아크릴-아미드 등의 폴리아미드, 폴리비닐알콜, 실리카 및 제어 공극 유리 중에서 선택되는 것이 바람직하다.

매트릭스 백본으로서 특히 목적한 고체상 재료는, 예를 들면 스웨덴의 Pharmacia Biotech사의 세파로스 및 슈퍼로스 비드 등의 아가 또는 아가로스 비드, 및 미국의 Biorad사의 Biogel A; Pharmacia Biotech사의 세파덱스 등의 덱스트란계 비드; 체코슬로바키아의 Secheza사의 Perloza 셀룰로오스 등의 셀룰로오스계 비드 및 멤브레인; Pharmacia Biotech사의 세파크릴 및 슈퍼덱스 등의 복합 비드; 미국의 Toso-Haas사의 프락토겔 등의 합성 유기 폴리머의 비드; 미국의 Perceptive Biosystems사의 POROS 배지, Biorad사의 Bio-Rex, Bio-Gel P 및 Macro Prep, TESSEK사의 HEMA 및 세파론, 및 미국의 BioSepra사의 Hyper D 및 트리스아크릴 배지, 미국의 3M사의 Enzacryl 및 Azlactone; 제어 공극 유리, 잉글랜드의 Bioprocesing사의 PROSEP, 및 Spherocil, BioSepra 등의 규산질 재료의 비드; 및 미국의 Arbor Technologies사의 ACTI-DISK, ACTI-MOD 및 CycloSep 등의 비드 또는 멤브레인 형태의 코팅된 실리카 복합체이다.

일반적으로, 고체상 매트릭스 백본은 얻어진 관능화 고체상 매트릭스 뿐만 아니라, 예를 들면 불규칙 입자 또는 구형 비드, 멤브레인 또는 시트, 성형면, 또는 봉의 형태이어도 좋다. 또한 고체상 재료는 단백질에 대하여 완전히 또는 부분적으로 침투성이거나 또는 완전히 불침투성이어도 좋다. 본 발명의 특히 목적하는 실시형태에 있어서, 매트릭스는 1-10000㎛, 바람직하게는 10-1000㎛의 범위에 있는 크기를 가진 불규칙 또는 구형 비드의 형태이고; 고성능 적용을 위해서는 10-60㎛이고, 또한 제조 목적을 위해서는 50-500㎛, 바람직하게는 50-300㎛이다.

특히 목적한 매트릭스의 형태는 밀도 제어 입자를 포함하는 덩어리의 형태인 밀도 제어 매트릭스이다. 이들 덩어리는 특히 유동화 또는 확장된 베드 크로마토그래피를 위한 대규모 조작에 적용가능할 뿐만 아니라 비충전 컬럼에서의 다른 배치식 크로마토그래피 기술, 예를 들면 간단한 교반탱크에서의 배치 흡착에도 적용가능하다.

본 발명에 따른 친화성 리간드는, 본 발명에 따른 친화성 리간드와 고체상 재료 사이의 직접 화학 반응에 의해서, 또는 그 자체로 매트릭스 백본과 리간드를 연결할 수 있는 공지된 적절한 시약을 사용하여 고체상 재료 또는 리간드의 선행 활성화에 의해서, 본 목적에 그 자체로 적용가능한 공지된 임의의 종류의 공유결합에 의해 고체상 재료에 부착될 수 있다. 이러한 적절한 활성화제의 예로는 에피클로로히드린, 에피브로모히드린, 알릴-글리시딜에테르; 부탄디올디글리시딜에테르 등의 비스에폭시드; 디클로로프로판올, 디비닐술폰 등의 할로겐-치환 지방족 화합물; 카르보닐디이미다졸; 글루타르 디알데히드 등의 알데히드; 퀴논; 시아노젠 브로마이드; 소듐-메타-과요오드산 등의 과요오드산; 카르보디이미드; 시아누릭 클로라이드 등의 클로로트리아진; 토실 클로라이드 및 트레실 클로라이드 등의 술포닐 클로라이드; N-히드록시 숙신이미드; 2-플루오로-1-메틸피리디늄톨루엔-4-술포네이트; 옥사졸론; 말레이미드; 피리딜 디술피드; 및 히드라진이 있다. 이들 중에서, 단일결합과 다른 스페이서기 SP1을 이탈시키는 활성화제, 예를 들면 에피클로로히드린, 에피브로모히드린, 알릴-글리시딜에테르; 비스-에폭시드; 할로겐-치환 지방족 화합물; 디비닐 술폰; 알데히드; 퀴논; 시아노젠 브로마이드; 클로로-트리아진; 옥사졸론; 말레이미드; 피리딜 디술피드; 및 히드라진이 바람직하다.

특히 목적한 활성화제는 에피클로로히드린, 알릴-글리시딘에테르 및 부탄디올 디글리시딜에테르 등의 에폭시 화합물인 것으로 사료된다.

본 발명의 범위 내에서 펩티드 친화성 크로마토그래피에 대하여, 펩티드 리간드의 고정에 유용한 임의의 매트릭스를 사용할 수 있다. 바람직하게는 독일의 Merck, Darmstadt사의 프락토겔 에폭시 (M) 또는 마찬가지로 바람직한 "모놀리식 크로마토그래피 매체" CIM-에폭시가 사용된다. 리간드는 크로마토그래피 매트릭스의 화학적으로 활성화된 백본에 직접적으로, 또는 스페이서 또는 연결자를 통해 고정화될 수 있다. 후자의 경우, 스페이서를 크로마토그래피 매트릭스에 연결한 다음, 상기 스페이서를 화학적으로 활성화하여, 리간드를 결합할 수 있다. 바람직하게는 프락토겔 에폭시 매트릭스를 스페이서와 조합하여 사용한다.

본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 스페이서는 크로마토그래피 매트릭스의 디아미노디프로필아민(DADPA)과의 반응 및 이어지는 무수숙신산(SA)과의 반응에 의해 생성된다. 스페이서 상의 얻어진 말단 카르복시기는 화학적으로 활성화되고, 바람직하게 말단 아미노기에 연결된다. 리간드는 그것을 포함하는 반응성기를 통해 매트릭스 또는 스페이서 상에 고정된다. 펩티드 리간드의 경우, 이러한 반응성기는 아미노, 카르복시 또는 술프히드릴 중 어느 하나이어도 좋다. 본 발명에서 아미노 결합을 통해 매트릭스 또는 스페이서 상에 펩티드를의 고정시키는 것이 특히 바람직하다.

바람직하게는, 특히 친화성 크로마토그래피 재료로서 제공된 본 발명에 따른 친화성 매트릭스는 상기 a) 및 b)에서 규정한 바와 같은 올리고펩티드 또는 상기 c)에서 규정한 바와 같은 폴리-아미노산을 나타낸다.

여기서 사용하는 "올리고펩티드"는 3개 이상의 아미노산을 함유하는 단백질성 화합물을 말한다. 보통 이러한 올리고펩티드는 최대 35개 아미노산의 길이, 바람직하게는 4~20개 아미노산 잔기의 길이를 갖는다.

따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 친화성 크로마토그래피 시스템은 5~12개 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 6~8개 아미노산 길이의, 특히 트립토판 잔기를 갖는 올리고펩티드 리간드를 사용하고, 이 리간드는 카오트로픽 조건하에서 자가단백분해 기능을 발휘하는 융합 폴리펩티드의 부분에 선택적으로 결합되고, 코스모트로픽 조건으로 변화하는 동안뿐만 아니라 코스모트로픽 조건하에서도 결합을 유지한다.

이러한 친화성 크로마토그래피의 형태는 항체로부터 알려진 실례와 같이 소정 폴리펩티드의 다른 폴리펩티드로의 특정 결합을 사용한다. 올리고펩티드는 친화성 리간드로서도 기능할 수 있다. 이들 분자는 높은 화학적 안정성, 효율, 선택성, 저비용을 제공하고, 또한 이들은 보통 유독하지 않다. 이들 특징은 특히 생물약제학 공정에 적용하는 경우에 특히 이점으로 생각된다. 표적 분자에 대해 적용된 펩티드 리간드는 당업자에게 알려진 방법으로 조합 펩티드 라이브러리 또는 생물학적 라이브러리에서 확인할 수 있다. 본 발명의 명세서에서, 펩티드 리간드의 차단은 카오트로픽 조건하에서 행하였다.

본 발명에 따른 이들 친화성 리간드는 변성조건, 예를 들면 4M 우레아에서 N^pro 및 N^pro-융합 단백질(및 그 돌연변이이거나 또는 이를 포함하는 단백질)에 결합하는 능력에 의해 구체적으로 특징지어지는 것으로 판명되었다.

본 분야에서 공지된 펩티드 합성방법은 본 발명에서 행하는 올리고펩티드 리간드의 제조에 적합하다. 그렇지만 바람직하게는 펩티드 리간드는 Ruiwu Liu, et al. Experimental Heamtology 31 (2003) 11-30에 기재되어 있는 SPOT 합성, PIN 합성, 티백 합성, 믹스 앤드 스플릿법, 또는 Joseph A. Buettner et al., Int. J. Peptide Protein Res. 47 (1996), 70-83에 기재되어 있는 PELICAN법에 의해 생성된다. 수개의 화학 연결자를 제 1 아미노산의 고정에 적용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 리간드는 개별적으로 생성된 후, 크로마토그래피 매트릭스 상에 고정화된다. 본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 펩티드 리간드는 크로마토그래피 매트릭스 상에 직접 합성된다.

올리고펩티드 리간드는 고도의 특이성을 발휘한다. 본 발명의 범위 내에서 합성된 올리고펩티드는 변성조건하에서 N^pro, N^pro 유도체 및 그 융합 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 능력에 의해 특징지어진다. 본 발명의 범위 내에서, 이러한 올리고펩티드 리간드는 자가단백분해 기능을 발휘하는 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드의 부분에 대해 적용된다.

본 발명의 보다 바람직한 실시형태에서, 올리고펩티드 리간드는 VSIFEW, AVSIEWY, AVSFIWY, VSFIWYK, ASRFWYA, AFYTWYA, AFYRWYK, AFYRWY, AFYRWYA, AVSIFEWY, AVSRNWY, ASRFWY, AFYRWYAA, AFYRWY, ASRFWYAA, AFYRWYAA 및 AFYSWYAA로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 범위에서, 올리고펩티드 리간드는 유리 N-말단 또는 예를 들면 아세틸/아실화에 의해 블록된 블록 N-말단과 함께 사용해도 좋다.

본 발명의 가장 바람직한 실시형태에 있어서, SEQ ID NO 5에 따른 CSFV의 자연 발생한 N^pro의 유도체(이 돌연변이의 아미노산 서열은 잔기 53~57개로부터 서열 모티프 "EDDIE"를 가지므로(야생형에서 "RGDIR" 대신), 이 돌연변이(및 이 모티프를 포함하는 다른 돌연변이)는 여기서 "EDDIE"-돌연변이라고 함)는 ASRFWYA, AFYTWYA, AFYRWYK, AFYRWY 및 AFYRWYA로 이루어진 군에서 선택되는 올리고펩티드 리간드와 조합하여 사용된다.

