CN107001432B - 突变的免疫球蛋白结合多肽 - Google Patents

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Abstract

一种碱稳定性改进的Fc结合多肽，其包含由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO 26或SEQ ID NO 27限定的葡萄球菌A蛋白(SpA)的Fc结合结构域的突变体，其中至少对应于SEQ ID NO:4‑7中42位的位置处的丙氨酸残基突变成精氨酸和/或其中至少对应于SEQ ID NO:4‑7中37位的位置处的天冬氨酸残基突变成谷氨酸。

Description

突变的免疫球蛋白结合多肽
发明的技术领域
本发明涉及亲和层析领域，更具体地说涉及可用于免疫球蛋白的亲和层析法的A蛋白的突变的免疫球蛋白结合结构域。本发明还涉及突变的结构域的多聚体和含有突变的结构域或多聚体的基质的分离。
发明前景
免疫球蛋白代表了全球制造或开发中最流行的生物制药制品。对这一特殊治疗市场的高商业需求和由此产生的价值导致重点投向制药公司以在控制相关成本的同时使其相应的mAb生产过程的生产力最大化。
在大多数情况下采用亲和层析法，作为在这些免疫球蛋白分子(例如单克隆或多克隆抗体)纯化中的关键步骤之一。特别引人关注的亲和试剂类别是能够与免疫球蛋白分子的不可变部分特异性结合的蛋白质，这种相互作用独立于抗体的抗原结合特异性。这类试剂广泛用于亲和层析法，从不同样品(例如但不限于血清或血浆制备物或细胞培养来源的原料)中回收免疫球蛋白。这类蛋白质的一个实例是葡萄球菌A蛋白，其含有能够与来自不同物种的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分结合的结构域。
基于葡萄球菌A蛋白(SpA)的试剂由于其高亲和力和选择性而广泛应用于生物技术，例如应用于亲和层析法以用于俘获和纯化抗体以及用于检测或定量。目前，基于SpA的亲和培养基可能是最广泛使用的亲和培养基用于从不同的样品(包括工业细胞培养上清液)中分离单克隆抗体及其片段。因此，包含A蛋白-配体的不同基质可以是市购获得的，例如为天然A蛋白的形式(例如Protein A SEPHAROSE™, GE Healthcare, Uppsala,Sweden)，也包括重组A蛋白(例如rProtein A SEPHAROSE™, GE Healthcare)。更准确地说，在商用重组A蛋白产品中进行的遗传操作的目的在于促进其与支持体的连接并提高配体的生产率。
像其它亲和层析应用一样，这些应用需要全面注意污染物的明确清除。这类污染物可以是例如层析程序中与固定相或基质吸附的未洗脱分子，例如不需要的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、糖、脂质、细菌和病毒。为了在后续使用之前使基质再生，通常在第一次洗脱所需产物后进行从基质中清除这类污染物。这类清除通常包括称为就地清洗(cleaning-in-place, CIP)的程序，其中使用能够将污染物从固定相中洗脱的剂。常用的一种这类作用剂是流经所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的清洁消毒剂是NaOH，其浓度范围可为0.1直到例如1 M，这取决于污染的程度和性质。该策略与将基质暴露于pH值高于13的溶液中有关。对于含有蛋白质性亲和配体的许多亲和层析基质，这类碱性环境是极严苛的条件，因此导致因配体对所涉及的高pH不稳定性所致的能力降低。
因此大量研究集中在开发显示承受碱性pH值的能力提高的工程改造的蛋白质配体。例如，Gülich等(Susanne Gülich, Martin Linhult, Per-Åke Nygren, Mathias Uhlén, Sophia Hober, Journal of Biotechnology 80 (2000), 169-178)提出进行工程改造以提高链球菌白蛋白结合结构域(ABD)在碱性环境中的稳定性质的蛋白质。Gülich等人建立了ABD的一个突变体，其中所有4个天冬酰胺残基被亮氨酸(1个残基)、天冬氨酸(2个残基)和赖氨酸(1个残基)置换。此外，Gülich等人报告了其突变体显示与天然蛋白质类似的靶蛋白质结合行为，且与使用亲代未工程改造的配体制备的柱相比，含有工程改造的配体的亲和柱显示在重复暴露于碱性条件后较高的结合能力。因此，在该文中得出结论，所有4个天冬酰胺残基都可被置换而对结构和功能没有任何显著作用。
最新研究表明，还可对A蛋白(SpA)进行改变以实现类似的性质。美国专利申请公开US 2005/0143566 (其通过引用以其整体结合到本文中)，公开了当至少一个天冬酰胺残基突变成谷氨酰胺或天冬氨酸以外的氨基酸时，与亲代SpA，例如SpA的B结构域或Z蛋白(一种来源于SpA的B结构域的合成构建体)相比，突变使在高达约13-14的pH值下化学稳定性提高(US 5,143,844，通过引用以其整体结合)。作者表明当这些突变的蛋白质用作亲和配体时，分离介质如预期可更好地承受使用碱性剂的清洗程序。WO 2008/039141、JP2006304633A、EP 1992692A1、EP2202310A2、WO 2010/110288、WO 2012/086660、WO 2012/083425、WO2012/087230和WO2014/146350中还公布了其目的在于提高碱稳定性的A蛋白结构域的其它突变，其所有均通过引用以其整体结合到本文中。然而，目前可获得的突变仍对碱性pH敏感，清洗期间的NaOH浓度通常限于0.1 M，这意味着难以实现彻底清洗。会改进清洗的较高NaOH浓度，导致不可接受的能力丧失。
因此在该领域仍需要获得含有针对碱性清洗程序稳定性进一步提高的蛋白质配体的分离基质。
发明概述
本发明的一个方面提供碱稳定性提高的多肽。这用权利要求1限定的多肽实现。
一个优势是碱稳定性相对于亲代多肽提高，同时保持对免疫球蛋白和其它含Fc的蛋白质的高选择性结合。
本发明的第二个方面提供碱稳定性提高、包含多个多肽的多聚体。这用权利要求限定的多聚体实现。
本发明的第三个方面提供编码碱稳定性提高的多肽或多聚体的核酸或载体。这用权利要求限定的核酸或载体实现。
本发明的第四个方面提供能够表达碱稳定性提高的多肽或多聚体的表达系统。这用权利要求限定的表达系统实现。
