TWI428448B

TWI428448B - 作為第九因子（ｆａｃｔｏｒｉｘ）原肽處理酶之ｐｃ５

Info

Publication number: TWI428448B
Application number: TW096110158A
Authority: TW
Inventors: Robert T Peters; Alan J Bitonti
Original assignee: Syntonix Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-03-24
Filing date: 2007-03-23
Publication date: 2014-03-01
Also published as: US20070259402A1; US20100015659A1; EP2650305A1; WO2007112005A3; HK1125656A1; US8021880B2; WO2007112005A2; HRP20160990T1; SI2004683T1; EP2650305B1; TW200815599A; DK2004683T3; EP2004683A2; US20110053222A1; EP2004683B1; HUE030567T2; US7566565B2; LT2004683T; US7795400B2

Description

作為第九因子(FACTOR IX)原肽處理酶之PC5

本發明係關於作為第九因子(FACTOR IX)原肽處理酶之PC5。

第九因子(FIX)為編碼於人類之X染色體上之絲胺酸蛋白酶之單鏈55 kDa酶原，其為血液凝聚級聯之固有路徑之重要組分。功能性FIX之缺乏引起血友病B，亦稱為血友病B(Christmas disease)。報導在100,000位男性出生者中有1位發生血友病B，且當未治療時，其與由於損傷後未控制出血至肌肉、關節及體腔中而產生之嚴重及慢性發病率相關。直至近期，FIX缺乏之治療已包含投與自得自血液供體池之血漿製備之天然FIX。該等治療帶有由包含人類免疫缺乏病毒(HIV)及肝炎C病毒(HCV)之血液傳染病毒感染，以及不希望之血栓及栓塞之附屬風險。最近，重組FIX之製劑(BeneFIX，Wyeth)成為市售的。

正常FIX活性需要某些轉譯後修飾。FIX表現為需要轉譯後處理以產生成熟FIX之前軀多肽。詳言之，FIX之前軀多肽需要所謂γ－羧基麩胺酸(Gla)域中之某些麩胺酸殘基之維生素K依賴性γ羧化及原肽之分解(參見圖1 ，前肽：信號序列，輸入ER以用於分泌；原肽：結合維生素K依賴性γ羧化酶；在分泌期間分解；Gla域：含有12個γ－羧酸化麩胺酸殘基(藉由VKD γ－羧化酶修飾)，給與結合內皮細胞表面所必需之針對磷脂性膜之親和力；疏水性堆疊，EGF－B，EGF－A，催化：功能域；活化肽：分解以產生活性蛋白酶，FIXa；FIX(1－145)及FIX(181－145)鏈仍經由單二硫化物鍵締合)。原肽為相對於Gla域之N－末端的18－胺基酸殘基序列。原肽結合維生素K依賴性γ羧化酶且隨後，在活體內，藉由內因性蛋白酶，最可能為PACE(成對鹼基胺基酸分解酶)，亦稱為弗林蛋白酶(furin)及PCSK3自FIX之前軀多肽而分解。無維生素K依賴性γ羧化時，Gla域不能結合鈣以採取將蛋白質錨定至帶負電荷磷脂表面所必需之正確構形，進而使第九因子為非功能性的。藉由諸如殺鼠靈(warfarin)之維生素K拮抗劑抑制維生素K依賴性羧化為抗凝劑療法之通用形式。即使其羧酸化，Gla域亦視原肽之分解而定以獲得適當功能，因為保留之原肽干擾與鈣及磷脂之最佳結合所必需之Gla域的構形改變。因此，所需FIX之前軀多肽之後轉譯修飾包含藉由維生素K依賴性γ羧化酶對於某些麩胺酸酸殘基進行γ羧化及最可能藉由PACE分解FIX原肽以產生成熟FIX。

成熟FIX必須藉由活化XI因子活化以產生IXa因子。在固有路徑中，FIX與具有經活化VIII因子、X因子、鈣及磷脂之複合物締合，其中FIX藉由XIa因子活化，且隨後IXa因子又與經活化VIII因子協同來活化X因子。或者，第九因子及X因子均可藉由與脂質化組織因子複合之VIIa因子活化，該VIIa因子已經由外來路徑產生。隨後，Xa因子參與最終共用路徑藉以凝血酶原轉化成凝血酶，其又將血纖維蛋白原轉化成血纖維蛋白。

直至現在，與關於活體內處理所已知一致之FIX之前軀多肽的活體外後轉譯處理依賴PACE以實現FIX原肽之分解。PACE為至少半打稱為前體蛋白(proprotein)轉化酶(PC)之哺乳動物枯草菌蛋白/Kex2p樣絲胺酸蛋白酶之家族的成員。吾人發現PACE係使用與KEX2同源之序列，其為酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )中之酶且首先識別為涉及於前軀物處理中之內切蛋白酶。隨後，已識別其他PC家族成員且發現其具有不同程度之序列一致性及不同受質特異性。

EP 0246709描述弗林蛋白酶(亦即，PACE)之部分cDNA及胺基酸序列。

人類弗林蛋白酶(亦即，PACE)之完整cDNA及胺基酸序列公開於1990年。Van den Ouweland AM等人(1990)Nucleic Acids Res. 18：664；Erratum in：Nucleic Acids Res. 18：1332(1990)。

頒予Barr等人之美國專利第5,460,950號描述重組PACE及用異源蛋白質之受質前驅物多肽共表現PACE以改良活性、成熟異源蛋白質之表現。在一實施例中，前軀多肽為FIX之前軀多肽。

頒予van de Ven等人之美國專利第5,935,815號同樣描述重組人類弗林蛋白酶(亦即，PACE)及用異源蛋白質之受質前驅物多肽共表現弗林蛋白酶以改良活性、成熟異源蛋白質之表現。揭示於該專利中之可能受質前軀物包含第九因子之前軀物。

哺乳動物枯草菌蛋白/Kex2p樣前體蛋白轉化酶(PC)家族中之除PACE外之其他家族成員經報導包含PC1/PC3、PC2、PC4、PC5/6(後文簡單地稱為PC5)、PACE4及LPC/PC7/PC8/SPC7。雖然該等各種成員共用某些所保留之總結構特徵，但是該等成員在其組織分佈、亞細胞定位、分解特異性及較佳受質上不同。為回顧，參見Nakayama K(1997)Biochem J. 327：625－35。相似於PACE，該等前體蛋白轉化酶通常包含自胺基末端開始，信號肽、原肽(其可自催化分解)、特徵為Asp、His、Ser及Asn/Asp殘基之枯草菌蛋白樣催化域，及亦為催化活性所必需且特徵為Arg－Gly－Asp(RGD)序列之同源B域。PACE、PACE4及PC5亦包含Cys富集域，其功能為未知的。另外，PC5具有擁有及無跨膜域之同功異型物；該等不同同功異型物稱為分別PC5B及PC5A。PACE之催化域之胺基酸序列與前體蛋白轉化酶之該家族之其他成員的催化域之胺基酸序列之間的比較揭示以下程度之一致性：對PC4而言，70%；對PACE4及PC5而言，65%；對PC1/PC3而言，61%；對PC2而言，54%；及對LPC/PC7/PC8/SPC7而言，51%。Nakayama K(1997)Biochem J. 327：625－35。

已報導PACE及PACE4具有部分重疊而相異之受質。詳言之，與PACE形成驚人對比，已報導PACE4不能處理FIX之前軀多肽。Wasley LC等人(1993)J Biol Chem. 268：8458－65；Rehemtulla A等人(1993)Biochemistry. 32：11586－90。

頒予Seidah等人之美國專利第5,840,529號揭示人類PC7之核苷酸及胺基酸序列及當與其他PC家族成員相比時，PC7將HIV gp160分解成gp120及gp41之顯著能力。

齧齒動物PC5之核苷酸及胺基酸序列首先藉由Lusson J等人(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90：6691－5作為PC5且藉由Nakagawa T等人(1993)J Biochem(Tokyo) 113：132－5作為PC6來描述。

頒予Day等人之美國專利第6,380,171號揭示人類PC5A之核苷酸及胺基酸序列，無跨膜域之同功異型物，以及藉由使用反義核酸以抑制PC5活性而減少血管再狹窄之方法。

本發明係部分基於由發明者之發現，即PC5對處理來自FIX之前軀多肽之原肽為有效的。如下文所詳述，該發現為意外的，因為緊密相關PC家族成員完全或大體上不能處理來自FIX之前軀多肽之原肽。本發明係關於適用於使用PC5處理FIX之前軀多肽以製備成熟第九因子之方法及組合物。該等方法及組合物係關於FIX本身以及關於含FIX之多肽及共軛物。

在一態樣中，本發明為真核細胞，其包含編碼第九因子之前體蛋白(proFIX)或其融合蛋白質之第一表現載體，及編碼功能性PC5之第二表現載體。

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，功能性PC5包含藉由SEQ ID NO：1提供之胺基酸序列，其相應於PC5A，一種無跨膜域之PC5之同功異型物。

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，功能性PC5包括相應於PC5B，一種具有跨膜域之PC5之同功異型物的胺基酸序列。

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，第一表現載體編碼proFIX。

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，融合蛋白質為proFIX－FcRn結合搭配物(partner)融合蛋白質。

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，proFIX－FcRn結合搭配物融合蛋白質包括將proFIX連接至FcRn結合搭配物之連接子。

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，proFIX－FcRn結合搭配物融合蛋白質為proFIX－Fc融合蛋白質。

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，proFIX－Fc融合蛋白質包括人類Fc γ。

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，proFIX－FcRn結合搭配物融合蛋白質包括將proFIX連接至Fc之連接子。

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，proFIX－Fc融合蛋白質為proFIX－Fc同型二聚體(homodimer)(亦在本文中簡單地稱為"二聚體")。

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，proFIX－Fc融合蛋白質為proFIX－Fc單體－二聚體雜合物(hybrid)(亦在本文中簡單地稱為"單體")。

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，融合蛋白質為proFIX－白蛋白融合蛋白質

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，proFIX－白蛋白融合蛋白質包含將proFIX連接至白蛋白之連接子。

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，融合蛋白質為proFIX－轉鐵蛋白融合蛋白質。

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，proFIX－轉鐵蛋白融合蛋白質包含將proFIX連接至轉鐵蛋白之連接子。

在根據本發明之該態樣及其他態樣之一實施例中，連接子為GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：16)。

在一實施例中，真核細胞為哺乳動物細胞。

在一實施例中，真核細胞為HEK 293細胞。

在一實施例中，真核細胞為CHO細胞。

在一實施例中，真核細胞為BHK細胞。

在一實施例中，編碼proFIX或其融合蛋白質之表現載體，及編碼功能性PC5之表現載體為單表現載體。

在一態樣中，本發明為表現載體，其包含編碼第九因子之前體蛋白(proFIX)或其融合蛋白質，並可操作地鍵聯於允許表現proFIX或其融合蛋白質之表現控制序列之第一聚核苷酸序列，及編碼功能性PC5，並可操作地鍵聯於允許表現功能性PC5之表現控制序列之第二聚核苷酸序列。

在一態樣中，本發明為自第九因子之前體蛋白(proFIX)或其融合蛋白質生產含成熟第九因子多肽之方法。根據本發明之該態樣之方法包含以下步驟：在容許表現proFIX或其融合蛋白質及功能性PC5及藉由功能性PC5處理proFIX或其融合蛋白質之條件下，培養包含編碼第九因子之前體蛋白(proFIX)或其融合蛋白質之第一表現載體，及編碼功能性PC5之第二表現載體之真核細胞。在一實施例中，含成熟第九因子多肽為FIX－Fc單體－二聚體雜合物。亦提供的為根據本發明之該態樣之方法而生產之FIX－Fc單體－二聚體雜合物。

