ES2817900T3 - Polipéptidos de unión a inmunoglobulina mutados - Google Patents

Polipéptidos de unión a inmunoglobulina mutados Download PDF

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Abstract

Un polipéptido de unión a Fc que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 24, y SEQ ID NO 25.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos de unión a inmunoglobulina mutados
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere al campo de la cromatografía de afinidad, y más específicamente a los dominios de unión a inmunoglobulina mutados de la Proteína A, que son útiles en la cromatografía de afinidad de inmunoglobulinas. La invención se refiere también a multímeros de los dominios mutados y a las matrices de separación que contienen dominios o multímeros mutados.
Antecedentes de la invención
Las inmunoglobulinas representan los productos biofarmacéuticos más frecuentes en la fabricación o el desarrollo en todo el mundo. La alta demanda comercial y, por tanto, el valor de este mercado terapéutico particular ha llevado a que las empresas farmacéuticas hagan hincapié en maximizar la productividad de sus respectivos procesos de fabricación de mAb mientras se controlan los costes asociados.
La cromatografía de afinidad se utiliza en la mayoría de los casos, como una de las etapas clave en la purificación de estas moléculas de inmunoglobulina, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales. Una clase particularmente interesante de reactivos de afinidad son las proteínas capaces de unirse específicamente a partes invariables de una molécula de inmunoglobulina, siendo dicha interacción independiente de la especificidad de unión al antígeno del anticuerpo. Dichos reactivos pueden ser ampliamente utilizados para la recuperación por cromatografía de afinidad de inmunoglobulinas de diferentes muestras tales como, pero no limitadas a, preparaciones de suero o plasma o materias primas derivadas de cultivos celulares. Un ejemplo de dicha proteína es la proteína estafilocócica A, que contiene dominios capaces de unirse a las porciones Fc y Fab de las inmunoglobulinas IgG de diferentes especies. Estos dominios se denominan comúnmente dominios E, D, A, B y C. Los reactivos basados en la proteína estafilocócica A (SpA), debido a su alta afinidad y selectividad, han encontrado un uso generalizado en el campo de la biotecnología, por ejemplo, en cromatografía de afinidad para la captura y purificación de anticuerpos, así como para la detección y cuantificación. En la actualidad, el medio de afinidad basado en SpA es probablemente el medio de afinidad más ampliamente utilizado para el aislamiento de anticuerpos monoclonales y sus fragmentos de diferentes muestras incluyendo sobrenadantes de cultivos celulares industriales. En consecuencia, varias matrices que comprenden ligandos de la proteína A están disponibles comercialmente, por ejemplo, en forma de proteína A nativa (por ejemplo, Protein A SEPHAROSE™, GE Healthcare, Uppsala, Sweden) y también compuestas por proteína A recombinante (por ejemplo, rProtein A-SEPHAROSE™, GE Healthcare). Más específicamente, la manipulación genética realizada en el producto de proteína A recombinante comercial tiene como objetivo facilitar la unión de la misma a un soporte y aumentar la productividad del ligando. Estas aplicaciones, como otras aplicaciones de la cromatografía de afinidad, requieren atención integral para la eliminación definitiva de los contaminantes. Dichos contaminantes pueden ser, por ejemplo, moléculas no eluidas adsorbidas en la fase estacionaria o matriz en un procedimiento cromatográfico, tales como biomoléculas o microorganismos no deseados, incluyendo por ejemplo proteínas, carbohidratos, lípidos, bacterias y virus. La eliminación de dichos contaminantes de la matriz se realiza generalmente después de la primera elución del producto deseado para regenerar la matriz antes del siguiente uso. Dicha eliminación implica normalmente un procedimiento conocido como limpieza in situ (CIP), en donde se utilizan agentes capaces de eluir los contaminantes de la fase estacionaria. Una de dichas clases de agentes utilizadas a menudo son las disoluciones alcalinas que se pasan sobre dicha fase estacionaria. En la actualidad, el agente de limpieza y desinfección más utilizado es el NaOH, y la concentración del mismo puede oscilar entre 0,1 hasta, por ejemplo, 1 M, dependiendo del grado y la naturaleza de la contaminación. Esta estrategia está asociada con la exposición de la matriz a disoluciones con valores de pH superiores a 13. Para muchas matrices de cromatografía de afinidad que contienen ligandos de afinidad proteínicos, dicho entorno alcalino es una condición muy dura y, en consecuencia, da como resultado capacidades disminuidas debido a la inestabilidad del ligando al pH elevado implicado.
Por lo tanto, se ha centrado una extensa investigación en el desarrollo de ligandos de proteínas modificadas genéticamente que muestran una capacidad mejorada para soportar valores de pH alcalinos. Por ejemplo, Gülich et al. (Susanne Gülich, Martin Linhult, Per-Ake Nygren, Mathias Uhlén, Sophia Hober, Journal of Biotechnology 80 (2000), 169-178) sugirieron la modificación genética de proteínas para mejorar las propiedades de estabilidad de un dominio de unión a albúmina (ABD) de estreptococos en entornos alcalinos. Gülich et al. crearon un mutante de ABD, en el que los cuatro residuos de asparagina han sido reemplazados por leucina (un residuo), aspartato (dos residuos) y lisina (un residuo). Además, Gülich et al. reportan que su mutante muestra un comportamiento de unión a la proteína diana similar al de la proteína nativa, y que las columnas de afinidad que contienen el ligado modificado genéticamente muestran mayores capacidades de unión después de la exposición repetida a condiciones alcalinas que las columnas preparadas utilizando el ligando parental no modificado. Por lo tanto, se concluye en la presente memoria que los cuatro residuos de asparagina se pueden reemplazar sin ningún efecto significativo sobre la estructura y función.
Un trabajo reciente muestra que también se pueden realizar cambios en la proteína A (SpA) para lograr propiedades similares. La publicación de solicitud de patente estadounidense US 2005/0143566 describe que cuando al menos un residuo de asparagina se muta a un aminoácido distinto de glutamina o ácido aspártico, la mutación confiere un aumento de la estabilidad química a valores de pH de hasta aproximadamente 13-14 en comparación con el SpA parental, tal como el dominio B del SpA, o la proteína Z, un constructo sintético derivado del dominio B del SpA (documento US 5.143.844). Los autores muestran que cuando estas proteínas mutadas se utilizan como ligandos de afinidad, los medios de separación, como se esperaba, pueden resistir mejor los procedimientos de limpieza que utilizan agentes alcalinos. Además, mutaciones de los dominios de la proteína A con el propósito de aumentar la estabilidad alcalina se han publicado en los documentos WO 2008/039141, JP 2006304633A, EP 1992692A1, EP 2202310A2, WO 2010/110288, WO 2012/086660, WO 2012/083425, WO 2012/087230, WO 2014/146350, EP 2728000 A1, WO 03/080655 A1, JP 2010081866 A, US 5011686 y WO 2015/005859 A1, así como en Hober et al.: J Chromatogr B, 848(1), 40-47, 2007. Sin embargo, las mutaciones actualmente disponibles siguen siendo sensibles al pH alcalino y la concentración de NaOH durante la limpieza suele limitarse a 0,1 M, lo que significa que es difícil conseguir una limpieza completa. Concentraciones más altas de NaOH, que mejorarían la limpieza, conducen a pérdidas de capacidad inaceptables.
Por lo tanto, todavía existe la necesidad en este campo de obtener una matriz de separación que contenga ligandos de proteína que tenga una estabilidad mejorada adicional frente a los procedimientos de limpieza alcalina.
Compendio de la invención
Un aspecto de la invención es proporcionar un polipéptido con una estabilidad alcalina mejorada. Esto se logra con un polipéptido como se define en la reivindicación 1.
Una ventaja es que la estabilidad alcalina se mejora con respecto a los polipéptidos parentales, con una unión altamente selectiva mantenida hacia inmunoglobulinas y otras proteínas que contienen Fc.
Un segundo aspecto de la invención es proporcionar un multímero con estabilidad alcalina mejorada, que comprende una pluralidad de polipéptidos. Esto se logra con un multímero como se define en las reivindicaciones. Un tercer aspecto de la invención es proporcionar un ácido nucleico o un vector que codifica un polipéptido o multímero con estabilidad alcalina mejorada. Esto se logra con un ácido nucleico o vector como se define en las reivindicaciones.
Un cuarto aspecto de la invención es proporcionar un sistema de expresión capaz de expresar un polipéptido o multímero con estabilidad alcalina mejorada. Esto se logra con un sistema de expresión como se define en las reivindicaciones.
Un quinto aspecto de la invención es proporcionar una matriz de separación capaz de unir selectivamente inmunoglobulinas y otras proteínas que contienen Fc y mostrar una estabilidad alcalina mejorada. Esto se logra con una matriz de separación como se define en las reivindicaciones.
Un sexto aspecto de la invención es proporcionar un método eficaz y económico para aislar una inmunoglobulina u otra proteína que contiene Fc. Esto se logra con un método como se define en las reivindicaciones.
Realizaciones adecuadas adicionales de la invención se describen en las reivindicaciones dependientes.
Definiciones
Los términos “anticuerpo” e “inmunoglobulina” se utilizan indistintamente en la presente memoria, y se entiende que incluyen también fragmentos de anticuerpos, proteínas de fusión que comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y conjugados que comprenden anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
Los términos “polipéptido de unión a Fc” y “proteína de unión a Fc” significan un polipéptido o proteína respectivamente, capaz de unirse a la parte cristalizable (Fc) de un anticuerpo e incluye, por ejemplo, la Proteína A y la Proteína G, o cualquier fragmento o proteína de fusión de las mismas que haya mantenido dicha propiedad de unión.
El término “enlazador” en la presente memoria significa un elemento que une dos unidades polipeptídicas, monómeros o dominios entre sí en un multímero.
El término “espaciador” en la presente memoria significa un elemento que conecta un polipéptido o un multímero polipeptídico a un soporte.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una alineación de los dominios de unión a Fc como se define en SEQ ID NO: 1-7 y 51-52.
La Figura 2 muestra los resultados del Ejemplo 2 para la estabilidad alcalina de las variantes del polipéptido Zvar tetramérico parental y mutado (SEQ ID nO 7) acoplado a un chip biosensor SPR.
La Figura 3 muestra los resultados del Ejemplo 4 para la estabilidad alcalina (NaOH 0,5 M) de las variantes del polipéptido Zvar tetramérico parental y mutado (SEQ ID NO 7) acoplado a perlas de agarosa.
La Figura 4 muestra los resultados del Ejemplo 4 para la estabilidad alcalina (NaOH 1,0 M) de las variantes del polipéptido Zvar tetramérico parental y mutado (SEQ ID NO 7) acoplado a perlas de agarosa.