本发明的第五个方面提供能够选择性结合免疫球蛋白和其它含Fc的蛋白质并显示碱稳定性提高的分离基质。这用权利要求限定的分离基质实现。
本发明的第六个方面提供分离免疫球蛋白或其它含Fc的蛋白质的经济有效的方法。这用权利要求限定的方法实现。
随附权利要求书中描述了本发明的其它合适的实施方案。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文可互换使用，要理解为还包括抗体的片段、包含抗体或抗体片段的融合蛋白和包含抗体或抗体片段的缀合物。
术语“Fc结合多肽”和“Fc结合蛋白”分别是指能够与抗体的可结晶部分(Fc)结合的多肽或蛋白质，包括例如A蛋白和G蛋白或其保持所述结合性质的任何片段或融合蛋白。
术语“接头”在本文是指在多聚体中使两个多肽单元单体或结构域彼此连接的元件。
术语“间隔基(spacer)”在本文是指将多肽或多肽多聚体与支持体连接的元件。
附图简述
图1显示由SEQ ID NO:1-7和26-27限定的Fc结合结构域的比对。
实施方案的详细描述
一方面，本发明公开了Fc结合多肽，其包含由图1所示的SEQ ID NO: 1 (E-结构域)、SEQ ID NO: 2 (D-结构域)、SEQ ID NO:3 (A-结构域)、SEQ ID NO: 4 (B-结构域)、SEQ ID NO: 5 (C-结构域)、SEQ ID NO:6 (Z蛋白)、SEQ ID NO:7 (Zvar)或SEQ ID NO:8(变体A-结构域)、SEQ ID NO 26 (无接头区氨基酸1-6的Zvar)或SEQ ID NO 27 (无接头区氨基酸1-6的C-结构域)限定的、或与之有至少90%、至少95%或至少98%同一性的葡萄球菌A蛋白(SpA)的Fc结合结构域的突变体或由其组成，其中至少对应于SEQ ID NO:4-7中*42位的位置处的丙氨酸残基突变成另一个氨基酸残基(例如精氨酸)，和/或其中至少对应于SEQID NO:4-7中37位的位置处的天冬氨酸残基突变成谷氨酸。Z蛋白(SEQ ID NO:6)是US5143844中公开的突变的B-结构域，而SEQ ID NO 7表示Z蛋白进一步突变的变体，本文称为Zvar，其突变为N3A,N6D,N23T。SEQ ID NO:8是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)菌株N315的A蛋白的A-结构域的一种天然变体，使用图1的位置术语，其具有A46S突变。与亲代结构域/多肽相比，这些结构域中D37和/或A42的突变赋予提高的碱稳定性，而又不损害免疫球蛋白结合性质。因此，多肽还可描述为Fc结合多肽或免疫球蛋白结合多肽，或者作为Fc结合多肽单元或免疫球蛋白结合多肽单元。
*在该描述中，使用图1的氨基酸残基位置编号惯例，且按对应于SEQ ID NO 4-7中的那些标明位置编号。
在替代用语中，本发明公开了包含由SEQ ID NO 28限定的或与之有至少90%、至少95%或至少98%同一性的序列的Fc结合多肽。
SEQ ID NO 28
KEX1QX2AFYEILX3LPNLTEEQRX4X5FIQX6LKDX7PSX8SX9X10X11LAEAKX12X13NDAQAPK
其中其每个各独立为
X1=A或Q
X2=E、K或N
X3=H或K
X4=A或N
X5=A或G
X6=S或K
X7=E或D
X8=Q或V
X9=K、R或A
X10=A、E或N
X11=I或L
X12=K或R
X13=L或Y
D37E (X7)和/或A42R (X9)突变可为仅有的突变或多肽还可包含其它突变，例如对应于SEQ ID NO:4-8中的3、6、9、10、15、18、23、28、29、32、33、36、37、40、42、43、44、47、50、51、55和57位的位置的至少一个的取代。在这些位置的一个或多个中，原始氨基酸残基例如可被不是天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸取代。原始氨基酸残基例如可被丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸取代。此外，例如来自第1-6位和/或第56-58位的一个或多个氨基酸残基可缺失。
在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:4-7 (X1)的9位的位置处的氨基酸残基是谷氨酰胺、天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸以外的氨基酸，例如丙氨酸。在具体的实施方案中，SEQ ID NO: 7的9位的氨基酸残基是丙氨酸，11位的氨基酸残基是赖氨酸。9位的突变还论述于同时待审的申请PCT/SE2014/050872中，其通过引用以其整体结合到本文中。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7中50位的位置处的氨基酸残基(X12)是精氨酸或谷氨酸。
在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7中的11位的位置处的氨基酸残基(X2)是赖氨酸或谷氨酸。
在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7中的3位的位置处的氨基酸残基是丙氨酸和/或对应于SEQ ID NO:4-7中的6位的位置处的氨基酸残基是天冬氨酸。3和6位的氨基酸残基之一可以是天冬酰胺，而在备选的实施方案中，3和6位的两个氨基酸残基可以是天冬酰胺。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7中的43位的位置处的氨基酸残基(X10)是丙氨酸或谷氨酸，例如丙氨酸。在具体的实施方案中，SEQ ID NO: 7中9位的氨基酸残基是丙氨酸，11位的氨基酸残基是赖氨酸或谷氨酸，而43位的氨基酸残基是丙氨酸或谷氨酸。
在某些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:4-7的28位的位置处的氨基酸残基(X4)是丙氨酸或天冬酰胺，例如丙氨酸。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7中的40位的位置处的氨基酸残基(X8)选自天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酸和缬氨酸，或选自谷氨酸和缬氨酸。