在一態樣中，本發明為增加來自第九因子之前體蛋白(proFIX)或其融合蛋白質之含成熟第九因子多肽的產量之方法。根據本發明之該態樣之方法包含以下步驟：在容許(a)表現proFIX或其融合蛋白質及功能性PC5，及(b)藉由功能性PC5處理proFIX或其融合蛋白質條件下，培養包含編碼第九因子之前體蛋白(proFIX)或其融合蛋白質之第一表現載體，及編碼功能性PC5之第二表現載體之真核細胞，其中與在相似條件下而無藉由功能性PC5之處理所產生之含成熟第九因子多肽的產量比較，含成熟第九因子多肽之產量增加。

在一態樣中，本發明為自第九因子之前體蛋白(proFIX)或其共軛物生產含成熟第九因子多肽之方法。根據本發明之該態樣之方法包含以下步驟：將proFIX或其共軛物與有效量之功能性PC5接觸。

在一實施例中，proFIX或其共軛物為proFIX。

在一實施例中，含成熟第九因子多肽為FIX－Fc單體－二聚體雜合物。亦提供的為根據本發明之該態樣之方法而生產之FIX－Fc單體－二聚體雜合物。

在一實施例中，proFIX或其共軛物為聚乙二醇化proFIX。

在一實施例中，proFIX或其共軛物為proFIX－FcRn結合搭配物融合蛋白質。

本發明之限制之各者可涵蓋本發明之各種實施例。因此預期，涉及任一元素或元素之組合之本發明的限制之各者可包含於本發明之各態樣中。本發明在其應用中不受以下描述中所陳述或圖示中所說明之組分之構造及排列的限制。本發明可能為其他實施例且以各種方式實踐或進行。又，本文所使用之成語及術語係用於描述目的且不應視為限制。"包含"、"包括"或"具有"、"含有"、"涉及"及其在本文中之變化之使用意欲涵蓋其後所列之項目及其等價者以及額外項目。

本發明至少部分係關於與適用於製備FIX及包含FIX融合蛋白質之FIX之共軛物的PC5有關之組合物及方法。在某些特定實施例中，PC5為PC5A且FIX融合蛋白質為下文討論之FIX－Fc單體－二聚體雜合物。

在一態樣中，本發明係關於真核細胞，其包含編碼第九因子之前體蛋白之第一表現載體及編碼功能性PC5多肽之第二表現載體。如本文所使用，功能性PC5多肽係指包括至少一個同源B域及前體蛋白轉化酶PC5之枯草菌蛋白樣催化域之酶促活性多肽。在一實施例中，功能性PC5多肽係指包括至少一個同源B域及人類前體蛋白轉化酶PC5之枯草菌蛋白樣催化域之酶促活性多肽。在一實施例中，功能性PC5多肽係指包括至少一個同源B域及前體蛋白轉化酶PC5之枯草菌蛋白樣催化域之酶促活性多肽，其中功能性PC5為PC5A。如上所述，PC5A異構體缺乏跨膜域。相反，PC5B異構體包含C－末端跨膜域。在一實施例中，功能性PC5多肽係指包括至少一個同源B域及前體蛋白轉化酶PC5之枯草菌蛋白樣催化域之酶促活性多肽，其中功能性PC5為人類PC5A。

人類PC5A之胺基酸序列以基因庫寄存編號NP_006191(再現為SEQ ID NO：1)提供，將其全部內容併入本文。

參考SEQ ID NO：1，PC5信號肽橫跨胺基酸殘基1－32，PC5原肽橫跨胺基酸殘基33－114，且成熟PC5蛋白質(以枯草菌蛋白樣催化域開始)橫跨胺基酸殘基115－913。在一實施例中，功能性PC5多肽係指具有提供為SEQ ID NO：1之胺基酸序列之多肽。在一實施例中，功能性PC5多肽係指具有提供為SEQ ID NO：1之胺基酸殘基33－913之胺基酸序列的多肽。在一實施例中，功能性PC5多肽係指具有提供為SEQ ID NO：1之胺基酸殘基115－913之胺基酸序列的多肽。

由於遺傳編碼之簡並，人類PC5A多肽可藉由任一適合核苷酸序列來編碼。在一實施例中，人類PC5A之核苷酸序列以基因庫寄存編號NM_006200(再現為SEQ ID NO：2)之核苷酸478－3216提供，其全部內容以引用之方式併入本文。該序列編碼上文之SEQ ID NO：1。

編碼PC5多肽之核苷酸序列可含有不影響胺基酸序列之取代。在一實施例中，基因庫寄存編號NM_006200之位置876處之核苷酸可藉由胸苷(T)替代胞嘧啶核苷(C)而置換，但保存胺基酸Ser 133(相應於基因庫寄存編號NP_006191之胺基酸編號)。在一實施例中，基因庫寄存編號NM_006200之位置1950處之核苷酸可藉由胞嘧啶核苷(C)替代胸苷(T)而置換，但保存胺基酸Ala 491。注意，在位置1950處之該核苷酸改變消除HindIII限制位點。在一實施例中，基因庫寄存編號NM_006200之位置1962處之核苷酸可藉由腺嘌呤(A)替代鳥苷(G)而置換，但保存胺基酸Ser 496。在一實施例中，編碼PC5之核苷酸序列係與下文實例3中所提供一樣。在其他實施例中，可存在上述取代之任一組合。在另一額外實施例中，相似類型之取代亦藉由本發明涵蓋且在本發明之實踐中，在熟習此項技術者製造及使用之能力範圍內。

PC5序列亦可含有在可見於SNP資料庫中之核苷酸含量下之其他非編碼改變。舉例而言，在各種實施例中，Leu 16可在密碼子位置3處具有替代鳥苷(G)之腺嘌呤(A)；Cys 30可在密碼子位置3處具有替代胸苷(T)之胞嘧啶(C)；Thr 385可在密碼子位置3處具有替代鳥苷(G)之腺嘌呤(A)；Ser 495可在密碼子位置3處具有替代鳥苷(G)之腺嘌呤(A)；Pro 623可在密碼子位置3處具有替代胞嘧啶(C)之胸苷(T)；Cys 767可在密碼子位置3處具有替代胞嘧啶(C)之胸苷(T)；及其任一組合。該等實例並非意欲以任何方式限制。

如本文所使用，第九因子之前體蛋白(proFIX)係指包含至少一個第九因子原肽、Gla域及第九因子催化域之任一第九因子多肽。第九因子原肽為相鄰於Gla域之定位N－末端。在一實施例中，第九因子之前體蛋白另外包含原肽之前肽(prepeptide)(信號序列)N－末端。在一實施例中，第九因子之前體蛋白為人類第九因子之前體蛋白。在一實施例中，人類第九因子前體蛋白具有以基因庫寄存編號NP_000124提供，以SEQ ID NO：3再現於下文之胺基酸序列。在該序列中，胺基酸殘基1－28表示前肽(信號序列)；胺基酸殘基29－46表示原肽；胺基酸殘基47－86表示含有12個麩胺酸殘基組之Gla域；胺基酸殘基191－226表示活化肽；及胺基酸殘基227－461表示催化域。活化肽藉由XIa因子分解以產生藉由一或多個二硫化物鍵結共價締合之重鏈及輕鏈。應注意，在一實施例中，SEQ ID NO：3中之胺基酸194處之蘇胺酸可藉由丙胺酸置換。

由於遺傳編碼之簡並，人類第九因子之前體蛋白可藉由任一適合核苷酸序列來編碼。在一實施例中，編碼人類第九因子之前體蛋白之核苷酸序列以基因庫寄存編號NM_000133之核苷酸30－1412提供，以SEQ ID NO：4再現於下文。該序列編碼上文之SEQ ID NO：3。

如本文所使用，多肽係指胺基酸之聚合物且並非係指聚合物之特定長度；因此，肽、寡肽及蛋白質包含於多肽之定義中。在一實施例中，多肽為單鏈多肽。如本文所使用，蛋白質可為單鏈多肽或其可包含多於一個單鏈多肽。又如本文所使用，術語多肽可包含具有一或多個後表現修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化、聚乙烯二醇化、添加脂質部分或添加任何有機或無機分子之多肽。胺基酸明確地包含但不限於普通、所謂天然產生之胺基酸。該等胺基酸包含丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。包含於多肽之定義中的為(例如)含有一或多種胺基酸之類似物(包含(例如)非天然胺基酸)之多肽及具有經取代鍵聯以及此項技術中已知之其他修飾之多肽，其為天然產生及非天然產生的。在一實施例中，多肽為融合蛋白質。

各種改變可在本發明之多肽及蛋白質或其組分之胺基酸序列中，或編碼該等多肽及蛋白質之相應DNA序列中進行，而無其生物活性、功能或實用性之可觀損失。得自該等改變之衍生物、類似物或突變體及該等衍生物之用途在本發明之範疇內。

如將由熟習此項技術者所瞭解，胺基酸之取代基可選自胺基酸所屬之種類之其他成員(參見(例如)表1)。此外，各種胺基酸通常經例如丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸之中性胺基酸取代。參見(例如)MacLennan DH等人，Acta Physiol Scand Suppl. 643：55－67(1988)；Sasaki N等人，Adv Biophys. 35：1－24(1998)。

如本文所使用，融合蛋白質係指涵蓋至少兩種異源多肽之重組融合蛋白質。重組融合蛋白質係指蛋白質，其藉由得自彼此共價鍵聯之至少兩種異源核苷酸序列之單核苷酸序列編碼，以便來自各組分核苷酸序列之編碼序列在其適當閱讀框架中轉譯。製造重組DNA構築體之通用方法此項技術中為熟知的。如下文所揭示，融合蛋白質為如本文所使用之共軛物之一種類型。在一實施例中，融合蛋白質可視情況經修飾以包含一或多個碳水化合物或其他非蛋白質部分。

如下文更詳細之描述，融合蛋白質可視情況包含在任何組分胺基酸序列之間的連接子部分。任選連接子部分可(但不需要)包含一或多種胺基酸。在一實施例中，任選連接子部分為至少兩個胺基酸殘基長之肽。

本發明之融合蛋白質通常包含proFIX融合蛋白質。在一實施例中，proFIX融合蛋白質為proFIX－白蛋白融合蛋白質。如本文所使用，proFIX－白蛋白融合蛋白質係指包含與白蛋白共價鍵結之proFIX多肽之融合蛋白質。proFIX多肽可融合於白蛋白多肽之N－末端或融合於白蛋白多肽之C－末端，其限制條件為(如本文所述)，proFIX－白蛋白融合蛋白質之proFIX組分可藉由酶促活性PC5處理以產生成熟含FIX多肽。在一實施例中，proFIX多肽為人類proFIX多肽且白蛋白多肽為人類白蛋白多肽。

在另一實施例中，proFIX融合蛋白質為proFIX－轉鐵蛋白融合蛋白質。如本文所使用，proFIX－轉鐵蛋白融合蛋白質係指包含與轉鐵蛋白共價鍵結之proFIX多肽之融合蛋白質。proFIX多肽可融合於轉鐵蛋白多肽之N－末端或融合於轉鐵蛋白多肽之C－末端，其限制條件為(如本文所述)，proFIX－轉鐵蛋白融合蛋白質之proFIX組分可藉由酶促活性PC5處理以產生成熟含FIX多肽。在一實施例中，proFIX多肽為人類proFIX多肽且轉鐵蛋白多肽為人類轉鐵蛋白多肽。