Descripción detallada de las realizaciones
En un aspecto la presente invención describe un polipéptido de unión a Fc como se define en la reivindicación 1, que comprende, o consiste esencialmente en, un mutante de un dominio de unión a Fc de la Proteína estafilocócica A (SpA), según lo definido por, o que tiene al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% de identidad con, SEQ ID nO: 1 (dominio E), SEQ ID NO: 2 (dominio D), SEQ ID NO: 3 (dominio A), SEQ ID NO: 22 (variante del dominio A), SEQ ID NO: 4 (dominio B), SEQ ID NO: 5 (dominio C), SEQ ID NO: 6 (Proteína Z), SEQ ID NO: 7 (Zvar), SEQ ID NO 51 (Zvar sin los aminoácidos de la región enlazadora 1-6) o SEQ ID NO 52 (dominio C sin los aminoácidos de la región enlazadora 1-6) como se ilustra en la Figura 1, en donde al menos el residuo de asparagina (o serina, en el caso de SEQ ID NO 2) en la posición* que corresponde a la posición 11 en SEQ ID NO: 4-7 ha sido mutado a un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en ácido glutámico, y lisina.
La Proteína Z (SEQ ID NO: 6) es un dominio B mutado como se describe en el documento de Patente US5143844, mientras que SeQ ID NO 7 indica una variante mutada adicional de la Proteína Z, denominada en la presente memoria Zvar, con las mutaciones N3A, N6 D, N23T. SEQ ID NO: 22 es una variante natural del dominio A en la Proteína A de la cepa N315 de Staphylococcus aureus, que tiene una mutación A46S, utilizando la terminología de posición de la Figura 1. La mutación de N11 en estos dominios confiere una estabilidad alcalina mejorada en comparación con el dominio/polipéptido parental, sin alterar las propiedades de unión a inmunoglobulinas. Por lo tanto, el polipéptido se puede describir también como un polipéptido de unión a Fc- o inmunoglobulina, o alternativamente como una unidad polipeptídica de unión a Fc- o inmunoglobulina.
*A lo largo de esta descripción, se utiliza la convención de numeración de la posición del residuo de aminoácido de la Figura 1, y los números de posición se designan como correspondientes a los de la SEQ ID NO 4-7.
La descripción también describe un polipéptido de unión a Fc que comprende una secuencia como se define por, o que tiene al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% de identidad con SEQ ID NO 53.
SEQ ID NO 53
KEXiQ X2AFYEILX3LP NLTEEQRX4X5F IXeXyLKDXsPSXg SX10X11X12LAEAKX13
X14NDAQAPK
donde individualmente uno de otro:
XI = A o Q
X2 =E, K, Y, T, F, L, W, I, M, V, A, H o R
X3 = H o K
X4 = A o N
X5 =A o G
X6 = Q o E
X7 = S o K
X8 = E o D
X9 = Q o V
X10 = K, R o A
XII = A, E o N
X12 = I o L
X13 = K o R
X14 = L o Y
El residuo de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 9 en SEQ ID NO: 4-7 (Xi ) es una alanina. La combinación de las mutaciones en las posiciones 9 y 11 proporciona una estabilidad alcalina particularmente buena, como se muestra en los ejemplos. En realizaciones específicas, en SEQ ID NO: 7 el residuo de aminoácido en la posición 9 es una alanina y el residuo de aminoácido en la posición 11 es una lisina o ácido glutámico, por ejemplo, una lisina. Las mutaciones en la posición 9 se describen también en la solicitud de Patente en trámite PCT/SE2014/050872.
En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 50 en SEQ ID NO: 4-7 (X13) es una arginina.
El residuo de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 3 en SEQ ID NO: 4-7 es una alanina y el residuo de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 6 en SEQ ID NO: 4-7 es un ácido aspártico. En algunas realizaciones el residuo de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 43 en SEQ ID NO: 4­ 7 (X11) es una alanina o un ácido glutámico, por ejemplo, una alanina. En realizaciones específicas, los residuos de aminoácidos en las posiciones 9 y 11 en SEQ ID NO: 7 son alanina y lisina/ácido glutámico respectivamente, mientras que el residuo de aminoácido en la posición 43 es alanina o ácido glutámico.
En ciertas realizaciones el residuo de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 28 en SEQ ID NO: 4-7 (X5) es una alanina o una asparagina, por ejemplo, una alanina.
En algunas realizaciones el residuo de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 40 en SEQ ID NO: 4­ 7 (X9) es valina. En realizaciones específicas, los residuos de aminoácidos en las posiciones 9 y 11 en SEQ ID NO: 7 son alanina y ácido glutámico respectivamente, mientras que el residuo de aminoácido en la posición 40 es valina. Opcionalmente, el residuo de aminoácido en la posición 43 puede ser entonces alanina o ácido glutámico.
En ciertas realizaciones el residuo de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 42 en SEQ ID NO: 4-7 (X10) es una alanina, lisina o arginina.
En algunas realizaciones el residuo de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 18 en SEQ ID NO: 4­ 7 (X3) es una lisina o una histidina, por ejemplo, una lisina.
En ciertas realizaciones el residuo de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 33 en SEQ ID NO: 4-7 (X7) es una lisina o una serina, por ejemplo, una lisina.
En algunas realizaciones el residuo de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 37 en SEQ ID NO: 4­ 7 (X8) es un ácido glutámico o un ácido aspártico, por ejemplo, un ácido glutámico.
En ciertas realizaciones el residuo de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 51 en SEQ ID NO: 4-7 (X14) es una tirosina o una leucina, por ejemplo, una tirosina.
En algunas realizaciones, el residuo de aminoácido en la posición correspondiente a la posición 44 en SEQ ID NO: 4-7 (X12) es una leucina o una isoleucina. En realizaciones específicas, los residuos de aminoácidos en las posiciones 9 y 11 en SEQ ID NO: 7 son alanina y lisina/ácido glutámico respectivamente, mientras que el residuo de aminoácido en la posición 44 es isoleucina. Opcionalmente, el residuo de aminoácido en la posición 43 puede ser entonces alanina o ácido glutámico.
La mutación en SEQ ID NO 7, se selecciona del grupo que consiste en: Q9A, N11E, N43A;
Q9A, N11 E, N28A, N43A; Q9A, N11 E, Q40V, A42K, N43E, L44I;
Q9A, N11 E, Q40V, A42K, N43A, L44I; Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I; y
Q9A, N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y. Estas mutaciones proporcionan estabilidades alcalinas particularmente altas.
El polipéptido comprende o consiste esencialmente en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO 8 , SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11 SEQ ID NO 24, y SEQ ID NO 25. El polipéptido puede, por ejemplo, definirse mediante una secuencia seleccionada de los grupos anteriores o de subgrupos de estos grupos, pero puede comprender también residuos de aminoácidos adicionales en el extremo N- y/o C-terminal, por ejemplo, una secuencia líder en el extremo N-terminal y/o una secuencia de cola en el extremo C-terminal.
SEQ ID NO 8 Zvar(Q9A,N 11E,N43A)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 9 Zvar(Q9A,N 11E,N28A,N43A)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 10 Zvar(Q9A,Nl 1E,Q40V,A42K,N43E,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 11 Zvar(Q9A,NllE,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 12 Zvar(N 11E,Q32A)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IASLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 13 Zvar(NllE)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 14 Zvar(N 11E,Q32E,Q40E)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IESLKDDPSE SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 15 Zvar(N 11E,Q32E,K50R)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IESLKDDPSQ SANLLAEAKR LNDAQAPK
SEQ ID NO 16 Zvar(N 11K)
VDAKFDKEQQ KAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 23 Zvar(NllK,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y) VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK
SEQ ID NO 24 Zvar(Q9A,Nl 1E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I) VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 25 Zvar(Q9A,NllK,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y) VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRAAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK
SEQ ID NO 26 Zvar(Nl 1K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I) VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 27 Zvar(Q9A, NI 1K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I) VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 28 Zvar(Q9A, NI 1K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R) VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKR LNDAQAPK
SEQ ID NO 29 Zvar(Q9A,Nl 1K,H18K,D37E,A42R)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 36 B(Q9A,N11E,Q40Y,A42K,N43A,L44I)
ADNKFNKEAQ EAFYEILHLP NLNEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO 37 C(Q9A,N11E,E43A)
ADNKFNKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO 38 Zvar(NllY)
VDAKFDKEQQ YAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO 39 Zvar(Nl IT)
VDAKFDKEQQ TAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO 40 Zvar(N 11F)
VDAKFDKEQQ FAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO 41 Zvar(N 11L)
VDAKFDKEQQ LAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO 42 Zvar(Nl 1W)
VDAKFDKEQQ WAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO 43 Zvar(Nl II)
VDAKFDKEQQ IAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO 44 Zvar(Nl 1M)
VDAKFDKEQQ MAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO 45 Zvar(NllV)
VDAKFDKEQQ VAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO 46 Zvar(Nl 1A)
VDAKFDKEQQ AAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO 47 Zvar(Nl 1H)
VDAKFDKEQQ HAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO 48 Zvar(Nl IR)
VDAKFDKEQQ RAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO 49 Zvar(Q9A,Nl 1E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I) VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK SEQ ID NO 50 Zvar(Q9A,NllE,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I) VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK
En un segundo aspecto la presente invención describe un multímero que comprende, o consiste esencialmente en, una pluralidad de unidades polipeptídicas como se define por una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. El multímero puede, por ejemplo, ser un dímero, un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero, un heptámero, un octámero o un nonámero. Puede ser un homomultímero, donde todas las unidades en el multímero son idénticas o puede ser un heteromultímero, donde al menos una unidad difiere de las otras.
Ventajosamente, todas las unidades en el multímero son estables a los álcalis, por ejemplo, comprendiendo las mutaciones descritas anteriormente. Los polipéptidos se pueden unir unos con otros directamente mediante enlaces peptídicos entre los extremos C-terminal y N-terminal de los polipéptidos. Alternativamente, dos o más unidades en el multímero se pueden unir mediante enlazadores que comprenden especies oligoméricas o poliméricas, tales como elementos que comprenden hasta 15 o 30 aminoácidos, por ejemplo, 1-5, 1-10 o 5-10 aminoácidos. Este es el caso en particular para mutaciones de los polipéptidos de SEQ ID NO 51 y 52 y para SEQ ID NO 53, donde ejemplos específicos de enlazadores pueden ser, por ejemplo, VDAKFD o ADNKFN, por ejemplo, VDAKFD. La naturaleza de dicho enlazador preferiblemente no debería desestabilizar la conformación espacial de las unidades de proteínas. Esto puede lograrse, por ejemplo, evitando la presencia de prolina en los enlazadores. Además, dicho enlazador debería ser preferiblemente también suficientemente estable en entornos alcalinos para no perjudicar las propiedades de las unidades de proteína mutadas. Para este fin, es ventajoso si los enlazadores no contienen asparagina. Puede ser adicionalmente ventajoso si los enlazadores no contienen glutamina. El multímero puede comprender además en el extremo N-terminal una pluralidad de residuos de aminoácidos, por ejemplo, que se originan en el proceso de clonación o que constituyen un residuo de una secuencia de señalización eliminada. El número de residuos de aminoácidos adicionales puede ser, por ejemplo, 15 o menos, por ejemplo 10 o menos o 5 o menos. Como un ejemplo específico, el multímero puede comprender una secuencia AQ en el extremo N-terminal.
