DE112015005181T5

DE112015005181T5 - Mutierte Immunglobulin-bindende Polypeptide

Info

Publication number: DE112015005181T5
Application number: DE112015005181.3T
Authority: DE
Inventors: Gustav Rodrigo; Tomas Bjorkman; Mats Ander
Original assignee: GE Healthcare Bioprocess R&D AB
Current assignee: Cytiva Bioprocess R&D AB
Priority date: 2014-11-17
Filing date: 2015-11-16
Publication date: 2017-08-24
Also published as: EP3757124A1; CN107001432B; RU2017115342A3; RU2017115345A; US20200079878A1; US20230331870A1; US11566082B2; ES2817900T3; JP2017533924A; RU2701695C2; EP3757123A1; KR102552335B1; AU2015348640A1; RU2017115342A; US20180327512A1; AU2015348640B2; CN107001432A; JP2017536819A; CN107001448A; RU2712882C2

Abstract

Ein Fc-bindendes Polypeptid mit verbesserter Alkalistabilität, umfassend eine Mutante einer Fc-bindenden Domäne von Staphylococcus-Protein A (SpA), wie definiert durch SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR 51 oder SEQ ID NR 52, wobei zumindest der Asparagin- oder Serin-Rest an der Position entsprechend Position 11 in SEQ ID NR: 4–7 zu einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glutaminsäure, Lysin, Tyrosin, Threonin, Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Tryptophan, Methionin, Valin, Alanin, Histidin und Arginin, mutiert worden ist.

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Affinitätschromatographie und insbesondere auf mutierte Immunglobulin-bindende Domänen von Protein A, welche bei der Affinitätschromatographie von Immunglobulinen nützlich sind. Die Erfindung bezieht sich auch auf Multimere der mutierten Domänen und Trennmatrizen, die die mutierten Domänen oder Multimere enthalten.
Hintergrund der Erfindung
Immunglobuline stellen weltweit die am weitesten verbreiteten biopharmazeutischen Erzeugnisse sowohl in der Herstellung als auch der Entwicklung dar. Die hohe kommerzielle Nachfrage und damit der Wert dieses besonderen therapeutischen Marktes hat dazu geführt, dass der Schwerpunkt bei pharmazeutischen Unternehmen darauf gelegt wird, die Produktivität ihrer entsprechenden mAb-Herstellungsprozesse zu maximieren und gleichzeitig die damit assoziierten Kosten zu kontrollieren.
In den meisten Fällen wird die Affinitätschromatographie als einer der Schlüsselschritte bei der Reinigung dieser Immunglobulin-Moleküle verwendet, wie z.B. monoklonaler oder polyklonaler Antikörper. Eine besonders interessante Klasse von Affinitätsreagenzien sind Proteine, die in der Lage sind, spezifisch an konstante („invariable“) Teile eines Immunglobulin-Moleküls zu binden, wobei diese Wechselwirkung unabhängig von der Antigenbindespezifität des Antikörpers ist. Solche Reagenzien können umfassend für die Affinitätschromatographie-Gewinnung von Immunglobulinen aus verschiedenen Proben, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, Serum- oder Plasmapräparate oder Rohstoffe („feed stocks“) aus Zellkultur, verwendet werden. Ein Beispiel für ein solches Protein ist Staphylokokken-Protein A, das Domänen enthält, die in der Lage sind, an die Fc- und Fab-Teile von IgG-Immunglobulinen verschiedener Spezies zu binden. Diese Domänen werden allgemein als die E-, D-, A-, B- und C-Domänen bezeichnet.
Staphylokokken-Protein A(SpA)-basierte Reagenzien haben aufgrund ihrer hohen Affinität und Selektivität eine umfassende Anwendung auf dem Gebiet der Biotechnologie gefunden, z.B. in der Affinitätschromatographie zur Erfassung und Reinigung von Antikörpern sowie zur Detektion oder Quantifizierung. Gegenwärtig ist SpA-basiertes Affinitätsmedium wahrscheinlich das am weitesten verbreitete Affinitätsmedium zur Isolierung von monoklonalen Antikörpern und deren Fragmente aus verschiedenen Proben, einschließlich industrieller Zellkulturüberstände. Entsprechend sind verschiedene Matrizen, die Protein-A-Liganden umfassen, kommerziell erhältlich, zum Beispiel in Form von nativem Protein A (z.B. Protein A SEPHAROSE^TM, GE Healthcare, Uppsala, Schweden) und auch umfassend rekombinantes Protein A (z.B. rProtein A SEPHAROSE^TM, GE Healthcare). Insbesondere zielt die genetische Manipulation durchgeführt an dem kommerziellen, rekombinanten Protein A-Erzeugnis darauf, dessen Bindung an einen Träger zu erleichtern und die Produktivität des Liganden zu erhöhen.
Diese Anwendungen, wie andere Affinitätschromatographie-Anwendungen, erfordern umfassende Aufmerksamkeit auf definitive Entfernung von Verunreinigungen. Solche Verunreinigungen können beispielsweise nicht-eluierte Moleküle sein, die an der stationären Phase oder Matrix in einem chromatographischen Verfahren adsorbiert sind, wie z.B. nicht erwünschte Biomoleküle oder Mikroorganismen, einschließlich zum Beispiel Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Bakterien und Viren. Die Entfernung derartiger Verunreinigungen aus der Matrix wird üblicherweise nach einer ersten Elution des gewünschten Erzeugnisses durchgeführt, um die Matrix vor der nachfolgenden Verwendung zu regenerieren. Eine solche Entfernung involviert üblicherweise ein Verfahren, das als „cleaning-in-place“ (CIP) bekannt ist, wobei Agenzien verwendet werden, die in der Lage sind, Verunreinigungen aus der stationären Phase zu eluieren. Eine solche Klasse von Agenzien, die häufig verwendet wird, sind alkalische Lösungen, die über die stationäre Phase geleitet werden. Gegenwärtig ist das am umfangreichsten genutzte Reinigungs- und Desinfektionsmittel NaOH und dessen Konzentration kann von 0,1 bis z.B. 1 M reichen, abhängig von dem Grad und Natur der Kontamination. Diese Strategie ist assoziiert mit der Exposition der Matrix gegenüber Lösungen mit pH-Werten über 13. Für viele Affinitätschromatographie-Matrizen, die proteinöse Affinitätsliganden enthalten, ist eine solche alkalische Umgebung eine sehr raue Bedingung und führt folglich zu verminderten Kapazitäten aufgrund der Instabilität des Liganden gegenüber dem einhergehenden hohen pH.
Umfangreiche Forschung hat sich daher auf die Entwicklung von konstruierten Proteinliganden konzentriert, die eine verbesserte Kapazität aufweisen, alkalischen pH-Werten standzuhalten. Zum Beispiel haben Gülich et al. (Susanne Gülich, Martin Linhult, Per-Åke Nygren, Mathias Uhlén, Sophia Hober, Journal of Biotechnology 80 (2000), 169–178) Protein-Engineering vorgeschlagen, um die Stabilitätseigenschaften einer Streptokokken-Albumin-bindenden Domäne (ABD) in alkalischen Umgebungen zu verbessern. Gülich et al. erzeugten eine Mutante von ABD, wobei alle der vier Asparagin-Reste durch Leucin (ein Rest), Aspartat (zwei Reste) und Lysin (ein Rest) ersetzt worden sind. Ferner berichten Gülich et al., dass ihre Mutante ein Zielprotein-Bindungsverhalten ähnlich dem des nativen Proteins aufweist und dass Affinitätssäulen, die den konstruierten Liganden enthalten, nach wiederholter Exposition gegenüber alkalischen Bedingungen höhere Bindungskapazitäten aufweisen als Säulen, die unter Verwendung des ursprünglichen („parental“), nicht-konstruierten Liganden hergestellt worden sind. Daher wird darin geschlossen, dass alle vier Asparagin-Reste ohne erhebliche Auswirkung auf Struktur und Funktion ersetzt werden können.
Jüngste Arbeiten zeigen, dass Änderungen auch an Protein A (SpA) vorgenommen werden können, um ähnliche Eigenschaften zu bewirken. Die US-Patentanmeldungsveröffentlichung US 2005/0143566 , die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird, offenbart, dass, wenn zumindest ein Asparagin-Rest zu einer anderen Aminosäure als Glutamin oder Asparaginsäure mutiert wird, die Mutation bei pH-Werten von bis zu etwa 13– 14 eine erhöhte chemische Stabilität im Vergleich zu dem ursprünglichen SpA, wie z.B. der B-Domäne von SpA oder Protein Z, einem synthetischen Konstrukt abgeleitet von der B-Domäne von SpA ( US 5,143,844 , aufgenommen durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit), verleiht. Die Autoren zeigen, dass, wenn diese mutierten Proteine als Affinitätsliganden verwendet werden, die Trennmedien, wie erwartet, besser Reinigungsverfahren unter Verwendung alkalischer Agenzien standhalten können. Weitere Mutationen von Protein A-Domänen mit dem Zweck der Erhöhung der Alkalistabilität wurden auch in WO 2008/039141 , JP 2006304633A , EP 1992692A1 , EP 2202310A2 , WO 2010/110288 , WO 2012/086660 , WO 2012/083425 , WO 2012/087230 und WO 2014/146350 veröffentlicht, die alle hiermit durch Bezugnahme in ihren Gesamtheiten aufgenommen werden. Allerdings sind die derzeit verfügbaren Mutanten noch immer empfindlich gegenüber alkalischem pH und die NaOH-Konzentration während der Reinigung ist üblicherweise auf 0,1 M begrenzt, was bedeutet, dass eine vollständige Reinigung schwierig zu erreichen ist. Höhere NaOH-Konzentrationen, die die Reinigung verbessern würden, führen zu unannehmbaren Kapazitätsverlusten.
Es besteht daher noch immer ein Bedarf in diesem Gebiet, eine Trennmatrix zu erhalten, die Proteinliganden mit einer weiter verbesserten Stabilität gegenüber alkalischen Reinigungsverfahren enthält.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Aspekt der Erfindung besteht darin, ein Polypeptid mit verbesserter alkalischer Stabilität bereitzustellen. Dies wird mit einem Polypeptid, wie definiert in Anspruch 1, erreicht.
Ein Vorteil ist, dass die alkalische Stabilität gegenüber den ursprünglichen Polypeptiden verbessert ist, bei aufrechterhaltener, hochselektiver Bindung gegenüber Immunglobulinen und anderen Fc-enthaltenden Proteinen.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung ist, ein Multimer mit verbesserter alkalischer Stabilität bereitzustellen, das eine Vielzahl von Polypeptiden umfasst. Dies wird mit einem Multimer, wie in den Ansprüchen definiert, erreicht.
Ein dritter Aspekt der Erfindung ist, eine Nukleinsäure oder einen Vektor bereitzustellen, der ein Polypeptid oder Multimer mit verbesserter alkalischer Stabilität kodiert. Dies wird mit einer Nukleinsäure oder einem Vektor, wie in den Ansprüchen definiert, erreicht.
Ein vierter Aspekt der Erfindung ist, ein Expressionssystem bereitzustellen, das in der Lage ist, ein Polypeptid oder Multimer mit verbesserter alkalischer Stabilität zu exprimieren. Dies wird mit einem wie in den Ansprüchen definierten Expressionssystem erreicht.
Ein fünfter Aspekt der Erfindung ist, eine Trennmatrix bereitzustellen, die in der Lage ist, selektiv Immunglobuline und andere Fc-enthaltende Proteine zu binden und eine verbesserte alkalische Stabilität aufweist. Dies wird mit einer wie in den Ansprüchen definierten Trennmatrix erreicht.
Ein sechster Aspekt der Erfindung ist, ein effizientes und ökonomisches Verfahren zur Isolierung eines Immunglobulins oder anderen Fc-enthaltenden Proteins bereitzustellen. Dies wird mit einem wie in den Ansprüchen definierten Verfahren erreicht.
Weitere geeignete Ausführungsformen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.
Definitionen
Die Begriffe „Antikörper“ und „Immunglobulin“ werden hierin austauschbar verwendet und verstehen sich als auch die Fragmente von Antikörpern, Antikörper- oder Antikörperfragmente-umfassende Fusionsproteine und Antikörper- oder Antikörperfragmente-umfassende Konjugate einzuschließen.
Die Begriffe „Fc-bindendes Polypeptid“ und „Fc-bindendes Protein“ bedeuten ein Polypeptid bzw. Protein, das in der Lage ist, an den kristallisierbaren Teil (Fc) eines Antikörpers zu binden und schließt z.B. Protein A und Protein G, oder jedes die Bindeeigenschaft beibehaltendes Fragment oder Fusionsprotein davon, ein.
Der Begriff „Linker“ bedeutet hierin ein Element, das zwei Polypeptideinheiten, Monomere oder Domänen miteinander in einem Multimer verbindet.
Der Begriff „Spacer“ bedeutet hierin ein Element, das ein Polypeptid oder ein Polypeptid-Multimer an einen Träger verbindet.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
zeigt ein Alignment der Fc-bindenden Domänen wie definiert durch SEQ ID NR: 1–7 und 51–52.
zeigt Ergebnisse von Beispiel 2 für die Alkalistabilität von ursprünglichen und mutierten tetrameren Zvar(SEQ ID NR 7)-Polypeptidvarianten, die an einen SPR-Biosensorchip gekuppelt sind.
zeigt Ergebnisse von Beispiel 4 für die Alkalistabilität (0,5 M NaOH) von ursprünglichen und mutierten tetrameren Zvar(SEQ ID NR 7)-Polypeptidvarianten, die an Agaroseperlen gekuppelt sind.
zeigt Ergebnisse von Beispiel 4 für die Alkalistabilität (1,0 M NaOH) von ursprünglichen und mutierten tetrameren Zvar(SEQ ID NR 7)-Polypeptidvarianten, die an Agaroseperlen gekuppelt sind.
Ausführliche Beschreibung der Ausführungsformen
In einem Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung ein Fc-bindendes Polypeptid, das eine Mutante einer Fc-bindenden Domäne von Staphylococcus-Protein A (SpA) umfasst, oder im Wesentlichen daraus besteht, wie definiert durch oder mit zumindest 90%, zumindest 95% oder zumindest 98% Identität zu SEQ ID NR: 1 (E-Domäne), SEQ ID NR: 2 (D-Domäne), SEQ ID NR: 3 (A-Domäne), SEQ ID NR: 22 (variante A-Domäne), SEQ ID NR: 4 (B-Domäne), SEQ ID NR: 5 (C-Domäne), SEQ ID NR: 6 (Protein Z), SEQ ID NR: 7 (Zvar), SEQ ID NR 51 (Zvar ohne die Linker-Region-Aminosäuren 1–6) oder SEQ ID NR 52 (C-Domäne ohne die Linker-Region-Aminosäuren 1–6), wie dargestellt in , wobei zumindest der Asparagin(oder Serin, im Fall von SEQ ID NR 2)-Rest an der Position*