本發明之特徵化proFIX融合蛋白質包含可藉由新生Fc受體(FcRn)特異結合之proFIX融合蛋白質。該等特徵化proFIX融合蛋白質包含proFIX－FcRn結合搭配物融合蛋白質、proFIX－Fc融合蛋白質、proFIX－Fc同型二聚體及proFIX－Fc單體－二聚體雜合物(參見(例如)圖2 )。

如本文所使用，FcRn或(等價地)FcRn受體係指新生Fc受體。FcRn首先描述為新生大鼠及小鼠中之IgG之腸道細胞受體。該受體結合於免疫球蛋白G(IgG)之Fc部分且藉由轉胞吞作用在內腔至膜漿液方向上運輸IgG，亦即，以據信為造成將母體IgG傳遞至新生兒之原因之方法，自消化道內腔運輸至組織間隙。據信IgG之FcRn介導運輸在新生兒哺乳期期間，優先於IgG之被動獲取。隨後發現，FcRn不僅在新生兒中而且在成年人中，廣泛表現於多類型之人類上皮細胞上。FcRn已成為提供為與FcRn結合搭配物之共軛物之大量分子的全身性傳遞之基礎。參見美國專利第6,030,613、6,086,875及6,485,726，及公開國際專利申請案WO 03/077834。

FcRn現已良好表徵。已分離包含人類之若干哺乳動物種之FcRn。人類、大鼠及小鼠FcRn分子之序列可見於(例如)Story CM等人(1994)J Exp Med. 180：2377－81中。FcRn以相對低pH結合IgG(但不結合諸如IgA、IgD、IgM及IgE之其他免疫球蛋白種類)，在內腔至膜漿液方向上，細胞間活性運輸IgG，且隨後以見於間質液中之相對高pH釋放IgG。如將藉由熟習此項技術者所認識，FcRn可藉由選殖或藉由使用(例如)單株抗體之親和力純化而分離。隨後，該分離FcRn可用以識別及分離FcRn結合搭配物。

如本文所使用，FcRn結合搭配物意謂可藉由FcRn特異結合之任一實體。在某些實施例中，FcRn結合搭配物可包含但不限於，整個IgG、IgG之Fc片段及包含FcRn之完整結合區域之IgG的其他片段。結合於FcRn之IgG之Fc部分的區域已基於X射線結晶學描述(Burmeister WP等人，Nature 372：379－83(1994))。Fc與FcRn之主要接觸區域在C_H 2及C_H 3域之接合處附近。根據基於Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,Bethesda,MD,1991)之胺基酸之編號習慣，可能接觸點為殘基C_H 2中之248、250－257、272、285、288、290－291、308－311及314，及C_H 3中之385－387、428及433－436。該等位點相異於藉由子類比較或藉由如對結合於白血球FcγRI及FcγRII之Fc而言重要之定點突變所識別的彼等位點。前述Fc－FcRn接觸點均在單一Ig重鏈上。先前已注意到，2個FcRn可結合單一(同型二聚體)Fc分子。結晶資料提示，在該複合物中，各FcRn分子結合Fc同型二聚體FcRn結合搭配物之單一多肽。因此，在一實施例中，包含FcRn之完整結合區域之IgG的片段至少包含在C_H 2及C_H 3域之接合處附近之Fc與FcRn的主要接觸區域。

在一實施例中，FcRn結合搭配物為FcRn結合搭配物而不為整個IgG。在一實施例中，FcRn結合搭配物為FcRn結合搭配物而不為整個人類IgG。

在一實施例中，FcRn結合搭配物為IgG之Fc片段。除本文中另外規定外，IgG之Fc片段為IgG重鏈多肽片段之同型二聚體(亦即，Fc多肽)，當締合時，該等片段一起構成包含IgG之鉸鏈域、C_H 2域及C_H 3域之整個IgG的片段。IgG之Fc片段相應於僅含有IgG之兩個重鏈之經二硫化物鍵聯的羧基末端區域之IgG之蛋白水解片段。IgG之Fc片段藉由結合於某些Fc受體及C1q互補蛋白質而介導效應功能，且其欲不同於IgG之抗原結合Fab片段。在一實施例中，FcRn結合搭配物為人類IgG之Fc片段，亦即，人類Fc γ。在一特定實施例中，FcRn結合搭配物為人類IgG1之Fc片段(亦即，Fcγ1)。在一實施例中，人類IgG之Fc片段之各多肽(亦即，各Fc多肽)具有如由SEQ ID NO：5所提供之胺基酸序列，其相應於Kabat胺基酸殘基編號221－447。

在一實施例中，編碼來自人類IgG1之Fc多肽之核酸具有由基因庫寄存編號Y14735(SEQ ID NO：62)所提供之序列：

Fc多肽之核苷酸序列可經修飾以併入或消除限制核酸內切酶位點同時保存胺基酸序列。在一實施例中，A231、P232及E233之密碼子自GCA、CCT、GAA修飾成GCT、CCG、GAA以併入BspEI限制位點而不改變所表現之胺基酸序列。在另一實施例中，G236、G237及P238之密碼子自GGG、GGA、CCG修飾成GGC、GGA、CCG以併入RsrII限制位點同時保存胺基酸序列。

IgG之Fc多肽可根據諸如定點突變及其類似物之良好公認之程序來修飾以產生將藉由FcRn結合之經修飾IgG或Fc片段或其部分。該等修飾包含遠離FcRn接觸位點之修飾以及在保存或甚至增強對FcRn之結合之接觸位點內的修飾。舉例而言，以下人類IgG1 Fc(Fcγ1)中之單胺基酸殘基(Kabat編號習慣)可經取代而無Fc對FcRn之結合親和力之顯著損失：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、VS03A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A及K447A，其中(例如)P238A表示在位置編號238處經丙胺酸取代之野生型脯胺酸。作為一實例，一特定實施例併入N297A突變，移除高度保留之N－糖基化位點。。除丙胺酸外，其他胺基酸可在上文規定之位置取代野生型胺基酸。突變可單獨引入Fc中產生多於一百個之相異於原生Fc之FcRn結合搭配物。另外，該等個別突變之2者、3者或多者之組合可一起引入，產生超過數百個之FcRn結合搭配物。此外，二聚Fc片段或其他二聚FcRn結合搭配物之聚核苷酸之一者可包含突變而另一者不包含突變，或兩者均可突變但使用不同突變。包含N297A之本文所述突變之任一者可用以修飾Fc。

某些上述突變可給與FcRn結合搭配物新穎功能性。舉例而言，一實施例併入N297A，移除高度保留之N－糖基化位點。該突變之潛在效應為降低免疫原性，進而增強FcRn結合搭配物之循環半衰期，且使FcRn結合搭配物不能結合於包含FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB及FcγRIIIA之其他Fc受體，而不折衷對FcRn之親和力。Routledge EG等人(1995)Transplantation 60：847－53；Friend PJ等人(1999)Transplantation 68：1632－7；Shields RL等人(1995)J Biol Chem 276：6591－604。作為自上文所述之突變產生之新穎功能性的另一實例，對FcRn之親和力可增加超過在一些情況下野生型之親和力。該增加親和力可反映增加之"接通"速率、降低之"斷開"速率，或增加之"接通"速率及降低之"斷開"速率。經報導賦予對FcRn之增加親和力之突變包含T256A、T307A、E380A及N434A。Shields等人(2001)J Biol Chem 276：6591。

另外，至少3種人類Fc γ受體似乎認識低鉸鏈區域內之IgG上之結合位點，通常為胺基酸234－237。因此，新穎功能性及潛在降低免疫原性之另一實例可自該區域之突變產生，如(例如)藉由將人類IgG1之胺基酸233－236(ELLG；SEQ ID NO：6)置換成來自IgG2之相應序列(PVA，一個胺基酸缺失)而產生。已報導，當該等突變已引入後，介導各種效應功能之FcγRI、FcγRII及FcγRIII將不結合於IgG1。Ward ES等人(1995)Ther Immunol 2：77－94；Armour KL等人(1999)Eur J Immunol 29：2613－24。

如本文所使用，proFIX－FcRn結合搭配物融合蛋白質係指包含共價鍵聯於FcRn結合搭配物多肽之proFIX多肽之融合蛋白質。proFIX多肽組分能夠藉由PC5處理以產生FIX之成熟形式，又能夠藉由XIa因子活化以產生活化FIXa多肽。FcRn結合搭配物多肽組分可為可藉由FcRn特異結合之任一適合多肽。在某些實施例中，FcRn結合搭配物多肽為IgG之Fc多肽或人類IgG之Fc多肽。proFIX多肽組分與FcRn結合搭配物多肽組分之間的鍵聯可為直接的或其可經由連接子而為間接的。

如本文所使用，proFIX－Fc融合蛋白質係指包含共價鍵聯於Fc多肽之proFIX多肽之融合蛋白質。proFIX多肽組分能夠藉由PC5處理以產生FIX之成熟形式，又能夠藉由XIa因子活化以產生活化FIXa多肽。Fc多肽組分可為可藉由FcRn特異結合之任一適合Fc多肽。在某些實施例中，Fc多肽為IgG之Fc多肽或人類IgG之Fc多肽。proFIX多肽組分與Fc多肽組分之間的鍵聯可為直接的或其可經由連接子而為間接的。

本發明之融合蛋白質可包含經由相同或不相同多肽之二聚合而形成之各種二聚結構。因此，本發明之二聚融合蛋白質可包含同型二聚體及異型二聚體。在一實施例中，本發明之融合蛋白質包括至少包括第一域之第一多肽鏈，該第一域具有至少一個特異結合搭配物，及至少包括第二域之第二多肽鏈，其中該第二域為該第一域之特異結合搭配物。融合蛋白質因此包括由於第一域及第二域之相互作用而能夠與另一多肽二聚之多肽。使用異源域將抗體二聚之方法在此項技術中為已知的。參見(例如)美國專利第5,807,706號及第5,910,573號；Kostelny等人(1992)J Immunol 148：1547。

二聚合可藉由形成共價鍵或者非共價鍵而發生，例如，疏水性相互作用、凡得瓦爾力(Van der Waals force)、諸如(但不限於)α螺旋之兩親媒性肽之併合、帶有相反電荷之胺基酸，諸如(但不限於)離胺酸及天冬胺酸，精胺酸及麩胺酸之電荷－電荷相互作用。在一實施例中，二聚合涉及包括螺旋、旋轉及另一螺旋之螺旋束。在另一實施例中，二聚合涉及包括具有若干重複胺基酸之肽之白胺酸拉鏈，其中每7個胺基酸為一白胺酸殘基。在一實施例中，特異結合搭配物為Fos及Jun。參見Branden等人(1991)Introduction to Protein Structure,Garland Publishing,New York。

在另一實施例中，二聚合藉由化學鍵聯介導(參見(例如)Brennan等人(1985)Science 229：81)。在該實施例中，將完整免疫球蛋白或包括免疫球蛋白恆定區域之至少部分之融合蛋白質分解以產生重鏈片段。該等片段在諸如亞砷酸鈉之二硫酚複合劑存在下還原以穩定鄰二硫酚且防止分子間二硫化物形成。隨後，將如此產生之片段轉化成硫硝基苯甲酸(TNB)衍生物。隨後，藉由用諸如巰乙胺之還原劑之還原將TNB衍生物之一者再轉化成重鏈片段硫醇且隨後與等莫耳量之另一TNB衍生物混合以形成二聚體。

如本文所使用，proFIX－Fc同型二聚體係指在兩個相同proFIX－Fc多肽之間形成之共價或非共價鍵聯二聚體。在一實施例中，兩個多肽彼此共價鍵聯以便形成雙鏈體結構，其中兩種多肽自N－末端共同對齊於C－末端。在一實施例中，兩個多肽經由在一Fc多肽之鉸鏈域區域與另一Fc多肽之鉸鏈域區域之間形成之一或多個二硫化物橋而彼此共價鍵聯，以便形成雙鏈體結構，其中Fc多肽自N－末端共同對齊於C－末端。說明proFIX－Fc同型二聚體之一實施例之結構的圖提供於圖2A 中。

