JP6724000B2 - 変異免疫グロブリン結合ポリペプチド - Google Patents
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Description
用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は本明細書において同義的に使用され、抗体のフラグメント、抗体又は抗体フラグメントを含む融合タンパク質及び抗体又は抗体フラグメントを含むコンジュゲートも含むと理解される。
KEX1Q X2AFYEILX3LP NLTEEQRX4X5F IX6X7LKDX8PSX9 SX10X11X12LAEAKX13 X14NDAQAPK
式中、互いに独立に、
X1=A又はQ
X2=E、K、Y、T、F、L、W、I、M、V、A、H又はR
X3=H又はK
X4=A又はN
X5=A又はG
X6=Q又はE
X7=S又はK
X8=E又はD
X9=Q又はV
X10=K、R又はA
X11=A、E又はN
X12=I又はL
X13=K又はR
X14=L又はY
である。
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK
配列番号9 Zvar(Q9A、N11E、N28A、N43A)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK
配列番号10 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43E、L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK
配列番号11 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号12 Zvar(N11E、Q32A)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IASLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号13 Zvar(N11E)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号14 Zvar(N11E、Q32E、Q40E)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IESLKDDPSE SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号15 Zvar(N11E、Q32E、K50R)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IESLKDDPSQ SANLLAEAKR LNDAQAPK
配列番号16 Zvar(N11K)
VDAKFDKEQQ KAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号23 Zvar(N11K、H18K、S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y)
VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK
配列番号24 Zvar(Q9A、N11E、N28A、Q40V、A42K、N43A、L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号25 Zvar(Q9A、N11K、H18K、S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRAAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK
配列番号26 Zvar(N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I)
VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号27 Zvar(Q9A、N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号28 Zvar(Q9A、N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKR LNDAQAPK
配列番号29 Zvar(Q9A、N11K、H18K、D37E、A42R)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号36 B(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)
ADNKFNKEAQ EAFYEILHLP NLNEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号37 C(Q9A、N11E、E43A)
ADNKFNKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号38 Zvar(N11Y)
VDAKFDKEQQ YAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号39 Zvar(N11T)
VDAKFDKEQQ TAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号40 Zvar(N11F)
VDAKFDKEQQ FAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号41 Zvar(N11L)
VDAKFDKEQQ LAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号42 Zvar(N11W)
VDAKFDKEQQ WAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号43 Zvar(N11I)