*: In dieser Beschreibung wird die Aminosäure-Rest-Positionsnumerierungskonvention von Abb. 1 verwendet und die Positionsnummern werden als entsprechend denjenigen in SEQ ID NR: 4–7 bezeichnet.

US5143844

*
In alternativer Sprache offenbart die Erfindung ein Fc-bindendes Polypeptid, das eine Sequenz definiert durch oder mit zumindest 90%, zumindest 95% oder zumindest 98% Identität zu SEQ ID NR 53 umfasst. SEQ ID NR 53
wobei unabhängig voneinander:
X₁ = A oder Q
X₂ = E, K, Y, T, F, L, W, I, M, V, A, H oder R
X₃ = H oder K
X₄ = A oder N
X₅ = A oder G
X₆ = Q oder E
X₇ = S oder K
X₈ = E oder D
X₉ = Q oder V
X₁₀ = K, R oder A
X₁₁ = A, E oder N
X₁₂ = I oder L
X₁₃ = K oder R
X₁₄ = L oder Y
Die N11(X₂)-Mutation (z.B. eine N11E- oder N11K-Mutation) kann die einzige Mutation sein oder das Polypeptid kann auch weitere Mutationen umfassen, wie z.B. Substitutionen in zumindest einer der Positionen entsprechend den Positionen 3, 6, 9, 10, 15, 18, 23, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 42, 43, 44, 47, 50, 51, 55 und 57 in SEQ ID NR: 4–7. In einer oder mehreren dieser Positionen kann der ursprüngliche Aminosäure-Rest z.B. mit einer Aminosäure substituiert werden, die nicht Asparagin, Prolin oder Cystein ist. Der ursprüngliche Aminosäure-Rest kann z.B. mit einem Alanin, einem Valin, einem Threonin, einem Serin, einem Lysin, einer Glutaminsäure oder einer Asparaginsäure substituiert werden. Ferner können ein oder mehrere Aminosäure-Reste deletiert sein, z.B. von Positionen 1–6 und/oder von Positionen 56–58.
In einigen Ausführungsformen ist der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 9 in SEQ ID NR: 4–7 (X₁) eine andere Aminosäure als Glutamin, Asparagin, Prolin oder Cystein, wie z.B. ein Alanin. Die Kombination der Mutationen an den Positionen 9 und 11 stellt, wie in den Beispielen gezeigt, eine besonders gute Alkalistabilität bereit. In spezifischen Ausführungsformen ist in SEQ ID NR: 7 der Aminosäure-Rest an Position 9 ein Alanin und der Aminosäure-Rest an Position 11 ist ein Lysin oder Glutaminsäure, wie z.B. ein Lysin. Mutationen an Position 9 werden auch in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung PCT/SE2014/050872 diskutiert, die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird. In einigen Ausführungsformen ist der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 50 in SEQ ID NR: 4–7 (X₁₃) ein Arginin oder eine Glutaminsäure.
In bestimmten Ausführungsformen ist der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 3 in SEQ ID NR: 4–7 ein Alanin und/oder der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 6 in SEQ ID NR: 4–7 eine Asparaginsäure. Einer der Aminosäure-Reste an Positionen 3 und 6 kann ein Asparagin und in einer alternativen Ausführungsform können beide Aminosäure-Reste an den Positionen 3 und 6 Asparagine sein.
In einigen Ausführungsformen ist der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 43 in SEQ ID NR: 4–7 (X₁₁) ein Alanin oder eine Glutaminsäure, wie z.B. ein Alanin. In spezifischen Ausführungsformen sind die Aminosäure-Reste an den Positionen 9 und 11 in SEQ ID NR: 7 Alanin bzw. Lysin/Glutaminsäure, während der Aminosäure-Rest an Position 43 Alanin oder Glutaminsäure ist.
In bestimmten Ausführungsformen ist der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 28 in SEQ ID NR: 4–7 (X₅) ein Alanin oder ein Asparagin, wie z.B. ein Alanin.
In einigen Ausführungsformen ist der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 40 in SEQ ID NR: 4–7 (X₉) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Asparagin, Alanin, Glutaminsäure und Valin oder aus der Gruppe bestehend aus Glutaminsäure und Valin. In spezifischen Ausführungsformen sind die Aminosäure-Reste an den Positionen 9 und 11 in SEQ ID NR: 7 Alanin bzw. Glutaminsäure, während der Aminosäure-Rest an Position 40 Valin ist. Gegebenenfalls kann der Aminosäure-Rest an Position 43 dann Alanin oder Glutaminsäure sein.
In bestimmten Ausführungsformen ist der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 42 in SEQ ID NR: 4–7 (X₁₀) ein Alanin, Lysin oder Arginin.
In einigen Ausführungsformen ist der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 18 in SEQ ID NR: 4–7 (X₃) ein Lysin oder ein Histidin, wie z.B. ein Lysin.
In bestimmten Ausführungsformen ist der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 33 in SEQ ID NR: 4–7 (X₇) ein Lysin oder ein Serin, wie z.B. ein Lysin.
In einigen Ausführungsformen ist der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 37 in SEQ ID NR: 4–7 (X₈) eine Glutaminsäure oder eine Asparaginsäure, wie z.B. eine Glutaminsäure.
In bestimmten Ausführungsformen ist der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 51 in SEQ ID NR: 4–7 (X₁₄) ein Tyrosin oder ein Leucin, wie z.B. ein Tyrosin.
In einigen Ausführungsformen ist der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 44 in SEQ ID NR: 4–7 (X₁₂) ein Leucin oder ein Isoleucin. In spezifischen Ausführungsformen sind die Aminosäure-Reste an den Positionen 9 und 11 in SEQ ID NR: 7 Alanin bzw. Lysin/Glutaminsäure, während der Aminosäure-Rest an Position 44 Isoleucin ist. Gegebenenfalls kann der Aminosäure-Rest an Position 43 dann Alanin oder Glutaminsäure sein.
In einigen Ausführungsformen sind die Aminosäure-Reste an den Positionen entsprechend Positionen 1, 2, 3 und 4 oder Positionen 3, 4, 5 und 6 in SEQ ID NR: 4–7 deletiert worden. In spezifischen Varianten dieser Ausführungsformen ist das ursprüngliche Polypeptid die C-Domäne von Protein A (SEQ ID NR: 5). Die Wirkungen dieser Deletionen auf die native C-Domäne sind in US9018305 und US8329860 beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme in ihren Gesamtheiten aufgenommen werden.
In bestimmten Ausführungsformen ist die Mutation in SEQ ID NR: 4–7, wie z.B. in SEQ ID NR: 7, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
N11K; N11E; N11Y; N11T; N11F; N11L; N11W; N11I; N11M; N11V; N11A; N11H; N11R; N11E, Q32A; N11E, Q32E, Q40E; N11E, Q32E, K50R; Q9A, N11E, N43A; Q9A, N11E, N28A, N43A; Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I; Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I; N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y; Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I; Q9A, N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y; N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I; Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I; Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R; Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R; Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42K, N43A, L44I und Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42R, N43A, L44I.
Diese Mutationen stellen besonders hohe alkalische Stabilitäten bereit. Die Mutation in SEQ ID NR: 4–7, wie z.B. in SEQ ID NR: 7, kann auch aus der Gruppe ausgewählt werden, bestehend aus
N11K; N11Y; N11F; N11L; N11W; N11I; N11M; N11V; N11A; N11H; N11R; Q9A, N11E, N43A; Q9A, N11E, N28A, N43A; Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I; Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I; Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I; N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y; Q9A, N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y; N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I; Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I und Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R.
In einigen Ausführungsformen umfasst das Polypeptid eine, oder besteht im Wesentlichen aus einer, Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
SEQ ID NR 8, SEQ ID NR 9, SEQ ID NR 10, SEQ ID NR 11, SEQ ID NR 12, SEQ ID NR 13, SEQ ID NR 14, SEQ ID NR 15, SEQ ID NR 16, SEQ ID NR 23, SEQ ID NR 24, SEQ ID NR 25, SEQ ID NR 26, SEQ ID NR 27, SEQ ID NR 28, SEQ ID NR 29, SEQ ID NR 36, SEQ ID NR 37, SEQ ID NR 38, SEQ ID NR 39, SEQ ID NR 40, SEQ ID NR 41, SEQ ID NR 42, SEQ ID NR 43, SEQ ID NR 44, SEQ ID NR 45, SEQ ID NR 46, SEQ ID NR 47, SEQ ID NR 48, SEQ ID NR 49 und SEQ ID NR 50.
Es kann z.B. umfassen oder im Wesentlichen bestehen aus einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
SEQ ID NR 8, SEQ ID NR 9, SEQ ID NR 10, SEQ ID NR 11, SEQ ID NR 16, SEQ ID NR 23, SEQ ID NR 24, SEQ ID NR 25, SEQ ID NR 26, SEQ ID NR 27, SEQ ID NR 28 und SEQ ID NR 29.
Es kann auch umfassen oder im Wesentlichen bestehen aus einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
SEQ ID NR 8, SEQ ID NR 9, SEQ ID NR 10, SEQ ID NR 11, SEQ ID NR 16, SEQ ID NR 23, SEQ ID NR 24, SEQ ID NR 25, SEQ ID NR 27, SEQ ID NR 28, SEQ ID NR 38, SEQ ID NR 40; SEQ ID NR 41; SEQ ID NR 42; SEQ NO 43, SEQ ID NR 44, SEQ ID NR 45, SEQ ID NR 46, SEQ ID NR 47 und SEQ ID NR 48.
Das Polypeptid kann z.B. durch eine Sequenz definiert werden, die aus den oben genannten Gruppen oder aus Teilmengen dieser Gruppen ausgewählt ist, sie kann aber auch zusätzliche Aminosäure-Reste an dem N- und/oder C-terminalen Ende umfassen, z.B. eine „Leader“-Sequenz an dem N-terminalen Ende und/oder eine „Tail“-Sequenz an dem C-terminalen Ende. SEQ ID NR 8 Zvar(Q9A, N11E, N43A)
SEQ ID NR 9 Zvar(Q9A, N11E, N28A, N43A)
SEQ ID NR 10 Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I)
SEQ ID NR 11 Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)
SEQ ID NR 12 Zvar(N11E, Q32A)
SEQ ID NR 13 Zvar(N11E)
SEQ ID NR 14 Zvar(N11E, Q32E, Q40E)
SEQ ID NR 15 Zvar(N11E, Q32E, K50R)
SEQ ID NR 16 Zvar(N11K)