如本文所使用，proFIX－Fc單體－二聚體雜合物係指異質二聚蛋白質，其包含第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中該第一多肽鏈包含proFIX多肽及能夠特異結合於FcRn之免疫球蛋白恆定鏈之至少部分，且其中該第二多肽鏈包含能夠特異結合於FcRn之免疫球蛋白恆定鏈之至少部分，但該第二多肽鏈不包含proFIX多肽。因此，在本發明之該態樣中，蛋白質就proFIX而言為單聚的且就Fc而言為二聚的(因此為術語"單體－二聚體雜合物")。然而，應瞭解，雖然proFIX－Fc單體－二聚體雜合物因為兩個鏈為相異的而為異質二聚的，但是該等分子亦可簡稱為"單體"，因為與傳統同型二聚體Fc融合蛋白質比較，僅存在一種生物活性proFIX。參考US 2005/0032174，其全部內容以引用之方式併入本文。在一實施例中，能夠特異結合於FcRn之免疫球蛋白恆定鏈之部分在各情況下包含IgG Fc片段域。在一實施例中，能夠特異結合於FcRn之免疫球蛋白恆定鏈之部分在各情況下為IgGFc片段域。在一實施例中，能夠特異結合於FcRn之免疫球蛋白恆定鏈之部分在各情況下包含人類IgG Fc片段域。在一實施例中，能夠特異結合於FcRn之免疫球蛋白恆定鏈之部分在各情況下為人類IgG Fc片段域。在一實施例中，能夠特異結合於第一多肽鏈中之FcRn之免疫球蛋白恆定鏈的部分相同於能夠特異結合於第二多肽鏈中之FcRn之免疫球蛋白恆定鏈的部分。在一實施例中，能夠特異結合於第一多肽鏈中之FcRn之免疫球蛋白恆定鏈的部分不同於能夠特異結合於第二多肽鏈中之FcRn之免疫球蛋白恆定鏈的部分。說明proFIX－Fc單體－二聚體雜合物之一實施例之結構的圖提供於圖2B 中。

本發明之融合蛋白質及共軛物可視情況包括至少一種連接子分子。連接子通常可包括任何有機分子。在一實施例中，連接子為聚乙二醇(PEG)。在另一實施例中，連接子包括胺基酸。胺基酸連接子可包括1－5個胺基酸、1－10個胺基酸、1－20個胺基酸、10－50個胺基酸、50－100個胺基酸、100－200個胺基酸。在一實施例中，胺基酸連接子可藉由併入編碼融合蛋白質之核酸分子中之核酸序列來編碼。在一實施例中，胺基酸連接子可產生為分離合成肽，亦即，使用在細胞外部執行之已知化學合成技術(例如，固體相合成)所產生之肽。本文中所述之胺基酸連接子之任一者可用於本發明之融合蛋白質，例如，proFIX－Fc單體－二聚體雜合物。

在一實施例中，胺基酸連接子為8個胺基酸連接子EFAGAAAV(SEQ ID NO：7)，其中E表示麩胺酸，F表示苯丙胺酸，A表示丙胺酸，G表示甘胺酸且V表示纈胺酸。在一實施例中，連接子藉由併入編碼融合蛋白質之核酸分子中之核酸序列來編碼。

在某些實施例中，胺基酸連接子可包含序列G_n (SEQ ID NO：8)、(GA)_n (SEQ ID NO：9)、(GGS)_n (SEQ ID NO：10)、(GGGGS)_n (SEQ ID NO：11)或其任一組合，其中在各情況下，G表示甘胺酸，A表示丙胺酸，S表示絲胺酸且n可為1－10之整數，亦即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。連接子之實例包含(但不限於)GGG、SGGSGGS(SEQ ID NO：12)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO：13)、GGSGG－SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：14)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO：15)。在一實施例中，連接子為GGGGSGGG－GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：16)。在一實施例中，連接子藉由併入編碼融合蛋白質之核酸分子中之核酸序列來編碼。連接子不消除或減少融合蛋白質之生物活性。視情況，連接子(例如)藉由進一步減少立體障礙效應且使FIX組分及/或其他組分為更易達到而增強融合蛋白質之生物活性。

連接子亦可併入能夠化學分解(例如，酯鍵之水解)，酶促分解(例如，併入蛋白酶分解序列)或光解分解(例如，諸如3－胺基－3－(2－硝基苯基)丙酸(ANP)之發色團)之部分以自Fc蛋白質釋放生物活性分子。

用於該等目的之交聯化學及有效試劑為此項技術中熟知的。用以共軛各種組分之交聯劑之性質不為本發明所限制。可使用任何交聯劑，其限制條件為a)保留FIX之活性，及b)藉由共軛物之FcRn結合搭配物組分之FcRn的結合不被不利影響。

Fc及化合物之有效一步驟交聯之實例為在室溫在磷酸鈉緩衝液中Fc以過碘酸鈉氧化30分鐘，接著在4℃與欲共軛之化合物隔夜培育。共軛亦可藉由在室溫用6－[3－(2－吡啶基二硫基)丙醯胺基己酸磺酸基琥珀醯亞胺酯(sulfo－LC－SPDP，Pierce)將化合物及Fc片段衍化18小時來執行。共軛物亦可藉由隨後可形成一個共價鍵聯之不同交聯劑衍化Fc片段及所欲化合物而製備。該反應之實例為用4－(N－馬來醯亞胺甲基)環己烷－1－甲酸磺酸基琥珀醯亞胺酯(Sulfo－SMCC，Pierce)衍化Fc片段，及用S－乙醯基硫乙酸N－琥珀醯亞胺酯(SATA)硫醇化(巰基化)(thiolated)欲與Fc共軛之化合物。將衍化之組分純化為不含交聯劑且在室溫下合併1小時以容許交聯。包括醛、醯亞胺、氰基、鹵素、羧基、活化羧基、酐及順丁烯二醯亞胺官能基之其他交聯試劑為熟習此項技術者已知，亦可用於化合物與Fc片段之共軛。

當然，交聯劑之選擇將視所要共軛之組分之性質而定。上文所述之交聯劑對於蛋白質－蛋白質共軛有效。若欲將碳水化合物或含碳水化合物之部分共軛於多肽，則諸如ABH、M2C2H、MPBH及PDPH之雜雙官能交聯劑可用於共軛(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)。蛋白質及碳水化合物共軛之另一種方法由Brumeanu等人(Genetic Engineering News,October 1,1995，p.16)揭示。若欲將脂質或含脂質之部分共軛於多肽，則可使用諸如SPDP、SMPB及其衍生物之交聯劑(Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)。

在所有上述交聯反應中，重要的是將經衍生化合物純化為不含交聯劑的。亦重要的是將最終共軛物純化為大體上不含未共軛反應物的。純化可藉由基於共軛物之每一組分之性質的親和力、凝膠過濾或離子交換層析達到。尤其較佳方法為使用蛋白質A－瓊脂糖之初始親和力純化步驟以保留Fc及含Fc共軛物，接著基於Fc共軛物之質量、尺寸或電荷之凝膠過濾或離子交換層析。該純化流程之初始步驟確保共軛物將結合於FcRn，其為本發明之基本要求。

根據本發明已發現，PC5可用以處理FIX前軀多肽以產生成熟FIX多肽。在一實施例中，PC5及FIX前軀多肽表現於細胞內，其中PC5處理FIX前軀多肽。在另一實施例中，分離PC5可用以處理分離FIX前軀多肽。

當欲在細胞內共表現PC5及FIX前軀多肽時，在一實施例中，細胞天然表現PC5且含有編碼第九因子之前體蛋白(proFIX)或其融合蛋白質之表現載體。

當欲在細胞內共表現PC5及FIX前軀多肽時，在一實施例中，細胞含有編碼第九因子之前體蛋白(proFIX)或其融合蛋白質之表現載體，且細胞藉由同源重組修飾以包含引起內因性PC5基因之過渡表現之核酸表現控制序列。在該實施例中，將外生、更有效啟動子交換成內因性PC5啟動子，造成內因性PC5之過渡表現。參見(例如)美國專利第5,641,670號、第5,733,761號及第5,272,071號；WO 91/06666；WO 91/06667；及WO 90/11354，所有者以引用之方式全部併入。

當欲在細胞內共表現PC5及FIX前軀多肽時，在一實施例中，細胞含有編碼第九因子之前體蛋白(proFIX)或其融合蛋白質之表現載體及編碼功能性PC5多肽之表現載體。編碼第九因子之前體蛋白(proFIX)或其融合蛋白質之表現載體及編碼功能性PC5多肽之表現載體可為分離表現載體或可組合於單表現載體中。

如本文所使用，表現載體係指任一核酸構築體，其含有轉錄及轉譯經插入編碼序列所必需之元素，或在RNA病毒載體狀況下，含有當引入適當宿主細胞中時，複製及轉譯所必需之元素。表現載體可包含質體、噬質體、病毒及其衍生物。

本發明之表現載體將包含編碼本發明之多肽，例如PC5及proFIX之聚核苷酸。如本文所使用，聚核苷酸係指兩種或兩種以上之核苷酸之任何共價鍵聯聚合物。核苷酸為包括鍵聯於磷酸基團之糖(例如，核糖或脫氧核糖)及核苷酸鹼基，亦即嘌呤或嘧啶之分子。嘌呤包含但不限於腺嘌呤及鳥嘌呤。嘧啶包含但不限於胞嘧啶、胸嘧啶及尿嘧啶。在一實施例中，聚核苷酸為脫氧核糖核苷酸之聚合物，亦即DNA分子。在一實施例中，聚核苷酸為核糖核苷酸之聚合物，亦即RNA分子。在一實施例中，聚核苷酸為編碼多肽之核酸分子，亦即聚核苷酸為編碼序列。在一實施例中，編碼多肽之核酸分子為編碼多肽之染色體組DNA分子。在一實施例中，編碼多肽之核酸分子為編碼多肽之互補DNA(cDNA)。在一實施例中，聚核苷酸為編碼多肽之重組DNA分子。

在某些實施例中，編碼序列可操作地鍵聯於表現控制序列。如本文所使用，兩個核酸序列當其以此方式共價鍵聯以允許各組分核酸序列保留其功能性時，為可操作鍵聯的。據稱，編碼序列及基因表現控制序列當其以此方式共價鍵聯以使編碼序列之表現或轉錄及/或轉譯處於基因表現控制序列之影響或控制下時，為可操作鍵聯的。據稱，若5'基因表現序列中之啟動子之誘導造成編碼序列之轉錄且若兩個DNA序列之間的鍵聯性質不(1)造成框架位移突變之引入，(2)干擾啟動子區域引導編碼序列之轉錄之能力，或(3)干擾相應RNA轉錄物轉譯成蛋白質之能力，則兩個DNA序列為可操作鍵聯的。因此，若基因表現序列能夠實現編碼核酸序列之轉錄以便所得轉錄物轉譯成所要蛋白質或多肽，則基因表現序列將可操作地鍵聯於編碼核酸序列。