En ciertas realizaciones, el multímero puede comprender, o consistir esencialmente en, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34 y SEQ ID NO 35. Estas secuencias se enumeran a continuación y se denominan Padre(Mutaciones)n, donde n es el número de unidades de monómero en un multímero.
SEQ ID NO 17 Zvar(Q9A,N 11E,N43A)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 18 Zvar(Q9A,Nl 1E,N28A,N43A)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 19 Zvar(Q9A,N 11E,Q40V,A42K,N43E,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 20 Zvar(Q9A,N 11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 30 Zvar(NllK,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)4
AQGT VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPKC
SEQ ID NO 31 Zvar(Q9A,Nl 1K,H18K,D37E,A42R)4
AQGT VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 32 Zvar(Q9A,Nl 1E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 33 Zvar(Q9A,Nl 1E,Q40V,A42K,N43A,L44I)6
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 34 Zvar(Q9A,Nl 1E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKA ILA E A K K LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV S K A ILA E A K K LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV S K A ILA E A K K LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV S K A ILA E A K K LNDAQAPKC
SEQ ID NO 35 Zvar(Q9A,NllE,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SR AILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SR AILAEAKK LNDAQAPKC
En algunas realizaciones, el polipéptido y/o multímero, como se describió anteriormente, comprende además en el extremo C-terminal o N-terminal uno o más elementos de acoplamiento, seleccionados del grupo que consiste en uno o más residuos de cisteína, una pluralidad de residuos de lisina y una pluralidad de residuos de histidina. El/los elemento(s) de acoplamiento también se pueden localizar dentro de 1-5 residuos de aminoácidos, por ejemplo, dentro de 1-3 o 1-2 residuos de aminoácidos del extremo C-terminal o N-terminal. El elemento de acoplamiento puede ser, por ejemplo, una única cisteína en el extremo C-terminal. El/los elemento(s) de acoplamiento puede unirse directamente al extremo C- o N-terminal, o él/ellos pueden unirse mediante una extensión que comprende hasta 15 aminoácidos, por ejemplo, 1-5, 1-10 o 5-10 aminoácidos. Esta extensión sería preferiblemente también suficientemente estable en entornos alcalinos para no perjudicar las propiedades de la proteína mutada. Para este fin, es ventajoso si la extensión no contiene asparagina. Adicionalmente puede ser ventajoso si la extensión no contiene glutamina. Una ventaja de tener una cisteína C-terminal es que el acoplamiento del punto final de la proteína se puede lograr mediante la reacción del tiol de la cisteína con un grupo electrófilo sobre un soporte. Esto proporciona una excelente movilidad de la proteína acoplada que es importante para la capacidad de unión.
La estabilidad alcalina del polipéptido o multímero se puede evaluar acoplándolo a un chip SPR, por ejemplo, a los chips de un sensor Biacore CM5 como se describe en los ejemplos, utilizando, por ejemplo, las químicas de acoplamiento de NHS- o maleimida, y midiendo la capacidad de unión de inmunoglobulina del chip, utilizando normalmente IgG policlonal humana, antes y después de la incubación en disoluciones alcalinas a una temperatura especificada, por ejemplo, 22 /- 22C. La incubación puede realizarse, por ejemplo, en NaOH 0,5 M para un número de ciclos de 10 min, tal como 100 , 200 o 300 ciclos. La capacidad de la IgG de la matriz después de 100 ciclos de incubación de 10 min en NaOH 0,5 M a 22 /- 2°C puede ser al menos 55, por ejemplo, al menos 60, al menos 80 o al menos 90% de la capacidad de la IgG antes de la incubación. Alternativamente, la capacidad de la IgG restante después de 100 ciclos para un mutante particular medido como anteriormente se puede comparar con la capacidad de la IgG restante para el polipéptido/multímero parental. En este caso, la capacidad de la IgG restante para el mutante puede ser al menos 105%, por ejemplo, al menos 110%, al menos 125%, al menos 150% o al menos 200% de la del polipéptido/multímero parental.
En un tercer aspecto la presente invención describe un ácido nucleico que codifica un polipéptido o un multímero según una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente. Por tanto, la invención abarca todas las formas de la secuencia de ácido nucleico presente tales como el RNA y el DNA que codifica el polipéptido o multímero. La invención abarca un vector, tal como un plásmido, que además de la secuencia codificante comprende las secuencias de señal requeridas para la expresión del polipéptido o multímero según la invención. En una realización, el vector comprende un ácido nucleico que codifica un multímero según la invención, en donde los ácidos nucleicos separados que codifican cada unidad pueden tener secuencias de DNA homólogas o heterólogas.
En un cuarto aspecto la presente invención describe un sistema de expresión, que comprende, un ácido nucleico o un vector como se describe anteriormente. El sistema de expresión puede ser, por ejemplo, un sistema de células huésped procariotas gram-positivas o gram-negativas, por ejemplo, E. colio Bacillus sp. que ha sido modificado para expresar el presente polipéptido o multímero. En una realización alternativa, el sistema de expresión es un sistema de células huésped eucariota, como una levadura, por ejemplo, Pichia pastoris o Saccharomyces cerevisiae, o células mamíferas, por ejemplo, células CHO.
En un quinto aspecto, la presente invención describe una matriz de separación, en donde una pluralidad de polipéptidos o multímeros según una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente se ha acoplado a un soporte sólido. Dicha matriz es útil para la separación de inmunoglobulinas u otras proteínas que contienen Fc y, debido a la estabilidad alcalina mejorada de los polipéptidos/multímeros, la matriz resistirá condiciones altamente alcalinas durante la limpieza, lo cual es esencial para el uso repetido a largo plazo en un ajuste de separación de bioprocesos. La estabilidad alcalina de la matriz se puede evaluar midiendo la capacidad de unión a inmunoglobulina, utilizando normalmente IgG humana policlonal, antes y después de la incubación en disoluciones alcalinas a una temperatura especificada, por ejemplo, 22 /- 2°C. La incubación puede realizarse, por ejemplo, en NaOH 0,5 M o 1,0 M durante un número de ciclos de 15 min, por ejemplo, 100, 200 o 300 ciclos, que corresponde a un tiempo de incubación total de 25, 50 o 75 horas. La capacidad de la IgG de la matriz después de 96-100 ciclos de incubación de 15 min o un tiempo de incubación total de 24 o 25 horas en NaOH 0,5 M a 22 /- 2°C puede ser al menos 80, por ejemplo, al menos 85, al menos 90 o al menos 95% de la capacidad de la IgG antes de la incubación. La capacidad de la matriz después de un tiempo de incubación total de 24 horas en NaOH 1,0 M a 22 /- 2°C puede ser al menos 70, por ejemplo, al menos 80 o al menos 90% de la capacidad de la IgG antes de la incubación.
Como comprenderá el experto, el polipéptido o multímero expresado debería purificarse en un grado apropiado antes de inmovilizarse en un soporte. Dichos métodos de purificación son bien conocidos en el campo y la inmovilización de ligandos basados en proteínas en soportes se lleva a cabo fácilmente utilizando métodos estándar. Los métodos y soportes adecuados se analizarán a continuación con más detalle.
El soporte sólido de la matriz según la invención puede ser de cualquier tipo adecuado bien conocido. Una matriz de separación por afinidad convencional es a menudo de naturaleza orgánica y se basa en polímeros que exponen una superficie hidrófila al medio acuoso utilizado, es decir, exponen grupos hidroxilo (-OH), carboxilo (-COOH), carboxamido (-CONH2, posiblemente en formas N-sustituidas), amino (-NH2, posiblemente en formas sustituidas), oligo- o polietilenoxi en sus superficies externas y, si están presentes, también en las internas. El soporte sólido puede ser adecuadamente poroso. La porosidad puede expresarse como un valor de Kav o Kd (la fracción de volumen de poro disponible para una molécula de sonda de un tamaño particular) medido mediante cromatografía de exclusión por tamaño inverso, por ejemplo, según los métodos descritos en Gel Filtration Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology 1991, págs. 6-13. Por definición, tanto los valores de Kd como Kav siempre se encuentran dentro del rango de 0 - 1. El valor de Kav puede ser ventajosamente 0,6 - 0,95, por ejemplo, 0,7 - 0,90 o 0,6 - 0,8, medido con dextrano de peso molecular 110 kDa como una molécula sonda. Una ventaja de esto es que el soporte tiene una gran fracción de poros capaces de acomodar tanto los polipéptidos/multímeros de la invención como las inmunoglobulinas que se unen a los polipéptidos/multímeros y proporcionar transporte masivo de inmunoglobulinas hacia y desde los sitios de unión.
Los polipéptidos o multímeros puede unirse al soporte mediante técnicas de acoplamiento convencionales utilizando, por ejemplo, grupos tiol, amino y/o carboxilo presentes en el ligando. Bisepóxidos, epiclorhidrina, CNBr, N-hidroxisuccinimida (NHS) etc son agentes de acoplamiento bien conocidos. Entre el soporte y el polipéptido/multímero se puede introducir una molécula conocida como espaciador, que mejora la disponibilidad del polipéptido/multímero y facilita el acoplamiento químico del polipéptido/multímero al soporte. Dependiendo de la naturaleza del polipéptido/multímero y las condiciones de acoplamiento, el acoplamiento puede ser un acoplamiento multipunto (por ejemplo, mediante una pluralidad de lisinas) o un acoplamiento de un solo punto (por ejemplo, mediante una sola cisteína). Alternativamente, el polipéptido/multímero puede unirse al soporte mediante un enlace no covalente, tal como adsorción física o adsorción bioespecífica.
En algunas realizaciones la matriz comprende 5 - 25, tal como 5 - 20 mg/ml, 5 - 15 mg/ml, 5 - 11 mg/ml o 6 -11 mg/ml del polipéptido o multímero acoplado al soporte. La cantidad de polipéptido/multímero acoplado se puede controlar mediante la concentración de polipéptido/multímero utilizado en el proceso de acoplamiento, mediante las condiciones de activación y acoplamiento utilizadas y/o por la estructura porosa del soporte utilizado. Como regla general, la capacidad de unión absoluta de la matriz aumenta con la cantidad de polipéptido/multímero acoplado, al menos hasta un punto en que los poros se estrechan significativamente por el polipéptido/multímero acoplado. La capacidad de unión relativa por mg de polipéptido/multímero acoplado disminuirá a niveles altos de acoplamiento, dando como resultado un óptimo de costo-beneficio dentro de los rangos especificados anteriormente.