SEQ ID NR 23 Zvar(N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)
SEQ ID NR 24 Zvar(Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I)
SEQ ID NR 25 Zvar(Q9A, N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)
SEQ ID NR 26 Zvar(N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I)
SEQ ID NR 27 Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I)
SEQ ID NR 28 Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R)
SEQ ID NR 29 Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R)
SEQ ID NR 36 B(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)
SEQ ID NR 37 C(Q9A, N11E, E43A)
SEQ ID NR 38 Zvar(N11Y)
SEQ ID NR 39 Zvar(N11T)
SEQ ID NR 40 Zvar(N11F)
SEQ ID NR 41 Zvar(N11L)
SEQ ID NR 42 Zvar(N11W)
SEQ ID NR 43 Zvar(N11I)
SEQ ID NR 44 Zvar(N11M)
SEQ ID NR 45 Zvar(N11V)
SEQ ID NR 46 Zvar(N11A)
SEQ ID NR 47 Zvar(N11H)
SEQ ID NR 48 Zvar(N11R)
SEQ ID NR 49 Zvar(Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42K, N43A, L44I)
SEQ ID NR 50 Zvar(Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42R, N43A, L44I)
In einem zweiten Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung ein Multimer umfassend, oder im Wesentlichen bestehend aus einer, Vielzahl von wie durch eine der oben offenbarten Ausführungsform definierten Polypeptideinheiten. Das Multimer kann z.B. ein Dimer, ein Trimer, ein Tetramer, ein Pentamer, ein Hexamer, ein Heptamer, ein Octamer oder ein Nonamer sein. Es kann ein Homomultimer sein, bei dem alle Einheiten im Multimer identisch sind oder es kann ein Heteromultimer sein, bei dem sich zumindest eine Einheit von den anderen unterscheidet. Vorteilhafterweise sind alle Einheiten im Multimer alkalistabil, wie z. B. durch Umfassen der oben offenbarten Mutationen. Die Polypeptide können durch Peptidbindungen zwischen den C-terminalen und N-terminalen Enden der Polypeptide direkt miteinander verbunden sein. Alternativ können zwei oder mehr Einheiten im dem Multimer durch oligomere oder polymere Spezies umfassende Linker verbunden sein, wie z.B. bis zu 15 oder 30 Aminosäuren umfassende Elemente, wie z.B. 1–5, 1–10 oder 5–10 Aminosäuren. Dies ist insbesondere der Fall für Mutationen der SEQ ID NR 51 und 52 und für das SEQ ID NR 53-Polypeptid, bei denen spezifische Beispiele für Linker z.B. VDAKFD oder ADNKFN sein können, wie z.B. VDAKFD. Die Natur eines solchen Linkers sollte vorzugsweise die räumliche Konformation der Proteineinheiten nicht destabilisieren. Dies kann z.B. erreicht werden durch Vermeiden der Anwesenheit von Prolin in den Linkern. Weiterhin sollte der Linker vorzugsweise auch in alkalischen Umgebungen ausreichend stabil sein, um die Eigenschaften der mutierten Proteineinheiten nicht zu beeinträchtigen. Für diesen Zweck ist es vorteilhaft, wenn die Linker kein Asparagin enthalten. Es kann zusätzlich vorteilhaft sein, wenn die Linker kein Glutamin enthalten. Das Multimer kann ferner am N-terminalen Ende eine Vielzahl von Aminosäure-Resten umfassen, die z.B. aus dem Klonierungsverfahren stammen oder einen Rest aus einer abgespaltenen Signalsequenz („signaling sequence“) bilden. Die Anzahl zusätzlicher Aminosäure-Reste kann z.B. 15 oder weniger sein, wie z.B. 10 oder weniger oder 5 oder weniger. Als ein spezifisches Beispiel kann das Multimer eine AQ-Sequenz am N-terminalen Ende umfassen.
In bestimmten Ausführungsformen kann das Multimer umfassen oder im Wesentlichen bestehen aus einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NR 17, SEQ ID NR 18, SEQ ID NR 19, SEQ ID NR 20, SEQ ID NR 30, SEQ ID NR 31, SEQ ID NR 32, SEQ ID NR 33, SEQ ID NR 34 und SEQ ID NR: 35. Diese Sequenzen sind unten aufgeführt und als „Eltern(Mutationen)n“ bezeichnet, wobei n die Anzahl der Monomereinheiten in einem Multimer ist. SEQ ID NR 17 Zvar(Q9A, N11E, N43A)4
SEQ ID NR 18 Zvar(Q9A, N11E, N28A, N43A)4
SEQ ID NR 19 Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I)4
SEQ ID NR 20 Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4
SEQ ID NR 30 Zvar(N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)4
SEQ ID NR 31 Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R)4
SEQ ID NR 32 Zvar(Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I)4
SEQ ID NR 33 Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)6
SEQ ID NR 34 Zvar(Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4
SEQ ID NR 35 Zvar(Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42R, N43A, L44I)4
In einigen Ausführungsformen umfasst das wie oben offenbarte Polypeptid und/oder Multimer ferner an dem C-terminalen oder N-terminalen Ende eines oder mehrere Kupplungselemente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem oder mehreren Cystein-Resten, einer Vielzahl von Lysin-Resten und einer Vielzahl von Histidin-Resten. Das (die) Kupplungselement(e) kann (können) auch innerhalb von 1–5 Aminosäure-Resten lokalisiert sein, wie z.B. innerhalb von 1–3 oder 1–2 Aminosäure-Resten von dem C-terminalen oder N-terminalen Ende. Das Kupplungselement kann z.B. ein einziges Cystein am C-terminalen Ende sein. Das (die) Kupplungselement(e) kann (können) direkt mit dem C- oder N-terminalen Ende verbunden sein, oder es (sie) kann (können) über einen bis zu 15 Aminosäuren umfassenden Abschnitt verbunden sein, wie z.B. 1–5, 1–10 oder 5–10 Aminosäuren. Dieser Abschnitt sollte vorzugsweise auch ausreichend stabil in alkalischen Umgebungen sein, um die Eigenschaften des mutierten Proteins nicht zu beeinträchtigen. Für diesen Zweck ist es vorteilhaft, wenn der Abschnitt kein Asparagin enthält. Es kann zusätzlich vorteilhaft sein, wenn der Abschnitt kein Glutamin enthält. Ein Vorteil eines C-terminalen Cysteins ist, dass Endpunktkupplung des Proteins durch Reaktion des Cystein-Thiols mit einer elektrophilen Gruppe auf einem Träger erreicht werden kann. Dies stellt eine ausgezeichnete Beweglichkeit des gekuppelten Proteins bereit, was für die Bindungskapazität wichtig ist.
Die Alkalistabilität des Polypeptids oder Multimers kann durch Kupplung an einen SPR-Chip untersucht werden, z.B. an wie in den Beispielen beschrieben Biacore CM5-Sensorchips, unter Verwendung von z.B. NHS- oder Maleimid-Kupplungs-Chemie und Messen der Immunglobulin-Bindungskapazität des Chips, typischerweise unter Verwendung von polyklonalem humanen IgG, vor und nach der Inkubation in alkalischen Lösungen bei einer bestimmten Temperatur, z.B. 22 +/– 2 °C. Die Inkubation kann z.B. in 0,5 M NaOH für mehrere 10 min-Zyklen durchgeführt werden, wie z.B. 100, 200 oder 300 Zyklen. Die IgG-Kapazität der Matrix nach 100 10 min-Inkubationszyklen in 0,5 M NaOH bei 22 +/– 2 °C kann zumindest 55, wie z.B. zumindest 60, zumindest 80 oder zumindest 90% der IgG-Kapazität vor der Inkubation, sein. Alternativ kann die wie oben gemessene, für eine bestimmte Mutante nach 100 Zyklen verbliebene IgG-Kapazität mit der verbliebenen IgG-Kapazität für das ursprüngliche Polypeptid/Multimer verglichen werden. In diesem Fall kann die verbliebene IgG-Kapazität für die Mutante zumindest 105%, wie z.B. zumindest 110%, zumindest 125%, zumindest 150% oder zumindest 200% des ursprünglichen Polypeptids/Multimers, betragen.
In einem dritten Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure, die ein Polypeptid oder Multimer gemäß einer der oben offenbarten Ausführungsform kodiert. Daher umfasst die Erfindung alle Formen der vorliegenden Nukleinsäuresequenz, wie z.B. die RNA und die DNA, die für das Polypeptid oder Multimer kodiert. Die Erfindung umfasst einen Vektor, wie z.B. ein Plasmid, das neben der kodierenden Sequenz die erforderlichen Signalsequenzen für die Expression des Polypeptids oder Multimers gemäß der Erfindung umfasst. In einer Ausführungsform umfasst der Vektor für ein Multimer gemäß der Erfindung kodierende Nukleinsäure, wobei die für jede Einheit kodierenden separaten Nukleinsäuren homologe oder heterologe DNA-Sequenzen haben können.
In einem vierten Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung ein Expressionssystem, das eine wie oben offenbarte Nukleinsäure oder Vektor umfasst. Das Expressionssystem kann z.B. ein gram-positives oder gram-negatives prokaryotisches Wirtszellsystem sein, z.B. E. coli oder Bacillus sp., das modifiziert worden ist, um das vorliegende Polypeptid oder Multimer zu exprimieren. In einer alternativen Ausführungsform ist das Expressionssystem ein eukaryotisches Wirtszellsystem, wie z.B. eine Hefe, z.B. Pichia pastoris oder Saccharomyces cerevisiae, oder Säugetierzellen, z.B. CHO-Zellen.
In einem fünften Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung eine Trennmatrix, wobei eine Vielzahl von Polypeptiden oder Multimeren gemäß einer der oben offenbarten Ausführungsform an einen festen Träger gekuppelt worden sind. Eine solche Matrix ist nützlich zur Trennung von Immunglobulinen oder anderen Fc-enthaltenden Proteinen und die Matrix wird, aufgrund der verbesserten Alkalistabilität der Polypeptide/Multimere, bei der Reinigung stark alkalischen Bedingungen standhalten, was für eine langzeitig wiederholte Verwendung im Rahmen einer Bioprozessentrennung essentiell ist. Die Alkalistabilität der Matrix kann durch Messen der Immunglobulin-Bindungskapazität, typischerweise unter Verwendung von polyklonalem humanem IgG, vor und nach Inkubation in alkalischen Lösungen bei einer bestimmten Temperatur, z.B. 22 +/– 2 °C, untersucht werden. Die Inkubation kann z.B. in 0,5 M oder 1,0 M NaOH für mehrere 15 min-Zyklen durchgeführt werden, wie z.B. 100, 200 oder 300 Zyklen, entsprechend einer Gesamtinkubationszeit von 25, 50 oder 75 h. Die IgG-Kapazität der Matrix nach 96–100 15 min-Inkubationszyklen oder einer Gesamtinkubationszeit von 24 oder 25 h in 0,5 M NaOH bei 22 +/– 2 °C kann zumindest 80, wie z.B. zumindest 85, zumindest 90 oder zumindest 95% der IgG-Kapazität vor der Inkubation, betragen. Die Kapazität der Matrix nach einer Gesamtinkubationszeit von 24 h in 1,0 M NaOH bei 22 +/– 2 °C kann zumindest 70, wie z.B. zumindest 80 oder zumindest 90% der IgG-Kapazität vor der Inkubation, betragen.