따라서, 바람직한 친화성 리간드는 VSDDWY, VSEDWY, VSIDWY, VSYDWY, VSVDWY, VSWDWY, VSYDWY, VSFDWY, VSDEWY, VSEEWY, VSIEWY, VSYEWY, VSVEWY, VSWEWY, VSYEWY, VSFEWY, DDDDWY, DDEDWY, DDIDWY, DDYDWY, DDVDWY, DDWDWY, DDYDWY, DDFDWY, VSIFWE, FSIFEW, WSIFEW, VSLIWY, VSLIDW, VSLIEW, VSLIWE, FSLEEW, VSDLDW, VSDLEW, VSYIDW, VSYIWE(이들 모든 펩티드는 pH 5.5에서 N^pro에 결합함), VSIDWY, VSIEWY, VSIWWY, VSIIWY, VSYIWY, VSVIWY, VSFIWY, VSFIWE, VSIFEW, VSIFWE, FSIFEW, WSIFEW, VSLIWY, VSLIDW, VSLIEW, VSLIWE, FSLIEW, WSLIEW, FSYFEW, FSFYEW, WSFYEW, FSYIEW, WSYIEW(이들 모든 펩티드는 pH 7.3에서 N^pro에 결합함), AFYTWYA, AFYRWYK, AFYRWY, AFYRWYA, AFFRWYA, AFGRWYA, AFHRWYA, AFIRWYA, AFLRWYA, AFMRWYA, AFNRWYA, AFPRWYA, AFQRWYA, AFRRWYA, AFSRWYA, AFTRWYA, AFVRWYA, AFYRWYA, AFYFWYA, AFYGWYA, AFYLWYA, AFYMWYA, AFYNWYA, AFYPWYA, AFYTWYA, AFYVWYA, AFYWWYA, AFYYWYA, AKWFRYA, VSRNWY, ASRNWYA, ASRFWYA, FSRNWYA, VFRNWYA, VWRNWYA, VYRNWYA, VSRAWYA, VSRFWYA, VSRWWYA, VSRYWYA, VSRNFYA, VSRNYYA, VSRNWFA, VSRNWWA(이들 모든 펩티드는 아미노산 잔기 53~57개에서 EDDIE 모티프와 함께 N^pro 돌연변이에 대하여 특히 높은 친화성을 가짐), Ac-AFYTWYAK, Ac-AFYRWYKK, Ac-AFYRWYK, Ac-AFYRWYAK, Ac-AFFRWYAK, Ac-AFGRWYAK, Ac-AFHRWYAK, Ac-AFIRWYAK, Ac-AFLRWYAK, Ac-AFMRWYAK, Ac-AFNRWYAK, Ac-AFPRWYAK, Ac-AFQRWYAK, Ac-AFRRWYAK, Ac-AFSRWYAK, Ac-AFTRWYAK, Ac-AFVRWYAK, Ac-AFYRWYAK, Ac-AFYFWYAK, Ac-AFYGWYAK, Ac-AFYLWYAK, Ac-AFYMWYAK, Ac-AFYNWYAK, Ac-AFYPWYAK, Ac-AFYTWYAK, Ac-AFYVWYAK, Ac-AFYWWYAK, Ac-AFYYWYAK, Ac-AKWFRYAK, Ac-VSRNWYK, Ac-ASRNWYAK, Ac-ASRFWYAK, Ac-FSRNWYAK, Ac-VFRNWYAK, Ac-VWRNWYAK, Ac-VYRNWYAK, Ac-VSRAWYAK, Ac-VSRFWYAK, Ac-VSRWWYAK, Ac-VSRYWYAK, Ac-VSRNFYAK, Ac-VSRNYYAK, Ac-VSRNWFAK, Ac-VSRNWWAK, YWKA, Ac-YWKAK, YKYA, Ac-YKYAK, YWRA, Ac-YWRAK, ARWY, Ac-ARWYK, YWRA, Ac-YWRAK(이들 모든 펩티드는 N-말단 아세틸화 및 C-말단 리신화에 의해 기질에 대한 고정화능이 향상됨)로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명에 따른 친화성 매트릭스의 특징은 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro(N^pro) 또는 N^pro-돌연변이, 및 N^pro 융합 단백질에 특히 결합한다는 것이다. 본 발명의 매트릭스에 대한 이들 단백질의 결합은 단백질이 통상의 비카오트로픽 조건하에서 결합할 정도로 유효하다. 그러므로, 본 발명에 따른 매트릭스는 고체상 및 친화성 리간드에 대하여 특정하게 설계되어, 카오트로픽 및 비카오트로픽 조건하에서 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro(N^pro) 또는 N^pro-돌연변이, 및 N^pro 융합 단백질모두의 결합을 유효하게 할 수 있다.

다른 형태에 따르면, 본 발명은 액체 출발 재료로부터의 단백질의 친화성 결합방법에 관한 것으로, 상기 단백질은 카오트로픽 조건하에서 본 발명에 따른 친화성 매트릭스와 접촉함으로써, 상기 단백질이 상기 매트릭스에 결합하고 상기 액체 출발 재료로부터 분리되는 방법에 관한 것이다.

용어 "코스모트로프"(오더 베이커) 및 "카오트로프"(비오더 메이커)는 본래 각각 단백질 및 멤브레인을 안정화 또는 불안정화시키는 용질을 나타내었다. 후에, 이들은 각각 증가 또는 감소된 물의 구조의 외관상으로 관련된 특성을 의미하였다. 이러한 특성은 환경, 측정방법 또는 조사된 용매화 껍질에 따라 변할 수 있다. 코스모트로프에 대해 사용되는 대체 용어는 삼투적 압력을 받는 세포에서 고염분(물의 본래 수소 결합망을 파괴함)의 유해 효과를 보완하는 것으로 알려졌기 때문에 "보상 용질"이다. 수소결합의 정도 및 강도 모두 용질에 의해 독립적으로 변화할 수 있지만, 이들 중 어느 하나는 질서 형성의 수단으로서 사용될 수 있고 사용되어 왔다. 그러나, 양질의 수소결합의 정도의 효과는 가장 중요하다. 코스모트로프의 질서 효과는 이들의 확산순환에 의해 혼란될 수 있어서, 포위 벌크수에 의해 덜 수화된 카오트로프보다 더 무질서한 더욱 광범위한 파괴된 접합 영역을 생성한다. 대부분의 코스모트로프는 물에서 대규모의 그물 구조를 유발하지 않는다.

이온성 코스모트로프(또는: 비이온성 코스모트로프와 구별되는 "안티카오트로프")는 주로 포위 물분자의 통제된 광학적인 배열에 의해 비이온성 코스모트로프와 달리 취급될 수 있다. 일반적으로, 비이온성 행동은 호프마이스터 시리즈와 대등하다. 저전하 밀도의 대형 1가 이온(예를 들면 SCN^-, H₂PO₄ ^-, HSO₄ ^-, HCO₃ ^-, I^-, Cl^-, NO₃ ^-, NH₄ ⁺, Cs⁺, K⁺, (NH₂)₃C⁺(구아디늄) 및 (CH₃)₄N⁺(테트라메틸암모늄) 이온; 물 그 자체보다 물과의 상호작용이 약하여, 포위의 수소결합에서의 방해가 적음)은 카오트로프인 반면, 고전하 밀도의 소형 또는 다가 이온은 코스모트로프이다(예를 들면 SO₄ ² ^-, HPO₄ ² ^-, Mg² ⁺, Ca² ⁺, Li⁺, Na⁺, H⁺, OH^- 및 HPO₄ ² ^-, 물 그 자체보다 물분자와의 상호작용이 강하므로, 물-물 수소결합을 파괴시킬 수 있음). 1가의 카오트로픽 이온의 반경은, 양이온에 대하여 1.06Å 보다 더 크고 음이온에 대하여 1.78Å 보다 더 크다. 따라서, 물분자 사이의 수소결합은 이온성 카오트로프보다 이온성 코스모트로프의 인접한 부근에서 더 파괴된다. 이 결론을 보충하면, 할라이드 이온 F^-, Cl^-, Br^- 및 I^- 주변의 물의 수소-결합 구조에 대한 라만 분광학적 연구는 이온 크기가 증가함에 따라 수성 수소 결합의 총 범위가 증가한다는 것을 나타내고, HDO:D₂O에서의 IR 연구에서는 크기가 증가함에 따라 더욱 느려지는 이들 할라이드 이온 주위에서의 느린 수소 결합 배열을 보인다. 용질이 그것을 포위한 수소 결합의 일부를 강화시키면서(구조 형성; 예를 들면 코스모트로픽 양이온은 내부 껍질 물분자에 의해 제공된 수소 결합을 강화시킬 것이다), 동시에 다른 일부 수소 결합을 파괴할 수 있다(구조 파괴; 예를 들면 코스모트로픽 양이온은 내부 껍질 물분자에 의해 수용된 수소 결합을 약화시킬 것이다)는 것은 타당하다. 유사한 다른 요인으로, 쯔비터이온성 및 양이온성 아미노산 사이의 차이에 의해 나타나는 바와 같이, 물분자는 정미전하가 없는 분자에 의해서 보다는 정미전하를 보유한 분자에 의해서 보다 강하게 유지된다.

약하게 수화된 이온(카오트로프, K⁺, Rb⁺, Cs⁺, Br^-, I^-, 구아니디늄⁺)은 이온-물 수화의 강도가 벌크 용액에서 물-물 상호작용의 강도와 거의 동등한 경우에 일어나는 강한 이온성 수화로부터 약한 이온성 수화로의 변화에 따라 강한 물-물 상호작용에 의해 약하게 수화된 표면으로 "푸쉬"될 수 있다(Na⁺는 강한 측의 경계선이고 Cl^-는 약한 측의 경계선임). 2개의 중요한 카오트로프(구아니디늄 및 티오시아네이트 이온)에 대한 중성자 회절 연구에서는 이들은 수화에 매우 취약하다는 것을 나타내고, 이들이 물보다는 단백질과 우선적으로 상호작용한다는 가설을 뒷받침한다. 코스모트로프와 관련해서, 전자의 저전하 밀도에 의한 이온성 및 비이온성 카오트로프의 특성 사이의 차이가 현저한 것은 아니다.

염에 의한 생물학적 거대 분자의 최적 안정성은 코스모트로픽 음이온과 카오트로픽 양이온의 혼합을 필요로 한다.

카오트로프는 물의 수소-결합 네트워크를 파괴시켜서, 거대 분자를 보다 구조적으로 자유롭게 하여, 단백질을 확장 및 변성시킨다. 코스모트로프는 물의 질서를 향상시키는 용질(다가알콜, 트레할로스, 트리메틸아민 N-옥시드, 글리신 베타인, 엑토인, 프롤린 및 각종 다른 쯔비터이온 등)을 안정화 시키는 반면, 카오트로프는 보다 약한 수소 결합을 생성하여 물의 질서를 감소시키고, 그 표면 장력을 향상시키고, 또한 거대 분자 구조를 불안정화시킨다(구아니디늄 클로라이드 및 고농도의 우레아 등). 최근 연구는 우레아는 수소 결합과 소수성 상호작용을 모두 약화시키지만, 글루코스는 코스모트로프로서 작용하여 이들 특성을 향상시킨다는 것을 보여준다. 따라서, 우레아 분자는 충분한 물이 없는 경우 그 자체 및 단백질(펩티드 연결을 상당히 포함함)에 대하여 최적으로 수화된(우레아 몰당 약 6-8몰의 물) 우레아 수소결합이 아니어서, 보다 소수성으로 되므로, 또한 단백질 상에서 다른 부위와 더욱 상호작용할 수 있어, 국소적 탈수화-지배 변성을 유도한다. 구아니디늄은 통상 발견되는 4차 구조 아르기닌-카르복실레이트 "염" 연결과 유사하게, 그 가장자리 주변에 약한 수소결합을 형성할 수 있지만, 단백질 카르복실레이트에 대해서는 강하게 유지된 수소-결합 이온쌍을 생성할 수 있는 평면 이온이다. 또한, 구아니디늄은 유사 단백질 표면와 상호작용하여 단백질을 변성시킬 수 있는 소수성 표면을 보유한다. 두 변성제 모두 소수성 부위 사이에서 슬라이딩에 의한 단백질 팽윤 및 붕괴를 초래하여, 결과적으로 수소결합된 물에 당겨져서 변성을 완료한다.

일반적으로, 용질의 코스모트로픽/카오트로픽 성질은 대개 필연적으로 고농도에서 물의 물리적 벌크 특성으로부터 결정된다. 구조화도의 변화는, 예를 들면 NMR 또는 진동 분광계를 사용하여 알 수 있다. 단백질-안정화 용질(코스모트로프)는 수소 결합의 정도를 증가시키고(양성자 및 ¹⁷O 스핀-격자 완화 시간을 저감시킴), 반면에 NMR 화학 시프트는 증가되거나(약한 결합, 예를 들면 쯔비터이온 코스모트로프, 트리메틸아민 N-옥시드에서 보임) 또는 감소된다(강한 결합, 예를 들면 폴리히드록시 코스모트로프, 트레할로스를 보임). 트레할로스는 화학 시프트 및 완화 시간 모두 저감되고, 보다 적은 범위가 단백질 안정화제 (NH₄)₂SO₄인 반면, NaCl은 화학 이동에서만 저감을 보이고, 단백질 불안정화제 KSCN은 완화 시간 증가 및 화학 시프트 저감을 보인다. 진동 분광은 5200cm^-1(v₂+v₃ 조합) 근처의 근-IR 파장을 사용할 수 있고, 이것은 수소 결합이 강화되었을 때 보다 장파장(작은 파수)에 대하여 이동한다.

가장 중요한 코스모트로프의 하나는 비환원 당 α,α-트레할로스이다. 이것은 트레할로스가 이것의 변광 회전의 결핍에 의해 환원당보다 보다 많은 정적 구조를 갖거나, 또는 이것의 푸란환의 결핍에 의해 다른 통상의 비환원 이당류를 갖는 것을 나타낼 수 있다.