VDAKFDKEQQ IAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号44 Zvar(N11M)
VDAKFDKEQQ MAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号45 Zvar(N11V)
VDAKFDKEQQ VAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号46 Zvar(N11A)
VDAKFDKEQQ AAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号47 Zvar(N11H)
VDAKFDKEQQ HAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号48 Zvar(N11R)
VDAKFDKEQQ RAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
配列番号49 Zvar(Q9A、N11E、D37E、Q40V、A42K、N43A、L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
配列番号50 Zvar(Q9A、N11E、D37E、Q40V、A42R、N43A、L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK
第2の態様では、本発明は、上に開示されるいずれかの実施形態で定義される複数のポリペプチド単位を含むか、又はそれから本質的になる多量体を開示する。多量体は、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体又は九量体であり得る。それは、多量体中の全ての単位が同一であるホモ多量体であってもよいし、1以上の単位が他の単位と異なるヘテロ多量体であってもよい。有利には、多量体中の全ての単位は、例えば上に開示される変異を含むことによって、アルカリ安定性である。ポリペプチドは、ポリペプチドのC末端とN末端との間のペプチド結合によって直接に互いと結合することができる。或いは、多量体中の2以上の単位は、オリゴマー種又はポリマー種、例えば最大15又は30アミノ酸、例えば1〜5、1〜10又は5〜10アミノ酸などを含む要素などを含むリンカーによって結合することができる。これは特に配列番号51及び52の変異並びに配列番号53のポリペプチドの例であり、リンカーの具体例は、例えば、VDAKFD又はADNKFN、例えばVDAKFDなどであり得る。そのようなリンカーの性質は、好ましくはタンパク質単位の空間的立体構造を不安定化するべきではない。これは、例えばリンカー中にプロリンが存在しないようにすることによって達成することができる。さらに、リンカーはまた、好ましくは変異したタンパク質単位の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきでもある。この目的のため、リンカーがアスパラギンを含まない場合は有利である。リンカーがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。多量体はさらにN末端で複数のアミノ酸残基、例えばクローニングプロセスに由来するか、又は切断されるシグナル伝達配列由来の残基を構成するアミノ酸残基などを含むことがある。さらなるアミノ酸残基の数は、例えば15以下、例えば10以下又は5以下などであってよい。具体例として、多量体は、AQ配列をN末端に含むことがある。
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPKC
配列番号18 Zvar(Q9A、N11E、N28A、N43A)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPKC
配列番号19 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43E、L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号20 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号30 Zvar(N11K、H18K、S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y)4
AQGT VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPKC
配列番号31 Zvar(Q9A、N11K、H18K、D37E、A42R)4
AQGT VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPKC
配列番号32 Zvar(Q9A、N11E、N28A、Q40V、A42K、N43A、L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号33 Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)6
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号34 Zvar(Q9A、N11E、D37E、Q40V、A42K、N43A、L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
配列番号35 Zvar(Q9A、N11E、D37E、Q40V、A42R、N43A、L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPKC
一部の実施形態では、上に開示されるポリペプチド及び/又は多量体は、C末端又はN末端に、1以上のシステイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される、1以上の連結要素をさらに含む。1以上の連結要素はまた、C末端又はN末端から1〜5アミノ酸残基の範囲内、例えば1〜3又は1〜2アミノ酸残基の範囲内に位置してもよい。連結要素は、例えばC末端の単一のシステインであることがある。1以上の連結要素は、C又はN末端に直接に結合してもよいし、或いは連結要素は、最大15アミノ酸、例えば1〜5、1〜10又は5〜10アミノ酸を含むストレッチを介して結合してもよい。このストレッチもまた、好ましくは変異したタンパク質の性質を損なわないようにアルカリ環境で十分に安定しているべきである。この目的のため、ストレッチがアスパラギンを含まない場合は有利である。ストレッチがグルタミンを含まない場合はさらに有利であり得る。C末端システインを有する利点は、タンパク質のエンドポイントカップリングがシステインチオールと担体上の求電子基との反応を通じて達成され得ることである。このことは、結合能に重要である、結合したタンパク質の優れた移動度をもたらす。
a)免疫グロブリンを含む液体試料と上に開示される分離マトリックスとを接触させる工程、
b)分離マトリックスを洗浄液で洗浄する工程、
c)溶出液を用いて分離マトリックスから免疫グロブリンを溶出する工程、及び
d)分離マトリックスを清浄液(或いは定置洗浄(CIP)液と呼ぶこともできる)
で、例えば少なくとも10分の接触(インキュベーション)時間で清浄する工程
を含む。
部位特異的変異導入を、変異をコードするオリゴヌクレオチドを用いて2工程のPCRによって実施した。鋳型として、Z、B又はCのいずれかの単一のドメインを含有するプラスミドを使用した。PCR断片を大腸菌発現ベクターに連結した。DNA塩基配列決定法を使用して、挿入した断片の正しい配列を検証した。
構築物を、標準培地中の大腸菌K12の発酵によって細菌ペリプラズム内に発現させた。発酵後、細胞を熱処理してペリプラズムの内容物を培地に放出させた。培地に放出された構築物を、孔径0.2μmの膜を用いる精密濾過法によって回収した。
N末端のAQGTリーダー配列及びC末端のシステインをさらに含む、表1に記載の精製単量体リガンドを、BiacoreCM5センサーチップ(GE Healthcare、スウェーデン)上に固定化し、十分な量でGE Healthcareのアミンカップリングキット(チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用)を使用して、Biacore表面プラズモン共鳴(SPR)計測器(GE Healthcare、スウェーデン)で約200〜1500RUのシグナル強度を得た。固定化表面のIgG結合能を追跡するため、1mg/mlヒトポリクローナルIgG(Gammanorm)をチップの上に流し、シグナル強度(結合量に比例)を記録した。次に、表面を定置洗浄した(CIP)、すなわち、室温で(22±2℃)10分間、500mM NaOHを流した。これを96〜100サイクル繰り返し、固定化リガンドのアルカリ安定性を、各サイクルの後に残存IgG結合能(シグナル強度)として追跡した。結果は表1に示され、少なくともリガンドZvar(N11K)1、Zvar(N11E)1、Zvar(N11Y)1、Zvar(N11T)1、Zvar(N11F)1、Zvar(N11L)1、Zvar(N11W)1、Zvar(N11I)1、Zvar(N11M)1、Zvar(N11V)1、Zvar(N11A)1、Zvar(N11H1)、Zvar(N11R)1、Zvar(N11E、Q32A)1、Zvar(N11E、Q32E、Q40E)1及びZvar(N11E、Q32E、K50R)1、Zvar(Q9A、N11E、N43A)1、Zvar(Q9A、N11E、N28A、N43A)1、Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43E、L44I)1、Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)1、Zvar(Q9A、N11E、N28A、Q40V、A42K、N43A、L44I)1、Zvar(N11K、H18K、S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y)1、Zvar(Q9A、N11K、H18K、S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y)1、Zvar(N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I)1、Zvar(Q9A、N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I)1及びZvar(Q9A、N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R)1が、基準として使用した親構造Zvar1と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。さらに、リガンドB(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)1及びC(Q9A、N11E、E43A)1は、基準として使用した親Bドメイン及びCドメインと比較して安定性が改善された。