如本文所使用，基因表現控制序列為任一調節核苷酸序列，諸如啟動子序列或啟動子－強化子組合，其促進與其可操作鍵聯之編碼核酸之有效轉錄及轉譯。基因表現控制序列可(例如)為哺乳動物或病毒啟動子，諸如構成性啟動子或誘導性啟動子。構成性哺乳動物啟動子包含(但不限於)以下基因之啟動子：次黃嘌呤轉磷酸核糖基酶(HPRT)、腺甙脫胺酶、丙酮酸激酶、β－肌動蛋白啟動子及其他構成性啟動子。在真核細胞中起構成性功能之例示性病毒啟動子包含(例如)來自以下病毒之啟動子：細胞巨大病毒(CMV)、猴病毒(例如，SV40)、乳頭狀瘤病毒、腺病毒、人類免疫缺乏病毒(HIV)、魯式肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、細胞巨大病毒、莫洛尼氏白血病病毒(Moloney leukemia virus)之長末端重複序列(LTR)及其他反轉錄病毒，及疱疹性單病毒之胸苷激酶啟動子。其他構成性啟動子為熟習此項技術者已知。適用作本發明之基因表現序列之啟動子亦包含誘導性啟動子。誘導性啟動子係在誘導劑存在下表現。舉例而言，金屬硫蛋白啟動子係在某些金屬離子存在下誘導以促進轉錄及轉譯。其他誘導性啟動子為熟習此項技術者已知。

一般而言，基因表現控制序列將包含(按需要)分別與起始轉錄及轉譯聯繫之5'非轉錄及5'非轉譯序列，諸如TATA box、封端序列、CAAT序列及其類似物。尤其地，該等5'非轉錄序列將包含啟動子區域，其包含用於可操作接合編碼核酸之轉錄控制之啟動子序列。基因表現序列視情況包含強化子序列或(如需要)上游活化子序列。

病毒載體包含(但不限於)來自以下病毒之核酸序列：反轉錄病毒，諸如莫洛尼氏鼠類白血病病毒、哈威氏鼠類肉瘤病毒(Harvey murine sarcoma virus)、鼠類乳腺腫瘤病毒及魯式肉瘤病毒；腺病毒、腺相關病毒；SV40型病毒；多形瘤病毒；EB病毒(Epstein－Barr virus)；乳頭狀瘤病毒；疱疹性病毒；牛痘病毒；小兒麻痺病毒；及RNA病毒，諸如反轉錄病毒。熟習此項技術者可易使用未指定但此項技術中已知之其他載體。某些病毒載體係基於其中非基本基因已經所關注之基因置換之非細胞病變真核病毒。非細胞病變病毒包含反轉錄病毒，其生命週期涉及染色體組病毒RNA反轉錄成DNA與後續前病毒整合成宿主細胞DNA。已認可人類基因療法試驗之反轉錄病毒。最有效者為複製不足(亦即，能夠直接合成所要蛋白質，但不能製造感染顆粒)之彼等反轉錄病毒。該等遺傳改變反轉錄病毒表現載體在活體內，基因之高效率轉導而言具有通用實用性。生產複製不足反轉錄病毒之標準協定(包含之步驟為：將外生遺傳物質併入質體中，用質體轉染封裝細胞系，藉由封裝細胞系生產重組反轉錄病毒，自組織培養基收集病毒顆粒，及用病毒顆粒感染目標細胞)提供於Kriegler,M.,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,W.H.Freeman Co.,New York(1990)及Murry,E.J.,Methods in Molecular Biology，第7卷，Humana Press,Inc.,Cliffton,New Jersey(1991)中。

在一實施例中，病毒為腺相關病毒、雙股DNA病毒。腺相關病毒可工程化為複製不足的且能夠感染廣泛範圍之細胞類型及物種。其另外具有優點，諸如熱穩定性及脂質溶劑穩定性；在包含造血細胞之具有不同細胞系之細胞中的高轉導頻率；及缺乏重複感染抑制，因此容許多系列之轉導。據稱，腺相關病毒可以位點特異方式整合入人類細胞DNA中，進而最小化插入突變之可能性及反轉錄病毒感染之插入基因表現特徵之可變性。另外，已在不存在選擇性壓力下，在組織培養中追蹤到大於100繼代之野生型腺相關病毒感染，意味著腺相關病毒染色體組整合為相對穩定之事件。腺相關病毒亦可以染色體外方式起作用。

其他載體包含質體載體。質體載體已在此項技術中廣泛描述且為熟習此項技術者熟知。參見(例如)Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。近幾年，已發現質體載體對在活體內將基因傳遞至細胞而言為尤其有利的，因為其不能在宿主基因組內複製且整合入宿主基因組中。然而，具有與宿主細胞相容之啟動子之該等質體可自可操作編碼於質體內之基因表現肽。一些可購自商業供應商之常用質體包含pBR322、pUC18、pUC19、各種pcDNA質體、pRC/CMV、各種pCMV質體、pSV40及pBlueScript。特定質體之額外實例包含pcDNA3.1，目錄號V79020；pcDNA3.1/hygro，目錄號V87020；pcDNA4/myc－His，目錄號V86320；及pBudCE4.1，目錄號V53220，全部來自Invitrogen(Carlsbad，CA)。其他質體為熟習此項技術者熟知。另外，質體可使用標準分子生物技術來定製設計以移除及/或添加DNA之特定片段。

在可用以生產本發明之蛋白質之一昆蟲表現系統中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhidrosis virus)(AcNPV)用作表現外來基因之載體。病毒在草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )細胞中生長。編碼序列可選殖至病毒之非基本區域中(例如多面體基因)且使其處於ACNPV啟動子(例如多面體啟動子)之控制下。編碼序列之成功插入將造成多面體基因之失活及非閉合重組病毒之產生(亦即，病毒缺乏藉由多面體基因編碼之蛋白質包衣)。隨後，將該等重組病毒用以感染其中表現插入基因之草地黏蟲細胞。(參見(例如)Smith等人(1983)J Virol 46：584；美國專利第4,215,051號)。該表現系統之其他實例可見於Ausubel等人，編.(1989)Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience中。

可用以表現本發明之蛋白質之另一系統為麩醯胺酸合成酶基因表現系統，亦稱為"GS表現系統"(Lonza Biologics PLC,Berkshire UK)。該表現系統詳細描述於美國專利第5,981,216號中。

在哺乳動物宿主細胞中，可利用大量以病毒為主之表現系統。在腺病毒用作表現載體之狀況下，編碼序列可接合至腺病毒轉錄/轉譯控制複合物，例如，晚期啟動子及三連先導序列。隨後，該嵌合基因可藉由活體外或活體內重組而插入腺病毒基因組中。於病毒基因組之非基本區域中(例如，區域E1或E3)之插入將產生可生長發育的及能夠在感染宿主中表現肽之重組病毒。參見(例如)Logan & Shenk(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81：3655)。或者，可使用牛痘7.5 K啟動子。參見(例如)Mackett等人(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79：7415；Mackett等人(1984)J Virol 49：857；Panicali等人(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79：4927。

為增加生產效率，聚核苷酸可經設計以編碼由酶促分解位點分離之本發明之蛋白質的多個單元。所得多肽可分解(例如，藉由用適當酶之處理)以回收多肽單元。其可增加藉由單一啟動子驅動之多肽之產量。當用於適當病毒表現系統中時，藉由mRNA編碼之各多肽之轉譯係在轉錄物內部引導；例如，藉由內部核糖體入口位點，IRES引導。因此，多作用子構築體引導單一、大多作用子mRNA之轉錄，其又引導多個、個別多肽之轉譯。該方法消除聚合蛋白質之生產及酶促處理且可顯著增加藉由單一啟動子驅動之多肽之產量。

用於轉型作用之載體將通常含有用以識別轉移體之可選擇標記物。在細菌系統中，其可包含諸如安比西林(ampicillin)或康黴素(kanamycin)之抗生素抗性基因。用於經培養哺乳動物細胞之可選擇標記物包含給與對諸如新黴素(neomycin)、濕黴素(hygromycin)及甲胺喋呤(methotrexate)之藥物之抗性的基因。可選擇標記物可為可擴征選擇標記物。一種可擴征選擇標記物為二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。Simonsen CC等人(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80：2495－9。可選擇標記物由Thilly(1986)Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers,Stoneham,Mass.回顧，且可選擇標記物之選擇完全在熟習此項技術者之技術水平內。

可選擇標記物可與所關注之基因同時於分離質體上引入細胞中，或其可引入相同質體上。若在相同質體上，則可選擇標記物及所關注之基因可處於不同啟動子或相同啟動子之控制下，後一配置產生雙順反子訊息。該類型之構築體在此項技術中已知(例如，美國專利第4,713,339號)。

表現載體可編碼允許重組生產之蛋白質之容易純化的標籤。實例包含(但不限於)載體pUR278(Ruther等人(1983)EMBO J 2：1791)，其中欲表現之蛋白質之編碼序列可接合至具有lac z編碼區域之框架中之載體中，以便產生標籤融合蛋白質；pGEX載體可用以表現具有麩胱甘肽S－轉移酶(GST)標籤之本發明之蛋白質。該等蛋白質通常為可溶的且可易藉由吸附於麩胱甘肽－瓊脂糖珠粒，接著在游離麩胱甘肽存在下溶離而自細胞純化。載體包含用於在純化後容易移除標籤之分解位點(凝血酶或Xa因子蛋白酶，或PreScission Protease^TM (Pharmacia,Peapack,N.J.))。

隨後，將表現載體轉染或共轉染至將表現多肽之適合目標細胞中。此項技術中已知之轉染技術包含(但不限於)磷酸鈣沉澱(Wigler等人(1978)Cell 14：725)、電穿孔(Neumann等人(1982)EMBO J 1：841)及以脂質體為主之試劑。可利用包含原核或真核細胞之各種宿主表現載體系統以表現本文所述之蛋白質。該等系統包含(但不限於)微生物，諸如經含有適當編碼序列之重組噬菌體DNA或質體DNA表現載體轉型之細菌(例如，大腸桿菌(E.coli ))；經含有適當編碼序列之重組酵母或真菌表現載體轉型之酵母或絲狀真菌；經含有適當編碼序列之重組病毒表現載體(例如，桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；經重組病毒表現載體(例如，花椰菜嵌紋病毒或煙草花葉病毒)感染或經含有適當編碼序列之重組質體表現載體(例如，Ti質體)轉型之植物細胞系統；或包含哺乳動物細胞(例如，HEK 293、CHO、Cos、HeLa及BHK細胞)之動物細胞系統。

在一實施例中，宿主細胞為真核細胞。如本文所使用，真核細胞係指具有胚乳原核之任一動物或植物細胞。動物之真核細胞包含例如哺乳動物之脊椎動物之細胞及例如昆蟲之無脊椎動物之細胞。植物之真核細胞可明確地包含(而不限於)酵母細胞。真核細胞相異於例如細菌之原核細胞。

在某些實施例中，真核細胞為哺乳動物細胞。哺乳動物細胞為得自哺乳動物之任一細胞。哺乳動物細胞明確地包含但不限於哺乳動物細胞系。在一實施例中，哺乳動物細胞為人類細胞。在一實施例中，哺乳動物細胞為HEK 293細胞，其為人類胚胎腎細胞系。HEK 293細胞可以CRL－1533購自American Type Culture Collection,Manassas,VA，及以293－H細胞，目錄號11631－017或293－F細胞，目錄號11625－019購自Invitrogen(Carlsbad,CA)。在一實施例中，哺乳動物細胞為PER.C6細胞，其為得自視網膜之人類細胞系。PER.C6細胞可購自Crucell(Leiden,The Netherlands)。在一實施例中，哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。CHO細胞可購自American Type Culture Collection,Manassas,VA(例如，CHO－K1；CCL－61)。在一實施例中，哺乳動物細胞為仔倉鼠腎(BHK)細胞。BHK細胞可購自American Type Culture Collection,Manassas,VA(例如，CRL－1632)。