Wie der Fachmann verstehen wird, sollte das exprimierte Polypeptid oder Multimer in einem geeigneten Ausmaß gereinigt werden, bevor es an einem Träger immobilisiert wird. Solche Reinigungsverfahren sind in dem Gebiet gut bekannt und die Immobilisierung von Protein-basierten Liganden an Trägern wird leicht unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt. Geeignete Verfahren und Träger werden unten ausführlicher erläutert.
Der feste Träger der erfindungsgemäßen Matrix kann von jeder geeigneten gut bekannten Art sein. Eine konventionelle Affinitätstrennungsmatrix ist oft von organischer Natur und auf Polymeren basiert, die dem verwendeten wässrigen Medium eine hydrophile Oberfläche exponieren, d.h. sie exponieren Hydroxy-(-OH), Carboxy-(-COOH), Carboxamido-(-CONH₂, möglicherweise in N-substituierten Formen), Amino-(-NH₂, möglicherweise in substituierter Form), Oligo- oder Polyethylenoxy-Gruppen auf ihren externen und, falls vorhanden, auch auf inneren Oberflächen. Der feste Träger kann geeigneterweise porös sein. Die Porosität kann als ein Kav- oder Kd-Wert ausgedrückt werden (der Anteil des Porenvolumens, der für ein Sondenmolekül einer bestimmten Größe verfügbar ist), gemessen durch inverse Größenausschlußchromatographie, z.B. gemäß den Verfahren beschrieben in „Gel Filtration Principles and Methods“, Pharmacia LKB Biotechnology 1991, S. 6–13. Definitionsgemäß liegen sowohl Kd- als auch Kav-Werte immer im Bereich von 0– 1. Der Kav-Wert kann vorteilhafterweise 0,6–0,95 betragen, z.B. 0,7–0,90 oder 0,6–0,8, gemessen mit Dextran mit Mw 110 kDa als ein Sondenmolekül. Ein Vorteil davon ist, dass der Träger einen großen Anteil an Poren hat, die in der Lage sind sowohl die Polypeptide/Multimere der Erfindung als auch die Immunglobuline, die an die Polypeptide/Multimere binden, aufzunehmen und Massentransport der Immunglobuline zu und von den Bindungsstellen bereitzustellen.
Die Polypeptide oder Multimere können an den Träger über konventionelle Kupplungstechniken unter Verwendung von in dem Liganden vorhandenen z.B. Thiol-, Amino- und/oder Carboxy-Gruppen verbunden werden. Bisepoxide, Epichlorhydrin, CNBr, N-Hydroxysuccinimid (NHS) etc. sind gut bekannte Kupplungsreagenzien. Zwischen dem Träger und dem Polypeptid/Multimer kann ein als Spacer bekanntes Molekül eingeführt werden, das die Verfügbarkeit des Polypeptids/Multimers verbessert und die chemische Kupplung des Polypeptids/Multimers an den Träger erleichtert. Abhängig von der Natur des Polypeptids/Multimers und der Kupplungsbedingungen kann die Kupplung eine Mehrpunktkupplung (z.B. über eine Vielzahl von Lysinen) oder eine Einzelpunktkupplung (z.B. über ein einziges Cystein) sein. Alternativ kann das Polypeptid/Multimer an den Träger durch nicht-kovalente Bindung, wie z.B. physikalische Adsorption oder biospezifische Adsorption, verbunden sein.
In einigen Ausführungsformen umfasst die Matrix 5–25, wie z.B. 5–20 mg/ml, 5–15 mg/ml, 5–11 mg/ml oder 6–11 mg/ml des an den Träger gekuppelten Polypeptids oder Multimers. Die Menge des gekuppelten Polypeptids/Multimers kann durch die Konzentration des im Kupplungsverfahren verwendeten Polypeptids/Multimers, durch die verwendeten Aktivierungs- und Kupplungsbedingungen und/oder durch die Porenstruktur des verwendeten Trägers kontrolliert werden. Als eine allgemeine Regel steigt die absolute Bindungskapazität der Matrix mit der Menge des gekuppelten Polypeptids/Multimers an, zumindest bis zu einem Punkt, an dem die Poren durch das gekuppelte Polypeptid/Multimer signifikant verengt werden. Die relative Bindungskapazität pro mg gekuppeltem Polypeptid/Multimer wird bei hohen Kupplungsniveaus abnehmen, was zu einem Kosten-Nutzen-Optimum innerhalb der oben angegebenen Bereiche führt.
In bestimmten Ausführungsformen werden die Polypeptide oder Multimere über Thioether-Bindungen an den Träger gekuppelt. Verfahren zur Durchführung einer solchen Kupplung sind in diesem Gebiet gut bekannt und werden von dem Fachmann in diesem Gebiet unter Verwendung von Standardtechniken und -ausrüstung leicht durchgeführt. Thioether-Bindungen sind flexibel und stabil und eignen sich generell für die Verwendung bei der Affinitätschromatographie. Insbesondere wenn die Thioether-Bindung über einen terminalen oder nahezu terminalen Cystein-Rest an dem Polypeptid oder Multimer vorliegt, ist die Mobilität des gekuppelten Polypeptids/Multimers gesteigert, was eine verbesserte Bindungskapazität und Bindungskinetik bereitstellt. In einigen Ausführungsformen ist das Polypeptid/Multimer über ein an einem wie oben beschriebenen Protein bereitgestelltes C-terminales Cystein gekuppelt. Dies ermöglicht eine effiziente Kupplung des Cysteinthiols an elektrophile Gruppen, z.B. Epoxid-Gruppen, Halogenhydrin-Gruppen etc. auf einem Träger, was in einer Thioether-Brückenkupplung resultiert.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Träger ein Polyhydroxypolymer, wie z.B. ein Polysaccharid. Beispiele für Polysaccharide schließen z.B. Dextran, Stärke, Cellulose, Pullulan, Agar, Agarose etc. ein. Polysaccharide sind inhärent hydrophil, mit geringen Graden an nicht-spezifischen Wechselwirkungen, sie stellen einen hohen Gehalt an reaktiven (aktivierbaren) Hydroxyl-Gruppen bereit und sind generell gegenüber alkalischen, bei der Bioprozessierung verwendeten Reinigungslösungen stabil.
In einigen Ausführungsformen umfasst der Träger Agar oder Agarose. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Träger können leicht gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wie z.B. die inverse Suspensionsgelierung (S Hjertén: Biochim Biophys Acta 79(2), 393–398 (1964)). Alternativ sind die Basismatrizen kommerziell erhältliche Produkte, wie z.B. unter dem Namen SEPHAROSE^TM FF (GE Healthcare) vertriebe, vernetzte Agaroseperlen. In einer Ausführungsform, die für Trennungen in großem Maßstab besonders vorteilhaft ist, ist der Träger zur Erhöhung seiner Steifigkeit unter Verwendung der in US6602990 oder US7396467 beschriebenen Verfahren, die hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden, angepasst worden, welcher somit die Matrix für hohe Flussraten besser geeignet macht.
In bestimmten Ausführungsformen ist der Träger, wie z.B. ein Polysaccharid- oder Agarose-Träger, vernetzt, wie z. B. mit Hydroxyalkylether-Vernetzungen. Vernetzungsreagenzien, die solche Vernetzungen erzeugen, können z.B. Epihalogenhydrine wie Epichlorhydrin, Diepoxide wie Butandioldiglycidylether, Allylierungsreagenzien wie Allylhalogenide oder Allylglycidylether sein. Vernetzung ist für die Steifigkeit des Trägers vorteilhaft und verbessert die chemische Stabilität. Hydroxyalkylether-Vernetzungen sind alkalistabil und verursachen keine signifikante nicht-spezifische Adsorption.
Alternativ basiert der feste Träger auf synthetischen Polymeren, wie z.B. Polyvinylalkohol, Polyhydroxyalkylacrylaten, Polyhydroxyalkylmethacrylaten, Polyacrylamiden, Polymethacrylamiden etc. Im Fall von hydrophoben Polymeren, wie z.B. auf Divinyl- und Monovinyl-substituierten Benzenen basierenden Matrizen, wird die Oberfläche der Matrix oft hydrophilisiert, um wie oben definierte, hydrophile Gruppen einer umgebenden wässrigen Flüssigkeit zu exponieren. Solche Polymere werden leicht gemäß Standardverfahren hergestellt, siehe z.B. „Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization“ (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70–75 (1988)). Alternativ wird ein kommerziell erhältliches Produkt, wie z.B. SOURCE^TM (GE Healthcare), verwendet. In einer anderen Alternative umfasst der feste Träger gemäß der Erfindung einen Träger anorganischer Natur, z.B. Kieselsäure, Zirkonoxid etc.
In noch einer anderen Ausführungsform ist der feste Träger in einer anderen Form, wie z.B. einer Oberfläche, einem Chip, Kapillaren oder einem Filter (z.B. einer Membran oder einer Tiefenfilter-Matrix). Was die Form der Matrix gemäß der Erfindung betrifft, so ist in einer Ausführungsform die Matrix in Form eines porösen Monolithen. In einer alternativen Ausführungsform ist die Matrix in Perlen- oder Partikelform, die porös oder nicht porös sein kann. Matrizen in Perlen- oder Partikelform können als gepacktes Bett („packed bed“) oder in suspendierter Form verwendet werden. Suspendierte Formen schließen jene ein, die als expandiertes Bett („expanded bed“) bekannt sind und reine Suspensionen, in welchen sich die Partikel oder Perlen frei bewegen können. Im Fall von Monolithen, gepacktem Bett und expandierten Betten folgt das Trennverfahren allgemein der konventionellen Chromatographie mit einem Konzentrationsgradienten. Im Fall einer reinen Suspension wird der chargenweise Modus verwendet.
In einem sechsten Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isolierung eines Immunglobulins, wobei eine wie oben offenbarte Trennmatrix verwendet wird.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Verfahren die Schritte:

a) Inkontaktbringen einer flüssigen Probe, umfassend ein Immunglobulin, mit einer Trennmatrix, wie oben offenbart,
b) Waschen der Trennmatrix mit einer Waschflüssigkeit,
c) Eluieren des Immunglobulins aus der Trennmatrix mit einer Elutionsflüssigkeit und
d) Reinigen der Trennmatrix mit einer Reinigungsflüssigkeit, die alternativ als als eine „cleaning-in-place“(CIP)-Flüssigkeit bezeichnet werden kann, z.B. mit einer Kontaktzeit (Inkubation) von zumindest 10 min.

Das Verfahren kann auch folgende Schritte umfassen, vor Schritt a), Bereitstellen einer Affinitätstrennungsmatrix gemäß einer der oben beschriebenen Ausführungsformen und Bereitstellen einer Lösung, die ein Immunglobulin und zumindest eine andere Substanz als flüssige Probe umfasst und, nach Schritt c), Gewinnung des Eluats und gegebenenfalls Aussetzen des Eluats gegenüber weiteren Trennschritten, z.B. Anionen- oder Kationen-Austauschchromatographie, multimodale Chromatographie und/oder hydrophobe Interaktionschromatographie. Geeignete Zusammensetzungen der flüssigen Probe, der Waschflüssigkeit und der Elutionsflüssigkeit sowie die allgemeinen Bedingungen für die Durchführung der Trennung sind in dem Gebiet der Affinitätschromatographie und insbesondere in dem Gebiet der Protein A-Chromatographie gut bekannt. Die flüssige Probe, die ein Fc-enthaltendes Protein und zumindest eine andere Substanz umfasst, kann Wirtszellproteine („host cell proteins“, HCP), wie z.B. CHO-Zell-, E. coli- oder Hefe-Proteine, umfassen. Der Gehalt an CHO-Zell- und E. coli-Proteinen kann komfortabel durch gegen diese Proteine gerichtete Immunoassays bestimmt werden, z.B. CHO-HCP- oder E. coli-HCP-ELISA-Kits von Cygnus Technologies. Die Wirtszellproteine oder CHO-Zell-/E. coli-Proteine können während Schritt b) desorbiert werden.
Die Elution kann unter Verwendung von jeder geeigneten, für die Elution von Protein A-Medien verwendeten Lösung durchgeführt werden. Dies kann z.B. eine Lösung oder ein Puffer mit pH 5 oder niedriger, wie z.B. pH 2,5–5 oder 3–5 sein. Es kann auch in einigen Fällen eine Lösung oder Puffer mit pH 11 oder höher sein, wie z.B. pH 11–14 oder pH 11– 13. In einigen Ausführungsformen umfasst der Elutionspuffer oder der Elutionspuffergradient zumindest eine mono-, di- oder trifunktionelle Carbonsäure oder Salz einer solchen Carbonsäure. In bestimmten Ausführungsformen umfasst der Elutionspuffer oder der Elutionspuffergradient zumindest eine Anionenspezies, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acetat, Citrat, Glycin, Succinat, Phosphat und Formiat.
In einigen Ausführungsformen ist die Reinigungsflüssigkeit alkalisch, wie z.B. mit einem pH von 13–14. Solche Lösungen stellen eine effiziente Reinigung der Matrix bereit, insbesondere am oberen Ende des Intervalls.
In bestimmten Ausführungsformen umfasst die Reinigungsflüssigkeit 0,1–2,0 M NaOH oder KOH, wie z.B. 0,5–2,0 oder 0,5–1,0 M NaOH oder KOH. Dies sind effiziente Reinigungslösungen, insbesondere dann, wenn die NaOH- oder KOH-Konzentration über 0,1 M oder zumindest 0,5 M liegt. Die hohe Stabilität der Polypeptide der Erfindung ermöglicht die Verwendung solcher stark alkalischer Lösungen.
Das Verfahren kann auch einen Schritt des Desinfizierens der Matrix mit einer Desinfektionsflüssigkeit einschließen, die z.B. ein Peroxid, wie z.B. Wasserstoffperoxid und/oder eine Persäure, wie z.B. Peressigsäure oder Perameisensäure, umfassen kann.
In einigen Ausführungsformen werden Schritte a)–d) zumindest 10 Mal wiederholt, wie z.B. zumindest 50 Mal, 50–200, 50–300 oder 50–500 Mal. Dies ist für die Prozessökonomie wichtig, insofern als die Matrix vielfach wiederverwendet werden kann.
Die Schritte a)–c) können auch zumindest 10 Mal wiederholt werden, wie z.B. zumindest 50 mal, 50–200, 50–300 oder 50–500 Mal, wobei Schritt d) nach einer Vielzahl von Vorgängen von Schritt c) durchgeführt wird, derart dass Schritt d) zumindest 10 Mal durchgeführt wird, wie z.B. zumindest 50 Mal. Schritt d) kann z.B. jeden zweiten bis zwanzigsten Vorgang des Schrittes c) durchgeführt werden.
Beispiele
Mutagenese von Protein
Die ortsgerichtete Mutagenese („site-directed mutagenesis“) wurde durch eine zweistufige PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden durchgeführt, die für die Mutationen kodieren. Als Matrize („template“) wurde ein Plasmid verwendet, das eine einzelne Domäne von entweder Z, B oder C enthielt. Die PCR-Fragmente wurden in einen E. coli-Expressionsvektor ligiert. DNA-Sequenzierung wurde verwendet, um die korrekte Sequenz von insertierten Fragmenten zu verifizieren. Zur Bildung von Multimeren von Mutanten wurde eine in den Startcodons (GTA GAC) der B-, C- oder Z-Domäne lokalisierte, den Aminosäuren VD entsprechende Acc I-Stelle verwendet. Der Vektor für die monomere Domäne wurde mit Acc I verdaut und mit Phosphatase behandelt. Acc I-Primer mit klebrigen Enden („sticky ends“) wurden konstruiert, spezifisch für jede Variante, und zwei überlappende PCR-Produkte wurden von jeder Matrize generiert.
Die PCR-Produkte wurden gereinigt und die Konzentration wurde durch Vergleich der PCR-Produkte auf einem 2%-Agarosegel abgeschätzt. Gleiche Mengen der paarweisen PCR-Produkte wurden in Ligationspuffer hybridisiert (90 °C -> 25 °C in 45 min). Das resultierende Produkt besteht zu etwa 1/4 aus Fragmenten, die in eine Acc I-Stelle ligiert werden können (korrekte PCR-Fragmente und/oder der verdaute Vektor). Nach der Ligation und Transformation wurden Kolonien einem PCR-Screening unterzogen, um Konstrukte zu identifizieren, die die gewünschte Mutante enthalten. Positive Klone wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
Konstrukt-Expression und -Reinigung
Die Konstrukte wurden im Bakterienperiplasma durch Fermentation von E. coli K12 in Standardmedien exprimiert. Nach der Fermentation wurden die Zellen wärmebehandelt, um den Periplasma-Inhalt in die Medien freizusetzen. Die in das Medium freigesetzten Konstrukte wurden durch Mikrofiltration mit einer Membran mit einer Porengröße von 0,2 µm gewonnen.
Jedes Konstrukt, jetzt im Permeat aus dem Filtrationsschritt, wurde mittels Affinität gereinigt. Das Permeat wurde auf ein Chromatographiemedium geladen, das immobilisiertes IgG (IgG Sepharose 6FF, GE Healthcare) enthielt. Das beladene Produkt wurde mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und durch Absenken des pH eluiert. Der Elutionspool wurde auf einen neutralen pH (pH 8) eingestellt und durch Zugabe von Dithiothreitol reduziert. Die Probe wurde dann auf einen Anionenaustauscher geladen. Nach einem Waschschritt wurde das Konstrukt in einem NaCl-Gradienten eluiert, um es von jeglichen Verunreinigungen zu trennen. Der Elutionspool wurde durch Ultrafiltration auf 40– 50 mg/ml konzentriert. Es ist festzuhalten, dass die erfolgreiche Affinitätsreinigung eines Konstrukts an einem immobilisierten IgG-Medium anzeigt, dass das fragliche Konstrukt eine hohe Affinität zu IgG aufweist. Die gereinigten Liganden wurden mit RPC LC-MS analysiert, um die Reinheit zu bestimmen und festzustellen, dass das Molekulargewicht dem erwarteten (basierend auf der Aminosäuresequenz) entsprach.
Beispiel 1