在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7中的42位的位置处的氨基酸残基(X9)是丙氨酸、赖氨酸或精氨酸。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7中的18位的位置处的氨基酸残基(X3)是赖氨酸或组氨酸，例如赖氨酸。
在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7中的33位的位置处的氨基酸残基(X6)是赖氨酸或丝氨酸，例如赖氨酸。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7中的37位的位置处的氨基酸残基(X7)是谷氨酸或天冬氨酸，例如谷氨酸。
在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7中的51位的位置处的氨基酸残基(X13)是酪氨酸或亮氨酸，例如酪氨酸。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7中的44位的位置处的氨基酸残基(X11)是亮氨酸或异亮氨酸。在具体的实施方案中，SEQ ID NO: 7中9和11位的氨基酸残基分别是丙氨酸和赖氨酸，而44位的氨基酸残基是异亮氨酸。任选43位的氨基酸残基则可为丙氨酸或谷氨酸。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO: 4-7的1、2、3和4位或3、4、5和6位的位置处的氨基酸残基缺失。在这些实施方案的具体变体中，亲代多肽是A蛋白的C结构域(SEQ IDNO: 5)。这些缺失对天然C结构域的作用描述于US9018305和US8329860，其通过引用以其整体结合到本文中。
在某些实施方案中，SEQ ID NO 4-7 (例如SEQ ID NO 7中)的突变，选自：D37E；A42R；N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y；Q9A,N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y；N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I；Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I；Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R；Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R；Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I和Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I。这些突变提供特别高的碱稳定性。
在一些实施方案中，多肽包含选自SEQ ID NO: 9-18和24-25；10-18和24-25或11-18和24-25的序列或基本上由其组成。多肽可由例如选自上组或选自该组的子集的序列限定，但是它还可包含在N端和/或C端的其它氨基酸残基，例如N端的前导序列和/或C端的尾序列。
SEQ ID NO 9 Zvar(D37E)
VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 10 Zvar(A42R)
VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO: 11 Zvar(S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)
VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKRYNDAQAPK
SEQ ID NO: 12 Zvar(H18K，S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)
VDAKFDKEQQ NAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKRYNDAQAPK
SEQ ID NO 13 Zvar(N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)
VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKRYNDAQAPK
SEQ ID NO 14 Zvar(Q9A,N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRAAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKRYNDAQAPK
SEQ ID NO 15 Zvar(N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I)
VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 16 Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 17 Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKR LNDAQAPK
SEQ ID NO 18 Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 24 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 25 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK
在第二方面，本发明公开了包含由上文公开的任何实施方案限定的多个多肽单元的多聚体或基本上由其组成的多聚体。多聚体可以是例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。它可以是同多聚体(homomultimer)，其中多聚体中的所有单元是相同的或它可以是异多聚体(heteromultimer)，其中至少一个单元不同于其它单元。有利的是，多聚体中的所有单元例如通过包含上文公开的突变是碱稳定性的。多肽可通过多肽的C端和N端之间的肽键彼此直接连接。或者，多聚体中的两个或更多个单位可通过包含寡聚物类或聚合物类的接头，例如包含多达15或30个氨基酸，例如1-5、1-10或5-10个氨基酸的元件连接。这类接头的性质应优选不破坏蛋白质单元的空间构象的稳定。例如这可通过避免接头中脯氨酸的存在而实现。此外，所述接头还应优选在碱性环境中足够稳定，从而不损害突变的蛋白质单元的性质。为此目的，如果接头不含天冬酰胺，则是有利的。如果接头不含谷氨酰胺，则也是有利的。多聚体可在N端进一步包含多个氨基酸残基，例如来源于克隆过程的残基或从切下的信号序列构成残基。其它氨基酸残基的数目可为例如为15个或更少，例如10个或更少或5个或更少。作为一个具体实例，多聚体可在N端包含AQ序列。
在某些实施方案中，多聚体可包含选自以下的序列或基本由其组成：SEQ ID NO20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 22和SEQ ID NO 23。下文列出了这些序列，并命名为亲代(突变)n，其中n为多聚体中单体单位的数目。
SEQ ID NO 20 Zvar(N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)4
AQGT VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKRYNDAQAPKVDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKRYNDAQAPK VDAKFDKEQQKAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKRYNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLPNLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKRYNDAQAPKC
SEQ ID NO 21 Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R)4
AQGT VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQKAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLPNLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 22 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQEAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLPNLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 23 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQEAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLPNLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPKC
在一些实施方案中，上文公开的多肽和/或多聚体在C端或N端还包含选自一个或多个半胱氨酸残基、多个赖氨酸残基和多个组氨酸残基的一个或多个偶联元件。偶联元件还可位于距C端或N端1-5个氨基酸残基内，例如1-3或1-2个氨基酸残基内。偶联元件可以是例如C端的单一半胱氨酸。偶联元件可与C端或N端直接连接，或它/它们可通过包含多达15个氨基酸例如1-5、1-10或5-10个氨基酸的序列段(stretch) (接头)连接。特别在针对SEQID NO 26和27的突变和对于SEQ ID NO 28多肽就是这种情况，其中接头的具体实例可为例如VDAKFD或ADNKFN，例如VDAKFD。这个序列段优选还应在碱性环境中足够稳定而不损害突变的蛋白质的性质。为此目的，如果序列段不含天冬酰胺，则是有利的。如果序列段不含谷氨酰胺，则也可以是有利的。具有C端半胱氨酸的优势是蛋白质的终点偶联可通过半胱氨酸硫醇基与支持体上的亲电子基团反应来实现。这提供了偶联蛋白质的优异迁移率，这对结合能力是重要的。
多肽或多聚体的碱稳定性可如下评价：通过使用例如NHS-或马来酰亚胺偶联化学，按实施例中所述使之与SPR芯片(例如to Biacore CM5传感器芯片)偶联，并且在碱性溶液中在规定的温度(例如22 +/- 2℃)下温育之前和之后，通常使用多克隆人IgG，测量芯片的免疫球蛋白结合能力。温育可在例如0.5 M NaOH中进行多个10分钟循环，例如100、200或300个循环。在0.5 M NaOH中在22 +/- 2℃下100个10分钟温育循环后，基质的IgG容量可为温育前IgG容量的至少55%，例如至少60%、至少80%或至少90%。或者，可将所述在100个循环后针对如上测量特定突变体的剩余IgG容量与亲代多肽/多聚体的剩余IgG容量进行比较。在这种情况下，突变体的剩余IgG容量可为亲代多肽/多聚体的至少105%，例如至少110%、至少125%、至少150%或至少200%。
在第三方面，本发明公开了编码上文公开的任何实施方案的多肽或多聚体的核酸。因此，本发明包括本发明核酸序列的所有形式，例如编码多肽或多聚体的RNA和DNA。本发明包括载体，例如质粒，其除编码序列以外，还包含所需的用于表达本发明的多肽或多聚体的信号序列。在一个实施方案中，载体包含编码本发明的多聚体的核酸，其中编码各单元的各个核酸可具有同源或异源的DNA序列。