在一實施例中，將包含proFIX－Fc融合編碼序列及例如芥森(zeocin)抗性之可選擇標記物之質體轉染至HEK 293細胞中，以生產FIX－Fc同型二聚體。

在一實施例中，將包含proFIX－Fc融合編碼序列及例如芥森抗性基因之第一可選擇標記物之第一質體，及包含Fc編碼序列及例如新黴素抗性基因之第二可選擇標記物之第二質體共轉染至HEK 293細胞，以生產FIX－Fc單體－二聚體雜合物。第一及第二質體可以相等量(亦即1：1比率)引入，或其可以不等量引入。

在一實施例中，將包含proFIX－Fc融合編碼序列及例如芥森抗性基因之第一可選擇標記物之第一質體及包含Fc編碼序列及例如新黴素抗性基因之第二可選擇標記物之第二質體，及包含PC5編碼序列及例如濕黴素抗性基因之第三可選擇標記物之第三質體共轉染至HEK 293細胞中，以生產FIX－Fc單體－二聚體雜合物。第一及第二質體可以相等量(亦即1：1莫耳比率)引入，或其可以不等量引入。

在一實施例中，將包含proFIX－Fc融合編碼序列、Fc編碼序列及例如芥森抗性基因之第一可選擇標記物之第一質體，及包含PC5編碼序列及例如濕黴素抗性基因之第二可選擇標記物之第二質體共轉染至HEK 293細胞中，以生產FIX－Fc單體－二聚體雜合物。proFIX－Fc融合編碼序列及Fc編碼序列之啟動子可為不同的或其可為相同的。

在一實施例中，將包含proFIX－Fc融合編碼序列、Fc編碼序列及例如芥森抗性基因之第一可選擇標記物之第一質體及包含Fc編碼序列及例如新黴素抗性基因之第二可選擇標記物之第二質體，及包含PC5編碼序列及例如濕黴素抗性基因之第三可選擇標記物之第三質體共轉染至HEK 293細胞中，以生產FIX－Fc單體－二聚體雜合物。第一質體中之proFIX－Fc融合編碼序列及Fc編碼序列之啟動子可為不同的或其可為相同的。第一及第二質體可以相等量(亦即1：1莫耳比率)引入，或其可以不等量引入。

在一實施例中，FIX內含子I(基因庫寄存編號NC_000023)之截斷形式包含於FIX之編碼序列中。先前已展示其由於功能性拼接序列存在於前軀物mRNA中而增加FIX表現之水平。Kurachi S等人(1995)J Biol Chem. 270：5276－81。

在一實施例中，轉染細胞經穩定轉染。該等細胞可使用熟習此項技術者已知之習知技術選擇且維持為穩定細胞系。

含有蛋白質之DNA構築體之宿主細胞係在適當生長培養基中生長。如本文所使用，術語"適當生長培養基"意謂含有細胞生長所需之養分之培養基。細胞生長所需之養分可包含碳來源、氮來源、基本胺基酸、維生素、礦物及生長因子。視情況，培養基可含有一或多種選擇因子。視情況，培養基可含有小牛血清或胎牛血清(FCS)。在一實施例中，培養基大體上不含有IgG。生長培養基通常將藉由(例如)藥物選擇而選擇含有DNA構築體或缺乏基本養分之細胞，該基本養分藉由DNA構築體上之可選擇標記物互補或用DNA構築體共轉染。經培養哺乳動物細胞通常係在市售含血清或不含血清培養基(例如，MEM、DMEM、DMEM/F12)中生長。在一實施例中，培養基為CD293(Invitrogen,Carlsbad,CA)。在一實施例中，培養基為CD17(Invitrogen,Carlsbad,CA)。選擇適於所使用之特定細胞系之培養基係在熟習此項技術者之技術水平內。

在一態樣中，本發明提供自第九因子之前體蛋白或其融合蛋白質生產含成熟第九因子多肽之方法。

如本文所使用，含成熟第九因子多肽係指包含第九因子之成熟形式之多肽。在一實施例中，含成熟第九因子多肽係指為第九因子之成熟形式之多肽。第九因子之成熟形式至少包含γ－羧酸化Gla域及催化域，且排除前肽及原肽(如本文所述)。第九因子之成熟形式可(但並非必要)為第九因子之活化形式。舉例而言，在一實施例中，第九因子之成熟形式藉由SEQ ID NO：3之胺基酸殘基47－461表示。在一實施例中，Gla域中之12個麩胺酸殘基之至少10者經γ羧酸化。當Gla域中之12個麩胺酸殘基僅10者經γ羧酸化時，在一實施例中，10個羧酸化麩胺酸殘基為Gla域中之前10個麩胺酸殘基(例如，SEQ ID NO：3中之Glu53、Glu54、Glu61、Glu63、Glu66、Glu67、Glu72、Glu73、Glu76及Glu79)。在一實施例中，Gla域中之12個麩胺酸殘基之至少11者經γ羧酸化。在一實施例中，Gla域中之所有麩胺酸殘基經γ羧酸化。

在根據本發明之該態樣之一實施例中，含成熟第九因子多肽係指為第九因子之成熟形式之多肽。

在根據本發明之該態樣之一實施例中，諸如公開為US 2005/0032174之共有美國專利申請案第10/841250號中所揭示，含成熟第九因子多肽為FIX－Fc單體－二聚體雜合物，該專利之全部內容以引用之方式併入本文。在該實施例中，前前體蛋白(proproprotein)融合蛋白質相應於proFIX－Fc單體－二聚體雜合物。

亦提供的為根據本發明之該態樣之方法而生產之成熟FIX－Fc單體－二聚體雜合物。

生產含成熟第九因子多肽之方法需要培養(如上文所述)含有編碼第九因子之前體蛋白或其融合蛋白質之第一表現載體，及編碼功能性PC5多肽之第二表現載體之細胞。該等細胞係在容許表現proFIX或其融合蛋白質及功能性PC5多肽之條件下培養。

如本文所使用，培養係指在活體外維持活細胞至少規定時間。維持可(但不需)包含活細胞群體之增加。舉例而言，維持於培養基中之細胞可為群體靜態的，但仍可生長發育且能夠生產所要產物，例如重組蛋白質或重組融合蛋白質。培養真核細胞之適合條件在此項技術中為熟知的且包含培養基、培養基補充物、溫度、pH、氧飽和度及其類似物之適當選擇。對商業目的而言，培養可包含使用各種類型之按比例擴大系統之任一者，其包含震盪器燒瓶、輥瓶、中空纖維生物反應器、攪拌槽式生物反應器、氣升生物反應器、Wave生物反應器及其他。

細胞培養條件亦經選擇以容許藉由功能性PC5多肽處理proFIX或其融合蛋白質。容許藉由功能性PC5多肽特異地處理proFIX或其融合蛋白質之條件可包含維生素K來源之存在。舉例而言，在一實施例中，穩定轉染HEK 293細胞係在用4 mM麩醯胺酸及10 μg/L維生素K₃ 補充之CD293培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培養。

如本文所使用，藉由功能性PC5處理係指自proFIX分解原肽。換言之，藉由功能性PC5處理係指將含proFIX多肽PC5介導轉化成含成熟第九因子多肽。

在一態樣中，本發明係關於增加來自第九因子之前體蛋白或其融合蛋白質之含成熟第九因子多肽的產量之方法。如本文所使用，就含成熟第九因子多肽而言，增加產量係指與不用PC5且在規定條件下獲得之含成熟第九因子多肽之參考量或活性相比，誘導用PC5且在規定條件下獲得之含成熟第九因子多肽之數量或活性的可量測增量。在一實施例中，可量測增量為至少5%。在一實施例中，可量測增量為至少10%。在額外個別實施例中，可量測增量為至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%。

在一態樣中，本發明係關於自第九因子之前體蛋白或其融合蛋白質生產含成熟第九因子多肽之方法。如本文所使用，自第九因子之前體蛋白或其共軛物生產含成熟第九因子多肽係指，用PC5處理proFIX或其共軛物以產生含成熟第九因子多肽。

如本文所使用，共軛物係指藉由包含(但不限於)疏水性相互作用、共價相互作用、氫鍵相互作用、離子相互作用及其任一組合之任一物理化學方式而彼此結合之任何兩個或兩個以上實體。因此，在一實施例中，本發明之共軛物係指藉由共價相互作用而彼此結合之任何兩個或兩個以上實體。舉例而言，在一實施例中，共軛物為融合蛋白質。在一實施例中，本發明之共軛物係指藉由非共價相互作用而彼此結合之任何兩個或兩個以上實體。

根據本發明之該態樣之方法涉及將proFIX或其共軛物與有效量之功能性PC5多肽接觸。接觸係指使各種實體達到緊密物理接觸(例如)以便允許PC5處理proFIX或其共軛物。如本文所使用，有效量係指足以達到例如藉由PC5處理proFIX或其共軛物之所要生物效應之量。

在一實施例中，根據本發明之該態樣之方法可使用第九因子之分離前體蛋白或其共軛物，及分離PC5多肽來實踐。舉例而言，得自一來源之第九因子之分離前體蛋白可在容許藉由功能性PC5多肽處理proFIX或其融合蛋白質之條件下，與得自另一來源之分離PC5多肽接觸。容許藉由功能性PC5多肽處理proFIX或其融合蛋白質之條件包含維生素K來源、γ羧化酶之存在及適於γ羧化酶酶促活性之額外組分及條件。

在根據本發明之該態樣之一實施例中，諸如公開為US 2005/0032174之共有美國專利申請案第10/841250號中所揭示，含成熟第九因子多肽為FIX－Fc單體－二聚體雜合物，該專利之全部內容以引用之方式併入本文。在該實施例中，proFIX共軛物相應於proFIX－Fc單體－二聚體雜合物。

如本文所使用，聚乙二醇化proFIX係指在proFIX與至少一個聚乙二醇(PEG)分子之間形成之共軛物。PEG為以大量種類之分子量及平均分子量範圍市售的。PEG平均分子量範圍之典型實例包含(但不限於)200、300、400、600、1000、1300－1600、1450、2000、3000、3000－3750、3350、3000－7000、3500－4500、5000－7000、7000－9000、8000、10000、8500－11500、16000－24000、35000及40000。該等平均分子量僅提供為實例且並非意欲以任一方式限制。

在一實施例中，本發明之肽可經聚乙二醇化以包含單－或多－(例如，2－4)PEG部分。聚乙烯二醇化可藉由此項技術中已知之聚乙烯二醇化反應之任一者進行。製備聚乙二醇化蛋白質產物之方法將通常包含(a)在本發明之肽藉以變成連接於一或多個PEG基團之條件下，使多肽與聚乙二醇(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)反應；及(b)獲得反應產物。一般而言，反應之最佳反應條件將藉由基於已知參數及所要結果之狀況而確定。

存在熟習此項技術者可用之大量PEG連接方法，例如EP 0 401 384；Malik F等人(1992)Exp Hematol. 20：1028－35；Francis(1992)Focus on Growth Factors 3(2)：4－10；EP 0 154 316；EP 0 401 384；WO 92/16221；及WO 95/34326。

如對本發明之蛋白質所描述之聚乙烯二醇化的步驟可經由與反應性聚乙二醇分子之醯化反應或烷基化反應進行。因此，根據本發明之蛋白質產物包含其中PEG基團經由醯基或烷基連接之聚乙二醇化蛋白質。該等產物可為單－聚乙二醇化的或多－聚乙二醇化的(例如，含有2－6個或2－5個PEG基團之彼等者)。PEG基團通常在胺基酸之α－胺基或ε－胺基處連接於蛋白質，但亦預期PEG基團可連接於與蛋白質連接之任何胺基，其為充足反應性的以在適合反應條件下變成連接於PEG基團。