Die in Tabelle 1 aufgeführten, gereinigten, monomeren Liganden, die ferner eine AQGT-Leader-Sequenz am N-Terminus und ein Cystein am C-Terminus umfassen, wurden auf Biacore CM5-Sensorchips (GE Healthcare, Schweden) unter Verwendung des Amin-Kupplungskits von GE Healthcare (zur Carbodiimid-Kupplung von Aminen an den Carboxymethyl-Gruppen auf dem Chip) immobilisiert, in einer Menge ausreichend, um eine Signalstärke von etwa 200–1500 RU in einem Biacore-Oberflächenplasmonresonanz(SPR)-Instrument (GE Healthcare, Schweden) zu ergeben. Um die IgG-Bindungskapazität der immobilisierten Oberfläche zu verfolgen, wurden 1 mg/ml menschliches polyklonales IgG (Gammanorm) über den Chip fließen gelassen und wurde die Signalstärke (proportional zu dem Betrag des Bindens) festgestellt. Die Oberfläche wurde dann „cleaning-in-place“(CIP)-gereinigt, d.h. mit 500 mM NaOH für 10 Minuten bei Raumtemperatur (22 +/– 2 °C) gespült. Dies wurde für 96–100 Zyklen wiederholt und die Alkalistabilität des immobilisierten Liganden als die verbliebene IgG-Bindungskapazität (Signalstärke) nach jedem Zyklus verfolgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt und zeigen, dass zumindest die Liganden Zvar(N11K)1, Zvar(N11E)1, Zvar(N11Y)1, Zvar(N11T)1, Zvar(N11F)1, Zvar(N11L)1, Zvar(N11W)1, ZN11I)1, Zvar(N11M)1, Zvar(N11V)1, Zvar(N11A)1, Zvar(N11H1), Zvar(N11R)1, Zvar(N11E, Q32A)1, Zvar(N11E, Q32E, Q40E)1 und Zvar(N11E, Q32E, K50R)1, Zvar(Q9A, N11E, N43A)1, Zvar(Q9A, N11E, N28A, N43A)1, Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I)1, Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)1, Zvar(Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I)1, Zvar(N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)1, Zvar(Q9A, N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)1, Zvar(N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I)1, Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I)1 und Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R)1 eine verbesserte Alkalistabilität im Vergleich zur der als Referenz verwendeten, ursprünglichen Struktur Zvar1 haben. Ferner haben die Liganden B(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)1 und C(Q9A, N11E, E43A)1 verbesserte Stabilität im Vergleich zu den als Referenzen verwendeten, ursprünglichen B- und C-Domänen. Tabelle 1. Monomere Liganden, ausgewertet durch Biacore (0,5 M NaOH).

Ligand	Sequenz	Kapazität nach 96–100 Zyklen	Referenz-Kapazität nach 96–100 Zyklen	Kapazität relativ zur Referenz
Zvar(N11E, Q32A)1	SEQ ID NR 12	57%	55%	1,036
Zvar(N11E)1	SEQ ID NR 13	59%	55%	1,073
Zvar(N11E, Q32E, Q40E)1	SEQ ID NR 14	52%	51%	1,020
Zvar(N11E, Q32E, K50R)1	SEQ ID NR 15	53%	51%	1,039
Zvar(N11K)1	SEQ ID NR 16	62%	49%	1,270
Zvar(N11Y)1	SEQ ID NR 38	55%	46%	1,20
Zvar(N11T)1	SEQ ID NR 39	50%	46%	1,09
Zvar(N11F)1	SEQ ID NR 40	55%	46%	1,20
Zvar(N11L)1	SEQ ID NR 41	57%	47%	1,21
Zvar(N11W)1	SEQ ID NR 42	57%	47%	1,21
Zvar(N11I)1	SEQ ID NR 43	57%	47%	1,21
Zvar(N11M)1	SEQ ID NR 44	58%	46%	1,26
Zvar(N11V)1	SEQ ID NR 45	56%	46%	1,22
Zvar(N11A)1	SEQ ID NR 46	58%	46%	1,26
Zvar(N11H)1	SEQ ID NR 47	57%	46%	1,24
Zvar(N11R)1	SEQ ID NR 48	59%	46%	1,28
Zvar(Q9A, N11E, N43A)1	SEQ ID NR 8	70%	47%	1,49
Zvar(Q9A, N11E, N28A, N43A)1	SEQ ID NR 9	68%	47%	1,45
Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I)1	SEQ ID NR 10	67%	47%	1,43
Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)1	SEQ ID NR 11	66%	47%	1,40
Zvar(Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I)1	SEQ ID NR 24	65%	48%	1,35
Zvar(N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)1	SEQ ID NR 23	67%	46%	1,46
Zvar(Q9A, N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)1	SEQ ID NR 25	59%	46%	1,28
Zvar(N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I)1	SEQ ID NR 26	59%	45%	1,31
Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I)1	SEQ ID NR 27	63%	45%	1,40
Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R)1	SEQ ID NR 28	67%	45%	1,49
B(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)1	SEQ ID NR 36	39%	35%	1,11
C(Q9A, N11E, E43A)1	SEQ ID NR 37	60%	49%	1,22

Beispiel 2

Die in Tabelle 2 aufgeführten, gereinigten, tetrameren und hexameren Liganden wurden auf Biacore CM5-Sensorchips (GE Healthcare, Schweden) unter Verwendung des Amin-Kupplungskits von GE Healthcare (zur Carbodiimid-Kupplung von Aminen an den Carboxymethylgruppen auf dem Chip) immobilisiert, in einer Menge ausreichend, um eine Signalstärke von etwa 200–1500 RU in einem Biacore-Instrument (GE Healthcare, Schweden) zu ergeben. Um die IgG-Bindungskapazität der immobilisierten Oberfläche zu verfolgen, wurden 1 mg/ml menschliches, polyklonales IgG (Gammanorm) über den Chip fließen gelassen und wurde die Signalstärke (proportional zu dem Betrag des Bindens) festgestellt. Die Oberfläche wurde dann „cleaning-in-place“(CIP)-gereinigt, d.h. mit 500 mM NaOH für 10 Minuten bei Raumtemperatur (22 +/– 2 °C) gespült. Dies wurde für 300 Zyklen wiederholt und die Alkalistabilität des immobilisierten Liganden als die verbliebene IgG-Bindungskapazität (Signalstärke) nach jedem Zyklus verfolgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und gezeigt und zeigen, dass zumindest die Liganden Zvar(Q9A, N11E, N43A)4, Zvar(Q9A, N11E, N28A, N43A)4, Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I)4 und Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4, Zvar(Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4 und Zvar(Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42R, N43A, L44I)4 verbesserte Alkalistabilität im Vergleich zur der als Referenz verwendeten, ursprünglichen Struktur Zvar4 haben. Der hexamere Ligand Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)6 hat auch verbesserte Alkalistabilität gegenüber der als Referenz verwendeten, ursprünglichen Struktur Zvar6. Tabelle 2. Tetramere und hexamere Liganden, ausgewertet durch Biacore (0,5 M NaOH).

Ligand	SEQ ID NR:	Verbliebene Kapazität 100 Zyklen (%)	Kapazität relativ zu Ref. 100 Zyklen	Verbliebene Kapazität 200 Zyklen (%)	Kapazität relativ zu Ref. 200 Zyklen	Verbliebene Kapazität 300 Zyklen (%)	Kapazität relativ zu Ref. 300 Zyklen
Zvar4	21	67	1	36	1	16	1
Zvar(Q9A, N11E, N43A)4	17	81	1,21	62	1,72	41	2,56
Zvar(Q9A, N11E, N28A, N43A)4	18	80	1,19	62	1,72	42	2,62
Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I)4	19	84	1,25	65	1,81	48	3,00
Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4	20	90	1,34	74	2,06	57	3,56
Zvar(Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I)4	32	84	1,24	Nicht getestet	Nicht getestet	Nicht getestet	Nicht getestet
Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)6	33	87	1,30	Nicht getestet	Nicht getestet	Nicht getestet	Nicht getestet
Zvar(Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4	34	81	1,13	Nicht getestet	Nicht getestet	Nicht getestet	Nicht getestet
Zvar(Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42R, N43A, L44I)4	35	84	1,17	Nicht getestet	Nicht getestet	Nicht getestet	Nicht getestet

Beispiel 3

Beispiel 2 wurde mit 100 CIP-Zyklen von drei Liganden unter Verwendung von 1 M NaOH anstelle von 500 mM, wie in Beispiel 2, wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt und zeigen, dass alle drei Liganden eine verbesserte Alkalistabilität auch in 1 M NaOH verglichen mit der als Referenz verwendeten, ursprünglichen Struktur Zvar4 haben. Tabelle 3. Tetramere Liganden, ausgewertet durch Biacore (1M NaOH).

Ligand	Sequenz	Verbliebene Kapazität 100 Zyklen (%)	Kapazität relativ zu Ref. 100 Zyklen
Zvar4	SEQ ID NR 21	27	1
Zvar(Q9A, N11E, N28A, N43A)4	SEQ ID NR 18	55	2,04
Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I)4	SEQ ID NR 19	54	2,00
Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4	SEQ ID NR 20	56	2,07

Beispiel 4

Die gereinigten, tetrameren Liganden der Tabelle 2 (alle mit einem zusätzlichen N-terminalen Cystein) wurden auf Agaroseperlen unter Verwendung der unten beschriebenen Verfahren immobilisiert und auf Kapazität und Stabilität untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 und gezeigt. Tabelle 4 Matrizen mit tetramere Liganden, ausgewertet in Säulen (0,5 M NaOH).