따라서, 용어 "카오트로픽 조건"은 액체 출발 재료의 성질(예를 들면 용액, 현탁액, 에멀젼, 2 또는 3상 액계 등)에 따라, 특히 1이상의 상을 포함하는 재료에 있어서 재료의 수상에 따라 고려되어야 한다. 본 발명에 따른 바람직한 카오트로픽 조건은 1~7M, 특히 2~6M의 우레아 농도에 상응하는 것이다(바람직하게는 8.0g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na₂HPO₄, 0.24g KH₂PO₄ ad 1000㎖ with A. dest., pH 7.4 with HCl 등의 완충염 용액). 카오트로픽 조건(및 카오트로피시티의 저감("낮은" 또는 "적은" 카오트로픽 조건))의 대응은 상술한 방법 뿐만 아니라 호프메이스터 시리즈의 기술을 적용하여 쉽게 결정할 수 있다. 출발 액체 중의 각종 물질의 첨가는 결합을 위한 최적 결합/비응집 조건을 제공하기 위해서 개별의 경우마다 확인해야 한다. 예를 들면, 환원제의 사용은 0.05~50mM 디티오트레이톨(DTT), 특히 0.1~10mM DDT의 양에 해당하도록 최적되어야 한다. 또한, 상술한 바와 같이 세정제의 첨가는 출발 재료의 카오트로피시티에 영향을 줄 수 있다.

바람직하게는, 상기 매트릭스에 결합된 단백질은 상기 매드릭스에 결합되어 있는 동안 더 처리된다. 이러한 추가 처리는 바람직하게는 화학 유도체화, 복합화, 퇴행화 등, 특히 자가단백분해(자가촉매성 부분을 갖는 융합 단백질의 경우)이어도 좋다. 이 추가 처리는 출발 재료 중에 카오트로픽이 적은 조건하에서 행하는 것이 바람직하다. 보통, 이들 후처리 단계를 위한 최적 조건은 친화성 리간드에 대한 친화성 매트릭스에 결합된 단백질의 친화성을 유지할 목적으로 균형잡힌 처리 반응 자체를 위한 최적 조건에 의존한다.

결합되어 있고 또한 필요에 따라 가용성 형태로 처리된 단백질을 제공하기 위해서, 자가단백분해성 부위 및 표적 단백질 부분을 포함하는 융합 단백질로서 제공된다면 단백질은 담체로부터, 또는 적어도 융합 단백질의 표적 단백질 부분으로부터 재차 용리되어야 한다. 이것은 여러가지 방법으로 행할 수 있다. 자가촉매성 부분을 갖는 융합 단백질의 경우, 용리는 자가단백분해 반응에 의해 행해진다. 이러한 경우, 오토프로테아제 일부는 친화성 매트릭스에 체류한다. 다른 경우, 바람직하게는 액체 출발 재료로서 보다 낮은 카오트로피시티를 갖는 용리 완충제를 적용하는 경우에도, 매트릭스 또는 상기 처리된 단백질에 결합된 단백질은 매트릭스에 유지된다. 바람직하게는 적어도 융합 단백질의 자가단백분해성 부위가 매트릭스에 유지결합된다.

다른 경우, 단백질은 친화성 매트릭스 상에 유지되어, 예를 들면 고정된 효소를 제공하기 위한 고정체로서 사용될 수 있다. 비공유이지만, 고체 표면에 대한 단백질의 강한 결합에 의해서, 고정화된 효소는 산업 공정에 사용될 수 있고, 특히 고정화된 단백질이 효소적 활성을 갖는 경우에는, 활성 표면을 제공함으로써(효소적으로, 촉매적으로) 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 단백질은 자가단백분해성 부위 및 상기 자가단백분해성 부위에 의해 비카오트로픽 조건하에서 자가단백분해적으로 분절가능한 목적한 단백질로 이루어진 부분을 포함하는 이종의 재조합 폴리펩티드, 특히 자가단백분해성 부위가 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro(N^pro) 또는 N^pro-돌연변이인 융합 단백질, 및 변성조건하에서 봉입체로서 발현되는 N^pro융합 단백질이다.

상술한 바와 같은 공정의 바람직한 실시형태에 따르면, 융합 폴리펩티드는 상술한 바와 같은 적어도 하나의 시스테인 잔기의 치환 이외에, 적어도 하나의 염기성 아미노산 잔기가 산성 아미노산 잔기로 교환된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체를 포함한다.

더욱 바람직한 것은 상술한 바와 같은 적어도 하나의 시스테인 잔기의 치환 이외에, 아미노산 H5, K16, N35, R53, G54, R57, L143, K145 및 R150 중 하나 이상이 더 교환된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체이다. 바람직한 예는 아미노산 아르기닌(R) 53이 글루타민산(E)으로, 아미노산 글리신(G) 54가 아스파르트산(D)으로, 아미노산 아르기닌(R) 57이 글루타민산(E)으로, 또한 아미노산 류신(L) 143이 글루타민(Q)으로 교환된 유도체이다.

따라서, 더욱 바람직하게는 본 발명의 다른 형태는, 융합 폴리펩티드가 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체를 포함하고, 상술한 바와 같은 적어도 하나의 시스테인 잔기의 치환 이외에, 아미노산 아르기닌(R) 53이 글루타민산(E)으로, 아미노산 글리신(G) 54가 아스파르트산(D)으로, 아미노산 아르기닌(R) 57이 글루타민산(E)으로, 또한 아미노산 류신(L) 143이 글루타민(Q)으로 더 교환된 상술한 바와 같은 공정에 더욱 관련한 것이다.

본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 있어서, CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체는 하기 아미노산 서열을 포함한다:

SEQ ID NO 3:

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTL RDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGS DGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168).

따라서, 다른 형태에 있어서도 본 발명은 융합 폴리펩티드가 SEQ ID NO 3에 따른 서열을 갖는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체를 포함하는 상술한 바와 같은 공정에 관한 것이다.

또 다른 형태에 있어서, 본 발명은 자연적으로 발생하는 페스티바이러스의 N^pro의 유도체에 관한 것이고, 이것은 자연적으로 발생하는 페스티바이러스의 N^pro에 비하여 저감된 응집성 이외에 보다 중성의 pI, 더욱 향상된 용해성을 보인다.

상술한 바와 같이 용해성을 측정한다.

따라서, 본 발명은 상술한 바와 같은 적어도 하나의 시스테인 잔기의 치환 이외에, 적어도 하나의 소수성 아미노산 잔기가 친수성 잔기로 교환된 CSFV의 오토프로테아제 Npro의 유도체에 관한 것이다.

따라서, 다른 형태에 있어서 본 발명은 융합 폴리펩티드가 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체를 포함하고, 상술한 바와 같은 적어도 하나의 시스테인 잔기의 치환 이외에, 적어도 하나의 소수성 아미노산 잔기가 친수성 잔기에 의해 치환된 상술한 바와 같은 공정에 관한 것이다.

본 발명에서 상술한 바와 같은 적어도 하나의 시스테인 잔기의 치환 이외에 아미노산 V24, A27, L23, G54, L75, A109, V114, V121, L143, I155 및 F158 중 적어도 하나가 더 교환된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체가 바람직하다. 바람직한 예는 하기 아미노산 알라닌(A) 109, 발린(V) 114, 이소류신(I) 155 및 페닐알라닌(F) 158가 트레오닌(T)으로 교환된 유도체이다.

따라서 다른 형태에 있어서, 본 발명은 융합 폴리펩티드가 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체를 포함하고, 상술한 바와 같은 적어도 하나의 시스테인 잔기의 치환 이외에, 하기 아미노산 알라닌(A) 109, 발린(V) 114, 이소류신(I) 155 및 페닐알라닌(F) 158이 트레오닌(T)으로 교환된 상술한 바와 같은 공정에 관한 것이다. 또한, 본 발명에서 보다 바람직한 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체는 하기 아미노산 서열을 포함한다:

SEQ ID NO 4:

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTL RDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGS DGKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168).

따라서 다른 형태에 있어서 본 발명은 보다 바람직하게는 융합 폴리펩티드가 SEQ ID NO 4에 따른 서열을 갖는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체를 포함하는 상술한 바와 같은 공정에 관한 것이다.

본 발명에서 상술한 바와 같은 적어도 하나의 시스테인 잔기의 치환 이외에 아미노산 알라닌(A) 109, 발린(V) 114, 이소류신(I) 155 및 페닐알라닌(F) 158이 트레오닌(T)으로, 아미노산 아르기닌(R) 53이 글루타민산(E)으로, 아미노산 글리신(G) 54이 아스파라트산(D)으로, 아미노산 아르기닌(R) 57이 글루타민산(E)으로, 또한 아미노산 류신(L) 143이 글루타민(Q)으로 교환된 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체가 보다 바람직하다.

따라서 다른 형태에 있어서, 본 발명은 융합 폴리펩티드가 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체를 포함하고, 상술한 바와 같은 적어도 하나의 시스테인 잔기의 치환 이외에, 아미노산 알라닌(A) 109, 발린(V) 114, 이소류신(I) 155 및 페닐알라닌(F) 158이 트레오닌(T)으로, 아미노산 아르기닌(R)이 글루타민산(E)으로, 아미노산 글리신(G) 54이 아스파라트산(D)으로, 아미노산 아르기닌(R) 57이 글루타민산(E)으로, 또한 아미노산 류신(L) 143이 글루타민(Q)으로 교환된 상술한 바와 같은 공정에 관한 것이다.

본 발명에 따른 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체는 하기 아미노산 서열을 포함하는 것이 더욱 바람직하다:

SEQ ID NO 5:

(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTL RDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGS DGKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168) .

따라서, 더욱 바람직한 다른 형태에 있어서, 본 발명은 융합 폴리펩티드가 SEQ ID NO 5에 따른 서열을 갖는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체를 포함하는 상술한 바와 같은 공정에 관한 것이다.

동일하게 다른 바람직한 형태에 있어서, 본 발명은 융합 폴리펩티드가 SEQ ID NO 5에 따른 서열을 갖는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체를 포함하고, 아스파라긴(N) 35가 트레오닌(T)로 치환된 것 이외에, 트레오닌(T) 158이 세린(S)으로 교환된 상술한 바와 같은 이종 단백질의 생산공정에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 형태에 있어서, 본 발명은 융합 폴리펩티드가 SEQ ID NO. 32에 따른 서열을 갖는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체를 포함하고, 알라닌(a) 28이 글루타민산(E)으로 치환되는 것 이외에, 세린(S) 71이 페닐알라닌(F)으로 치환되고, 또한 아르기닌(R) 150이 히스티딘(H)으로 교환된 상술한 바와 같은 이종 단백질의 생산공정에 관한 것이다.

바람직하게는 본 발명에 따른 공정에서, CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체를 프로인슐린의 적어도 3개의 제 1 아미노산을 함유하는 단백질, 보다 바람직하게는 프로인슐린, 더욱 바람직하게는 인간 프로인슐린, 가장 바람직하게는 재조합 인간 프로인슐린의 융합에 사용하여, 프로인슐린을 생산한다.

본 발명에 따르면, CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체는 상술한 바와 같은 적어도 하나의 시스테인 잔기가 치환된 이외에, 아미노산 아르기닌(R) 53, 글리신(G) 54, 아르기닌(R) 57, 트레오닌(T) 109, 114, 155, 158 및 류신(L) 143 중 적어도 하나가 교환된다. 본 발명에 따른 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 바람직한 유도체는 상술한 바와 같은 적어도 하나의 시스테인 잔기가 치환되는 이외에, 아미노산 아르기닌(R) 53이 글루타민산(E)으로, 아미노산 글리신(G) 54이 아스파라트산(D)으로, 아미노산 아르기닌(R) 57이 글루타민산(E)으로, 아미노산 트레오닌(T) 109, 114, 155, 158이 세린(S)으로, 또한 아미노산 류신(L) 143이 글루타민산(Q) 또는 아스파라긴(N) 또는 아스파르트산(D) 또는 세린(S) 또는 히스티딘으로 교환된다.

다른 실시형태에 있어서, 특히 융합 단백질이 비카오트로픽 조건하에서도 본 발명에 따른 친화성 매트릭스에 결합될 수 있는 경우, 융합 단백질의 자가단백분해성 부위는 불활성이거나 또는 분절될 수 없는 형태로 제공되어야 한다. 이 때 이것은 자가단백분해 특성에 의한 것이 아니라 이것의 친화적 특성에 대해서만 사용되지만; 본 발명에 따른 친화성 매트릭스에 결합되는 경우-비카오트로픽(생리학적, "정상")조건이 아닌 경우에도 스스로, 또는 융합 단백질의 표적 분자 부분에 대한 이들의 연결자에 의해 자가단백분해 활성을 보이지 않는 CSFV의 오토프로테아제 N^pro의 유도체를 "자가단백분해"(부분)이라고도 한다.

바람직하게는, 자가단백분해성 부위는

SEQ ID NO 1: (N_pro)

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSD GKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168),

SEQ ID NO 2:

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168),

SEQ ID NO 3 :

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168) ,

SEQ ID NO 4:

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168),

SEQ ID NO 5: ("EDDIE"-돌연변이)

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168),

SEQ ID NO 6:

(I)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGTPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNSTNCPLWVTSC-(168),

SEQ ID NO 7:

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTEGRPLFGTPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLR DLPRKGDCRFGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPHTLKWTRNSTNCPLWVTSC-(168),

SEQ ID 8:

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKSAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168) 및

SEQ ID 9:

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGTPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSD GKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNSTNCPLWVTSC-(168)로 이루어진 군에서 선택된다.