藉由醯化之聚乙烯二醇化通常涉及使聚乙二醇之活性酯衍生物與本發明之肽反應。對醯化反應而言，所選聚合物通常具有單反應性酯基團。任何已知或隨後發現之反應性PEG分子可用以進行聚乙烯二醇化反應。適合活化PEG酯之實例為酯化成N－羥基琥珀醯亞胺(NHS)之PEG。如本文所使用，預期醯化包含(而不限於)治療蛋白質與諸如PEG之聚合物之間的以下類型之鍵聯：醯胺、胺基甲酸鹽、胺基甲酸酯及其類似物。參見(例如)Chamow SM等人(1994)Bioconjug Chem. 5：133－40。反應條件可選自聚乙烯二醇化技術中已知之彼等條件之任一者或隨後發展之彼等條件之任一者，但應避免將使欲修飾之多肽失活之諸如溫度、溶劑及pH的條件。

藉由醯化之聚乙烯二醇化將通常產生多－聚乙二醇化蛋白質。連接鍵聯可為醯胺。所得產物可大體上僅為(例如，>95%)單－聚乙二醇化、二－聚乙二醇化或三－聚乙二醇化的。然而，一些具有較高聚乙烯二醇化度之物質可以視所使用之特定反應條件而定之量形成。若須要，更多純化聚乙二醇化物質可藉由尤其包含透析、鹽析、超濾、離子交換層析、凝膠過濾層析及電泳法之標準純化技術自混合物(尤其為未反應物質)分離。

藉由烷基化之聚乙烯二醇化通常涉及在還原劑之存在下，使PEG之末端醛衍生物與多肽反應。對還原性烷基化反應而言，所選聚合物應具有單反應性醛基團。例示性反應性PEG醛為水穩定性之聚乙二醇丙醛，或其單C1－C10烷氧基或芳基氧基衍生物。參見(例如)美國專利第5,252,714號。

重組生產之FIX可自適用於活體外及活體內，包含臨床用途之細胞、培養基及其他產物分離。

當根據本發明之方法生產蛋白質時，其可發生於諸如其他蛋白質或蛋白質片段之分子之混合物中。舉例而言，FIX－Fc單體－二聚體雜合物通常表現於亦包含FIX－Fc二聚體及Fc二聚體之產物之混合物中。因此，本發明可涉及自含有蛋白質之混合物分離前述蛋白質之任一者之方法。詳言之，在一實施例中，本發明可涉及自包含單體－二聚體雜合物、二聚體及例如Fc片段之免疫球蛋白恆定區域之至少部分的蛋白質之混合物分離proFIX－Fc單體－二聚體雜合物之方法。在一實施例中，本發明可涉及自包含單體－二聚體雜合物、二聚體及例如Fc之免疫球蛋白恆定區域之至少部分的蛋白質之混合物分離proFIX－Fc同型二聚體之方法。

在一實施例中，蛋白質產物分泌於培養基中。將培養基與細胞分離、濃縮、過濾且隨後通過2個或3個親和力柱：蛋白質A柱及1個或2個陰離子交換柱。

在一典型實例中，藉由於拋棄式瓶中之離心將細胞自培養基分離。隨後經由0.8/0.2 μm PALL AcroPak過濾器將所分離之培養基過濾，且用Millipore ProFlux M12切向流式過濾系統、Pellicon 2卡匣，10 K,B10－A,0.5 m² 濃縮5－7倍。使用0.8/0.2 μm PALL AcroPak過濾器將保留物過濾至無菌塑料袋中。

用PBS，pH 7.4平衡蛋白質A柱(MabSelect,Amersham)。以150－200公分/小時之流動速率，用10－15毫克蛋白質/毫升之樹脂加載該柱且用PBS接著3－5柱體積之PBS加上0.9 M NaCl洗滌。在溶離之前，用PBS降低傳導率。隨後，用25 mM檸檬酸鈉/150 mM NaCl，pH 3.4溶離該柱，且用2M Tris將溶離份中和至為7之最終pH。所得溶離液含有所有含Fc物質。

將自蛋白質A柱之溶離液加載於DEAE柱(Fractogel,EMD)上且用25 mM Tris/150 mM NaCl，pH 7.5平衡該柱。用3－5柱體積之25 mM Tris/350 mM乙酸銨，pH 7.5洗滌所加載及平衡之柱後，用25 mM Tris/600 mM乙酸銨，pH 7.5溶離該柱。溶離液含有FIX－Fc單體－二聚體雜合物，不含FIX－Fc二聚體及Fc片段。

儘管在DEAE層析後，FIX－Fc單體－二聚體雜合物之純度已為約98%，但是作為使分離FIX－Fc單體－二聚體雜合物富集凝血活性之另一步驟，可使用第二離子交換層析步驟。用25 mM Tris/150 mM NaCl，pH 7.5將自先前步驟之溶離液1：4稀釋，且以7－10 mg/ml加載於Q Sepharose FF柱上(Amersham)。在用平衡緩衝液洗滌該柱後，用7 mM CaCl₂ /150 mM NaCl/25 mM Tris，pH 7.5溶離該柱。收集經溶離FIX－Fc單體－二聚體雜合物直至UV信號降至280 nm處之最大吸光度之約20%。可用較高濃度之CaCl₂ (例如，10 mM)或乙酸銨(例如，600 mM)將較低活性FIX－Fc單體－二聚體雜合物剝離出該柱。純化及富集之替代者及額外方法在該領域中為已知，例如，美國專利第4,981,952號及第5,714,583號。

使用肽映射，可能展示原肽藉由PC5而自FIX－Fc單體－二聚體雜合物完全處理。若FIX原肽並非完全處理，則FIX－Fc單體－二聚體雜合物之胰蛋白酶消化(LysC,ArgC)產生原肽之標記物(原肽指示肽，"PIP")。FIX原肽具有胺基酸序列TVFLDHENANKILNRPKR(SEQ ID NO：17)，其之序列TVFLDHENANK(SEQ ID NO：18)表示原肽指示肽(PIP)。PIP存在於不用處理酶(PC5)轉染之FIX－Fc單體－二聚體雜合物中，且其不存在於用處理酶(PC5)轉染之FIX－Fc單體－二聚體雜合物中。PIP亦存在於用PC7轉染之FIX－Fc單體－二聚體雜合物中，且不存在於用PACE轉染之單獨FIX中。相反，具有序列YGIYTK(SEQ ID NO：19)之參考肽("K23"相應於SEQ ID NO：3之胺基酸殘基395－400)存在於用或不用處理酶(PC5)轉染之FIX－Fc單體－二聚體雜合物中。

本發明之成熟、活化FIX及含FIX多肽之活性可使用標準經活化部分凝血酶時間(aPTT)檢定來量測。該檢定廣泛用作第九因子凝血活性之臨床檢定。為執行檢定，用磷脂及諸如土耳其鞣酸或矽石之活化子在缺FIX血漿中預培育測試樣本，且隨後藉由添加CaCl₂ 誘導凝血形成。(例如)用MLA Electra 1600臨床器具量測凝血形成之時間，且與世界衛生組織(WHO)第九因子標準比較。

FIX－Fc融合蛋白質及共軛物超過單獨FIX之特定優點為其在活體內之延長半衰期。與單獨FIX相比，延長半衰期允許根本上減少給藥要求。舉例而言，在一實驗中，發現HEK 293所得之FIX－Fc單體－二聚體雜合物在靜脈內注射至正常大鼠中後，具有30.0小時終端半衰期。經比較，發現在靜脈內注射至正常大鼠後，BeneFIX之終端半衰期為5小時。在正常狗中之分離實驗組中，發現在靜脈內投藥後，FIX－Fc單體－二聚體雜合物及BeneFIX之終端半衰期分別為36小時及12－14小時。令人驚訝地，發現在狗中之該實驗組中，FIX－Fc二聚體之半衰期為22小時。在所有該等實驗中，使用特定用於FIX之酶聯結免疫吸附劑檢定(ELISA)執行藥物動力學量測。

除基於ELISA之結果展示FIX－Fc單體－二聚體雜合物在活體內之延長半衰期外，藉由在缺FIX小鼠中量測PTT，FIX－Fc單體－二聚體雜合物之功能性活性亦展示為延長的。在單一靜脈內劑量之FIX－Fc單體－二聚體雜合物(217 IU/kg體重)後，展示血漿中之aPTT活性在缺FIX小鼠中以47小時之半衰期衰變。

本發明係部分關於治療具有止血病症之受檢者之方法，其包括投與治療有效量之根據本發明之一或多種方法生產的至少一種FIX多肽。詳言之，本發明之融合蛋白質及共軛物可用以藉由促進血纖維蛋白凝血之形成而治療或防止與缺FIX相關之止血病症。可藉由投藥本發明之融合蛋白質或共軛物治療之止血病症包含(但不限於)血友病B。

本發明之FIX蛋白質或共軛物可預防性地使用以治療具有止血病症之受檢者。或者或另外，本發明之FIX融合蛋白質或共軛物可用以治療具有止血病症之受檢者之急性出血發作。在一實施例中，止血病症為遺傳性缺乏第九因子之結果。在另一實施例中，止血病症可為後天性病症。後天性病症可由潛伏第二疾病或病狀產生。第二疾病或病狀可為(例如且不限於)肝疾病、散播性血管內凝血(DIC)、敗血症或感染、癌症、自體免疫疾病、懷孕、高齡或來自治療潛伏第二病症之用藥法(例如，癌症化學療法)。

本發明之FIX蛋白質及FIX共軛物可經由任一適合投藥路線投與，其包含靜脈內、皮下、肌肉內，或經由任一黏膜表面，例如經口、舌下、經頰、舌下、經鼻、經直腸、經鞘或經由經肺路線。本發明之FIX蛋白質及共軛物可視情況植入於或聯結於容許將FIX蛋白質或共軛物緩慢釋放至所要位點之生物聚合物固體支撐物。

FIX－FcRn結合搭配物融合蛋白質及其他含FcRn結合搭配物共軛物尤其良好地適於傳遞至表現FcRn之任何上皮表面。該等上皮表面包含(但不限於)口腔、胃、腸內、心臟內、鼻內及尤其包含大氣管之肺。

本發明之FIX蛋白質或共軛物之劑量將視受檢者及所使用之特定路線投藥而變化。劑量可在0.1至100,000 μg/kg體重之範圍變化。在一實施例中，劑量範圍為0.1－2,000 μg/kg。蛋白質或共軛物可連續投與或以特定時間間隔投與。可使用活體外檢定以確定最佳劑量範圍及/或投藥時程。另外，有效劑量可自得自動物模型之劑量－反應曲線外推。

對臨床用途而言，本發明之FIX蛋白質及共軛物可用任一適合醫藥載劑調配。適合醫藥載劑之實例描述於由E.W.Martin之Remington's Pharmaceutical Sciences中。賦形劑之實例可包含澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、水稻、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、乾脫脂牛奶、甘油、丙二醇、水、乙醇及其類似物。組合物亦可含有pH緩衝試劑及濕潤劑或乳化劑。

對經口投藥而言，醫藥組合物可採用藉由習知方式製備之錠劑或膠囊形式。組合物亦可製備為液體，例如糖漿或懸浮液。液體可包含懸浮劑(例如，山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)，乳化劑(卵磷酯或阿拉伯膠)，非水溶液媒劑(例如，杏仁油、油性酯、乙基醇或分級菜油)及防腐劑(例如，甲基－或丙基－對羥基苯甲酸酯或山梨酸)。製劑視情況亦可包含香料、著色劑及甜味劑。或者，組合物可提供呈用於用水或另一適合媒劑構築之乾燥(例如，冷凍乾燥)產物。