表2に記載の精製四量体及び六量体リガンドを、BiacoreCM5センサーチップ(GE Healthcare、スウェーデン)上に固定化し、十分な量でGE Healthcareのアミンカップリングキット(チップ上のカルボキシメチル基のアミンのカルボジイミドカップリング用)を使用して、Biacore計測器(GE Healthcare、スウェーデン)で約200〜1500RUのシグナル強度を得た。固定化表面のIgG結合能を追跡するため、1mg/mlヒトポリクローナルIgG(Gammanorm)をチップの上に流し、シグナル強度(結合量に比例)を記録した。次に、表面を定置洗浄した(CIP)、すなわち、室温で(22±2℃)10分間、500mM NaOHを流した。これを300サイクル繰り返し、固定化リガンドのアルカリ安定性を、各サイクルの後に残存IgG結合能(シグナル強度)として追跡した。結果は表2及び図2に示され、少なくともリガンドZvar(Q9A、N11E、N43A)4、Zvar(Q9A、N11E、N28A、N43A)4、Zvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43E、L44I)4及びZvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)4、Zvar(Q9A、N11E、D37E、Q40V、A42K、N43A、L44I)4及びZvar(Q9A、N11E、D37E、Q40V、A42R、N43A、L44I)4が、基準として使用した親構造Zvar4と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。六量体リガンドZvar(Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I)6も、基準として使用した親構造Zvar6と比較してアルカリ安定性が改善されたことを示す。
実施例2のような500mMの代わりに1M NaOHを用いて、3つのリガンドの100回のCIPサイクルを用いて実施例2を繰り返した。結果は表3に示され、3つ全てのリガンドが、基準として使用した親構造Zvar4と比較して1M NaOH中でも安定性を改善したことを示す。
表2の精製四量体リガンド(全てN末端にさらなるシステインを含む)を、下に記載される方法を用いてアガロースビーズに上に固定化し、能力及び安定性について評価した。結果を表4及び図3に示す。
使用したベースマトリックスは、米国特許第6602990号に記載の方法に従って調製し、Gel Filtration Principles and Methods,Pharmacia LKB Biotechnology 1991,pp 6−13に記載の方法に従う、Mw110kDaのデキストランの逆ゲル濾過クロマトグラフィーのKav値0.70に相当する孔径をもつ、85マイクロメートル(容積重量、d50V)の中位径の硬質架橋アガロースビーズであった。
50ml Falconチューブ中20mLのリガンド溶液(50mg/mL)に、169mgのNaHCO3、21mgのNa2CO3、175mgのNaCl及び7mgのEDTAを添加した。Falconチューブをローラーテーブルの上に5〜10分間載せた後、77mgのDTEを添加した。還元は45分超進行した。次に、Sephadex G−25を充填したPD10カラムでリガンド溶液を脱塩した。脱塩した溶液中のリガンド含有量を、276nmのUV吸収を測定することによって求めた。
Gammanorm165mg/ml(Octapharma)、平衡化緩衝液中2mg/mlに希釈。
PBSリン酸緩衝液10mM+0.14M NaCl+0.0027M KCl、pH7.4(Medicago)
吸着緩衝液
PBSリン酸緩衝液10mM+0.14M NaCl+0.0027M KCl、pH7.4(Medicago)
溶出緩衝液
100mM酢酸塩pH2.9
動的結合能
2mlの樹脂を、TRICORN(商標)5 100カラムに充填した。貫流容量を、AKTAExplorer10システムで滞留時間6分(流量0.33ml/分)で求めた。安定したベースラインが得られるまで平衡化緩衝液をバイパスカラムに流した。これは、オートゼロイングの前に行った。100%UVシグナルが得られるまで試料をカラムに加えた。その後、平衡緩衝液を再び安定したベースラインが得られるまで加えた。
10%貫流のDBC(Qb10)は、アルカリ洗浄溶液に繰り返し曝露する前と後に求めた。各々のサイクルには、0.5M NaOHを0.5/分の速度で20分間カラムに通してポンプ送達し、その後カラムを4時間静置するCIP工程が含まれた。曝露は室温(22±2℃)で行った。このインキュベーションの後、カラムを平衡緩衝液で流量0.5ml/分で20分間洗浄した。表4は、6回の4時間サイクル後の残存結合能(すなわち、0.5M NaOHへの累積曝露時間は24時間)を、絶対数で、そして初期能力と比較して表す。
実施例4を、表5に示される四量体リガンドを用いて、但しCIP工程で0.5Mの代わりに1.0M NaOHを使用して繰り返した。結果を表5及び図4に示す。
[実施態様1]
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号22、配列番号51又は配列番号52で定義されるか或いは90%以上、例えば95%以上又は98%以上の同一性を有するブドウ球菌プロテインA(SpA)のFc結合ドメインの変異体を含むFc結合ポリペプチドであって、配列番号4〜7の11位に対応する位置の少なくともアスパラギン又はセリン残基が、グルタミン酸、リジン、チロシン、トレオニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン、バリン、アラニン、ヒスチジン及びアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸に変異している、Fc結合ポリペプチド。
[実施態様2]
配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号51又は配列番号52で定義されるか或いは90%以上、例えば95%以上又は98%以上の同一性を有するブドウ球菌プロテインA(SpA)の親Fc結合ドメインの変異体を含む、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様3]
配列番号4〜7の11位に対応する位置のアミノ酸残基がグルタミン酸である、実施態様1又は2に記載のポリペプチド。
[実施態様4]
配列番号4〜7の11位に対応する位置のアミノ酸残基がリジンである、実施態様1乃至3のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様5]