많은 단백질은 생리학적 조건하에서 높은 응집 경향을 보이거나 또는 이들 본래 생물학적 활성은 프리온 단백질 또는 아밀로이드 펩티드에 대해 가정된 바와 같이 응집적이다. 이 단백질을 연구하기 위해서는, 이것들은 극단의 pH(산 또는 염기)의 수용액의 존재하에서 세정제의 첨가, 및 아세토니트릴, 에탄올, 이소프로판올, 프로판올, 피리딘 등의 유기 용제의 첨가에 의해서, 카오트로픽 조건하에서 가용화되어야 한다. 높은 응집 경향을 지닌 아밀로이드 펩티드는 다수의 질병과 관련되어 있다. 주요 아밀로이드 및 프로테인 또는 관련된 펩티드의 요약(중추신경계에 영향을 미치는 조건은 이태리체로 표시함):

임상 증후군	피브릴 성분
알츠하이머병	Aβ 펩티드(1-40, 1-41, 1-42, 1-43); Tau
해면상 뇌병증 ( Spongiform encephalopathies )	프리온 단백질(전장 또는 단편)
파킨슨병	α- 시누클레인 (야생형 또는 돌연변이)
전측두 치매 ( Fronto - temporal dementias )	Tau (야생형 또는 돌연변이)
가족성 덴마크 치매 ( Familial Danish dementia )	ADan 펩티드
가족성 브리티쉬 치매 ( Familial British dementia )	ABri 펩티드
아밀로이드증을 수반한 유전성 뇌출혈( Hereditary cerebral haemorrhage with amyloidoses )	시스타틴 C(마이너스 a 10- 잔기 단편); Aβ 펩티드
근위축성 측삭 경화증 ( Amyotrophic lateral sclerosis )	수퍼옥사이드 디스뮤타제 (야생형 또는 돌연변이)
Dentatorubro - pallido - Luysian atrophy	아트로핀 1( 폴리 Q 확장체 )
헌팅턴병	헌팅틴( 폴리 Q 확장체 )
소뇌성 운동실조 ( Cerebellar ataxias )	아탁신( 폴리 Q 확장체 )
케네디병	안드로겐 수용체( 폴리 Q 확장체 )
척수 소뇌성 운동실조증(Spino cerebellar ataxia 17)	TATA 박스-결합 단백질( 폴리 Q 확장체 )
일차 전신 아밀로이드증 (Primary systemic amyloidosis)	Ig 경쇄(전체 길이 또는 단편)
이차 전신 아밀로이드증 (Secondary systemic amyloidosis)	세륨 아밀로이드 A(단편)
가족성 지중해열병 (Familial Mediterranean Fever)	세륨 아밀로이드 A(단편)
노인성 전신 아밀로이드병 (Sinile systemic amyloidosis)	트란스타이레틴(야생형 또는 그 단편)
가족성 아밀로이드 다발신경병증Ⅰ (Familial amyloidotic polyneuropathyⅠ)	트란스타이레틴(45 이상의 변형체 또는 그 단편)
혈액투석-관련 아밀로이드증 (Hemodialysis-related amyloidosis)	β2-마이크로글로불린
가족성 아밀로이드 말초신경병증 Ⅲ (Familial amyloid polyneuropathy Ⅲ)	아폴리포단백질 A-1(단편)
핀란드 유전성 전신적 아밀로이드증 (Finnish hereditary systemic amyloidosis)	젤솔린(단편 또는 돌연변이 단백질)
Ⅱ형 당뇨병(Type Ⅱ diabetes)	Pro-islet 아밀로이드 폴리펩티드(단편)
갑상선의 수질암 (Medullary carcinoma of the thyroid)	프로칼시토닌(전장 또는 단편)
심방성 아밀로이드증(Atrial amyloidosis)	심방성 배설인자
리소자임 전신 아밀로이드증 (Lysozyme systemic amyloidosis)	리소자임(전장, 돌연변이)
인슐린-관련 아밀로이드 (Insulin-related amyloid)	인슐린(전장)
피브리노겐 α-쇄 아밀로이드 (Fibrinogen α-chain amyloidosis)	피브리노겐(α-쇄 변형체 및 단편)

다른 단백질 군인 멤브레인 단백질은 소위 멤브레인 이중층과 조합된다. 생물학적 멤브레인은 셀 사이의 계면 및 세포내 성분의 경계로서 외부에 대하여 계면으로서 중대한 기능을 수행한다. 따라서, 생물학적 멤브레인은 고인슐린혈증, 신성 요붕증, 울형성 심부전, 간경변증, 낭포성 섬유증, 고혈압 및 저혈압, 폐부종, 간질, 및 백내장 등의 많은 질병과 관련되어 있다. 약 30%의 서열화된 유전자가 멤브레인 단백질의 암호를 지정한다. 그러나, 세정제-가용성 멤브레인 단백질로부터 X-선 분석에 적합한 3차원(3D) 결정을 생산하는 것은 어렵기 때문에, 가용성 단백질의 3000개의 특정 결정 구조와 비교하여 30개의 멤브레인 단백질의 특이 구조만이 원자 분해를 해결하였다. 단백질 데이터 베이스에 축적된 67개 멤브레인 단백질 구조 중에서, 박테리아 기원인 52개는 박테리아 멤브레인 단백질이 식물 또는 동물의 것보다 보다 쉽게 생산, 정제 및 결정화된다고 생각된다. 이제의 과제는 고등 유기체로부터 멤브레인 단백질의 구조를 해결하고, 이들의 기능, 역학 및 리간드와의 상호작용을 연구하는 것이다. 멤브레인 단백질은 많은 종류의 질병을 위한 중요한 약제 표적을 구성한다. 바람직하게는, 이들 단백질("표적 단백질")은 친화성 매트릭스에 융합 단백질로서 결합된다. 표적 단백질이 고정화된 형태로 제공되거나 또는 사용되면, 융합 분자의 자가단백분해성 부위는 불활성 또는 비분절 형태로 제공되어야 한다. 이때는 자가단백분해성 부위는 비카오트로픽 조건하에서도 친화성 매트릭스 상에 표적 단백질을 고정하기 위해서 친화성 핸들 또는 태그로서만 기능한다.

인간에 있어서의 여러가지 크로이츠펠트야콥병(vCJD) 및 양의 스크래피 등의 프리온병은 PrP^Sc, 비정상 아밀로이드 단백질의 뇌 내에 축적하는 것을 특징으로 한다. PrP^c의 구조가 변화함으로써, PrP^Sc가 감염된 인간 및 동물의 뇌 전제에 증식되어, 신경퇴화 및 죽음을 유발한다. 수년 동안, 기초 조사 및 진단에 사용하기 위해서 PrP^c 단독 또는 PrP^c 및 PrP^Sc 모두를 인식하는 많은 항체가 개발되어 왔다. 그러나, PrP^Sc-특정 항체를 얻는 것은 더욱 어려웠다.

멤브레인 단백질(막전위 단백질(내재성 단백질)):

베타-배럴(Beta-barrel) 멤브레인 단백질은 그램-음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외부 멤브레인에 존재한다. β-배럴 멤브레인 단백질의 막관통 서열은 α-헬리칼 멤브레인 단백질의 것보다 소수성이 적어서, 이것은 왜 완전히 다른 폴딩 및 멤브레인 조립 경로가 이들 2종류의 멤브레인 단백질을 진화시키는지에 대한 주요 이유가 될 수 있다. β-배럴 멤브레인 단백질은 생체 외에서 지질 이중층 모델 멤브레인에 자발적으로 리폴드될 수 있다. 이것은 지질 및 단백질 샤프론은 적절한 표적 멤브레인에서 이들의 조립체를 보조하지만, 생체 내에서도 상기 능력을 가질 수 있다. 중요한 다른 멤브레인 단백질은 수퍼 항원이다.

본 방법은 통상 높은 응집 경향을 가지므로(생리학적 조건하에서) 표준 방법, 특히 친화성 정제 기술에 의해 정제될 수 없는, 정제된(또한 필요에 따라 고정된) 무상 단백질을 제공하는데 매우 적절하다. 본 발명에 따른 친화성 매트릭스는 카오트로픽 조건하에서 단백질에 결합하는 능력을 가지므로, 본 방법은 까다로운 단백질, 특히 인간 질병에 관련된 단백질의 친화성 정제에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 친화성 매트릭스에 결합되는 단백질은 생리학적 조건하에서 높은 응집 경항을 갖는 단백질 또는 단백질 일부, 특히 Aβ 펩티드, Tau 프리온 단백질, α-시누클레인, Tau, Adan 펩티드, ABri 펩티드, 시스타틴 C, Aβ 펩티드, 수퍼옥사이드 디스뮤타제 (superoxide dismutase), 아트로핀 1, 헌팅틴, 아탁신, 안드로겐 수용체, TATA 박스 결합 단백질, Ig 경쇄, 세륨 아밀로이드 A, 트란스타이레틴, β2-마이크로글로불린, 아폴리포 단백질 A-1, 젤솔린, Pro-islet, 아밀로이드 폴리펩티드, 프로칼시토닌, 심방성 배설 인자, 리소자임, 인슐린, 피브리노겐, 전장 단백질 또는 특정 단편, 돌연변이 또는 그 폴리Q-확장체로 이루어진 군에서 선택되는 단백질이거나 또는 이것을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 본 방법은 본 발명에 따른 친화성 매트릭스에 대하여 결합하는 것을 포함하는 이종의 폴리펩티드의 제조에 사용된다. 바람직하게는, 이러한 공정은 상기 폴리펩티드의 정제를 더 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 목적하는 이종 폴리펩티드의 친화성 결합 방법을 제공하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 페스티바이러스 오토프로테아제 N^pro 또는 그 유도체의 융합 폴리펩티드로서 발현되고, 상기 융합 폴리펩티드는 카오트로픽 조건하에서 페스티바이러스 오토프로테아제 N^pro 또는 그 유도체에 이러한 조건하에서 특정 결합하는 펩티드와 접촉하고, 또한 상기 펩티드는 고체상에 결합한다.

본 발명에 따른 친화성 리간드(친화성 매트릭스)는 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro(N^pro) 또는 N^pro-돌연변이, 및 전자 2개의 N^pro 융합-폴리펩티드에 대하여 카오트로픽 조건하에서 선택적으로 결합하여 코스모트로피 조건으로 변화하는 동안에도 이 특정 결합을 유지하는 특성을 갖는다. 본 발명에 따른 친화성 리간드의 특징은 카오트로피 조건하에서 단백질, 특히 N^pro, N^pro 돌연변이, 융합 폴리펩티드 및 고도로 응집된 단백질에 대한 이들의 결합 특이성이다. 이 특징은 카오트로픽 조건하에서 단백질의 특정 결합을 필요로 하는 임의의 실험 세팅에 이들을 유용하게 한다. 또한 특정 결합은 코스모트로피 조건으로 변화하는 동안에 유지할 수 있다. 이것은 상술한 바와 같은 펩티드가 변성된 표적 분자의 결합 및 단백질의 리폴딩 및 복원시 결합의 유지를 필요로 하는 실험 세팅에 사용될 수 있게 한다. 따라서 상술한 펩티드는 펩티드 친화성 크로마토그래피를 사용하는 변성조건하에서 N^pro의 포획 및 정제의 실례, 또는 카오트로피 조건하에서 리간드와 단백질의 상호작용을 포함하는 다른 형태의 친화성 분석 또는 친화성 정제에서 사용할 수 있다.

예를 들면, 높은 응집 경향을 갖는 단백질은 N^pro 또는 N^pro 돌연변이에 융합된 다음 이 융합 단백질이 정제되거나 또는 원추출물이 카오트로픽 조건하에서 발현체로부터 제공되어, 본 발명에 따른 친화성 리간드로 덮여진(고정된) 표면에서 배양된다. 그 다음 카오트로픽 조건은 다음 반응 공정 또는 분석에 적합한 조건으로 대체된다. 예를 들면

A. 카오트로픽 조건을 생리학적 완충제로 대체한 다음, 단백질의 특정한 도메인을 지정하는 항체 또는 항체 단편을 사용하여 면역학적 반응을 행한다. 이 전략은 높은 응집 경향을 갖는 단백질의 면역학적 반응을 가능하게 한다.

B. 카오트로픽 조건을 대체한 다음 특정 화학반응을 행하여, 단백질 구조를 변성시킨다. 그 예로는 아미노산 측쇄의 특정 산화, 인산염 또는 황산염의 첨가, 천연 합성 폴리머의 첨가(예를 들면 PEGlyation), 펩티드쇄를 첨가하여 단백질 분자의 n개 분기화, 생리학적 용액 또는 완충제에 불용성인 단백질로 염료의 첨가가 있다.