En ciertas realizaciones los polipéptidos o multímeros se acoplan al soporte mediante enlaces tioiéter. Los métodos para realizar dicho acoplamiento son bien conocidos en este campo y fácilmente realizables por el experto en este campo utilizando técnicas y equipos estándar. Los enlaces tioiéter son flexibles y estables y normalmente adecuados para su uso en cromatografía de afinidad. En particular cuando el enlace tioéter es mediante un residuo de cisteína terminal o casi terminal en el polipéptido o multímero, la movilidad del polipéptido/multímero acoplado aumenta, lo que proporciona una capacidad de unión y una cinética de unión mejoradas. En algunas realizaciones, el polipéptido/multímero se acopla mediante una cisteína C-terminal proporcionada en la proteína como se describió anteriormente. Esto permite un acoplamiento eficaz del tiol de la cisteína a grupos electrofílicos, por ejemplo, grupos epóxido, grupos halohidrina, etc. sobre un soporte, dando como resultado un acoplamiento de puente tioéter.
En ciertas realizaciones el soporte comprende un polímero polihidroxilo, tal como un polisacárido. Ejemplos de polisacáridos incluyen, por ejemplo, dextrano, almidón, celulosa, pululano, agar, agarosa, etc. Los polisacáridos son inherentemente hidrófilos con bajos grados de interacciones inespecíficas, proporcionan un alto contenido de grupos hidroxilo reactivos (activables) y generalmente son estables frente a las disoluciones de limpieza alcalinas utilizadas en el bioprocesamiento.
En algunas realizaciones el soporte comprende agar o agarosa. Los soportes utilizados en la presente invención se pueden preparar fácilmente según métodos estándar, tales como gelificación en suspensión inversa (S Hjertén: Biochim Biophys Acta 79 (2), 393-398 (1964). Alternativamente, las matrices base son productos comercialmente disponibles, tal como las perlas de agarosa reticuladas vendidas bajo el nombre de SEPHAROSE™ FF (GE Healthcare). En una realización, que es especialmente ventajosa para las separaciones a gran escala, el soporte se ha adaptado para aumentar su rigidez utilizando los métodos descritos en los documentos de Patente US6602990 o US7396467 y por lo tanto hacen que la matriz sea más adecuada para caudales altos.
En ciertas realizaciones el soporte, tal como un soporte de polisacárido o agarosa, está reticulado, como por ejemplo con reticulaciones de hidroxialquil éter. Los reactivos reticulantes que producen dichas reticulaciones pueden ser, por ejemplo, epihalohidrinas como epiclorhidrina, diepóxidos como butanodiol diglicidil éter, reactivos alilantes como el haluro de alilo o el alil glicidil éter. La reticulación es beneficiosa para la rigidez del soporte y mejora la estabilidad química. Las reticulaciones de hidroxialquil éter son estables a los álcalis y no provocan una adsorción inespecífica significativa.
Alternativamente, el soporte sólido se basa en polímeros sintéticos, tales como alcohol polivinílico, acrilatos de polihidroxialquilo, metacrilatos de polihidroxialquilo, poliacrilamidas, polimetacrilamidas, etc. En caso de polímeros hidrófobos, tales como matrices basadas en bencenos divinil y monovinil sustituidos, la superficie de la matriz se hidrofiliza a menudo para exponer los grupos hidrófilos como se definió anteriormente a un líquido acuoso circundante. Dichos polímeros se producen fácilmente según métodos estándar, véase, por ejemplo, “Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization” (R Arshady: Chimica e L’Industria 70(9), 70-75 (1988)). Alternativamente, se utiliza un producto comercialmente disponible, tal como SOURCETM (GE Healthcare). En otra alternativa, el soporte sólido según la invención comprende un soporte de naturaleza inorgánica, por ejemplo, sílice, óxido de circonio, etc.
En otra realización más, el soporte sólido tiene otra forma, como una superficie, un chip, capilares, o un filtro (por ejemplo, una membrana o una matriz de filtro de profundidad).
En cuanto a la forma de la matriz según la invención, en una realización la matriz está en la forma de un monolito poroso. En una realización alternativa, la matriz está en forma de perlas o partículas que pueden ser porosas o no porosas. Las matrices en forma de perlas o partículas se pueden utilizar como lecho empacado o en forma suspendida. Las formas suspendidas incluyen las conocidas como lechos expandidos y suspensiones puras, en las que las partículas o perlas pueden moverse libremente. En el caso de monolitos, lechos empacados y lechos expandidos, el procedimiento de separación sigue comúnmente la cromatografía convencional con un gradiente de concentración. En caso de la suspensión pura, se utilizará el modo por lotes.
En un sexto aspecto, la presente invención describe un método para aislar una inmunoglobulina, en donde se utiliza una matriz de separación como se describió anteriormente.
En ciertas realizaciones, el método comprende las etapas de:
a) poner en contacto una muestra líquida que comprende una inmunoglobulina con una matriz de separación como se describió anteriormente,
b) lavar dicha matriz de separación con un líquido de lavado,
c) eluir la inmunoglobulina desde la matriz de separación con un líquido de elución, y
d) limpiar la matriz de separación con un líquido de limpieza, que puede llamarse alternativamente líquido de limpieza in situ (CIP), por ejemplo, con un tiempo de contacto (incubación) de al menos 10 min.
El método puede comprender también las etapas de, antes de la etapa a), proporcionar una matriz de separación por afinidad según una cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente y proporcionar una disolución que comprenda una inmunoglobulina y al menos otra sustancia como una muestra líquida y de, después de la etapa c), recuperar el eluido y opcionalmente someter el eluido a etapas de separación adicionales, por ejemplo, mediante una cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía multimodal y/o cromatografía de interacción hidrófoba. Las composiciones adecuadas de la muestra líquida, el líquido de lavado y el líquido de elución, así como las condiciones generales para realizar la separación son bien conocidas en la técnica de la cromatografía de afinidad y en particular en la técnica de cromatografía de la Proteína A. La muestra líquida que comprende una proteína que contiene Fc y al menos otra sustancia puede comprender proteínas de células huésped (HCP), tales como células CHO, E Coli o proteínas de levadura. Los contenidos de células CHO y de proteínas de E Coli se pueden determinar convenientemente mediante inmunoensayos dirigidos hacia estas proteínas, por ejemplo, los kits de ELISA CHO HCP o E Coli HCP de Cygnus Techologies. Las proteínas de células huésped o proteínas de células CHO/E Coli se pueden desorber durante la etapa b).
La elución se puede realizar utilizando cualquier disolución adecuada utilizada para la elución del medio de Proteína A. Esta puede ser, por ejemplo, una disolución o tampón con pH 5 o menor, tal como pH 2,5 - 5 o 3 - 5. Puede ser también en algunos casos una disolución o tampón con pH 11 o mayor, tal como pH 11 - 14 o pH 11 - 13. En algunas realizaciones el tampón de elución o el gradiente del tampón de elución comprende al menos un ácido carboxílico mono- di- o trifuncional o una sal de dicho ácido carboxílico. En ciertas realizaciones el tampón de elución o el gradiente del tampón de elución comprende al menos una especie aniónica seleccionada del grupo que consiste en acetato, citrato, glicina, succinato, fosfato, y formiato.
En algunas realizaciones, el líquido de limpieza es alcalino, por ejemplo, con un pH de 13 - 14. Dichas disoluciones proporcionan una limpieza eficaz de la matriz, en particular en el extremo superior del intervalo.
En ciertas realizaciones, el líquido de limpieza comprende NaOH o KOH 0,1-2,0 M, por ejemplo, NaOH o KOH 0,5­ 2,0 o 0,5-1,0 M. Estas son disoluciones de limpieza eficientes, y en particular cuando la concentración de NaOH o KOH es superior a 0,1 M o al menos 0,5 M. La alta estabilidad de los polipéptidos de la invención permite el uso de dichas disoluciones fuertemente alcalinas.
El método puede incluir también una etapa de desinfección de la matriz con un líquido de desinfección, que puede comprender, por ejemplo, un peróxido, tal como peróxido de hidrógeno y/o un perácido, tal como ácido peracético o ácido perfórmico.
En algunas realizaciones, las etapas a)-d) se repiten al menos 10 veces, por ejemplo, al menos 50 veces o 50 - 200 veces, 50 - 300 o 50 - 500 veces. Esto es importante para la economía del proceso ya que la matriz se puede reutilizar muchas veces.
Las etapas a) - c) pueden repetirse también al menos 10 veces, por ejemplo, al menos 50 veces, 50 - 200, 50 - 300 o 50 - 500 veces, realizándose la etapa d) después de una pluralidad de ejemplos de la etapa c), de modo que la etapa d) se realiza al menos 10 veces, por ejemplo, al menos 50 veces. La etapa d) se puede realizar, por ejemplo, desde cada segundo hasta el vigésimo ejemplo de la etapa c).
Ejemplos
Mutagénesis de proteína
La mutagénesis dirigida al sitio se realizó mediante una PCR de dos etapas utilizando oligonucleótidos que codifican las mutaciones. Como plantilla se utilizó un plásmido que contiene un único dominio de Z, B o C. Los fragmentos de PCR se ligaron en un vector de expresión de E. Coli. Se utilizó secuenciación de DNA para verificar la secuencia correcta de los fragmentos insertados.
Para formar multímeros de mutantes se utilizó un sitio Acc I localizado en los codones de inicio (GTA GAC) del dominio B, C o Z, que corresponde a los aminoácidos VD. El vector para el dominio monomérico se digirió con Acc I y trató con fosfatasa. Se diseñaron cebadores de extremos pegajosos Acc I, específicos para cada variante, y se generaron dos productos de PCR superpuestos de cada plantilla. Los productos de PCR se purificaron y la concentración se estimó por comparación de los productos de PCR sobre gel de agarosa al 2%. Se hibridaron cantidades iguales de los productos de PCR por parejas (902C ^ 252C en 45 minutos) en tampón de ligación. El producto resultante consiste aproximadamente en % de fragmentos que probablemente se ligarán en un sitio Acc I (fragmentos de PCR correctos y/o el vector digerido). Después de la ligación y la transformación, las colonias se cribaron por PCR para identificar los constructos que contienen el mutante deseado. Los clones positivos se verificaron mediante secuenciación de DNA.