在第四方面，本发明公开了表达系统，其包含上文公开的核酸或载体。表达系统可以是例如革兰氏阳性或革兰氏阴性原核宿主细胞系统，例如经修饰表达本发明多肽或多聚体的大肠杆菌(E. coli)或芽孢杆菌(Bacillus sp.)。在一个备选的实施方案中，表达系统是真核宿主细胞系统，例如酵母，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
在第五方面，本发明公开了分离基质，其中多个上文公开的任何实施方案的多肽或多聚体与固相支持体偶联。这类基质可用于分离免疫球蛋白或其它含Fc的蛋白质，且由于多肽/多聚体的碱稳定性提高，因此基质在清洗期间会承受高度碱性的条件，这对在生物过程分离背景下的长期重复使用是必需的。可在碱性溶液中在规定的温度(例如22 +/- 2℃)下温育之前和之后，通常使用多克隆人IgG，测量免疫球蛋白结合能力，对基质的碱稳定性进行评价。温育可在例如0.5 M或1.0 M NaOH中进行多个15分钟循环，例如100、200或300个循环，相当于25、50或75小时的总温育时间。在0.5 M NaOH中在22 +/- 2℃下在96-100个15分钟温育循环或24或25小时的总温育时间之后，基质的IgG容量可为温育前IgG容量的至少80%、例如至少85%、至少90%或至少95%。在1.0 M NaOH中在22 +/- 2℃下在24小时的总温育时间后，基质的容量可为温育前IgG容量的至少70%、例如至少80%或至少90%。
本领域技术人员应了解，表达的多肽或多聚体应在固定在支持体之前纯化到适当程度。这类纯化方法是本领域众所周知的，容易采用标准方法进行基于蛋白质的配体在支持体上的固定。下面将更详细地论述合适的方法和支持体。
本发明的基质的固相支持体可以是任何合适的众所周知的类型。常规的亲和分离基质常常是有机性质的和以这样的聚合物为基础，其将亲水表面暴露于所用的水性介质，即将羟基(-OH)、羧基(-COOH)、甲酰氨基(-CONH2，可能呈N取代的形式)、氨基(-NH2，可能呈取代形式)、寡乙烯氧基或聚乙烯氧基暴露在其外面，也暴露在其内表面(如存在话)。固体支持体可适宜为多孔的。多孔性可表示为Kav或Kd值(特定大小的探针分子可达到的孔体积的分数)，该值例如按照描述于Gel Filtration Principles and Methods, PharmaciaLKB Biotechnology 1991, 第6-13页的方法，通过反向大小排阻层析法测量。按照定义，Kd和Kav值两者总是位于0-1的范围内。Kav值可有利地为0.6-0.95，例如0.7-0.90或0.6-0.8，如用Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量的。这个的优势是支持体具有大分数的孔隙，能够容纳本发明的多肽/多聚体和与多肽/多聚体结合的免疫球蛋白两者，并提供免疫球蛋白自结合部位往返的质量运输。
可利用例如存在于配体中的硫醇基、氨基和/或羧基，通过常规偶联技术使多肽或多聚体与支持体连接。Bisepoxides、环氧氯丙烷、CNBr、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等是众所周知的偶联试剂。可在支持体和多肽/多聚体之间，引入称为间隔基的分子，这改进多肽/多聚体的可用性和促进多肽/多聚体与支持体的化学偶联。根据多肽/多聚体的性质和偶联条件，偶联可以是多点偶联(例如通过多个赖氨酸)或单点偶联(例如通过单一半胱氨酸)。或者，多肽/多聚体可通过非共价键合(例如物理吸附或生物特异性吸附)与支持体连接。
在一些实施方案中，基质包含5-25，例如5-20 mg/ml、5-15 mg/ml、5-11 mg/ml或6-11 mg/ml的与支持体偶联的多肽或多聚体。可通过偶联过程中所用的多肽/多聚体的浓度、所用的激活和偶联条件和/或所用的支持体的孔结构来控制偶联的多肽/多聚体的量。作为普通规则，基质的绝对结合能力随着偶联的多肽/多聚体的量提高，至少达到其中孔变得显著受限于偶联的多肽/多聚体的点。每mg偶联的多肽/多聚体的相对结合能力在高偶联水平下会降低，导致上文规定范围内的最适成本效益。
在某些实施方案中，多肽或多聚体通过硫醚键与支持体偶联。进行这类偶联的方法是本领域众所周知的，且本领域技术人员采用标准技术和仪器容易进行。硫醚键是柔性和稳定的，并且常常适用于亲和层析法。特别当硫醚键是通过多肽或多聚体上的末端或近末端半胱氨酸残基时，偶联的多肽/多聚体的迁移率提高，这提供提高的结合能力和结合动力学。在一些实施方案中，如上文所述多肽/多聚体通过蛋白质上提供的C端半胱氨酸偶联。这允许半胱氨酸硫醇基与支持体上的亲电子基团(例如环氧基、卤代醇基等)的有效偶联，导致了硫醚桥偶联。
在某些实施方案中，支持体包含多羟基多聚体，例如多糖。多糖的实例包括例如葡聚糖、淀粉、纤维素、普鲁兰多糖(pullulan)、琼脂、琼脂糖等。多糖是固有亲水的，其非特异性相互作用的程度低，它们提供大量的反应性(可激活的)羟基，并且它们对用于生物加工的碱性清洗溶液通常是稳定的。
在一些实施方案中，支持体包含琼脂或琼脂糖。用于本发明的支持体可容易地按照标准方法制备，例如反相悬浮凝胶法(S Hjertén：Biochim Biophys Acta 79(2)，393-398 (1964)。或者，基础基质是可市购获得的产品，例如以SEPHAROSE™ FF (GEHealthcare)的名称销售的交联琼脂糖珠。在一个实施方案中，这对大规模分离是特别有利的，采用描述于US6602990或US7396467 (其通过引用以其整体结合到本文中)的方法，使支持体改变以增加其刚性，因此使基质更适于高的流速。
在某些实施方案中，支持体，例如多糖或琼脂糖支持体与例如羟基烷基醚交联剂交联。产生这类交联的交联试剂可以是例如表卤代醇如环氧氯丙烷、双环氧化合物如丁二醇二环氧甘油醚、烯丙基化试剂如烯丙基卤或烯丙基缩水甘油醚。交联对支持体的刚性是有益的，并提高化学稳定性。羟基烷基醚交联是碱稳定性的，并且不引起显著的非特异性吸附。