Ligand	SEQ ID NR.	Liganden-gehalt (mg/ml)	Initiale IgG-Kapazität Qb10 (mg/ml)	Verbliebene IgG-Kapazität Qb10 nach sechs 4 h-Zyklen (mg/ml)	Verbliebene IgG-Kapazität nach sechs 4 h-Zyklen (mg/ml)	Kapazitäts-Retention relativ zu Ref. nach sechs 4 h-Zyklen
Zvar4	21	7	52,5	36,5	60	1
Zvar4	21	12	61,1	43,4	71	1
Zvar(Q9A, N11E, N28A, N43A)4	18	7,0	49,1	44,1	90	1,50
Zvar(Q9A, N11E, N28A, N43A)4	18	12,1	50,0	46,2	93	1,31
Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4	20	7,2	49,0	44,2	90	1,50
Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4	20	12,8	56,3	53,6	95	1,34
Zvar(N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)4	30	9,7	56,3	52,0	92	1,53
Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R)4	31	10,8	56,9	52,5	92	1,30

Aktivierung
Die verwendete Basismatrix waren rigide, vernetzte Agaroseperlen mit 85 Mikrometern (volumengewichtet, d50V) medianer Durchmesser, hergestellt gemäß dem Verfahren von US6602990 und mit einer Porengröße entsprechend einem inversen Gelfiltrationschromatographie-Kav-Wert von 0,70 für Dextran mit Mw 110 kDa, gemäß den Verfahren beschrieben in „Gel Filtration Principles and Methods“, Pharmacia LKB Biotechnology 1991, S. 6–13.
25 ml (g) der drainierten Grundmatrix, 10,0 ml destilliertes Wasser und 2,02 g NaOH (s) wurden in einem 100 ml-Kolben unter mechanischem Rühren für 10 min bei 25 °C gemischt.
4,0 ml Epichlorhydrin wurden zugegeben und die Reaktion für 2 Stunden fortgesetzt. Das aktivierte Gel wurde mit 10 Gelsediment-Volumina (GV) Wasser gewaschen.
Kupplung
Zu 20 ml Ligandenlösung (50 mg/ml) in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen wurden 169 mg NaHCO₃, 21 mg Na2CO₃, 175 mg NaCl und 7 mg EDTA zugegeben. Das Falcon-Röhrchen wurde für 5–10 min auf einen Rolltisch gelegt und dann wurden 77 mg DTE zugegeben. Die Reduktion wurde für > 45 min fortgesetzt. Die Ligandenlösung wurde dann auf einer mit Sephadex G-25-gepackten PD10-Säule entsalzt. Der Ligandengehalt in der entsalzten Lösung wurde durch Messen der 276 nm-UV-Absorption bestimmt.
Das aktivierte Gel wurde mit 3–5 GV {0,1 M Phosphat/1 mM EDTA pH 8,6} gewaschen und der Ligand wurde dann gemäß dem in US6399750 beschriebenen Verfahren gekuppelt. Alle in den Experimenten verwendeten Puffer waren mit Stickstoffgas für zumindest 5–10 min entgast worden. Der Ligandengehalt der Gele konnte durch Variieren der Menge und Konzentration der Ligandenlösung kontrolliert werden.
Nach der Immobilisierung wurden die Gele 3 × GV mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Gele + 1 GV {0,1 M Phosphat/1 mM EDTA/10% Thioglycerin pH 8,6} wurden gemischt und die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur über Nacht in einem Schütteltisch belassen. Die Gele wurden dann abwechselnd mit 3 × GV {0,1 M TRIS/0,15 M NaCl pH 8,6} und 0,5 M HAc und dann 8–10 × GV mit destilliertem Wasser gewaschen. Gelproben wurden in ein externes Labor für die Aminosäureanalyse geschickt und der Ligandengehalt (mg/ml Gel) wurde aus dem Gesamtaminosäuregehalt berechnet.
Protein

Gammanorm 165 mg/ml (Octapharma), verdünnt auf 2 mg/ml in Äquilibrierungspuffer.

Äquilibrierungspuffer

PBS Phosphatpuffer 10 mM + 0,14 M NaCl + 0,0027 M KCl, pH 7,4 (Medicago)

Adsorptionspuffer

PBS Phosphatpuffer 10 mM + 0,14 M NaCl + 0,0027 M KCl, pH 7,4 (Medicago)

Elutionspuffer

100 mM Acetat pH 2,9

Dynamische Bindungskapazität
2 ml Harz wurde in TRICORN^TM 5 100-Säulen gepackt. Die Durchbruchkapazität („breakthrough capacity“) wurde mit einem ÄKTAExplorer 10-System bei einer Verweilzeit von 6 Minuten (0,33 ml/min Flussrate) bestimmt. Der Äquilibrierungspuffer wurde durch die Bypass-Säule laufen gelassen bis eine stabile Grundlinie erhalten wurde. Dies wurde vor einem automatischen Nullsetzen durchgeführt. Die Probe wurde auf die Säule aufgetragen bis ein 100%-UV-Signal erhalten wurde. Dann wurde wieder Äquilibrierungspuffer aufgetragen bis eine stabile Grundlinie erhalten wurde. Die Probe wurde auf die Säule geladen bis ein UV-Signal von 85% des maximalen Absorptionsvermögens erreicht wurde. Die Säule wurde dann mit 5 Säulen-Volumina („column volumes“, CV) Äquilibrierungspuffer bei Flussrate 0,5 ml/min gewaschen. Das Protein wurde mit 5 CV Elutionspuffer bei einer Flussrate von 0,5 ml/min eluiert. Dann wurde die Säule mit 0,5 M NaOH bei Flussrate von 0,2 ml/min gereinigt und mit Äquilibrierungspuffer re-äquilibriert. Für die Berechnung der Durchbruchkapazität bei 10% wurde die unten aufgeführte Gleichung verwendet. Das ist die Menge an IgG, die auf die Säule geladen wird, bis die Konzentration des IgG im Säulen-Ausfluss 10% der IgG-Konzentration in dem Zulauf beträgt.

A_100%: = 100%-UV-Signal;
A_sub: = Absorptionsvermögensbeitrag von nicht-bindenden IgG-Subklassen;
A(V): = Absorptionsvermögen bei einem gegebenen, aufgetragenen Volumen;
V_c: = Säulenvolumen;
V_app: = aufgetragenes Volume bis 10%-Durchbruch;
V_sys: = Totvolumen des Systems;
C₀: = Zulauf-Konzentration.

Die dynamische Bindungskapazität („dynamic binding capacity“, DBC) bei 10%-Durchbruch wurde berechnet. Die dynamische Bindungskapazität (DBC) wurde für 10- und 80%-Durchbruch berechnet. CIP - 0,5 M NaOH
Die 10%-Durchbruch-DBC (Qb10) wurde sowohl vor als auch nach wiederholten Expositionen gegenüber alkalischen Reinigungslösungen bestimmt. Jeder Zyklus enthielt einen CIP-Schritt mit 0,5 M NaOH, gepumpt durch die Säule mit einer Rate von 0,5/min für 20 min, wonach die Säule für 4 h stehengelassen wurde. Die Exposition erfolgte bei Raumtemperatur (22 +/– 2 °C). Nach dieser Inkubation wurde die Säule mit einem Äquilibrierungspuffer für 20 min bei einer Flussrate von 0,5 ml/min gewaschen. Tabelle 4 zeigt die verbliebene Kapazität nach sechs 4 h-Zyklen (d.h. 24 h kumulativer Expositionszeit gegenüber 0,5 M NaOH), sowohl in absoluten Zahlen als auch in Bezug auf die initiale Kapazität.
Beispiel 5

Beispiel 4 wurde mit den in Tabelle 5 gezeigten tetrameren Liganden wiederholt, jedoch mit in den CIP-Schritten verwendeter 1,0 M NaOH, anstelle von 0,5 M. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und in gezeigt. Tabelle 5. Matrizen mit tetrameren Liganden, ausgewertet in Säulen – 1,0 M NaOH.

Ligand	SEQ ID NR.	Liganden-gehalt (mg/ml)	Initiale IgG-Kapazität Qb10 (mg/ml)	Verbliebene IgG-Kapazität Qb10 nach sechs 4 h-Zyklen (mg/ml)	Verbliebene IgG-Kapazität Qb10 nach sechs 4 h-Zyklen (%)	Kapazitäts-Retention relativ zu Ref. nach sechs 4 h-Zyklen
Zvar4	21	12	60,1	33,5	56	1
Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4	20	12,8	60,3	56,0	93	1,67
Zvar(N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)4	30	9,7	62,1	48,1	77	1,44

Diese schriftliche Beschreibung verwendet Beispiele, um die Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsform, zu offenbaren und auch jedem Fachmann die Durchführung der Erfindung zu ermöglichen, einschließlich dem Herstellen und Verwenden jeder Vorrichtungen oder Systeme und dem Durchführen jeder der aufgenommenen Verfahren. Der patentierbare Umfang der Erfindung ist durch die Ansprüche definiert und kann andere Beispiele umfassen, die dem Fachmann in den Sinn kommen. Solche anderen Beispiele sollen im Umfang der Ansprüche liegen, wenn sie strukturelle Elemente aufweisen, die sich nicht von der wörtlichen Sprache der Ansprüche unterscheiden oder wenn sie äquivalente Strukturelemente mit unerheblichen Unterschieden zu der wörtlichen Sprachen der Ansprüche einschließen. Alle im Text erwähnten Patente und Patentanmeldungen werden hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen, als ob sie einzeln aufgenommen worden wären.