Expresión del constructo y purificación
Los constructos se expresaron en el periplasma bacteriano mediante fermentación de E. Coli K12 en medio estándar. Después de la fermentación las células se trataron térmicamente para liberar el contenido de periplasma en el medio. Los constructos liberados en el medio se recuperaron por microfiltración con una membrana que tiene un tamaño de poro de 0,2 pm.
Cada constructo, ahora en el permeado de la etapa de filtración, se purificó por afinidad. El permeado se cargó en un medio de cromatografía que contenía la IgG inmovilizada (IgG Sepharose 6 FF, GE Healthcare). El producto cargado se lavó con una disolución salina tamponada con fosfato y se eluyó disminuyendo el pH.
El conjunto de elución se ajustó a un pH neutro (pH 8) y se redujo mediante la adición de ditiotreitol. La muestra se cargó después en un intercambiador aniónico. Después de la etapa de lavado el constructo se eluyó en un gradiente de NaCl para separarlo de cualquier contaminante. El conjunto de elución se concentró mediante ultrafiltración a 40­ 50 mg/ml. Cabe señalar que la purificación por afinidad satisfactoria de un constructo en un medio de IgG inmovilizada indica que el constructo en cuestión tiene una alta afinidad por la IgG.
Los ligandos purificados se analizaron con RPC LC-MS para determinar la pureza y comprobar que el peso molecular correspondía al esperado (basado en la secuencia de aminoácidos).
Ejemplo 1
Los ligandos monoméricos purificados listados en la Tabla 1, que comprenden además una secuencia líder AQGT en el extremo N-terminal y una cisteína en el extremo C-terminal, se inmovilizaron en los chips de sensor Biacore CM5 (GE Healthcare, Sweden), utilizando el kit de acoplamiento de amina de GE Helathcare (para el acoplamiento de carbodiimidas de aminas en los grupos carboximetilo en el chip) en una cantidad suficiente para dar una intensidad de señal de aproximadamente 200-1500 RU en un instrumento de resonancia de plasmón superficial Biacore (SPR) (GE Healthcare, Sweden). Para seguir la capacidad de unión de IgG de la superficie inmovilizada, se hizo fluir 1mg/ml de IgG policlonal humana (Gammanorm) sobre el chip y se anotó la intensidad de la señal (proporcional a la cantidad de unión). A continuación, la superficie se sometió a una limpieza in situ (CIP), es decir, se lavó abundantemente con NaOH 500 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente (22 /- 2°C). Esto se repitió durante 96-100 ciclos y la estabilidad alcalina del ligando inmovilizado se siguió como la capacidad de unión de la IgG restante (intensidad de señal) después de cada ciclo. Los resultados se muestran en la Tabla 1 e indican que al menos los ligandos Zvar(N11K)1, Zvar(N11E)1, Zvar(N11Y)1, Zvar(N11T)1, Zvar(N11F)1, Zvar(N11L)1, Zvar(N11W)1, ZN111)1, Zvar(N11M)1, Zvar(N11V)1, Zvar(N11A)1, Zvar(N11H1), Zvar(N11R)1, Zvar(N11E, Q32A)1, Zvar(N11E, Q32E, Q40E)1 y Zvar(N11E, Q32E, K50R)1, Zvar(Q9A, N11E, N43A)1, Zvar(Q9A, N11E, N28A, N43A)1, Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I)1, Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)1, Zvar(Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I)1, Zvar(N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)1, Zvar(Q9A, N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)1, Zvar(N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I) 1, Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I)1 y Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R)1 tienen una estabilidad alcalina mejorada en comparación con la estructura Zvar1 parental, utilizada como referencia. Además, los ligandos B(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I) 1 y C(Q9A, N11E, E43A)1 tienen una estabilidad mejorada en comparación con los dominios B y C parentales, utilizados como referencia.
Tabla 1. Ligandos monoméricos, evaluados por Biacore (NaOH 0,5 M)
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Ejemplo 2
Los ligandos tetraméricos y hexaméricos purificados indicados en la Tabla 2 se inmovilizaron en los chips de sensor Biacore CM5 (GE Healthcare, Sweden), utilizando el kit de acoplamiento de amina de GE Helathcare (para el acoplamiento de carbodiimidas de aminas en los grupos carboximetilo en el chip) en una cantidad suficiente para dar una intensidad de señal de aproximadamente 200-1500 RU en un instrumento Biacore (GE Healthcare, Sweden). Para seguir la capacidad de unión de la IgG de la superficie inmovilizada, se hizo fluir 1mg/ml de la IgG policlonal humana (Gammanorm) sobre el chip y se anotó la intensidad de la señal (proporcional a la cantidad de unión). A continuación, la superficie sometió a una limpieza in situ (CIP), es decir, se lavó abundantemente con NaOH 500 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente (22 /- 2°C). Esto se repitió durante 300 ciclos y la estabilidad alcalina del ligando inmovilizado se siguió como la capacidad de unión de la IgG restante (intensidad de señal) después de cada ciclo. Los resultados se muestran en la Tabla 2 y en la Figura 2 e indican que al menos los ligandos Zvar(Q9A, N11E, N43A)4, Zvar(Q9A, N11E, N28A, N43A)4, Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I)4 y Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4, Zvar(Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4 y Zvar(Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42R, N43A, L44I)4 tienen una estabilidad alcalina mejorada en comparación con la estructura de Zvar4 parental, que se utilizó como referencia. El ligando hexamérico Zvar(Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)6 tiene también una estabilidad alcalina mejorada en comparación con la estructura Zvar6 parental, utilizada como referencia.
Tabla 2. Ligandos tetraméricos y hexaméricos, evaluados por Biacore (NaOH 0,5 M).
Figure imgf000015_0002
Ejemplo 3
El Ejemplo 2 se repitió con 100 ciclos CIP de tres ligandos utilizando NaOH 1 M en vez de 500 mM como en el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Tabla 3 y muestran que los tres ligandos tienen una estabilidad alcalina mejorada también en NaOH 1 M, en comparación con la estructura Zvar4 parental que se utilizó como referencia.
Tabla 3. Ligandos tetraméricos, evaluados por Biacore (NaOH 1 M).
Figure imgf000016_0001
Ejemplo 4
Los ligandos tetraméricos de la Tabla 2 (todos con una cisteína N-terminal adicional) se inmovilizaron sobre perlas de agarosa utilizando los métodos descritos a continuación y evaluados para la capacidad y estabilidad. Los resultados se muestran en la Tabla 4 y la Figura 3.
Tabla 4. Matrices con ligandos tetramétricos, evaluados en columnas (NaOH 0,5 M)
Figure imgf000016_0002
Activación
La matriz base utilizada fueron perlas de agarosa reticuladas rígidas de 85 micrómetros de diámetro medio (ponderado en volumen, d50V), preparadas según los métodos del documento de Patente US6602990 y con un tamaño de poro correspondiente a un valor de Kav de cromatografía de filtración en gel inversa de 0,70 para el dextrano de peso molecular 110 kDa, según los métodos descritos en Gel Filtration Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology 1991, págs. 6-13.
Se mezclaron 25 mL (g) de matriz base drenada, 10,0 mL de agua destilada y 2,02 g de NaOH (s) en un matraz de 100 mL con agitación mecánica durante 10 min a 25°C. Se añadieron 4,0 mL de epiclorhidrina y la reacción progresó durante 2 horas. El gel activado se lavó con 10 volúmenes de sedimento de gel (GV) de agua.
Acoplamiento
A 20 mL de disolución de ligando (50 mg/mL) en un tubo Falcon de 50 ml se añadieron 169 mg de NaHCO3, 21 mg de Na2CO3, 175 mg de NaCl y 7 mg de EDTA. El tubo Falcon se colocó en una mesa giratoria durante 5-10 minutos, y después se añadieron 77 mg de DTE. La reducción prosiguió durante > 45 minutos. La disolución de ligando se desaló, después, en una columna PD10 empaquetada con Sephadex G-25. El contenido de ligando en la disolución desalada se determinó midiendo la absorción de UV a 276 nm.
El gel activado se lavó con 3-5 GV {fosfato 0,1 M/EDTA 1 mM pH 8 ,6 } y después el ligando se acoplo según el método descrito en el documento de Patente US6399750. Todos los tampones utilizados en los experimentos se habían desgasificado con gas nitrógeno durante al menos 5-10 minutos. El contenido de ligando de los geles se podía controlar variando la cantidad y la concentración de la disolución de ligando.
Después de la inmovilización los geles se lavaron 3xGV con agua destilada. Los geles 1 GV {fosfato 0,1 M/EDTA 1 mM/tioglicerol al 10% pH 8 ,6 } se mezclaron y los tubos se dejaron en una mesa de agitación a temperatura ambiente durante la noche. Después, los geles se lavaron alternativamente con 3xGV {TRIS 0,1 M/NaCl 0,15 M pH 8 ,6} y HAc 0,5 M y después 8-10xGV con agua destilada. Las muestras de gel se enviaron a un laboratorio externo para el análisis de aminoácidos y el contenido de ligando (mg/ml de gel) se calculó a partir del contenido total de aminoácidos.
Proteína
165 mg/ml de Gammanorm (Octapharma), diluido a 2 mg/ml en tampón de equilibrio.
Tampón de equilibrio
Tampón fosfato PBS 10 mM NaCl 0,14 M KCl 0,0027 M, pH 7,4 (Medicago)
Tampón de adsorción
Tampón fosfato PBS 10 mM NaCl 0,14 M KCl 0,0027 M, pH 7,4 (Medicago)
Tampones de elución
Acetato 100 mM pH 2,9
Capacidad de unión dinámica
Se empaquetaron 2 ml de resina en columnas TRICORN™ 5 100. La capacidad de progreso se determinó con un sistema ÁKTAExplorer 10 a un tiempo de residencia de 6 minutos (caudal de 0,33 ml/min). Se pasó el tampón de equilibrio a través de la columna de derivación hasta que se obtuvo una línea base estable. Esto se hizo antes de la puesta a cero automática. La muestra se aplicó a la columna hasta que se obtuvo una señal de UV del 100%. Después, se aplicó de nuevo el tampón de equilibrio hasta que se obtuvo una línea base estable.
La muestra se cargó en la columna hasta que se alcanzó una señal de UV del 85% de la absorbancia máxima. Después, la columna se lavó con 5 volúmenes de columna (CV) de tampón de equilibrio a un caudal de 0,5 ml/min. La proteína se eluyó con tampón de elución con 5 CV a un caudal de 0,5 ml/min. Después, la columna se lavó con NaOH 0,5 M a un caudal de 0,2 ml/min y se volvió a equilibrar con tampón de equilibrio.
Para el cálculo de la capacidad de progreso al 10%, se utilizó la siguiente ecuación. Esa es la cantidad de IgG que se carga en la columna hasta que la concentración de IgG en el efluente de la columna es el 10% de la concentración de la IgG en la alimentación.