或者，固体支持体基于合成多聚体，例如聚乙烯醇、多羟基烷基丙烯酸酯、多羟基烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。在疏水多聚体的情况下，例如基于二乙烯和单乙烯基取代的苯的基质，基质的表面常常是亲水化的以将上文定义的亲水基显露在环境水性液体中。这类聚合物容易按照标准方法产生，参见例如“Styrene basedpolymer supports developed by suspension polymerization (通过悬浮多聚化开发的基于苯乙烯的多聚体支持体)” (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75(1988))。或者，使用市购可获得的产品，例如SOURCE™ (GE Healthcare)。在另一个备选方法中，本发明的固体支持体包含无机性质的支持体，例如二氧化硅、氧化锆等。
在又一个实施方案中，固体支持体呈另一种形式，例如表面、芯片、毛细管或滤器(例如膜或深层滤器(depth filter)基质)。
至于本发明的基质的形状，在一个实施方案中，基质呈多孔整料的形式。在一个备选的实施方案中，基质是可为多孔或无孔的珠状形式或颗粒形式。呈珠状形式或颗粒形式的基质可用作填充床或以悬浮形式使用。悬浮形式包括称为膨胀床和纯悬液的那些，其中颗粒或珠粒是自由移动的。在整料、填充床和膨胀床的情况下，分离程序通常遵循具有浓度梯度的常规层析法。在纯悬浮的情况下，将使用分批形式。
在第六方面，本发明公开了分离免疫球蛋白的方法，其中使用上文公开的分离基质。
在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a) 使包含免疫球蛋白的液体样品与上文公开的分离基质接触，
b) 将所述分离基质用洗液(washing liquid)洗涤，
c) 将免疫球蛋白用洗脱液从分离基质中洗脱，和
d) 将分离基质用清洗液(cleaning liquid) (其可备选称为就地清洗(CIP)液)清洗例如至少10分钟的接触(温育)时间。
所述方法还可包括以下步骤：在步骤a)前提供上述实施方案任一个的亲和分离基质并提供包含免疫球蛋白和至少一种其它物质的溶液作为液体样品，和在步骤c)后回收洗脱液和任选通过例如阴离子或阳离子交换层析法、多元层析法和/或疏水相互作用层析法对洗脱液进行进一步分离步骤。液体样品、洗液和洗脱液的合适组成以及进行分离的通用条件是亲和层析领域和特别是A蛋白层析领域中众所周知的。包含含Fc的蛋白质和至少一种其它物质的液体样品可包含宿主细胞蛋白质(HCP)，例如CHO细胞、大肠杆菌或酵母蛋白质。可通过针对这些蛋白质的免疫测定，例如来自Cygnus Technologies的CHO HCP或大肠杆菌HCP ELISA试剂盒，方便地测定CHO细胞和大肠杆菌蛋白质的含量。可在步骤b)期间使宿主细胞蛋白质或CHO细胞/大肠杆菌蛋白质解吸附。
可通过使用用于从A蛋白介质中洗脱的任何合适的溶液进行洗脱。这可以是例如pH 5或更低、例如pH 2.5-5或3-5的溶液或缓冲液。在一些情况下也可为pH 11或更高、例如pH 11-14或pH 11-13的溶液或缓冲液。在一些实施方案中，洗脱缓冲液或洗脱缓冲液梯度包含至少一个单官能、二官能或三官能羧酸或这类羧酸的盐。在某些实施方案中，洗脱缓冲液或洗脱缓冲液梯度包含选自以下的至少一种阴离子物类：乙酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐和甲酸盐。
在一些实施方案中，清洗液是碱性的，例如pH为13-14。这类溶液提供基质、特别是间隔(interval)上层的有效清洗。
在某些实施方案中，清洗液包含0.1-2.0 M NaOH或KOH，例如0.5-2.0或0.5-1.0 MNaOH或KOH。这些是有效的清洗溶液，当NaOH或KOH浓度超过0.1 M或至少0.5 M时特别如此。本发明的多肽的高稳定性使得能够使用这类强碱性溶液。
所述方法还可包括将基质用消毒液消毒的步骤，所述消毒液可包含例如过氧化物，例如过氧化氢和/或过酸，例如过乙酸或过甲酸。
在一些实施方案中，重复步骤a)-d)至少10次，例如至少50次、50-200、50-300或50-500次。这对于工艺经济性是重要的，因为基质可重复使用多次。
还可重复步骤a)-c)至少10次，例如至少50次、50-200、50-300或50-500次，其中步骤d)在步骤c)的多次后进行，使得进行步骤d)至少10次，例如至少50次。步骤d)可在例如步骤c)的每第二至第二十次时进行。
实施例
蛋白质的诱变
使用编码突变的寡核苷酸，通过两步PCR进行位点定向诱变。使用含有Z、B或C的单一结构域的质粒作为模板。将PCR片段连接入大肠杆菌表达载体。采用DNA测序以证实插入片段的正确序列。
为了形成突变体的多聚体，使用位于B、C或Z结构域的起始密码子(GTA GAC)的AccI位点(相当于氨基酸VD)。单体结构域的载体用Acc I消化和磷酸酶处理。设计对各变体有特异性的Acc I黏性末端引物，从每个模板产生2个重叠的PCR产物。将PCR产物纯化，通过比较2%琼脂糖凝胶上的PCR产物来估算浓度。将等量的成对PCR产物在连接缓冲液中杂交(90℃ -> 25℃，45分钟)。所得产物构成可能连接至Acc I位点的片段的约¼ (正确的PCR片段和/或消化的载体)。在连接和转化后，集落经PCR筛选以鉴定含有所需突变体的构建体。阳性克隆通过DNA测序证实。
构建体表达和纯化
在标准培养基中通过大肠杆菌K12发酵，使构建体在细菌周质中表达。在发酵后，对细胞进行热处理以将周质内容物释放到培养基中。通过用具有0.2 µm孔径的膜微过滤，回收释放到培养基中的构建体。
将此时在来自过滤步骤的渗透物中的各个构建体通过亲和力纯化。将渗透物加载到含有固定化IgG (IgG Sepharose 6FF，GE Healthcare)的层析介质中。通过降低pH，对加载的产物用磷酸缓冲盐水进行洗涤和洗脱。
将洗脱合并物调节至中性pH (pH 8)并通过加入二硫苏糖醇还原。然后将样品加载至阳离子交换器中。在洗涤步骤后，将构建体在NaCl梯度中洗脱以将其与任何污染物分开。通过超滤使洗脱合并物浓缩至40-50 mg/ml。应注意到，固定化IgG介质中构建体成功的亲和纯化表明，所论述的构建体对IgG具有高亲和力。
用RPC LC-MS分析纯化的配体以测定纯度并确定与预期(根据氨基酸序列)相当的分子量。
实施例1