C. N^pro 또는 N^pro-돌연변이로의 단백질의 융합에 의한 멤브레인 단백질의 단일 분자 복원한다. 분자 핸들은 융합 단백질에 대항하여 본 발명에 따른 친화성 리간드에 고정되어 있고 4M 우레아의 존재하에서 결합된다. 이어서 우레아는 세정제 및 지질 이중층에 의해 제거된다.

크로마토그래피 시스템에 융합 폴리펩티드가 결합된 경우, 비결합 오염 성분은 컬럼에서 쉽게 세정할 수 있다. 이러한 오염 화합물은 예를 들면 숙주 세포 폴리펩티드 및 핵산이 될 수 있고, 이것은 봉입체에 축적 또는 흡착되어 효소적 세포 분열로부터의 잔류 성분 뿐만 아니라 가용화후 폴리펩티드 용액에 잔존한다. 세정 후 융합 폴리펩티드만이 컬럼에 결합되어 잔존하여 정제 시스템에서 하기 단계를 행한다.

융합 폴리펩티드의 결합은 카오트로픽, 불활성 조건하에서 이루어진다. 리폴딩을 유도하기 위해서, 조건은 코스모트로픽으로 변경한다.

바람직한 실시형태에서 융합 폴리펩티드의 리폴딩 단계는 완충제 교환을 통해 카오트로픽에서 코스모트로픽 조건으로 변경하여 행한다.

완충제는 택일적으로 서서히 또는 한번에 코스모트로픽 조건으로 변경될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 카오트로피 완충제의 코스모트로픽 완충제로의 변환은 플러그로서 완충제의 적용에 의해 한번에 행한다. 본 발명의 마찬가지로 바람직한 다른 실시형태에서는, 완충제의 교환을 서서히 행한다.

컬럼에 대한 융합 폴리펩티드의 결합 및/또는 리폴딩 및 상기 융합 폴리펩티드의 분절은 완충제 교환이 온도 조정에 의해 이루어지면 용이하게 행해 질 수 있다. 이것은, 예를 들면 냉각/가열 자켓에 의해 행해질 수 있다. 그러므로, 바람직한 실시형태에 있어서, 냉각/가열 자켓은 온도 조정을 위해 적용되고; 보다 바람직하게는, 완충제가 그 적용 전에 소정의 온도로 된다. 이러한 방법으로 온도 조정이 이루어진다.

충전된 베드 내의 조건이 변경되면, 융합 폴리펩티드는 리폴드되기 시작하고, 자가단백분해 기능을 발휘하는 부분이 활성화된다. 그 결과, 목적하는 C-말단 융합 폴리펩티드가 자가단백분해성 부위의 특이성에 의해 규정된 고유 위치에서 분절되어, 목적하는 폴리펩티드의 동종 N-말단을 생산한다. 융합 폴리펩티드의 리폴딩에 필요한 시간에 의존하여, 모든 카오트로픽 완충제가 충전된 베드로부터 이동하면, 코스모트로픽 완충제를 갖는 유동상의 속도가 감소 또는 정지된다. 리폴딩이 완료된 후, 목적하는 해방된 폴리펩티드가 다음 코스모트로픽 완충제의 주입에 의해 충전된 베드로부터 세정된다. 미분절된 융합 폴리펩티드 뿐만 아니라 융합 폴리펩티드의 N-말단 자가단백분해성 부위도 크로마토그래피 재료 재생을 위해서 종래의 수단, 예를 들면 높은 염농도, pH-변화 또는 NaOH에 의해 용리된다. 재생을 위해서, 흡착제로부터 오토프로테아제를 분리하는 완충제로 충전된 베드를 세정한다. 이들 완충제는 산성 또는 알라킬성 용액 중 어느 하나 또는 유기 용제를 함유한다. 출발 완충제/카오트로픽 완충제로 재평형화한 후, 다음 사이클을 위해 충전 베드를 준비한다.

한편, 정확한 리폴딩시 자가촉매적 불활성으로 잔존하는 융합 단백질을 융합 단백질의 자가단백분해성 부위과 표적 단백질 부분 사이에 적절한 연결자에 의해, 또는 불활성화된 돌연변이, 예를 들면 자가단백분해 활성이 없거나 저감된 오토프로테아제에 의해 제공할 수 있다. 예를 들면, 트리펩티드 연결자(아미노산 1, 2 및 3)를 위치 1 및 바람직하게는 위치 2 및 3 염기성 (R, K, H), 산성(D, E), 주로 소수성(V, L, I, M) 또는 방향족 아미노산(F, Y, W)에 갖는 2개의 부분 사이에 제공하여 자가단백분해 분절을 방지할 수 있다. 불활성 오토프로테아제 유도체의 예로는

Npro, R53E, G54D, R57E, T59M, D92N, A109S, C112E, V114S, V121K, C134E, C138E, L143N, I155S, F158S

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIET㎖R

DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQNYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSD

GKLYHIYVEVDGEILLKNAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168),

Npro, R53E, G54D, R57E, P87L, A109S, C112E, V114S, V121N, T122A, C134E, C138E, L143E, I155S, F158S

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLR

DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGLVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRNAGSD

GKLYHIYVEVDGEILLKEAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168) 및

Npro, R53E, G54D, R57E, A109S, C112E, V114S, V121K, C134E, C138E, L143Q, I155S, F158S

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRNTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168)가 있다.

이러한 실시형태에 있어서, 표적 단백질은 "천연 형태의" 구조를 갖지만, 당연히 원하지 않는 응집의 위험은 없는 고정된 기능적 활성 형태로 제공될 수 있다. 이러한 고정 또는 포획된 표적 단백질은 과학 연구용, 면역학, 본질, 형광 분석 또는 다른 생리학적 또는 약제학적으로 관심있는 분자의 상호작용 분석용으로 사용할 수 있다.

필요한 경우, 분절률은 소망하는 만큼 높지 않기 때문에, 재생 단계시 컬럼에서 세정되는 미분절 융합 폴리펩티드를 본 발명에 따른 크로마토그래피 공정의 다른 범주에 재주입할 수 있다.

목적하는 자유 폴리펩티드는 부분적으로 또는 완전히 리폴드된 상태에서 각 완충제의 선택을 통해 필요에 따라 얻을 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, 용리물 중의 목적하는 폴리펩티드는 부분적으로 또는 바람직하게는 완전히 리폴드된다. 본 발명의 한 실시형태에 있어서, 목적하는 폴리펩티드가 부분적으로 폴드되지 않고 잔존하지만, 융합 폴리펩티드의 자가단백분해 활성 부분의 리폴딩은 완료될 수 있다. 이 현상은, 예를 들면 목적하는 폴리펩티드가 매우 복잡한 조직, 예를 들면 3량체 또는 4량체를 갖거나 프로스테틱기 또는 보조 인자를 포함하는 경우에 일어날 수 있다. 이러한 목적하는 폴리펩티드는 리폴딩을 완료하기 위해서 특정 조건을 필요로 할 수 있다. 따라서, 이러한 경우 폴딩은 특수한 조건, 예를 들면 양성자 강도 및 pH 또는 통상적으로 리폴딩시 첨가되는 세정제를 완벽히 제거할 수 있는 별도의 단계에서 완료될 수 있다.

본 발명의 범위 내에서, 이 조건은 융합 폴리펩티드가 컬럼에 흡착된 상태인 경우 어느 상태로 변화될 수 있다.

본 발명은 본 발명에 따른 용도의 상술한 바와 같은 올리고펩티드 리간드 및 CSFV의 N^pro의 유도체를 개시한다. 본 발명은 본 발명에 따라 상술한 바와 같은 올리고펩티드 및 CSFV의 N^pro의 유도체의 용도에 관한 것이다.

다른 형태에 따르면, 본 발명은 친화성 결합, 특히 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro(N^pro) 또는 N^pro 돌연변이, 및 N^pro 융합 단백질의 결합을 위해 여기서 정의한 바와 같은 친화성 리간드의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 다른 형태는 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro(N^pro) 또는 N^pro 돌연변이, 및 변성조건하에서 봉입체로서 발현되는 N^pro 융합 단백질의 결합을 위한 친화성 리간드 또는 친화성 매트릭스, 바람직하게는 상기 a) 및 b)하에서 일반적으로 정의된 바와 같은 리간드, 특히 이들 상기 열거한 올리고펩티드의 특정형태; 또는 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro(N^pro) 또는 N^pro 돌연변이, 및 변성조건하에서 봉입체로서 발현되는 N^pro 융합 단백질의 결합을 위한 친화성 매트릭스, 바람직하게는 여기서 일반적으로 정의한 바와 같은 매트릭스에 관한 것이다.

본 발명을 하기 실시예를 참조하여 더 설명하고, 이것은 실례만 되는 것이고 한정하는 것은 아니다. 특히, 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태에 관한 것이다.

실시예 1- 친화성 크로마토그래피

1.1.1 크로마토그래피 장치

실시예 1에서 행하는 크로마토그래피는 AKTA 100 Explorer 크로마토그래피 시스템(Amersham Biosciences사)에서 수행한다. 준비한 펩티드 친화성 흡착제를 HR 5 컬럼(5mm i.d., Amersham biosciences사)에 충전한다. 겔 부피는 약 1㎖이다.

1.1.2 올리고펩티드 리간드의 제조

실시예 1에서 사용되는 올리고펩티드 리간드를 하기 방법으로 제조한다:

1-히드록시-1H-벤조트리아졸/N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(HOBt/DCC)-활성 Fmoc-보호 아미노산(Bachem, Bubendorf, Switzerland사)으로 433A 펩티드 합성 기(Biosystems, Vienna, Austria사 제품)에서 고체상 펩티드 합성을 행한다. 펩티드를 4-히드록시메틸-페녹시메틸-코폴리스티렌-1% 디비닐벤젠 수지(HMP 수지, Wang 수지)에서 합성한다. 측쇄를 위한 보호기로서 티로신, 세린 및 트레오닌에 대해서는 tert-부틸(t-부틸), 글루타민산 및 아스파라트산에 대해서는 OtBu, 리신 및 트립토판에 대해서는 tert-부톡시카르보닐(Boc), 시스테인, 히스티딘, 아스파라긴 및 글루타민에 대해서는 트리틸(Trt)이다. 제 1 아미노산의 연결을 위해서, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 촉매로서 사용한다. 제 1 아미노산의 연결 후, 무수 벤조산을 사용하여 캡핑 단계를 수행한다. Fmoc기의 탈보호는 20% 피페리딘으로 행한다. 수지로부터의 측쇄 탈보호 및 분절은 95% 트리플루오로아세트산(TFA), 2.5% 물 및 2.5% 트리이소프로필실란(TIS)을 함유하는 분절 혼합물과의 반응에 의해 수행한다. 디클로로메탄(DCM)으로 세정한 후, 에테르 석출을 반복함으로써 조 펩티드를 정제한 다음, 동결건조한다. 상기 펩티드를 30㎖/min에서 5-50% 아세토니트릴 대 물 (0.1% TFA)의 직선 구배를 사용하여, P 3500 펌프(스웨덴의 Amersham Biosciences, Uppsala사)를 갖는 Luna 15μ C18(2) 250×21.2mm 컬럼(미국의 Phenomenex, Torrence, CA사)에서 RP-HPLC에 의해 더 정제한다. 분당 1% 아세토니트릴의 직선 구배를 갖는 Luna 3μ C18(2) 100×4.6mm 컬럼(Phenomenex사)을 사용하는 HP 1090 액체 크로마토그래피(미국의 Hewlett Packard사)로 PP-HPLC 분석에 의해 순도를 확인한다. 매트릭스 어시스트 레이저 탈착 이온화-비행 시간형 질량분석기(Thermobioanalysis, Hempstead, UK사)로 동질성 및 동일성을 확인한다.

1.1.3 친화성 매트리스의 제조

실시예 1에서 사용하는 친화성 매트릭스를 하기 방법으로 제조한다:

10g의 프락토겔 에폭시 (M)(Merck, Darmstadt, Germany사)를 상온에서 48시간 동안 50㎖ 1M 디아미노디프로필아민(DADPA)과 반응시킨다. 반응 후 겔을 50㎖ 10mM HCl 및 3배의 50㎖ 물로 3회 세정한다. 겔을 물에 재현탁시키고, 0.1M NaOH를 첨가하여 pH를 7.0으로 조정하고, 2g의 무수 숙신산을 첨가한다. 30분 동안 서서히 교반한 후, 10M NaOH를 첨가하여 pH를 7.0으로 조정하고, 무수 숙신산을 2g 더 첨가한다. 상기 겔을 30분 동안 더 교반한 후, 50㎖ 0.1M NaOH, 50㎖ 인산 완충 식염수(PBS), 50㎖ 물로 3회 및 20% 에탄올로 세정한다. 흡입 건조 후 겔을 4℃에서 저장한다.