Figure imgf000017_0001
A100% = 100% de señal de UV
Asub = contribución a la absorbancia de la subclase de IgG no enlazante;
A(V) = absorbancia de un volumen aplicado dado;
Vc = volumen de columna;
Vapp = volumen aplicado hasta un progreso del 10%;
Vsys = volumen muerto del sistema;
C0 = concentración de la alimentación.
Se calculó la capacidad de unión dinámica (DBC) a un progreso del 10%. La capacidad de unión dinámica (DBC) se calculó para un progreso del 10 y 80%.
CIP - NaOH 0,5 M
La DBC (Qb10) a un progreso del 10% se determinó tanto antes como después de exposiciones repetidas a disoluciones de limpieza alcalinas. Cada ciclo incluyó una etapa CIP con NaOH 0,5 M bombeada a través de la columna a un caudal de 0,5 /min durante 20 minutos, después de lo cual la columna se dejó en reposo durante 4 h. La exposición tuvo lugar a temperatura ambiente (22 /- 2°C). Después de esta incubación, la columna se lavó con tampón de equilibrio durante 20 minutos a un caudal de 0,5 ml/min. La Tabla 4 muestra la capacidad remanente después de seis ciclos de 4 h (es decir, un tiempo de exposición acumulativo de 24 h a NaOH 0,5 M), tanto en números absolutos como relativos a la capacidad inicial.
Ejemplo 5
El Ejemplo 4 se repitió con los ligandos tetraméricos mostrados en la Tabla 5, pero con el NaOH 1,0 M utilizado en las etapas CIP en vez de 0,5 M. Los resultados se muestran en la Tabla 5 y la Figura 4.
Tabla 5. Matrices con ligandos tetraméricos, evaluados en columnas - NaOH 1,0 M.
Figure imgf000018_0001
Esta descripción escrita utiliza ejemplos para describir la invención, incluyendo el mejor modo, y también para permitir que cualquier persona experta en la técnica practique la invención, incluyendo la fabricación y el uso de cualquier dispositivo o sistema y la realización de cualquier método incorporado. El alcance patentable de la invención está definido por las reivindicaciones, y puede incluir otros ejemplos que se les ocurran a los expertos en la técnica. Estos otros ejemplos están destinados a estar dentro del alcance de las reivindicaciones si tienen elementos estructurales que no difieren del lenguaje literal de las reivindicaciones.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido de unión a Fc que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 8 , SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 24, y SEQ ID NO 25.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO 8 , SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10 y SEQ ID NO 11.
3. Un multímero que comprende o consiste esencialmente en una pluralidad de polipéptidos como se define por cualquier reivindicación anterior.
4. El multímero de la reivindicación 3, en donde los polipéptidos se unen mediante enlazadores que comprenden hasta 15 aminoácidos.
5. El polipéptido o multímero de cualquier reivindicación anterior, que comprende además uno o más elementos de acoplamiento en el extremo C-terminal o N-terminal, seleccionados del grupo que consiste en uno o más residuos de cisteína, una pluralidad de residuos de lisina y una pluralidad de residuos de histidina.
6. Una matriz de separación, en donde una pluralidad de polipéptidos o multímeros de cualquier reivindicación anterior se acopla a un soporte sólido, tal como en donde los polipéptidos o multímeros se acoplan a un soporte sólido mediante enlaces tioéter.
7. La matriz de separación de la reivindicación 6 , en donde el soporte sólido es un polisacárido.
8. Un método para aislar una inmunoglobulina, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto una muestra líquida que comprende una inmunoglobulina con la matriz de separación de una cualquiera de las reivindicaciones 6-7,
b) lavar dicha matriz de separación con un líquido de lavado,
c) eluir la inmunoglobulina de la matriz de separación con un líquido de elución, y
d) limpiar la matriz de separación con un líquido de limpieza alcalino.
9. El método de la reivindicación 8 , en donde el líquido de limpieza comprende NaOH o KOH 0,1-1,0 M.
10. El método de la reivindicación 8 , en donde el líquido de limpieza comprende NaOH o KOH 0,5-1,0 M.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde las etapas a) - d) se repiten al menos 10 veces, tal como al menos 50 veces o 50 - 200 veces.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en donde las etapas a) - c) se repiten al menos 10 veces, tal como al menos 50 veces o 50 - 200 veces y en donde la etapa d) se lleva a cabo después de una pluralidad de casos de la etapa c), tal como al menos 10 o al menos 50 veces.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8-12, en donde la muestra líquida comprende además proteínas de células huésped.
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Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE0200943D0 (sv) * 2002-03-25 2002-03-25 Amersham Biosciences Ab Mutant protein
US11566082B2 (en) * 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US10208091B2 (en) 2014-12-17 2019-02-19 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Modified kappa light chain-binding polypeptides
JP6891114B2 (ja) * 2015-07-22 2021-06-18 株式会社カネカ 酸性ｐＨ領域での抗体結合能が低下した抗体結合性タンパク質
GB201515339D0 (en) 2015-08-28 2015-10-14 Ge Healthcare Bio Sciences Ab A seperation matrix and a method of seperating antibodies
CA3022751A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Navigo Proteins Gmbh Targeted compounds for the site-specific coupling of chemical moieties comprising a peptide linker
JP7031934B2 (ja) * 2016-05-11 2022-03-08 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックス
CN109311949B (zh) * 2016-05-11 2022-09-16 思拓凡生物工艺研发有限公司 储存分离基质的方法
CN109071612B (zh) * 2016-05-11 2022-10-25 思拓凡生物工艺研发有限公司 突变的免疫球蛋白结合多肽
ES2874974T3 (es) 2016-05-11 2021-11-05 Cytiva Bioprocess R & D Ab Matriz de separación
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
EP3455242B1 (en) * 2016-05-11 2021-06-23 Cytiva BioProcess R&D AB Separation method
US11753438B2 (en) 2016-05-11 2023-09-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
AU2017311541B2 (en) * 2016-08-11 2020-08-13 Navigo Proteins Gmbh Novel alkaline stable immunoglobulin-binding proteins
GB201703116D0 (en) 2017-02-27 2017-04-12 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab A seperation matrix and a method of seperating antibodies
US11660550B2 (en) 2017-03-07 2023-05-30 Jmva Biotech Ab Modified adsorptive surfaces
EP3521304B9 (en) * 2018-02-01 2023-10-04 Repligen Corporation Fc binding proteins with cysteine in the c-terminal helical region
EP3546476A1 (en) * 2018-03-26 2019-10-02 Repligen Corporation Fc binding proteins with cysteine in the c-terminal helical region
AU2018314651B2 (en) 2017-08-07 2022-12-15 Repligen Corporation Fc binding proteins with Cysteine in the C-terminal helical region
US11709155B2 (en) 2017-09-18 2023-07-25 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved chromatography of metal interacting analytes
US11709156B2 (en) 2017-09-18 2023-07-25 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved analytical analysis
EP3706804B1 (en) 2017-11-07 2022-02-23 Navigo Proteins GmbH Fusion proteins with specificity for ed-b and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer
JP7306270B2 (ja) * 2017-11-09 2023-07-11 東ソー株式会社 免疫グロブリン結合性タンパク質
GB2569585A (en) 2017-12-20 2019-06-26 Ge Healthcare Bio Sciences Ab A method for preparation of a separation matrix
GB201800448D0 (en) * 2018-01-11 2018-02-28 Puridify Ltd Chromatography media and methods for producing them
EP3774861A1 (en) 2018-03-28 2021-02-17 Bristol-Myers Squibb Company Interleukin-2/interleukin-2 receptor alpha fusion proteins and methods of use
WO2020010117A2 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Bristol-Myers Squibb Company Fgf21 formulations
US20210179671A1 (en) * 2018-08-24 2021-06-17 Jsr Corporation Immunoglobulin-binding protein, and affinity carrier using same
BR112021013026A2 (pt) * 2019-02-01 2021-10-13 Navigo Proteins Gmbh Proteínas de ligação à imunoglobulina, matriz de separação por afinidade, uso da proteína de ligação à imunoglobulina, e método de purificação por afinidade de uma proteína compreendendo uma sequência de imunoglobulina
GB201904125D0 (en) 2019-03-26 2019-05-08 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Method for sanitization of a chromatography column
JP7432813B2 (ja) 2019-09-10 2024-02-19 東ソー株式会社 免疫グロブリン結合性タンパク質
CN114502569A (zh) * 2019-10-08 2022-05-13 北卡罗莱纳州立大学 免疫球蛋白纯化肽及其用途
US11918936B2 (en) 2020-01-17 2024-03-05 Waters Technologies Corporation Performance and dynamic range for oligonucleotide bioanalysis through reduction of non specific binding
WO2022081779A1 (en) 2020-10-13 2022-04-21 Avitide LLC Affinity ligand libraries of three-helix bundle proteins and uses thereof
KR20240000462A (ko) 2021-02-19 2024-01-02 아비타이드 엘엘씨 Aav2 친화성 제제
GB202113626D0 (en) 2021-09-24 2021-11-10 Cytiva Bioprocess R & D Ab FC binding polypeptides
GB202203478D0 (en) 2022-03-14 2022-04-27 Cytiva Bioprocess R & D Ab Vh3 binding polypeptides
CN117700501A (zh) * 2022-09-13 2024-03-15 普米斯生物技术(珠海)有限公司 免疫球蛋白结合蛋白及其应用

Family Cites Families (166)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE451946B (sv) 1982-12-10 1987-11-09 Gambro Lundia Ab Anordning for avlegsnande av en eller flera fraktioner ur helblod, plasma eller liknande kroppsvetskor
US4704366A (en) 1984-06-22 1987-11-03 Bio-Rad Laboratories, Inc. Process for binding IgG to protein A
SE8505922D0 (sv) 1985-12-13 1985-12-13 Kabigen Ab Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering
US4801687A (en) 1986-10-27 1989-01-31 Bioprobe International, Inc. Monoclonal antibody purification process using protein A
EP0623679B1 (en) * 1987-05-21 2003-06-25 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US5011686A (en) 1987-09-21 1991-04-30 Creative Biomolecules, Inc. Thrombus specific conjugates
US5084398A (en) 1987-11-20 1992-01-28 Creative Biomolecules Selective removal of immune complexes
US4933435A (en) 1989-04-05 1990-06-12 Bioprobe International Antibody purification process
EP0550771B1 (en) * 1991-07-25 1999-09-29 Oriental Yeast Co., Ltd. Immunoglobulin-binding artificial protein
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
SE9503925D0 (sv) 1995-11-07 1995-11-07 Pharmacia Biotech Ab Separationsmedium för IgG
SE9601368D0 (sv) 1996-04-11 1996-04-11 Pharmacia Biotech Ab Process for the production of a porous cross-linked polysaccharide gel
DE69739673D1 (de) 1996-11-27 2009-12-31 Genentech Inc Affinitätsreinigung von Polypeptid-Proteinen auf einer Protein A Matrix
EP2048154B2 (en) 2002-02-05 2015-06-03 Genentech, Inc. Protein purification
SE0200943D0 (sv) 2002-03-25 2002-03-25 Amersham Biosciences Ab Mutant protein
US7709209B2 (en) 2002-03-25 2010-05-04 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Protein ligands
EP1545574B8 (en) 2002-09-13 2014-09-24 Biogen Idec Inc. Method of purifying polypeptides by simulated moving bed chromatography
WO2004050847A2 (en) 2002-11-27 2004-06-17 Gtc Biotherapeutics, Inc. Modified antibodies stably produced in milk and methods of producing same
US8084032B2 (en) 2004-01-21 2011-12-27 Ajinomoto Co., Inc. Purification method which prevents denaturation of an antibody
SE0400274D0 (sv) 2004-02-09 2004-02-09 Affibody Ab New polypeptide
SE0402322D0 (sv) 2004-09-22 2004-09-22 Amersham Biosciences Ab Method of preparing a chromatography matrix
JP2006304633A (ja) 2005-04-26 2006-11-09 Apro Life Science Institute Inc イムノグロブリン結合タンパク質
ES2402650T3 (es) 2005-06-17 2013-05-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Métodos de purificación de anticuerpos anti A beta
MX2008002101A (es) 2005-08-12 2008-04-19 Schering Corp Fusiones de la proteina-1 quimiotactica de monocito.