配列番号4〜7の9位に対応する位置のアミノ酸残基がアラニンである、実施態様1乃至4のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様6]
配列番号4〜7の50位に対応する位置のアミノ酸残基がアルギニン又はグルタミン酸、例えばアルギニンなどである、実施態様1乃至5のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様7]
配列番号4〜7の3位に対応する位置のアミノ酸残基がアラニンである、及び/又は配列番号4〜7の6位に対応する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸である、実施態様1乃至6のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様8]
配列番号4〜7の3位及び6位に対応する位置のアミノ酸残基の少なくとも1つ、例えば両方がアスパラギンである、実施態様1乃至6のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様9]
配列番号4〜7の43位に対応する位置のアミノ酸残基がアラニン又はグルタミン酸、例えばアラニンなどである、実施態様1乃至8のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様10]
配列番号4〜7の28位に対応する位置のアミノ酸残基がアラニン又はアスパラギンである、実施態様1乃至9のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様11]
配列番号4〜7の40位に対応する位置のアミノ酸残基が、アスパラギン、アラニン、グルタミン酸及びバリンからなる群から選択される、実施態様1乃至10のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様12]
配列番号4〜7の42位に対応する位置のアミノ酸残基が、アラニン、リジン又はアルギニン、例えばアルギニンなどである、実施態様1乃至11のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様13]
配列番号4〜7の44位に対応する位置のアミノ酸残基が、ロイシン又はイソロイシン、例えばイソロイシンなどである、実施態様1乃至12のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様14]
配列番号4〜7の18位に対応する位置のアミノ酸残基が、リジン又はヒスチジン、例えばリジンなどである、実施態様1乃至13のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様15]
配列番号4〜7の33位に対応する位置のアミノ酸残基が、リジン又はセリン、例えばリジンなどである、実施態様1乃至14のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様16]
配列番号4〜7の37位に対応する位置のアミノ酸残基が、グルタミン酸又はアスパラギン酸、例えばグルタミン酸などである、実施態様1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様17]
配列番号4〜7の51位に対応する位置のアミノ酸残基が、チロシン又はロイシン、例えばチロシンなどである、実施態様1乃至16のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様18]
配列番号4〜7の1、2、3及び4位、又は3、4、5及び6位に対応する位置のアミノ酸残基が欠失している、実施態様1乃至17のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様19]
配列番号7で定義されるZvarの変異体であるポリペプチドであって、9位のアミノ酸残基がアラニンであり、11位のアミノ酸残基がリジン又はグルタミン酸、例えばリジンなどである、実施態様1乃至18のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様20]
43位のアミノ酸残基がアラニン又はグルタミン酸である、実施態様19に記載のポリペプチド。
[実施態様21]
40位のアミノ酸残基がバリンである、実施態様19又は20に記載のポリペプチド。
[実施態様22]
44位のアミノ酸残基がイソロイシンである、実施態様19乃至21のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様23]
変異が、N11K;N11E;N11Y;N11T;N11F;N11L;N11W;N11I;N11M;N11V;N11A;N11H;N11R;N11E、Q32A;N11E、Q32E、Q40E;N11E、Q32E、K50R;Q9A、N11E、N43A;Q9A、N11E、N28A、N43A;Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43E、L44I;Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I;N11K、H18K、S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y;Q9A、N11E、N28A、Q40V、A42K、N43A、L44I;Q9A、N11K、H18K、S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y;N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I;Q9A、N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I;Q9A、N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R;Q9A、N11K、H18K、D37E、A42R;Q9A、N11E、D37E、Q40V、A42K、N43A、L44I及びQ9A、N11E、D37E、Q40V、A42R、N43A、L44Iからなる群から選択される、実施態様1乃至22のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様24]