1.1.4 카르복시기의 활성화 및 펩티드의 고정화:

실시예 1에 따른 친화성 매트릭스를 하기의 방법으로 활성화한다:

1.1.3에서 설명한 바와 같이 1g의 습윤 프락토겔을 DADPA-SA 스페이서로 변성시키고, 5㎖ 아세토니트릴로 2회 세정한다. 아세토니트릴에 용해되어 있는 0.1M 트리에틸아민 및 0.1M의 숙신이미딜-트리클로로에틸카르보네이트로 3시간 동안 활성화를 행한다. 계속해서, 상기 겔을 아세토니트릴 및 1mM HCl로 세정한다. 펩티드 AFYRWYA를 3mg/㎖의 농도로 PBS에 용해시킨다. 상기 겔에 50㎖의 펩티드 용액을 급속히 첨가하고 24시간 동안 반응시킨다. 펩티드 VSFIWYK를 0.1M 트리에틸아민을 함유하는 디메틸포름아미드(DMF)에 용해시킨다. 5㎖의 펩티드 용액을 겔에 급속히 첨가하고, 24시간 동안 반응시킨다. 연결 전후에 샘플의 연결 수율을 RP-HPLC로 측정한다.

CIM-에폭시 상에 펩티드의 고정:

펩티드를 0.15M NaCl을 함유하는 pH 10.0의 100mM Na₂CO₃ 완충제에 용해시킨다. 시판의 카트리지에 CIM-디스크를 장착하고, P1 펌프(Amersham Biosciences사)를 사용하는 디스크를 통해 회전 모드에서 48시간 동안 상온에서 펩티드 용액을 천천히 펌프한다. 연결 전후에 샘플의 연결 수율을 RP-HPLC로 측정한다. 연결 후 잔존하는 에폭시기를 48시간 동안 pH 10.0의 0.5M 에탄올아민으로 블록시킨다.

1.1.5 융합 폴리펩티드의 발현

6xHistag 및 C-말단 융합 GFPmut3.0과 함께 N-말단 오토프로테아제 N^pro를 함유하는 융합 폴리펩티드를 발현하는 재조합체 E. coli HMS 174(DE3)을 10 l-발효기에서 배양한다. 이 융합 폴리펩티드는 하기 아미노산 서열을 포함한다:

1 MHHHHHHELN HFELLYKTSK QKPVGVEEPV YDTAGRPLFG NPSEVHPQST LKLPHDRGRG 60

61 DIRTTLRDLP RKGDCRSGNH LGPVSGIYIK PGPVYYQDYT GPVYHRAPLE FFDEAQFCEV 120

121 TKRIGRVTGS DGKLYHIYVC VDGCILLKLA KRGTPRTLKW IRNFTNCPLW VTSCSGTMRK 180

181 GEELFTGWP ILVELDGDVN GHKFSVSGEG EGDATYGKLT LKFICTTGKL PVPWPTLVTT 240

241 FGYGVQCFAR YPDHMKQHDF FKSAMPEGYV QERTIFFKDD GNYKTRAEVK FEGDTLVNRI 300

301 ELKGIDFKED GNILGHKLEY NYNSHNVYIM ADKQKNGIKV NFKIRHNIED GSVQLADHYQ 360

361 QNTPIGDGPV LLPDNHYLST QSALSKDPNE KRDHMVLLEF VTAAGITHGM DELYK

박테리아 숙주 세포, 예를 들면 발현 균주를 공지된 미생물학적 수단에 따라 그 자체로 배양한다. 균주는 일반적으로 영양 배지에서 단일 콜로니로부터 시작하 여 성장하지만, 저온보존된 세포 현탁 물질(세포 은행)을 사용할 수도 있다. 균주를 일반적으로 다단 공정에서 배양하여 다음에 사용하는데 충분한 바이오매스를 얻는다.

소규모에서는, 이것은 쉐이크 플라스크에서 수행할 수 있고, 대부분의 경우 복합 배지(예를 들면 LB 배양액)를 사용할 수 있다. 그러나, 특정한 배지(예를 들면 구연산염 배지)를 사용할 수도 있다. 배양을 위해서, 소량의 숙주 균주(단일 클로니 또는 cryo-배양균으로부터의 세포 현탁물질과 접목됨)의 예비-배양균을 성장시키고, 이 배양을 위한 온도는 최후의 발현 결과에 대해 일반적으로 중요하지 않아서, 비교적 고온(30℃ 또는 37℃)에서 통상적으로 행할 수 있다. 주배양균은 양호한 폭기를 확보하는데 특히 필요한 대용량(예를 들면 500㎖)으로 설정한다(내용물의 용량에 비하여 대용량의 플라스크, 고속의 회전). 발현을 불용성 봉입체의 형태로 일어나게 하기 위해서, 대부분의 경우 주배양도 상대적으로 고온(30℃ 또는 37℃)에서 행한다. 유발성 개체가 봉입체(예를 들면 trp, lac, tac 또는 phoA 프로모터로)를 생산하는데 특히 적합하다. 최후의 대수상(logarithmic phase)에 도달한 후(통상 쉐이크 플라스크에서 0.5~1.0의 최적 밀도), 이 경우 유도 물질(예를 들면 인돌아크릴산, 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드-IPTG)을 첨가하고 1~5시간 동안 배양을 계속한다. 이 시간 동안, 대부분의 N^pro 융합 폴리펩티드가 박테리아 시토플라즘에 봉이체로서 침전된다. 얻어진 세포를 회수하고 더 처리해도 좋다.

대규모에서는, 다단 시스템은 복수의 바이오리액터(발효기)로 이루어지고, 이러한 경우 공정의 공정 엔지니어링 제어를 향상시키기 위해서, 특정 영양 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 특정 영양소(공급량)를 계량함으로써, 바이오매스 및 생산율을 크게 증가시킬 수 있다. 한편, 공정은 쉐이크 플라스크와 동일하다. 예를 들면, 예비 단계 발효기 및 주요 단계 발효기를 사용하고, 배양 온도는 쉐이크 플라스크와 유사하게 선택한다. 예비 단계 발효기는 쉐이크 플라스크에서 일반적으로 단일 콜로니 또는 크리오배양균(cryoculture)으로부터 성장되는 소위 접종원과 접목된다. 양호한 폭기 및 충분한 유도 물질 농도는 발효기 및 특히 그 주요 단계에서 확보되어야 한다. 그러나, 유도상이 쉐이크 플라스크에 비하여 현저히 길어야 하는 경우도 있다. 얻어진 세포는 후처리를 위해 일단 회수한다.

1.1.6 봉입체의 분리

회수 후, 세포(850g 습식중량)를 pH 8.0의 2500㎖의 50mM Tris/HCl, 5mM EDTA, 1% Triton X-100에 현탁시킨다. 냉각한 현탁물질을 800bar에서 APV-2000 고압 호모지나이저(Invensys사)를 통해 3회 통과시켜서 세포를 분열시킨다. 통로 사이에서 현탁물질을 빙상에서 냉각시키고 Ultraturrax를 사용하여 균질화시킨다. 호모제네이트를 저속(JLA 10.500, 7500rpm, 30분)에서 원심분리하여 재조합 융합 폴리펩티드를 함유하는 봉입체를 얻는다.

1.1.7 봉입체의 가용화

펠릿을 pH 8.0의 50mM Tris/HCl, 5mM EDTA, 1% Triton X-100에 현탁시키고, 원심분리한다. 이 단계를 반복한다. H₂O 세정 단계 후 이 펠릿을 H₂O에 현탁시킨다. 얻어진 봉입체-현탁물질을 -20℃에 저장하여 나중에 사용한다. 봉입체-현탁물질을 상온에서 pH 7.3의 50mM Tris/HCl, 10M 우레아, 50mM DTT으로 1:5로 희석한다. 불용성 성분을 원심분리하여 제거한다. 약 15mg/㎖ 농도의 폴리펩티드를 얻는다. 폴리펩티드 용액을 pH 7.3의 50mM Tris/HCl, 100mM NaCl, 4M 우레아으로 희석하여 약 2mg/㎖ 농도의 폴리펩티드를 얻는다.

1.1.8 융합 폴리펩티드를 크로마토그래피 컬럼에 결합

0.5㎖의 폴리펩티드 용약을 프락토겔-DADPA-SA-VSFIWYK(0.5×5cm) 매트릭스에 가함으로서 준비하고, 1.1.2 및 1.1.3에서 상술한 바와 같이 각 펩티드의 연결을 행한다. 컬럼을 pH 7.3의 50mM Tris/HCl, 100mM NaCl, 4M 우레아로 50cm/h의 선유속으로 평형화한다. 샘플을 주입한 후, 유속을 150cm/h로 증가시킨다.

1.1.9 비결합 오염 물질의 세정

비결합 성분을 평형 완충제 5 컬럼 용량을 사용하여 세정한다. 리폴딩 완충제, 구체적으로 pH 7.3의 0.5M Tris/HCl, 2mM EDTA, 3% 글리세롤, 5mM DTT으로의 완충제 교환을 4.5 컬럼 용량을 사용하여 행한다.

1.1.10 리폴딩, 분절 및 용리

그 조건을 카오트로픽에서 코스모트로픽으로 변경한 후, 유동을 정지하여 융합 폴리펩티드를 크로마토그래피 수지 상에 2시간 동안 리폴드한다. 활성 오토프로테아제는 C-말단 융합 GFPmut3.1을 분절한다. 형광 측정법 및 SDS-PAGE로 확인한 바와 같이, 이어지는 50cm/h의 유속에서의 리폴딩 완충제으로의 용리는 천연 GFPmut3.1을 정제한다.

1.1.11 재생

크로마토그래피 수지의 재생을 50cm/h의 유속에서 0.1M NaOH을 사용하여 행한다.

실시예 2- 친화성 매트릭스의 제조

2.1 티올기를 갖는 매트릭스 상으로의 무수 요오드아세트산으로 유도된 C-말단 리신을 통한 연결을 사용한 펩티드 친화성 매트릭스의 제조

300mg의 N-아세틸화 펩티드 Ac-AFYRWYAK를 65㎕ 디이소프로필에틸아민을 함유하는 3㎖ 디메틸포름아미드(DMF)에 용해하였다. 그 다음 이 용액을 빙상에서 냉각했다. 그 후 130mg의 무수 요오드아세트산을 1.5㎖ DMF에 용해하고 펩티드 용액에 첨가하였다. 1분 후 1㎖ 포름산을 첨가하여 반응을 정지하였다. 그 다음 용액을 물로 희석하여 최종 30% 농도 DMF로 하였다. 그 다음 용액을 상술한 바와 같이 준비된 RP-HPLC로 정제하였다. 분획을 냉각건조하고, 질량분광법으로 분석하였다.

상술한 바와 같이 10g의 프락토겔-DADPA를 제조하였다. 계속해서 겔을 PBS 완충제로 3회 세정했다. 그 다음, 겔을 PBS 완충제에 용해된 10mg/㎖ 임미노티오란(IT)과 2시간 동안 반응시켰다. 250mg의 펩티드-요오드아세트산 유도체를 30% DMF를 함유하는 pH 6.0의 15㎖ 20mM MES 완충제에 용해시켰다. 그 다음, 이 용액을 겔과 3시간 동안 반응시켰다. RP-HPLC로 연결 전후 샘플을 분석하여 연결 수율을 측정했다. 겔에 잔존하는 티올기를 1mg/㎖ 요오드아세트아미드 용액으로 2시간 동안 블록시켰다. 이렇게 제조한 매트릭스를 프락토겔-DADPA-IT-AFYRWYAK라고 한다.

2.2 폴리(리신, 트립토판) 리간드를 갖는 친화성 매트릭스의 제조

10g 프락토겔 에폭시를 연결 완충제, 150mM 염화나트륨 및 10mM 트리에틸아민을 함유하는 pH 11.0의 20mM 탄산나트륨 완충제로 3회 세정하였다. 100mg의 폴리(리신, 트립토판), 4:1(폴리KW, Sigma)을 10㎖의 연결 완충제에 용해하고 겔과 48시간 반응시켰다. 연결 전후 폴리(리신, 트립토판) 용액의 280nm에서의 흡수를 측정하여 연결 효율을 측정했다. 그 다음, 겔을 0.5M 에탄올아민과 반응시켜 잔존하는 에폭시기를 블록시켰다. 이렇게 제조한 매트릭스를 프락토겔-polyKW로 한다.

또한, 상술한 과정을 Actigel B Ultraflow 4 에폭시로 행하였다. 이렇게 제조한 매트릭스를 Actigel-폴리KW로 한다.

또한, 상술한 과정을 에폭시 세파로스 6B로 행하였다. 이렇게 제조한 매트릭스를 세파로스-폴리KW로 한다.