AU2007204987B2 (en) 2006-01-06 2011-11-24 Amgen Inc. Methods and systems for isolating target molecules from complex solutions by column-chromatography using eluants containing organic solvents
MX2008009220A (es) 2006-01-17 2008-10-10 Biolex Therapeutics Inc Composiciones y metodos para la humanizacion y optimizacion de n-glicanos en plantas.
WO2007097361A1 (ja) 2006-02-21 2007-08-30 Protenova Co., Ltd. イムノグロブリン親和性リガンド
US8263750B2 (en) 2006-03-16 2012-09-11 Amgen Inc. Method for purifying a protein using protein-A affinity chromatography using an intermediate wash step
DK2004683T3 (en) 2006-03-24 2016-08-22 Biogen Hemophilia Inc PC5 AS A FACTOR IX PROPEPTID PROCESSING ENZYM
US8377448B2 (en) 2006-05-15 2013-02-19 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders
WO2007144476A1 (fr) 2006-06-16 2007-12-21 Groupe Novasep Procede de separation sequence multicolonnes
EP1873166B1 (en) 2006-06-30 2010-09-08 CONARIS research institute AG Improved sgp 130Fc dimers
CA2661872A1 (en) 2006-08-28 2008-03-06 Ares Trading S.A. Process for the purification of fc-fusion proteins
JP5386354B2 (ja) 2006-09-08 2014-01-15 ワイス・エルエルシー アフィニティークロマトグラフィーを使用するタンパク質精製におけるアルギニン洗浄
US8329860B2 (en) 2006-09-29 2012-12-11 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Chromatography ligand comprising domain C from Staphylococcus aureus protein A for antibody isolation
US8853371B2 (en) 2006-10-19 2014-10-07 Janssen Biotech, Inc. Process for preparing unaggregated antibody Fc domains
EP2099932A4 (en) 2006-12-06 2009-11-18 Repligen Corp NUCLEIC ACIDS ENCODING THE RECOMBINANT PROTEIN A
US20080167450A1 (en) 2007-01-05 2008-07-10 Hai Pan Methods of purifying proteins
US8198409B2 (en) 2007-05-21 2012-06-12 Nomadic Bioscience Co., Ltd. Polypeptide, an affinity chromatography material, and a method for separating and/or purifying immunoglobulin
WO2008153472A1 (en) 2007-06-15 2008-12-18 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Chromatography method
EP2280998A1 (en) 2008-04-23 2011-02-09 Symphogen A/S Methods for manufacturing a polyclonal protein
US8592555B2 (en) 2008-08-11 2013-11-26 Emd Millipore Corporation Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity
MX2011001696A (es) 2008-08-14 2011-03-25 Merck Sharp & Dohme Metodos para purificar anticuerpos usando cromatografia de afinidad con proteina a.
JP5229888B2 (ja) 2008-09-30 2013-07-03 独立行政法人産業技術総合研究所 弱酸性域での易解離性を向上したプロテインａ変異型タンパク質及び抗体捕捉剤
US8183207B2 (en) 2008-11-26 2012-05-22 Five Prime Therapeutics, Inc. Treatment of osteolytic disorders and cancer using CSF1R extracellular domain fusion molecules
WO2010062399A2 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Five Prime Therapeutics, Inc. Csf1r extracellular domain fusion molecules and treatments using same
SG195555A1 (en) 2008-12-24 2013-12-30 Emd Millipore Corp Caustic stable chromatography ligands
EP2412809B1 (en) 2009-03-24 2017-08-09 Kaneka Corporation Protein having affinity for immunoglobulin, and immunoglobulin-binding affinity ligand
WO2010120514A2 (en) 2009-03-31 2010-10-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antigen-binding proteins comprising recombinant protein scaffolds
EP2421892A1 (en) 2009-04-20 2012-02-29 Pfizer Inc. Control of protein glycosylation and compositions and methods relating thereto
US20120091063A1 (en) 2009-06-26 2012-04-19 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method in a chromatography system
EP2445936A1 (en) 2009-06-26 2012-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
WO2011023785A1 (en) 2009-08-27 2011-03-03 Novo Nordisk A/S Targeting tissue factor to activated platelets
EP2483310B1 (en) 2009-09-29 2014-08-13 Roche Glycart AG Bispecific death receptor agonistic antibodies
SG10201408384PA (en) 2009-12-18 2015-01-29 Novartis Ag Wash solution and method for affinity chromatography
EP2526114B1 (de) 2010-01-22 2014-06-18 Boehringer Ingelheim International GmbH Chromatographisches verfahren zur aufreinigung von fc enthaltenden proteinen
AU2011222991B2 (en) 2010-03-05 2015-07-16 Boehringer Ingelheim International Gmbh Selective enrichment of antibodies
US10273270B2 (en) 2010-03-24 2019-04-30 Kaneka Corporation Protein capable of binding specifically to immunoglobulin, and immunoglobulin-binding affinity ligand
FR2958936A1 (fr) 2010-04-14 2011-10-21 Sanofi Aventis Proteine de fusion robo1-fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs
MX2012011986A (es) 2010-04-15 2013-03-05 Amgen Inc RECEPTOR FGF HUMANO Y PROTEINAS ENLAZADAS A ß-KLOTHO.
WO2011133886A2 (en) 2010-04-23 2011-10-27 Genentech, Inc. Production of heteromultimeric proteins
KR101152036B1 (ko) 2010-04-27 2012-06-08 (주)셀트리온 컬럼 순환 및 시료 연속주입법을 이용한 단백질 ａ 크로마토그래피 정제 방법
US20130231464A1 (en) 2010-04-28 2013-09-05 Oncolmmune, Inc. Methods of use of soluble cd24 for therapy of rheumatoid arthritis
BR112012028326A2 (pt) 2010-05-06 2017-03-21 Novartis Ag anticorpo multivalente isolado, anticorpos biparatópicos isolados, ácido nucleico, vetor, composição farmacêutica, método de obtenção dos referidos anticorpos, bem como uso do dos mesmos
WO2011156356A1 (en) 2010-06-09 2011-12-15 Zymogenetics, Inc. Dimeric vstm3 fusion proteins and related compositions and methods
ES2671347T3 (es) 2010-06-21 2018-06-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para purificar una proteína que utiliza un aminoácido
US8883134B2 (en) 2010-10-20 2014-11-11 Handok Pharmaceuticals, Inc. Human interleukin-1 receptor antagonist—hybrid Fc fusion protein
AR083705A1 (es) 2010-11-04 2013-03-13 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
US9676871B2 (en) 2010-11-05 2017-06-13 Pfizer Inc. Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase
DK2640743T3 (en) 2010-11-16 2017-01-23 Excelimmune Inc PROCEDURES FOR THE PREPARATION OF RECOMBINANT PROTEINS
JP2014502272A (ja) 2010-11-29 2014-01-30 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ アフィニティークロマトグラフィーマトリックス
JP5974343B2 (ja) 2010-12-20 2016-08-23 ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ アフィニティークロマトグラフィーマトリックス
EP2654915B1 (en) * 2010-12-20 2018-10-24 GE Healthcare BioProcess R&D AB Affinity chromatography matrix
US9051375B2 (en) 2010-12-21 2015-06-09 The University Of Western Ontario Alkali-resistant variants of protein A and their use in affinity chromatography
US9040661B2 (en) 2010-12-21 2015-05-26 Jsr Corporation Support for affinity chromatography and method for isolating immunoglobulin
CA2823066A1 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Alexion Pharma International Sarl Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
US20120238730A1 (en) 2011-03-15 2012-09-20 Abbott Laboratories Integrated approach to the isolation and purification of antibodies
US10065995B2 (en) * 2011-03-25 2018-09-04 Kaneka Corporation Protein for affinity-separation matrix
KR20140007394A (ko) 2011-03-25 2014-01-17 가부시키가이샤 가네카 면역 글로불린 결합성 신규 폴리펩티드
CN107915769A (zh) 2011-03-29 2018-04-17 葛兰素史密斯克莱有限责任公司 用于蛋白纯化的缓冲液体系
CN102757930A (zh) * 2011-04-27 2012-10-31 长春安贝生物科技有限公司 超低IgG新生牛血清生产工艺
KR101953405B1 (ko) 2011-06-01 2019-02-28 노파르티스 아게 친화성 크로마토그래피를 위한 세척 용액 및 방법
JP5812303B2 (ja) 2011-06-03 2015-11-11 国立研究開発法人産業技術総合研究所 酸性域での親和性が低下したプロテインａ変異型タンパク質及び抗体捕捉剤
SG10201604559TA (en) 2011-06-08 2016-07-28 Emd Millipore Corp Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands
WO2013006244A1 (en) 2011-06-08 2013-01-10 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Bispecific monoclonal antibody therapeutics against west nile virus with improved cns penetration
AR086982A1 (es) 2011-06-22 2014-02-05 Hoffmann La Roche Eliminacion de celulas diana por parte de celulas t citotoxicas especificas de virus utilizando complejos que comprenden mhc de clase i
CN103930440A (zh) 2011-07-01 2014-07-16 拜耳知识产权有限责任公司 松弛素融合多肽及其用途
CA2840944A1 (en) 2011-07-08 2013-01-17 Bayer Intellectual Property Gmbh Fusion proteins releasing relaxin and uses thereof
CN103814044A (zh) 2011-07-08 2014-05-21 默沙东公司 纯化fc-融合蛋白的方法
WO2013033517A1 (en) 2011-09-01 2013-03-07 Human Genome Sciences, Inc. Viral clearance methods
RU2014114119A (ru) 2011-09-23 2015-10-27 Рош Гликарт Аг Биспецифические анти-egfr/анти igf-1r-антитела
CA2848520C (en) 2011-09-29 2019-11-26 Seattle Genetics, Inc. Intact mass determination of protein conjugated agent compounds
EP2578286A1 (en) 2011-10-04 2013-04-10 Merck Patent GmbH Method and apparatus for chromatographic purification