変異が、N11K;N11Y;N11F;N11L;N11W;N11I;N11M;N11V;N11A;N11H;N11R;Q9A、N11E、N43A;Q9A、N11E、N28A、N43A;Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43E、L44I;Q9A、N11E、Q40V、A42K、N43A、L44I;Q9A、N11E、N28A、Q40V、A42K、N43A、L44I;N11K、H18K、S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y;Q9A、N11K、H18K、S33K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50R、L51Y;N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I;Q9A、N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I及びQ9A、N11K、H18K、D37E、A42R、N43A、L44I、K50Rからなる群から選択される、実施態様1乃至22のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様25]
配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49及び配列番号50からなる群から選択される配列を含むか又はそれから本質的になる、実施態様1乃至24のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様26]
配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号16、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28及び配列番号29からなる群から選択される配列を含むか又はそれから本質的になる、実施態様1乃至25のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様27]
配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号16、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号27、配列番号28、配列番号38、配列番号40;配列番号41;配列番号42;配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47及び配列番号48からなる群から選択される配列を含むか又はそれから本質的になる、実施態様1乃至26のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様28]
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6又は配列番号7によって、例えば配列番号7などで定義されるポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を有する、実施態様1乃至27のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様29]
配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6又は配列番号7によって、例えば配列番号7などで定義される親ポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を有する、実施態様1乃至28のいずれか1項に記載のポリペプチド。
[実施態様30]
アルカリ安定性が、22±2℃の0.5M又は1.0M NaOH水溶液中、24又は25時間のインキュベーションの後に残存IgG結合能によって測定して改善されている、実施態様28又は29に記載のポリペプチド。
[実施態様31]
配列番号53で定義されるか或いは90%以上又は95%以上又は98%以上の同一性を有する配列を含むFc結合ポリペプチド。
式中、互いに独立に、
X1=A又はQ
X2=E、K、Y、T、F、L、W、I、M、V、A、H又はR
X3=H又はK
X4=A又はN
X5=A又はG
X6=Q又はE
X7=S又はK
X8=E又はD
X9=Q又はV
X10=K、R又はA
X11=A、E又はN
X12=I又はL
X13=K又はR
X14=L又はY。
[実施態様32]
実施態様1乃至31のいずれか1項に記載の複数のポリペプチドを含むか又はそれから本質的になる多量体。
[実施態様33]
ポリペプチドが、15残基以下のアミノ酸を含むリンカーで連結されている、実施態様32に記載の多量体。
[実施態様34]
二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体又は九量体である、実施態様32又は33に記載の多量体。
[実施態様35]
配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34及び配列番号35で定義される配列の群から選択される配列を含むか又はそれから本質的になる、実施態様32乃至34のいずれか1項に記載の多量体。
[実施態様36]
1以上のシステイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される、C末端又はN末端の1以上の連結要素の1〜5個のアミノ酸残基か又はその範囲内をさらに含む、実施態様1乃至35のいずれか1項に記載のポリペプチド又は多量体。