실시예 3: 친화성 크로마토그래피

3.1 N^pro EDDIE-6His 봉입체 추출물 N^pro EDDIE-6His의 정제:

1 MELNHFELLY KTSKQKPVGV EEPVYDTAGR PLFGNPSEVH PQSTLKLPHD RGEDDIETTL 60

61 RDLPRKGDCR SGNHLGPVSG IYIKPGPVYY QDYTGPVYHR APLEFFDETQ FEETTKRIGR 120

121 VTGSDGKLY HIYVEVDGEI LLKQAKRGTP RTLKWTRNTT NCPLWVTSCS VDKLAAALEH 180

181 HHHHH 185

pH 7.3의 50mM Tris, 100mM Nacl, 4M 우레아, 10mM α-모노티오글리세롤(MTG) 내의 조 N^proEDDIE-6His 봉입체 추출물을 pH 7.3의 50mM Tris, 100mM NaCl, 4M 우레아로 미리 평형화한 프락토겔-DADPA-IT-AFYRWYAK(0.5×5cm)에 각각 25 및 150cm/h의 선유속으로 로드하였다. 단백질 농도 약 2mg/㎖에서 샘플량을 5㎖의 양으로 가하였다. 미결합 성분을 5 컬럼 용량(CV)의 평형 완충제으로 150cm/h의 선유속으로 세정한 후, 10CV의 pH 7.3의 50mM Tris, 1M NaCl, 8M 우레아로 용리를 동일한 흐름 조건하에서 행하였다. 컬럼의 재생을 10CV의 0.2M NaOH로 행하였다. 숙주 세포 화합물의 소모를 SDS-PAGE으로 확인하였다.

3.2 NproEDDIE-6His 봉입체 추출물의 정제

pH 7.3의 50mM Tris, 100mM NaCl, 4M 우레아, 10mM MTG 내의 조 N^proEDDIE-6His 봉입체 추출물을 pH 7.3의 50mM Tris, 100mM NaCl, 4M 우레아로 미리 평형화한 프락토겔-폴리-KW(0.5×5cm)에 각각 25 및 150cm/h의 선유속으로 로드하였다. 단백질 농도 약 2mg/㎖의 샘플을 5㎖의 양으로 적용했다. 미결합 성분을 5컬럼 용적(CV)의 평형 완충제로 150cm/h의 선유속으로 세정한 후, 10CV의 pH 7.3의 50mM Tris, 1M NaCl, 8M 우레아로 용리를 동일한 흐름 조건하에서 행하였다. 컬럼의 재생을 10CV의 0.2M NaOH로 행하였다. 숙주 세포 화합물의 소모를 SDS-PAGE으로 확인하였다.

3.3 N^proEDDIE-6His 봉입체 추출물의 정제

상술한 바와 같이, GFPmut3.0 생산 E. coli HMS 174(DE3) 세포 호모제네이트로 스파이크된 조 N^proEDDIE-6His 봉입체 추출물의 친화성 크로마토그래피를 상술한 바와 같이 프락토겔-DADPA-IT-AFYRWYAK 상에서 행하였다. 흐름을 통해 용리된 샘플을 회수하고, SDS-PAGE으로 표적 단백질 및 오염 성분을 분석했다.

실시예 4- 검출 시스템

이 검출 시스템은 멤브레인에 공유적으로 고정화 또는 합성된 N^pro-EDDIE에 결합되는 펩티드 리간드를 사용하는, N^pro EDDIE 융합 단백질용 유전 검출 시스템을 나타낸다. 융합 단백질이 펩티드를 포함하는 멤브레인에 결합되어, 융합 파트너를 그 고유 특성, 예를 들면 GFP의 자가형광, 융합 파트너에 대항하는 항체, 융합 파트너의 결합 특성에 의해 검출할 수 있다. 이 멤브레인(본 발명에 따른 친화성 매트릭스의 바람직한 예)은 구체적으로 수용액에 불용성 또는 난용성이어서 검출하기 어려운 결합 단백질에 적합하다. 바람직하게는, 우레아가 본 발명에 따른 이러한 단백질을 가용화하는데 사용된다.

본 발명에 따른 오토프로테아제를 사용하는 경우, 그 활성은, 예를 들면 연결자, 불활성 돌연변이 또는 불활성 완충제 또는 완충제 성분(필요한 시점에 첨가할 수 있음)에 의해 억제될 수 있다.

고정된 펩티드 AFR^*WYA(^*는 20개 단백질 생성가능한 아미노산 각각을 나타냄)를 갖는 멤브레인을 조 6xHis-M^proEDDIE-GFPmut31 봉입체 추출물로 pH 7.3의 50mM Tris, 300mM NaCl, 4M 우레아, 12.5mM 디티오트레이톨(DTT)에서 1mg/㎖의 농도에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 완충제로 5분 세정한 후, 조건을 pH 7.3의 1M Tris, 0.25M 수크로오스, 2mM EDTA, 10mM DTT으로 변경하여 융합 GFPmut3.1의 리폴딩을 행하였다. 펩티드 스폿 상의 GFP 형광물질을 488nm의 여기파장 및 520nm 발광 에서 315, 350 및 400V의 다른 광전자 배증관 전압에서 Typhoon 스캐너(Amersham Biosciences사)로 검출했다.

실시예 5- 바이오티닐레이트된(biothnylated) Anti-N^pro-펩티드를 사용하는 검출 시스템

이 검출 시스템은 멤브레인-결합 Npro-EDDIE 융합 단백질에 대한 바이오티닐레이트된 펩티드의 결합을 사용하는 N^pro-EDDIE 융합 단백질을 위한 유전적 검출 시스템을 나타낸다. 스트렙타비딘-호르세라디쉬(streptavidin-horseradish) 퍼옥시다아제-접합으로 검출을 행한다.

E. coli 내에 Npro-EDDIE 및 C-말단 융합 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 과잉 발현을 Npro-EDDIE에 대항하여 라벨된 펩티드로 검출한다: 세포 호모지네이트는 E. coli 발효 배양액을 10M 우레아를 함유하는 용액으로 처리하여 제조한다. 호모지네이트는 니트로셀룰로오스 멤브레인에 스폿된다. 그 후 멤브레인을 건조하고 인산 완충제 내에서 3% 리소자임으로 1시간 동안 블록한다. 그 다음 멤브레인을 10㎍/㎖의 AFYRWYAK-Biotin-접합을 함유하는 용액으로 1시간 동안 배양한다. 1M 염화나트륨을 함유하는 PBS에 용해된 스트렙타비딘-HPO을 15분 동안 첨가한 다음 배양 완충제으로 3번 세정하고 이어서 Super Signal ™ West Pico 화학발광 검출 시스템(Perce, Rockford, IL, USA사) 및 LumiImager™(Boehringer, Mannheim, Germany사)로 검출한다.

실시예 6- N^pro 돌연변이 융합 단백질의 제조

각 10㎖의

-상술한 바와 같이 IBs로부터 추출된 융합 단백질 6HisN^pro-SGT-GFPmut.3.1,

-상술한 바와 같이 IBs로부터 추출된 6HisN^pro 용액 및

-상술한 바와 같이 IBs로부터 추출된 6HisN^pro-EDDIE 용액을

pH 7.3의 5mM Tris, 100mM NaCl, 4M 우레아 완충제로 각각 미리 평형화한

-프락토겔-DADPA-SA-VSIFEW 컬럼,

-프락토겔-DADPA-SA-AVSIEY 컬럼,

-프락토겔-DADPA-SA-AVSFIWY 컬럼,

-프락토겔-DADPA-SA-VSFIWYK 컬럼에 로드했다. 로드한 후, 컬럼을 평형 완충제의 15 컬럼 용량으로 세정했다. 500mM NaCl이 첨가된 평형 완충제으로 용리를 행하였다. 크로마토그래피시 회수된 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다. BSA 및 리소자임을 제어 단백질로 사용한다.

봉입체의 제조:

6His-tag 및 GFPmut3.1을 갖는 N-말단 오토프로테아제 N^pro를 함유하는 융합 단백질을 발현하는 재조합 E. coli HMS 174 (DE3)을 10 l - 발효기에서 배양하였다. 회수 후, 세포(850g 습식중량)를 2500㎖의 pH 8.0의 50mM Tris, 5mM EDTA, 1% Triton X-100에 현탁시킨다. 냉각한 현탁물질을 800bar에서 APV-2000 고압 호모지나이저(Invensys사)를 통해 3회 통과시켜서 세포를 분열시킨다. 통로 사이에서 현 탁물질이 얼음 상에서 냉각되고 Ultraturrax를 사용하여 균질화된다. 호모지네이트를 저속(JLA 10.500, 7500rpm, 30mm)으로 원심분리하여 재조합 융합 단백질을 함유하는 봉입체를 얻었다. 펠릿을 pH 8.0의 50mM Tris, 5mM EDTA, 1% Triton X-100에 현탁시키고 원심분리했다. 이 단계를 반복한다. H₂O 세정 단계 후 이 펠릿을 H₂O에 현탁시킨다. 건조 질량이 8.9%인 봉입체-현탁물질 580㎖를 얻었고, -20℃에 저장하여 나중에 사용한다. 봉입체-현탁물질을 pH 7.3의 50mM Tris, 10M 우레아, 50mM DTT으로 1:5로 희석했다. 불용성 물질을 원심분리하여 제거했다. 약 15mg/㎖ 농도의 폴리펩티드를 얻었다. 폴리펩티드 용액을 pH 7.3의 50mM Tris, 100mM NaCl, 4M 우레아로 희석하여 약 2mg/㎖ 농도의 폴리펩티드를 얻었다.

<110> Sandoz AG Boehringer Ingelheim Austria GmbH <120> AFFINITY LIGANDS <130> r47676 <140> PCT/AT2006/000167 <141> 2006-04-25 <150> GB0508435.5 <151> 2005-04-26 <150> GB0508434.8 <151> 2005-04-26 <150> GB0605379.7 <151> 2006-03-16 <160> 114 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 168 <212> PRT <213> pestivirus <400> 1 Met Glu Leu Asn His Phe Glu Leu Leu Tyr Lys Thr Ser Lys Gln Lys 1 5 10 15 Pro Val Gly Val Glu Glu Pro Val Tyr Asp Thr Ala Gly Arg Pro Leu 20 25 30 Phe Gly Asn Pro Ser Glu Val His Pro Gln Ser Thr Leu Lys Leu Pro 35 40 45 His Asp Arg Gly Arg Gly Asp Ile Arg Thr Thr Leu Arg Asp Leu Pro 50 55 60 Arg Lys Gly Asp Cys Arg Ser Gly Asn His Leu Gly Pro Val Ser Gly 65 70 75 80 Ile Tyr Ile Lys Pro Gly Pro Val Tyr Tyr Gln Asp Tyr Thr Gly Pro 85 90 95 Val Tyr His Arg Ala Pro Leu Glu Phe Phe Asp Glu Ala Gln Phe Cys 100 105 110 Glu Val Thr Lys Arg Ile Gly Arg Val Thr Gly Ser Asp Gly Lys Leu 115 120 125 Tyr His Ile Tyr Val Cys Val Asp Gly Cys Ile Leu Leu Lys Leu Ala 130 135 140 Lys Arg 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ligand <400> 57 Val Ser Ile Phe Trp Glu 1 5 <210> 58 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 58 Phe Ser Ile Phe Glu Trp 1 5 <210> 59 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 59 Trp Ser Ile Phe Glu Trp 1 5 <210> 60 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 60 Val Ser Leu Ile Trp Tyr 1 5 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 61 Val Ser Leu Ile Asp Trp 1 5 <210> 62 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 62 Val Ser Leu Ile Glu Trp 1 5 <210> 63 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 63 Val Ser Leu Ile Trp Glu 1 5 <210> 64 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 64 Phe Ser Leu Ile Glu Trp 1 5 <210> 65 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 65 Trp Ser Leu Ile Glu Trp 1 5 <210> 66 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 66 Phe Ser Tyr Phe Glu Trp 1 5 <210> 67 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 67 Phe Ser Phe Tyr Glu Trp 1 5 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 68 Trp Ser Phe Tyr Glu Trp 1 5 <210> 69 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 69 Phe Ser Tyr Ile Glu Trp 1 5 <210> 70 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 70 Trp Ser Tyr Ile Glu Trp 1 5 <210> 71 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 71 Ala Phe Tyr Thr Trp Tyr Ala 1 5 <210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 72 Ala Phe Tyr Arg Trp Tyr Lys 1 5 <210> 73 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 73 Ala Phe Tyr Arg Trp Tyr 1 5 <210> 74 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 74 Ala Phe Tyr Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 75 Ala Phe Phe Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 76 Ala Phe Gly Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 77 Ala Phe His Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 78 Ala Phe Ile Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 79 Ala Phe Leu Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 80 Ala Phe Met Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 81 Ala Phe Asn Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 82 Ala Phe Pro Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 83 Ala Phe Gln Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 84 Ala Phe Arg Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 85 Ala Phe Ser Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 86 Ala Phe Thr Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 87 Ala Phe Val Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 88 Ala Phe Tyr Arg Trp Tyr Ala 1 5 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 89 Ala Phe Tyr Phe Trp Tyr Ala 1 5 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 90 Ala Phe Tyr Gly Trp Tyr Ala 1 5 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 91 Ala Phe Tyr Leu Trp Tyr Ala 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 92 Ala Phe Tyr Met Trp Tyr Ala 1 5 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 93 Ala Phe Tyr Asn Trp Tyr Ala 1 5 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 94 Ala Phe Tyr Pro Trp Tyr Ala 1 5 <210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 95 Ala Phe Tyr Thr Trp Tyr Ala 1 5 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 96 Ala Phe Tyr Val Trp Tyr Ala 1 5 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 97 Ala Phe Tyr Trp Trp Tyr Ala 1 5 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 98 Ala Phe Tyr Tyr Trp Tyr Ala 1 5 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 99 Ala Lys Trp Phe Arg Tyr Ala 1 5 <210> 100 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 100 Val Ser Arg Asn Trp Tyr 1 5 <210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 101 Ala Ser Arg Asn Trp Tyr Ala 1 5 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 102 Ala Ser Arg Phe Trp Tyr Ala 1 5 <210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 103 Phe Ser Arg Asn Trp Tyr Ala 1 5 <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 104 Val Phe Arg Asn Trp Tyr Ala 1 5 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 105 Val Trp Arg Asn Trp Tyr Ala 1 5 <210> 106 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 106 Val Tyr Arg Asn Trp Tyr Ala 1 5 <210> 107 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 107 Val Ser Arg Ala Trp Tyr Ala 1 5 <210> 108 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 108 Val Ser Arg Phe Trp Tyr Ala 1 5 <210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 109 Val Ser Arg Trp Trp Tyr Ala 1 5 <210> 110 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 110 Val Ser Arg Tyr Trp Tyr Ala 1 5 <210> 111 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 111 Val Ser Arg Asn Phe Tyr Ala 1 5 <210> 112 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 112 Val Ser Arg Asn Tyr Tyr Ala 1 5 <210> 113 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 113 Val Ser Arg Asn Trp Phe Ala 1 5 <210> 114 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> affinity ligand <400> 114 Val Ser Arg Asn Trp Trp Ala 1 5