EP2771364B1 (en) 2011-10-27 2019-05-22 Genmab A/S Production of heterodimeric proteins
WO2013075740A1 (en) 2011-11-23 2013-05-30 Sanofi Antibody purification method
WO2013081540A1 (en) 2011-11-30 2013-06-06 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Affinity chromatography matrix
JP2015505843A (ja) 2011-12-15 2015-02-26 ザ・ロイヤル・インスティテューション・フォア・ザ・アドバンスメント・オブ・ラーニング／マクギル・ユニヴァーシティ 可溶性ＩＧＦレセプターＦｃ融合タンパク質およびその使用
CA2858613A1 (en) 2011-12-29 2013-08-08 Atyr Pharma, Inc. Aspartyl-trna synthetase-fc conjugates
JP6420756B2 (ja) 2012-03-28 2018-11-07 ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ アフィニティークロマトグラフィーマトリックス
KR101674784B1 (ko) 2012-04-05 2016-11-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 인간 tweak 및 인간 il17에 대한 이중특이적 항체 및 이의 용도
EP2656892A1 (en) 2012-04-23 2013-10-30 Merck Patent GmbH Chromatography method
US20140154270A1 (en) 2012-05-21 2014-06-05 Chen Wang Purification of non-human antibodies using kosmotropic salt enhanced protein a affinity chromatography
CN104363919A (zh) 2012-06-01 2015-02-18 Ibc药品公司 具有改进的体内稳定性、药物代谢动力学和功效的多聚体复合物
EP2682168A1 (en) 2012-07-02 2014-01-08 Millipore Corporation Purification of biological molecules
HRP20211641T1 (hr) 2012-07-13 2022-02-04 Roche Glycart Ag Bispecifična protutijela anti-vegf/anti-ang-2 i njihova primjena u liječenju vaskularnih očnih bolesti
EP2880169B1 (en) 2012-08-02 2017-05-17 F. Hoffmann-La Roche AG Method for producing monomeric and multimeric molecules and uses thereof
EP2880057A4 (en) 2012-08-02 2016-03-23 Jn Biosciences Llc MULTIMERIZED FUSION ANTIBODIES OR PROTEINS THROUGH THE MUTATION OF A CYSTEINE AND A PIECE OF TAIL
PL2880170T3 (pl) 2012-08-02 2017-02-28 F.Hoffmann-La Roche Ag SPOSÓB WYTWARZANIA ROZPUSZCZALNEGO FcR JAKO FUZJI Fc Z OBOJĘTNYM REGIONEM Fc IMMUNOGLOBULINY I JEGO ZASTOSOWANIA
CA2874864C (en) 2012-08-14 2023-02-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
ES2727453T3 (es) 2012-09-13 2019-10-16 Bristol Myers Squibb Co Proteínas de dominio de armazón a base de fibronectina que se unen a miostatina
AU2013318928A1 (en) 2012-09-21 2015-04-09 Kaneka Corporation Protein ligand for affinity isolation matrix
WO2015012904A2 (en) 2012-12-13 2015-01-29 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
EP2954056A4 (en) 2013-02-08 2016-09-21 Stemcentrx Inc NEW MULTISPECIFIC CONSTRUCTIONS
EP2772289B1 (en) 2013-03-01 2015-05-06 ChromaCon AG Chromatographic process for enrichment and isolation
JP6285532B2 (ja) 2013-03-14 2018-02-28 イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン タンパク質ａに基づくクロマトグラフィを使用するタンパク質純度を増加させる方法
EP3385277A1 (en) 2013-03-15 2018-10-10 F. Hoffmann-La Roche AG Il-22 polypeptides and il-22 fc fusion proteins and methods of use
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
CN105378075B (zh) 2013-03-15 2022-04-05 Atyr 医药公司 组氨酰-trna合成酶-fc缀合物
AU2013203043B2 (en) 2013-03-15 2016-10-06 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods to produce a human plasma-derived igg preparation enriched in brain disease-related natural iggs
CN104059133B (zh) 2013-03-18 2019-03-15 南京金斯瑞生物科技有限公司 一类突变的具有高耐碱特性的蛋白a及其应用
AU2014262566A1 (en) 2013-05-08 2015-11-12 Zymeworks Inc. Bispecific HER2 and HER3 antigen binding constructs
WO2014186350A1 (en) 2013-05-15 2014-11-20 Medimmune Limited Purification of recombinantly produced polypeptides
JP6147340B2 (ja) 2013-05-29 2017-06-14 Jsr株式会社 洗浄用組成物、タンパク質精製方法、及びタンパク質
WO2014204988A2 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Asana Biosciences, Llc 5t4-targeted immunofusion molecule and methods
EP3020731B1 (en) 2013-07-09 2019-06-12 ABLBio Novel dual-targeted protein specifically binding to dll4 and vegf, and use thereof
JP6544808B2 (ja) 2013-07-10 2019-07-17 ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 突然変異免疫グロブリン結合ポリペプチド
US9340582B2 (en) 2013-07-25 2016-05-17 Novartis Ag Bioconjugates of synthetic apelin polypeptides
MX371455B (es) 2013-08-02 2020-01-28 Pfizer Anticuerpos anti-cxcr4 y conjugados de anticuerpo y farmaco.
JP6602765B2 (ja) 2013-09-05 2019-11-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド クロマトグラフィー再使用のための方法
HUE057005T2 (hu) 2013-09-25 2022-04-28 Bioverativ Therapeutics Inc Oszlopon történõ vírusinaktiváló eljárások
CA2921707C (en) 2013-10-15 2023-03-28 Seattle Genetics, Inc. Pegylated drug-linkers for improved ligand-drug conjugate pharmacokinetics
AU2014357292B2 (en) 2013-11-27 2020-06-25 Zymeworks Bc Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting HER2
KR102178323B1 (ko) 2013-11-29 2020-11-13 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체
WO2015095301A2 (en) 2013-12-17 2015-06-25 Irm Llc Cytotoxic peptides and conjugates thereof
PT3099692T (pt) 2014-01-27 2019-05-24 Pfizer Agentes citotóxicos bifuncionais
WO2015130766A1 (en) 2014-02-25 2015-09-03 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antigen-binding proteins specific for hla-a2-restricted wilms tumor 1 peptide
AU2015232352B2 (en) 2014-03-17 2021-02-18 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Antibody-fynomer conjugates
WO2015149069A1 (en) 2014-03-28 2015-10-01 New York University Fgf23 fusion proteins
US11602525B2 (en) 2014-04-25 2023-03-14 Rinat Neuroscience Corp. Antibody-drug conjugates with high drug loading
JP6700197B2 (ja) 2014-04-30 2020-05-27 ノヴォ ノルディスク アー／エス カプリル酸を用いてタンパク質を精製する方法
JP6695812B2 (ja) 2014-05-14 2020-05-20 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト Ｈｅｒ３のベータヘアピン及びｈｅｒ２のドメインｉｉに結合するｈｅｒ３／ｈｅｒ２二重特異性抗体
EP3107938B1 (en) 2014-05-28 2022-05-04 Zymeworks Inc. Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
CA2951368A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Novartis Ag Auristatin derivatives and conjugates thereof
CA2951766A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Lupin Limited Process for the purification of tnfr:fc fusion protein
US9777073B2 (en) 2014-07-21 2017-10-03 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Construction and application of bispecific antibody EpCAM×CD3
AR101262A1 (es) 2014-07-26 2016-12-07 Regeneron Pharma Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos
KR102259232B1 (ko) 2014-08-25 2021-05-31 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체
RU2680238C2 (ru) 2014-08-28 2019-02-18 Пфайзер Инк. Модулирующие стабильность линкеры для использования с конъюгатами антитело-лекарственное средство
JP6783754B2 (ja) 2014-09-17 2020-11-11 ノヴォ ノルディスク アー／エス 組織因子経路インヒビター（１〜１６１）上の２つのエピトープに結合する能力がある抗体
EP3093034B1 (en) * 2014-10-24 2019-12-18 Gemtier Medical (Shanghai) Inc. Disposable anti-acupuncture intravenous infusion puncture needle
US11566082B2 (en) * 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
CA2970161A1 (en) 2014-12-09 2016-06-16 Abbvie Inc. Bcl-xl inhibitory compounds and antibody drug conjugates including the same
WO2016094505A1 (en) 2014-12-09 2016-06-16 Abbvie Inc. Antibody drug conjugates with cell permeable bcl-xl inhibitors
WO2016097300A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Genmab A/S Rodent bispecific heterodimeric proteins
EP3280453A1 (en) 2015-04-07 2018-02-14 Immunomedics, Inc. Y-90-labeled anti-cd22 antibody (epratuzumab tetraxetan) in refractory/relapsed adult cd22+ b-cell acute lymphoblastic leukemia
US11820807B2 (en) 2015-06-12 2023-11-21 Ubi Pharma Inc Immunoglobulin fusion proteins and uses thereof
US20180194861A1 (en) 2015-07-10 2018-07-12 Abbvie Inc. IgM- or IgE-Modified Binding Proteins and Uses Thereof
GB201515339D0 (en) 2015-08-28 2015-10-14 Ge Healthcare Bio Sciences Ab A seperation matrix and a method of seperating antibodies
ES2896475T3 (es) 2015-09-25 2022-02-24 Hoffmann La Roche Cadenas pesadas de inmunoglobulina recombinante que comprenden un bucle de conjugación de sortasa y conjugados de las mismas
WO2017055391A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules binding mesothelin and cd3
MX2018003820A (es) 2015-10-02 2018-12-10 F Hoffmann ­La Roche Ag Anticuerpos biespecificos especificos para un receptor de tnf coestimulador.
JP7074665B2 (ja) 2015-10-07 2022-05-24 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 共刺激ｔｎｆ受容体に対する四価の二重特異性抗体発明の分野
US20170216452A1 (en) 2015-11-30 2017-08-03 Pfizer Inc. Antibodies and antibody fragments for site-specific conjugation
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
ES2874974T3 (es) 2016-05-11 2021-11-05 Cytiva Bioprocess R & D Ab Matriz de separación
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix

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