使用GE Healthcare的胺偶联试剂盒(用于芯片中羧基甲基上的胺的碳二亚胺偶联)，以在Biacore表面等离子体共振(SPR)仪器(GE Healthcare，Sweden)上足以给于约200-1500 RU的信号强度的量，将列于表1中还在N端含AQGT前导序列和在C端含半胱氨酸的纯化的单体配体固定在Biacore CM5传感器芯片(GE Healthcare，Sweden)上。为了跟踪固定化表面的IgG结合能力，使1mg/ml人多克隆IgG (Gammanorm)从芯片上流过，记录信号强度(与结合的量成比例)。然后就地清洗(CIP)表面，即在室温(22 +/- 2℃)下用500mM NaOH冲洗10分钟。对此重复96-100个循环，跟踪固定化配体碱稳定性作为在每个循环后剩余的IgG结合能力(信号强度)。结果见表1，并且表明与用作参比的亲代结构Zvar1相比，至少配体Zvar(D37E)1、Zvar(A42R)1、Zvar(S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)1、Zvar(H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)1、Zvar(N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)1、Zvar(Q9A,N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)1、Zvar(N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I)1、Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I)1和Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,42R,N43A,L44I,K50R)1具有改进的碱稳定性。
表1. 通过Biacore评价的单体配体(0.5 M NaOH)。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实施例2
使用GE Healthcare的胺偶联试剂盒 (用于芯片中羧基甲基上胺的碳二亚胺偶联)，以在Biacore仪器(GE Healthcare，Sweden)上足以给予约200-1500 RU的信号强度的量，将表2中所列的纯化的四聚体配体固定在Biacore CM5传感器芯片(GE Healthcare，Sweden)上。为了跟踪固定化表面的IgG结合能力，使1mg/ml人多克隆IgG (Gammanorm)从芯片上流过，记录信号强度(与结合的量成比例)。然后使表面就地清洗(CIP)，即在室温(22+/- 2℃)下用500mM NaOH冲洗10分钟。对此重复300个循环，并跟踪固定化配体碱稳定性作为在每个循环后剩余的IgG结合能力(信号强度)。结果见表2和图2，且表明与用作参比的亲代结构Zvar4相比，至少配体Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4和Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I)4具有改进的碱稳定性。
表2. 通过Biacore评价的四聚体和六聚体配体(0.5M NaOH)。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
实施例3
采用下文描述的方法，使表3的纯化的四聚体配体(全部具有额外的N端半胱氨酸)固定在琼脂糖珠粒上，并针对容量和稳定性进行评价。结果见表2。
表3. 在柱中评价的含四聚体配体的基质(0.5M NaOH)。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
激活
所用的基础基质是按照US6602990的方法制备的85微米(容积加权的，d50V)介质直径的刚性交联的琼脂糖珠粒，且按照描述于Gel Filtration Principles and Methods,Pharmacia LKB Biotechnology 1991, 第6-13页的方法，其孔径相当于针对Mw 110 kDa葡聚糖的0.70的反向凝胶过滤层析法Kav值。
在25℃下机械搅拌10分钟的同时，将25 mL (g)沥干的基础基质、10.0 mL蒸馏水和2.02 g NaOH在100 mL烧瓶中混合。加入4.0 mL环氧氯丙烷，反应进行2小时。活化的凝胶用10凝胶沉积体积(GV)的水洗涤。
偶联
向50 ml Falcon管中的20 mL配体溶液(50 mg/mL)中加入169 mg NaHCO3、21 mgNa2CO3、175 mg NaCl和7 mg EDTA。将Falcon管置于摇床上5-10分钟，然后加入77 mg DTE。还原进行>45分钟。然后使配体溶液在装满Sephadex G-25的PD10柱中脱盐。通过测量276nm UV吸收，测定脱盐溶液中的配体含量。
激活的凝胶用3-5 GV {0.1 M磷酸盐/1 mM EDTA pH 8.6}洗涤，配体然后按照描述于US6399750的方法偶联。实验中所用的所有缓冲液通过氮气脱气至少5-10分钟。可通过改变配体溶液的量和浓度，控制凝胶的配体含量。
在固定后，凝胶用蒸馏水洗涤3xGV。将凝胶+ 1 GV {0.1 M磷酸盐/1 mM EDTA/10%硫代甘油pH 8.6}混合，将管置于摇床上在室温下过夜。然后将交替地用3xGV {0.1 MTRIS/0.15 M NaCl pH 8.6}和0.5 M HAc洗涤凝胶，接着8-10xGV和蒸馏水。将凝胶样品送往外面的实验室进行氨基酸分析，从总氨基酸含量计算配体含量(mg/ml凝胶)。
蛋白质
Gammanorm 165 mg/ml (Octapharma)，在平衡缓冲液中稀释至2mg/ml。
平衡缓冲液
PBS磷酸盐缓冲液10 mM + 0.14 M NaCl + 0.0027 M KCl，pH 7.4 (Medicago)
吸附缓冲液
PBS磷酸盐缓冲液10 mM + 0.14 M NaCl + 0.0027 M KCl，pH 7.4 (Medicago)
洗脱缓冲液
100 mM乙酸盐pH 2.9
动态结合能力
将2 ml树脂装入TRICORN™ 5 100柱中。用ÄKTAExplorer 10系统以6分钟的停留时间测定漏过容量（breakthrough capacity）。使平衡缓冲液流过旁通柱(bypasscolumn)，直到获得稳定的基线。这在自动零位调整之前进行。将样品施加到柱中，直到获得100% UV信号。然后，再次施加平衡缓冲液，直到获得稳定的基线。