Claims

고체상 및 상기 고체상에 연결된 펩티드 결합을 갖는 친화성 리간드를 포함하는 친화성 매트릭스로서:

상기 펩티드 결합을 갖는 친화성 리간드는 하기 리간드의 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 친화성 매트릭스.

a) 일반식 X₁X₂X₃X₄을 포함하는 펩티드로서, X₁~X₄가 아미노산 잔기이고, 또한 X₁~X₄ 중 2개 이상이 W, Y 또는 F인 펩티드;

b) 일반식 X₅X₆X₇X₈을 포함하는 펩티드로서, X₅~X₈가 아미노산 잔기이고, X₅~X₈ 중 1개 이상이 W이고, 또한 X₅~X₈ 중 1개 이상이 E 또는 D인 펩티드;

c) R, K, E 및 D로 이루어진 군의 아미노산 모노머 및 Y, F 및 W로 이루어진 군의 아미노산 모노머로 이루어진 폴리-아미노산, 바람직하게는 폴리-KY, 폴리-KF, 폴리-KW, 폴리-RY, 폴리-RF, 폴리-RW, 폴리-EY, 폴리-DY, 폴리-EF, 폴리-EW, 폴리-DF 및 폴리-DW, 단, a) 및 b)에 기재된 펩티드는 35개 아미노산 잔기의 최대 길이를 갖고 c)에 기재된 폴리-아미노산은 20개 아미노산 잔기의 최소 길이를 갖는다.
제 1 항에 있어서, 상기 a) 및 b)에 따른 펩티드는 5~12개, 특히 6~8개 아미노산 잔기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 친화성 매트릭스.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 친화성 리간드는 화학적으로 변성, 특히 아세틸화, 에스테르화, 아미드화, 산화, 환원되거나, 또는 연결자 분자가 제공되는 것을 특징으로 하는 친화성 매트릭스.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체상은 크로마토그래피 재료, 특히 셀룰로오스, 아가로스, 아크릴아미드, 폴리(스티렌-디비닐벤젠)를 기초로 한 지지체 또는 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 코폴리머, 마이크로티터 플레이트, 니트로셀룰로오스 멤브레인, 마이크로칩, 유리판 또는 금속 도포 지지체로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 친화성 매트릭스.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화성 리간드는 VSDDWY, VSEDWY, VSIDWY, VSYDWY, VSVDWY, VSWDWY, VSYDWY, VSFDWY, VSDEWY, VSEEWY, VSIEWY, VSYEWY, VSVEWY, VSWEWY, VSYEWY, VSFEWY, DDDDWY, DDEDWY, DDIDWY, DDYDWY, DDVDWY, DDWDWY, DDYDWY, DDFDWY, VSIFWE, FSIFEW, WSIFEY, VSLIWY, VSLIDW, VSLIEW, VSLIWE, FSLEEW, VSDLDW, VSDLEW, VSYIDW, VSYIWE, VSIDWY, VSIEWY, VSIWWY, VSIIWY, VSYIWY, VSVIWY, VSFIWY, VSFIWE, VSIFEW, VSIFWE, FSIFEW, WSIFEW, VSLIWY, VSLIDW, VSLIEW, VSLIWE, FSLIEW, WSLIEW, FSYFEW, FSFYEW, WSFYEW, FSYIEW, WSYIEW, AFYTWYA, AFYRWYK, AFYRWY, AFYRWYA, AFFRWYA, AFGRWYA, AFHRWYA, AFIRWYA, AFLRWYA, AFMRWYA, AFNRWYA, AFPRWYA, AFQRWYA, AFRRWYA, AFSRWYA, AFTRWYA, AFVRWYA, AFYRWYA, AFYFWYA, AFYGWYA, AFYLWYA, AFYMWYA, AFYNWYA, AFYPWYA, AFYTWYA, AFYVWYA, AFYWWYA, AFYYWYA, AKWFRYA, VSRNWY, ASRNWYA, ASRFWYA, FSRNWYA, VFRNWYA, VWRNWYA, VYRNWYA, VSRAWYA, VSRFWYA, VSRWWYA, VSRYWYA, VSRNFYA, VSRNYYA, VSRNWFA, VSRNWWA, Ac-AFYTWYAK, Ac-AFYRWYKK, Ac-AFYRWYK, Ac-AFYRWYAK, Ac-AFFRWYAK, Ac-AFGRWYAK, Ac-AFHRWYAK, Ac-AFIRWYAK, Ac-AFLRWYAK, Ac-AFMRWYAK, Ac-AFNRWYAK, Ac-AFPRWYAK, Ac-AFQRWYAK, Ac-AFRRWYAK, Ac-AFSRWYAK, Ac-AFTRWYAK, Ac-AFVRWYAK, Ac-AFYRWYAK, Ac-AFYFWYAK, Ac-AFYGWYAK, Ac-AFYLWYAK, Ac-AFYMWYAK, Ac-AFYNWYAK, Ac-AFYPWYAK, Ac-AFYTWYAK, Ac-AFYVWYAK, Ac-AFYWWYAK, Ac-AFYYWYAK, Ac-AKWFRYAK, Ac-VSRNWYK, Ac-ASRNWYAK, Ac-ASRFWYAK, Ac-FSRNWYAK, Ac-VFRNWYAK, Ac-VWRNWYAK, Ac-VYRNWYAK, Ac-VSRAWYAK, Ac-VSRFWYAK, Ac-VSRWWYAK, Ac-VSRYWYAK, Ac-VSRNFYAK, Ac-VSRNYYAK, Ac-VSRNWFAK, Ac-VSRNWWAK, YWKA, Ac-YWKAK, YKYA, Ac-YKYAK, YWRA, Ac-YWRAK, ARWY, Ac-ARWYK, YWRA, 및 Ac-YWRAK으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 친화성 매트릭스.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화성 리간드는 고체상에 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는 친화성 매트릭스.
액체 출발 재료로부터의 단백질의 친화성 결합방법으로서: 상기 단백질은 카오트로픽 조건하에서 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 친화성 매트릭스와 접촉시켜서, 상기 단백질을 상기 매트릭스에 결합시키고, 상기 액체 출발 재 료로부터 분리하는 것을 특징으로 하는 친화성 결합방법.
제 7 항에 있어서, 상기 매트릭스에 결합된 단백질은 상기 매트릭스에 결합되어 있는 동안 더 처리되는 것을 특징으로 하는 친화성 결합방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 매트릭스에 결합된 단백질 또는 상기 처리된 단백질은 바람직하게는 액체 출발 재료로서 낮은 카오트로피시티를 갖는 용리 완충제를 가함으로써 매트릭스로부터 용리되는 것을 특징으로 하는 친화성 결합방법.
제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 자가단백분해성 부위 및 상기 자가단백분해성 부위에 의해 비카오트로픽 조건하에서 자가단백분해적으로 분절가능한 목적한 단백질로 이루어진 부위를 포함하는 이종의 재조합 폴리펩티드로서, 특히 상기 자가단백분해성 부위가 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro(N^pro) 또는 N^pro-돌연변이인 융합 단백질, 및 변성조건하에서 봉입체로서 발현되는 N^pro융합 단백질인 것을 특징으로 하는 친화성 결합방법.
제 10 항에 있어서, 상기 자가단백분해성 부위는

SEQ ID NO 1:

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSD GKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168),

SEQ ID NO 2:

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168),

SEQ ID NO 3 :

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFEEVTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168),

SEQ ID NO 4:

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKLAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168),

SEQ ID NO 5:

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNTTNCPLWVTSC-(168),

SEQ ID NO 6:

(I)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGTPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPRTLKWTRNSTNCPLWVTSC-(168),

SEQ ID NO 7:

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTEGRPLFGTPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLR DLPRKGDCRFGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDETQFEETTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKQAKRGTPHTLKWTRNSTNCPLWVTSC-(168),

SEQ ID 8:

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGEDDIETTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDESQFEESTKRIGRVTGSD GKLYHIYVEVDGEILLKSAKRGTPRTLKWSRNSTNCPLWVTSC-(168) 및

SEQ ID 9:

(1)MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGTPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLR DLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSD GKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNSTNCPLWVTSC-(168)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 친화성 결합방법.
제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 생리학적 조건하에서 높은 응집 경향을 갖는 단백질 또는 단백질 부위이거나 또는 이것을 포함하고, 상기 단백질은 Aβ 펩티드, Tau 프리온 단백질, α-시누클레인, Tau, Adan 펩티드, ABri 펩티드, 시스타틴 C, Aβ 펩티드, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 아트로핀 1, 헌팅틴, 아탁신, 안드로겐 수용체, TATA 박스 결합 단백질, Ig 경쇄, 세륨 아밀로이드 A, 트란스타이레틴, β2-마이크로글로불린, 아폴리포 단백질 A-1, 젤솔린, Pro-islet, 아밀로이드 폴리펩티드, 프로칼시토닌, 심방성 배설 인자, 리소자임, 인슐린, 피브리노겐, 전장 단백질 또는 특정 단편, 돌연변이, 변형체 또는 그 폴리Q-확장체로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 친화성 결합방법.
제 7 항에 기재된 결합을 행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이종 폴리펩티드의 제조공정.
제 13 항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이종 폴리펩티드의 제조공정.
목적하는 이종 폴리펩티드의 친화성 결합방법으로서: 상기 폴리펩티드는 페스티바이러스 오토프로테아제 N^pro 또는 그 유도체의 융합 폴리펩티드로서 발현되고, 상기 융합 폴리펩티드는 카오트로픽 조건하에서 페스티바이러스 오토프로테아제 N^pro 또는 그 유도체에 이러한 조건하에서 특정 결합하는 펩티드와 접촉하고, 또한 상기 펩티드는 고체상에 결합하는 것을 특징으로 하는 이종 폴리펩티드의 친화성 결합방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 친화성 리간드의 용도로서: 친화성 정제, 특히 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro(N^pro) 또는 N^pro-돌연변이, 및 N^pro 융합 단백질의 결합에 사용되는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드의 용도.
제 1 항 a) 및 b), 제 2 항 및 제 5 항에 기재된 친화성 리간드로서: 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro(N^pro) 또는 N^pro-돌연변이, 및 N^pro 융합 단백질의 결합을 위한 것임을 특징으로 하는 친화성 리간드.
제 1 항 내지 제 6 항에 기재된 친화성 매트릭스로서: 페스티바이러스의 오토프로테아제 N^pro(N^pro) 또는 N^pro-돌연변이, 및 N^pro 융합 단백질의 결합을 위한 것임을 특징으로 하는 친화성 매트릭스.