Claims

Fc-bindendes Polypeptid, umfassend eine Mutante einer Fc-bindenden Domäne von Staphylococcus-Protein A (SpA), wie definiert durch oder mit zumindest 90%, wie z.B. zumindest 95% oder 98% Identität zu SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3, SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 51 oder SEQ ID NR: 52, wobei zumindest der Asparagin- oder Serin-Rest an der Position entsprechend Position 11 in SEQ ID NR: 4–7 zu einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glutaminsäure, Lysin, Tyrosin, Threonin, Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Tryptophan, Methionin, Valin, Alanin, Histidin und Arginin, mutiert worden ist.
Polypeptid gemäß Anspruch 1, umfassend eine Mutante einer ursprünglichen Fc-bindenden Domäne von Staphylococcus-Protein A (SpA), wie definiert durch oder mit zumindest 90%, wie z.B. zumindest 95% oder 98% Identität zu SEQ ID NR: 4, SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR 51 oder SEQ ID NR 52.
Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 11 in SEQ ID NR: 4–7 eine Glutaminsäure ist.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 11 in SEQ ID NR: 4–7 ein Lysin ist.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 9 in SEQ ID NR: 4–7 ein Alanin ist.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 50 in SEQ ID NR: 4–7 ein Arginin oder eine Glutaminsäure ist, wie z.B. ein Arginin.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 3 in SEQ ID NR: 4–7 ein Alanin und/oder der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 6 in SEQ ID NR: 4–7 eine Asparaginsäure ist.
Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1–6, wobei zumindest einer, wie z.B. beide, der Aminosäure-Reste an den Positionen entsprechend Positionen 3 und 6 in SEQ ID NR: 4–7 ein Asparagin ist.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 43 in SEQ ID NR: 4–7 ein Alanin oder eine Glutaminsäure ist, wie z.B. ein Alanin.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 28 in SEQ ID NR: 4–7 ein Alanin oder ein Asparagin ist.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 40 in SEQ ID NR: 4–7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Asparagin, Alanin, Glutaminsäure und Valin.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 42 in SEQ ID NR: 4–7 ein Alanin, Lysin oder Arginin ist, wie z.B. ein Arginin.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 44 in SEQ ID NR: 4–7 ein Leucin oder ein Isoleucin ist, wie z.B. ein Isoleucin.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 18 in SEQ ID NR: 4–7 ein Lysin oder ein Histidin ist, wie z.B. ein Lysin.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 33 in SEQ ID NR: 4–7 ein Lysin oder ein Serin ist, wie z.B. ein Lysin.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 37 in SEQ ID NR: 4–7 eine Glutaminsäure oder eine Asparaginsäure ist, wie z.B. eine Glutaminsäure.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Aminosäure-Rest an der Position entsprechend Position 51 in SEQ ID NR: 4–7 ein Tyrosin oder ein Leucin ist, wie z.B. ein Tyrosin.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Aminosäure-Reste an den Positionen entsprechend Positionen 1, 2, 3 und 4 oder Positionen 3, 4, 5 und 6 in SEQ ID NR: 4–7 deletiert worden sind.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem es sich um eine wie durch SEQ ID NR: 7 definierte Mutante von Zvar handelt, wobei der Aminosäure-Rest an Position 9 Alanin ist und der Aminosäure-Rest an Position 11 Lysin oder Glutaminsäure ist, wie z.B. Lysin.
Polypeptid gemäß Anspruch 19, wobei der Aminosäure-Rest an Position 43 Alanin oder Glutaminsäure ist.
Polypeptid gemäß Anspruch 19 oder 20, wobei der Aminosäure-Rest an Position 40 Valin ist.
Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 19–21, wobei der Aminosäure-Rest an Position 44 Isoleucin ist.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mutation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: N11K; N11E; N11Y; N11T; N11F; N11L; N11W; N11I; N11M; N11V; N11A; N11H; N11R; N11E, Q32A; N11E, Q32E, Q40E; N11E, Q32E, K50R; Q9A, N11E, N43A; Q9A, N11E, N28A, N43A; Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I; Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I; N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y; Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I; Q9A, N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y; N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I; Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I; Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R; Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R; Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42K, N43A, L44I und Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42R, N43A, L44I.
Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1–22, wobei die Mutation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: N11K; N11Y; N11F; N11L; N11W; N11I; N11M; N11V; N11A; N11H; N11R; Q9A, N11E, N43A; Q9A, N11E, N28A, N43A; Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I; Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I; Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I; N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y; Q9A, N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y; N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I; Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I und Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend oder im Wesentlichen bestehend aus einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NR 8, SEQ ID NR 9, SEQ ID NR 10, SEQ ID NR 11, SEQ ID NR 12, SEQ ID NR 13, SEQ ID NR 14, SEQ ID NR 15, SEQ ID NR 16, SEQ ID NR 23, SEQ ID NR 24, SEQ ID NR 25, SEQ ID NR 26, SEQ ID NR 27, SEQ ID NR 28, SEQ ID NR 29, SEQ ID NR 36, SEQ ID NR 37, SEQ ID NR 38, SEQ ID NR 39, SEQ ID NR 40, SEQ ID NR 41, SEQ ID NR 42, SEQ ID NR 43, SEQ ID NR 44, SEQ ID NR 45, SEQ ID NR 46, SEQ ID NR 47, SEQ ID NR 48, SEQ ID NR 49 and SEQ ID NR 50.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend oder im Wesentlichen bestehend aus einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NR 8, SEQ ID NR 9, SEQ ID NR 10, SEQ ID NR 11, SEQ ID NR 16, SEQ ID NR 23, SEQ ID NR 24, SEQ ID NR 25, SEQ ID NR 26, SEQ ID NR 27, SEQ ID NR 28 and SEQ ID NR 29.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend oder im Wesentlichen bestehend aus einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: SEQ ID NR 8, SEQ ID NR 9, SEQ ID NR 10, SEQ ID NR 11, SEQ ID NR 16, SEQ ID NR 23, SEQ ID NR 24, SEQ ID NR 25, SEQ ID NR 27, SEQ ID NR 28, SEQ ID NR 38, SEQ ID NR 40; SEQ ID NR 41; SEQ ID NR 42; SEQ NO 43, SEQ ID NR 44, SEQ ID NR 45, SEQ ID NR 46, SEQ ID NR 47 and SEQ ID NR 48.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid eine verbesserte alkalische Stabilität aufweist, verglichen mit einem Polypeptid, wie definiert durch SEQ ID NR 1, SEQ ID NR 2, SEQ ID NR 3, SEQ ID NR 4, SEQ ID NR 5, SEQ ID NR 6 oder SEQ ID NR 7, wie z.B. durch SEQ ID NR 7.
Polypeptid gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid eine verbesserte alkalische Stabilität aufweist, verglichen mit einem ursprünglichen Polypeptid, wie definiert durch SEQ ID NR 1, SEQ ID NR 2, SEQ ID NR 3, SEQ ID NR 4, SEQ ID NR 5, SEQ ID NR 6 oder SEQ ID NR 7, wie z.B. durch SEQ ID NR 7.
Polypeptid gemäß Anspruch 28 oder 29, wobei die alkalische Stabilität, gemessen durch die nach 24 oder 25 h Inkubation in 0,5 M oder 1,0 M wässriger NaOH bei 22 +/– 2 °C verbliebene IgG-Bindungskapazität, verbessert ist.
Fc-bindendes Polypeptid, das eine Sequenz, wie definiert durch oder mit zumindest 90% oder zumindest 95% oder 98% Identität zu SEQ ID NR 53, umfasst.
wobei unabhängig voneinander: X₁ = A oder Q X₂ = E, K, Y, T, F, L, W, I, M, V, A, H oder R X₃ = H oder K X₄ = A oder N X₅ = A oder G X₆ = Q oder E X₇ = S oder K X₈ = E oder D X₉ = Q oder V X₁₀ = K, R oder A X₁₁ = A, E oder N X₁₂ = I oder L X₁₃ = K oder R X₁₄ = L oder Y
Multimer, umfassend oder im Wesentlichen bestehend aus einer Vielzahl von Polypeptiden, wie definiert durch einen der vorhergehenden Ansprüche.
Multimer gemäß Anspruch 32, wobei die Polypeptide durch bis zu 15 Aminosäuren umfassende Linker verbunden sind.
Multimer gemäß Anspruch 32 oder 33, bei dem es sich um ein Dimer, Trimer, Tetramer, Pentamer, Hexamer, Heptamer, Octamer oder Nonamer handelt.
Multimer gemäß einem der Ansprüche 32–34, umfassend oder im Wesentlichen bestehend aus einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen definiert durch SEQ ID NR 17, SEQ ID NR 18, SEQ ID NR 19, SEQ ID NR 20, SEQ ID NR 30, SEQ ID NR 31, SEQ ID NR 32, SEQ ID NR 33, SEQ ID NR 34 und SEQ ID NR 35.
Polypeptid oder Multimer gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend an, oder innerhalb von 1–5 Aminosäure-Resten von, dem C-terminalen oder N-terminalen einen oder mehreren Kupplungselement, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem oder mehreren Cystein-Resten, eine Vielzahl von Lysin-Resten und eine Vielzahl von Histidin-Resten.
Nukleinsäure oder Vektor kodierend für ein Polypeptid oder Multimer gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.
Expressionssystem, umfassend eine Nukleinsäure oder Vektor gemäß Anspruch 37.
Trennmatrix, wobei eine Vielzahl von Polypeptiden oder Multimeren gemäß einem der Ansprüche 1–36 an einen festen Träger gekuppelt sind.
Trennmatrix gemäß Anspruch 39, wobei die Polypeptide oder Multimere über Thioether-Bindungen an den festen Träger gekuppelt worden sind.
Trennmatrix gemäß Anspruch 39 oder 40, wobei der feste Träger ein Polysaccharid ist.
Trennmatrix gemäß einem der Ansprüche 38–40, wobei die IgG-Kapazität der Matrix nach 24 Inkubation in 0,5 M NaOH bei 22 +/– 2 °C zumindest 80, wie z.B. zumindest 85, zumindest 90 oder zumindest 95% der IgG-Kapazität vor der Inkubation ist.
Trennmatrix gemäß einem der Ansprüche 39–42, wobei die IgG-Kapazität der Matrix nach 24 Inkubation in 1,0 M NaOH bei 22 +/– 2 °C zumindest 70, wie z.B. zumindest 80 oder zumindest 90% der IgG-Kapazität vor der Inkubation ist.
Verfahren zur Isolierung eines Immunglobulins, wobei eine Trennmatrix gemäß einem der Ansprüche 39–43 verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 44, umfassend die Schritte: a) Inkontaktbringen einer flüssigen Probe, umfassend ein Immunglobulin, mit einer Trennmatrix nach einem der Ansprüche 39–43, b) Waschen der Trennmatrix mit einer Waschflüssigkeit, c) Eluieren des Immunglobulins von der Trennmatrix mit einer Elutionsflüssigkeit und d) Reinigen der Trennmatrix mit einer Reinigungsflüssigkeit.
Verfahren gemäß Anspruch 45, wobei die Reinigungsflüssigkeit alkalisch ist, wie z.B. mit einem pH von 13–14.
Verfahren gemäß Anspruch 45 oder 46, wobei die Reinigungsflüssigkeit 0,1–1,0 M NaOH oder KOH umfasst, wie z.B. 0,5–1,0 M NaOH oder KOH.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 44–46, wobei Schritte a)–d) zumindest 10 Mal wiederholt werden, wie z.B. zumindest 50 Mal oder 50–200 Mal.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 44–48, wobei Schritte a)–c) zumindest 10 Mal wiederholt werden, wie z.B. zumindest 50 Mal oder 50–200 Mal und wobei Schritt d) nach einer Vielzahl von Vorgängen von Schritt c) durchgeführt wird, wie z.B. zumindest 10 oder zumindest 50 Mal.