[実施態様37]
実施態様1乃至36のいずれか1項に記載のポリペプチド又は多量体をコードする核酸又はベクター。
[実施態様38]
実施態様37に記載の核酸又はベクターを含む、発現系。
[実施態様39]
実施態様1乃至36のいずれか1項に記載の複数のポリペプチド又は多量体が固相支持体に結合されている、分離マトリックス。
[実施態様40]
ポリペプチド又は多量体が、チオエーテル結合によって固相支持体に結合されている、実施態様39に記載の分離マトリックス。
[実施態様41]
固相支持体が多糖である、実施態様39又は40に記載の分離マトリックス。
[実施態様42]
22±2℃の0.5M NaOH中での24時間のインキュベーションの後のマトリックスのIgG結合能が、インキュベーションの前のIgG結合能の80%以上、例えば85%以上、90%以上又は95%以上である、実施態様38乃至40のいずれか1項に記載の分離マトリックス。
[実施態様43]
22±2℃の1.0M NaOH中での24インキュベーションの後のマトリックスのIgG結合能が、インキュベーションの前のIgG結合能の70%以上、例えば80%以上又は90%以上である、実施態様39乃至42のいずれか1項に記載の分離マトリックス。
[実施態様44]
免疫グロブリンを単離する方法であって、実施態様39乃至43のいずれか1項に記載の分離マトリックスを使用する方法。
[実施態様45]
a)免疫グロブリンを含む液体試料と、実施態様39乃至43のいずれか1項に記載の分離マトリックスとを接触させる工程と、
b)分離マトリックスを洗浄液で洗浄する工程と、
c)溶出液を用いて分離マトリックスから免疫グロブリンを溶出する工程と、
d)分離マトリックスを清浄液で清浄する工程と
を含む、実施態様44に記載の方法。
[実施態様46]
清浄液がアルカリ性、例えばpHが13〜14である、実施態様45に記載の方法。
[実施態様47]
清浄液が0.1〜1.0M NaOH又はKOH、例えば0.5〜1.0M NaOH又はKOHを含む、実施態様45又は46に記載の方法。
[実施態様48]
工程a)〜d)を10回以上、例えば50回以上又は50〜200回繰り返す、実施態様44乃至46のいずれか1項に記載の方法。
[実施態様49]
工程a)〜c)を10回以上、例えば50回以上又は50〜200回繰り返し、工程c)を複数回、例えば10回以上又は50回以上行った後に工程d)を実施する、実施態様44乃至48のいずれか1項に記載の方法。
Claims (11)
- a)配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、及び、配列番号48からなる群
から選択される配列を含むか又はそれからなる、ブドウ球菌プロテインA(SpA)のFc結合ドメインの変異体を含むFc結合ポリペプチド。 - 配列番号7で定義されるポリペプチドと比較して改善されたアルカリ安定性を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1又は2に記載の複数のポリペプチドを含むか又はそれからなる多量体であって、適宜、
a)ポリペプチドが、15残基以下のアミノ酸を含むリンカーで連結されている、
b)多量体が、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体又は九量体である、及び/又は
c)多量体が、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34及び配列番号35で定義される配列の群から選択される配列を含むか又はそれからなる、
多量体。 - 1以上のシステイン残基、複数のリジン残基及び複数のヒスチジン残基からなる群から選択される、C末端又はN末端の1以上の連結要素の1〜5個のアミノ酸残基か又はその範囲内をさらに含む、請求項1乃至請求項3のいずれか1項に記載のポリペプチド又は多量体。
- 請求項1乃至請求項4のいずれか1項に記載のポリペプチド又は多量体をコードする核酸又はベクター。
- 請求項5に記載の核酸又はベクターを含む、発現系。
- 請求項1乃至請求項4のいずれか1項に記載の複数のポリペプチド又は多量体が固相支持体に結合されている、分離マトリックス。
- a)ポリペプチド又は多量体が、チオエーテル結合によって固相支持体に結合されている、
b)固相支持体が多糖である、
c)22±2℃の0.5M NaOH中での24時間のインキュベーションの後のマトリックスのIgG結合能が、インキュベーションの前のIgG結合能の80%以上、例えば85%以上、90%以上又は95%以上である、及び/又は
d)22±2℃の1.0M NaOH中での24インキュベーションの後のマトリックスのIgG結合能が、インキュベーションの前のIgG結合能の70%以上、例えば80%以上又は90%以上である、
請求項7に記載の分離マトリックス。 - 免疫グロブリンを単離する方法であって、請求項7又は請求項8に記載の分離マトリックスを使用する方法。
- a)免疫グロブリンを含む液体試料と、請求項7又は請求項8に記載の分離マトリックスとを接触させる工程と、
b)分離マトリックスを洗浄液で洗浄する工程と、
c)溶出液を用いて分離マトリックスから免疫グロブリンを溶出する工程と、
d)分離マトリックスを清浄液で清浄する工程と
を含む方法であって、適宜
清浄液がアルカリ性、例えばpHが13〜14である、及び/又は
清浄液が0.1〜1.0M NaOH又はKOH、例えば0.5〜1.0M NaOH又はKOHを含む、請求項9に記載の方法。 - i)工程a)〜d)を10回以上、例えば50回以上又は50〜200回繰り返す、及び/又は
ii)工程a)〜c)を10回以上、例えば50回以上又は50〜200回繰り返し、工程c)を複数回、例えば10回以上又は50回以上行った後に工程d)を実施する、請求項10に記載の方法。
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