将样品加载到柱中，直到达到最大吸光度85%的UV信号。然后将柱用5柱体积(CV)平衡缓冲液以0.5ml/分钟的流速洗涤。蛋白质用5 CV洗脱缓冲液以0.5 ml/分钟的流速洗脱。然后柱用0.5M NaOH以0.2 ml/分钟的流速清洗，并用平衡缓冲液再平衡。
为了计算10%下的漏过容量，应用以下方程式。这是加载到柱中直到柱流出物中IgG的浓度是进料中IgG浓度的10%的IgG的量。
Figure DEST_PATH_IMAGE008
A100% = 100% UV信号；
Asub = 来自非结合IgG亚类的吸光度贡献；
A(V) = 指定施加体积下的吸光度；
Vc= 柱体积；
Vapp = 施加直到10%漏过的体积；
Vsys = 系统死体积；
C0 = 进料浓度。
计算10%漏过下的动态结合能力(DBC)。针对10%和80%漏过，计算动态结合能力(DBC)。
CIP - 0.5 M NaOH
在重复暴露于碱性清洗溶液之前和之后均测定10%漏过DBC (Qb10)。各循环包括用0.5 M NaOH以0.5/分钟的速率泵送过柱20分钟的CIP步骤，之后将柱静置4小时。暴露发生在室温(22 +/- 2℃)下。在该温育后，柱用平衡缓冲液以0.5 ml/分钟的流速洗涤20分钟。表4显示6个4小时循环(即0.5 M NaOH的24小时累积暴露时间)后的剩余容积，呈绝对数和相对于起始容积两者。
该书面描述利用实施例以公开本发明，包括最佳方式，并且使本领域任何技术人员能够实施本发明，包括制备和使用任何装置或系统和进行任何结合的方法。本发明的专利范围由权利要求书限定，可包括本领域技术人员想到的其它实施例。如果这类其它实施例具有无不同于权利要求书的字面语言的结构要素，或如果它们包括与权利要求书的字面语言无实质性差异的等同结构要素，则它们旨在权利要求书的范围内。正文中提及的所有专利和专利申请均通过引用以其整体结合到本文中，就像它们被分别结合一样。
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Claims (30)

1.一种Fc结合多肽，其由SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16或SEQ ID NO 17的序列组成。
2.一种多聚体，其由多个权利要求1的多肽组成。
3.权利要求2的多聚体，其中所述多肽由包含至多15个氨基酸的接头连接。
4.权利要求2或3的多聚体，其是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。
5.一种多聚体，其由SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 22或SEQ ID NO 23限定的序列组成。
6.权利要求1的多肽或权利要求2、3或5的多聚体，其还在C端或N端处连接至一个或多个偶联元件，所述偶联元件选自一个或多个半胱氨酸残基、多个赖氨酸残基和多个组氨酸残基。
7.一种核酸或载体，其编码前述权利要求中任一项的多肽或多聚体。
8.一种表达系统，其包含权利要求7的核酸或载体。
9.一种分离基质，其中多个根据权利要求1-6中任一项的多肽或多聚体与固相支持体偶联。
10.权利要求9的分离基质，其中所述多肽或多聚体通过硫醚键与固相支持体偶联。
11.权利要求9或10的分离基质，其中所述固相支持体是多糖。
12.权利要求9或10的分离基质，其中在0.5 M NaOH中在22 +/- 2℃下在24小时温育后基质的IgG容量为温育前IgG容量的至少80%。
13.权利要求9或10的分离基质，其中在0.5 M NaOH中在22 +/- 2℃下在24小时温育后基质的IgG容量为温育前IgG容量的至少85%。
14.权利要求9或10的分离基质，其中在0.5 M NaOH中在22 +/- 2℃下在24小时温育后基质的IgG容量为温育前IgG容量的至少90%。
15.权利要求9或10的分离基质，其中在0.5 M NaOH中在22 +/- 2℃下在24小时温育后基质的IgG容量为温育前IgG容量的至少95%。
16.权利要求9或10的分离基质，其中在1.0 M NaOH中在22 +/- 2℃下在24小时温育后基质的IgG容量为温育前IgG容量的至少70%。
17.权利要求9或10的分离基质，其中在1.0 M NaOH中在22 +/- 2℃下在24小时温育后基质的IgG容量为温育前IgG容量的至少80%。
18.权利要求9或10的分离基质，其中在1.0 M NaOH中在22 +/- 2℃下在24小时温育后基质的IgG容量为温育前IgG容量的至少90%。
19.一种分离免疫球蛋白的方法，其中使用权利要求9-18中任一项的分离基质。
20.权利要求19的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 使包含免疫球蛋白的液体样品与权利要求9-18中任一项的分离基质接触，
b) 将所述分离基质用洗液洗涤，
c) 将免疫球蛋白用洗脱液从分离基质中洗脱，和
d) 将所述分离基质用清洗液清洗。
21.权利要求20的方法，其中所述清洗液是碱性的。
22.权利要求20的方法，其中所述清洗液是碱性的，其pH为13-14。
23.权利要求20或21的方法，其中所述清洗液包含0.1-1.0 M NaOH或KOH。
24.权利要求20或21的方法，其中所述清洗液包含0.5-1.0 M NaOH或KOH。
25.权利要求20或21的方法，其中重复步骤a)-d)至少10次。
26.权利要求20或21的方法，其中重复步骤a)-d)至少50次。
27.权利要求20或21的方法，其中重复步骤a)-d) 50-200次。
28.权利要求20或21的方法，其中重复步骤a)-c)至少10次且其中在多个步骤c)后，进行步骤d)。
29.权利要求20或21的方法，其中重复步骤a)-c)至少50次且其中在多个步骤c)后，进行步骤d)。
30.权利要求20或21的方法，其中重复步骤a)-c) 50-200次且其中在多个步骤c)后，进行步骤d)。
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