對頰及舌下投藥而言，組合物可根據習知協定採用錠劑、口含劑或快速溶解膜形式。

對藉由吸入之投藥而言，用於根據本發明之用途之化合物方便地以來自具有例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他適合氣體之適合推進劑之加壓包或噴霧器(例如，於PBS中)的氣溶膠噴霧形式傳遞。在加壓氣溶膠之狀況下，劑量單位可藉由提供傳遞計量式量之閥門確定。(例如)用於吸入器或吹藥器之明膠之膠囊及藥筒可經調配含有化合物及諸如乳糖或澱粉之適合粉末基質之粉末混合物。

醫藥組合物可經調配以用於藉由快速注射或注入之非經腸投藥(例如，靜脈內或肌肉內)。用於注射或注入之調配物可提供呈單位劑型，例如，提供呈具有額外防腐劑之安瓶或多劑量容器。組合物可採用如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之該等形式，且含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑之調配劑。或者，活性成份可呈用於用例如無熱原質水之適合媒劑構築之粉末形式(例如，冷凍乾燥)。

醫藥組合物亦可調配成(例如)含有諸如可可油或其他甘油脂之習知栓劑基質之栓劑或保留灌腸劑用於直腸投藥。

本發明之FIX蛋白質或共軛物可用以治療具有止血疾病或病狀之受檢者，其係與治療該疾病或病狀之至少一種其他已知藥劑組合。在一實施例中，本發明係關於治療具有止血病症之受檢者之方法，其包括投與治療有效量之本發明之至少一種FIX蛋白質或共軛物，與至少一種其他凝血因子或促進止血之藥劑之來源組合。在一實施例中，該來源為血漿之製劑，例如，新鮮冷凍血漿。該另一凝血因子或促進止血之藥劑可為具有經證實之凝血活性之任一治療劑。作為一實例，但不作為限制，凝血因子或止血劑可包含V因子、VII因子、VIII因子、第九因子、X因子、XI因子、XII因子、XII因子、凝血酶原、血纖維蛋白原或前述任一者之活化形式。止血劑之凝血因子亦可包含抗溶解血纖維蛋白藥物，例如ε－胺基－己酸，止血環酸。

本發明藉由以下實例進一步說明，該等實例不應以任何方式解釋為進一步之限制。

實例 實例1

選殖Fc表現構築體 IgG1之恆定區域之(EU # 221－447；Fc區域)之編碼序列藉由聚合酶鏈反應(PCR)擴增，使用以下低聚核苷酸引子，自白血球cDNA庫(Clontech,CA)獲得：rcFc－F：5'－GCTGCGGTCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCTCC－GGAACTCCTGGGCGGACCGTCAGTC－3'(SEQ ID NO：20)rcFc－R：5'－ATTGGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC－3'(SEQ ID NO：21)

前置引子rcFc－F在Fc區域之開始端前添加3個胺基酸(AAV)及SalI選殖位點，且亦使用遺傳編碼之簡並在胺基酸231－233處併入BspEI限制位點及在胺基酸236－238處併入RsrII限制位點以保存正確胺基酸序列(EU編號)。反置引子rcFc－R在Fc之終止密碼子後添加EcoRI選殖位點。25 μl PCR反應係根據製造商之標準協定，在使用以下循環之MJ溫度循環器中，使用Expand^TM High Fidelity System(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，用25 pmol之各引子進行：94℃，2分鐘；(94℃，30秒；58℃，30秒；72℃，45秒)之30次循環；72℃，10分鐘。用Gel Extraction套組(Qiagen,Valencia,CA)將預期尺寸帶(~696 bp)凝膠純化，且選殖至pGEM T－Easy(Promega,Madison,WI)中以產生中間質體pSYN－Fc－001(pGEM T－Easy/Fc)。

使用以下引子將小鼠Ig信號序列添加至Fc CDS：rc－Igsig seq－F：5'－TTTAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCC－TGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACAAAACT－CACACATGCCCACCG－3'(SEQ ID NO：22)Fc－noXma－GS－R：5'－GGTCAGCTCATCGCGGGATGGG－3'(SEQ ID NO：23)Fc－noXma－GS－F：5'－CCCATCCCGCGATGAGCTGACC－3'(SEQ ID NO：24)

rc－Ig信號序列F(rc－Igsig seq－F)引子將HindIII限制位點添加至分子之5'末端，接著使Kozak序列(GCCGCCACC；SEQ ID NO：25)，接著來自小鼠Ig輕鏈之信號序列直接相接於Fc序列(EU# 221)之開始端。使用遺傳編碼之簡並以保存正確胺基酸序列，Fc－noXma－GS－F及Fc－noXma－GS－R引子自Fc編碼序列移除內部XmaI位點。兩個25 μl PCR反應係根據製造商之標準協定，在MJ溫度循環器中，使用Expand^TM High Fidelity System(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，用25 pmol之rc－Ig信號序列－F及Fc－noXma－GS－R或Fc－noXma－GS－F及rcFc－R進行。第一反應係用500 ng之白血球cDNA庫(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)作為模板，使用以下循環進行：94℃，2分鐘；(94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，45秒)之30次循環；72℃，10分鐘。第二反應係用500 ng之pSYN－Fc－001(上述)作為模板，使用以下循環進行：94℃，2分鐘；(94℃，30秒；58℃，30秒；72℃，45秒)之16次循環；72℃，10分鐘。用Gel Extraction套組(Qiagen,Valencia,CA)將預期尺寸帶(分別為~495及299 bp)凝膠純化，隨後與25 pmol之rc－Ig信號序列－F及rcFc－R引子一起組合於PCR反應中且如前文一樣運作，並在58℃下黏接且繼續16次循環。用Gel Extraction套組(Qiagen,Valencia,CA)將預期尺寸帶(~772 bp)凝膠純化，且選殖至pGEM T－Easy(Promega,Madison,WI)中以產生中間質體pSYN－Fc－007(pGEM T－Easy/Igsig seq－Fc)。隨後，使用HindIII及EcoRI位點將全部Ig信號序列－Fc卡匣次選殖至pcDNA3.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)哺乳動物表現載體中以產生pSYN－Fc－015(pcDNA3/Igsig seq－Fc)。

插入pSYN－Fc－015中之核酸序列提供為SEQ ID NO：63，其中信號序列(前60個核苷酸)以斜體字展示。

為Fc區域之分泌，使用異源信號肽，明確地為小鼠Ig輕鏈信號序列，如見於基因庫寄存編號AB050084，抗－A/dT抗體之小家鼠(Mus musculus )VL2C mRNA。在Fc區域中，核苷酸序列經修飾以併入限制核酸內切酶位點同時保存編碼序列。明確地，A231、P232及E233之密碼子(EU編號)在核苷酸93及96處，自基因庫寄存編號Y14735中之IgG1之Fc區域的核苷酸序列中之GCA CCT GAA修飾成GCT CCG GAA以併入BspEI限制位點同時保存胺基酸編碼。又，G236、G237及P238之密碼子(EU編號)在核苷酸108處，自GGG GGA CCG修飾至GGC GGA CCG以併入RsrII限制位點同時保存胺基酸編碼。另外，在核苷酸102之CTC 至CTG 之Leu 234處存在非編碼差異，在核苷酸465之CGG 至CGC 之R465處存在非編碼差異，且在核苷酸592之C TG至T TG之L640處存在非編碼差異。

藉由SEQ ID NO：63編碼之轉譯產物之胺基酸序列提供為SEQ ID NO：64，其中信號肽(前20個殘基)以斜體字展示。

實例2

選殖FIX－Fc表現構築體 以下引子用以產生各種FIX－Fc表現構築體(黏接於初始模板之區域以粗體指示)。

NatFIX－F：5'－TTACTGCAGAAGGTTATGCAGCGCGTGAACATG －3'(SEQ ID NO：26)F9－R－ZTM：5'－AGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAATCC －3'(SEQ ID NO：27)FIXaddXba－F：5'－CAAGGGAA TCTAGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAA－GTG －3'(SEQ ID NO：28)FIXaddXba－R：5'－ACATTCTCTCTC TAGATTCCCTTGAACAAACTCTTCC －3'(SEQ ID NO：29)pEDFl－F：5'－ATGACATCCACTTTGCCTTTCTCT －3'(SEQ ID NO：30)fcclv－R：5'－ATAGAAGCCTTTGACCAGGC －3'(SEQ ID NO：31)FIX－Fc delta－F：5'－AAAAACAAAGCTCACTGACAAAACTCACACATG－CCCACC －3'(SEQ ID NO：32)FIX－Fc delta－R：5'－GTGTGAGTTTTGTC AGTGAGCTTTGTTTTTTCCTT－AATCCAG－3'(SEQ ID NO：33)IgkFc－NotI－F：5'－ATGCGGCCGCGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTC －3'(SEQ ID NO：34)Fc－Xho－R：5'－ATCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAG －3'(SEQ ID NO：35)FIXa5：5'－GTCAAAGCTTCGCGACGTACGGCCGCCACCATGCAGCGCGTG－AACATGATC －3'(SEQ ID NO：36)FIXa3：5'－CTGTGATGTTCCCACAGTACTTACCAACCTGCGTG －3'(SEQ ID NO：37)FIXb5：5'－AGTACTGTGGGAACATCACAG －3'(SEQ ID NO：38)FIXb3：5'－TGACTCTAGATTCCCTTGAACAAACTCTTCCAA －3'(SEQ ID NO：39)

構築FIX－Fc表現質體 FIX－Fc表現質體之構築以FIX編碼序列之逆轉錄酶－聚合酶鏈反應(RT－PCR)開始，接著產生用於在研究早期階段期間，在最終3個質體：pSYN－FIX－021、pSYN－FIX－027及pSYN－FIX－030建立之前表現之大量不同中間質體。製造所有最終FIX－Fc構築體以便FIX編碼區域直接融合於Fc編碼序列，而無插入連接子。

天然第九因子(FIX)序列(GenBank寄存編號NM_ 000133)係藉由RT－PCR自人類成人肝mRNA使用引子NatFIX－F及F9－R－ZTM與具有Platinum Taq套組之Invitrogen Superscript RT－PCR根據製造商之標準方案獲得。所使用之循環為在50℃下30 min用於逆轉錄，接著在94℃變性2 min及(94℃，30 sec；55℃，30 sec；72℃，1 min)之35次循環，接著在72℃延長10 min，隨後在4℃儲存。將所得PCR片段次選殖於載體pGEM－T－Easy中以產生pSYN－FIX－001。隨後，整個序列使用該兩個引子之延長版本擴增以添加限制位點(5' BsiWI)、Kozak序列及一個連接子，且在3個PCR反應中進一步擴增以添加Fc序列，且次選殖以產生pSYN－FIX－002，用於在不同載體系統(pEE12.4/FIX－Fc N297A)中表現FIX－Fc N297A。在將FIX序列次選殖於不同表現系統pSYN－FIX－011(pED.dC/FIX－Fc N297A)之前，將FIX編碼序列外部之其他序列次選殖於pSYN－FIX－002中以產生pSYN－FIX－003(pEE12.4－6.4/FIX－Fc N297A/PACE)及pSYN－FIX－004(pEE12.4－6.4/FIX－Fc N297A/KEX2)。

以相似於上文將XmaI位點自Fc移除之方式，將XbaI位點添加至FIX序列。簡言之，使用內部引子FIXaddXba－F及FIXaddXba－R以添加XbaI位點同時保存胺基酸序列。兩個25 μl PCR反應係根據製造商之標準方案在MJ溫度循環器中使用Expand^TM High Fidelity System用50 pmol之pEDFl－F及FIXaddXba－R或FIXaddXba－F及fcclv－R進行。兩個反應均用500 ng之pSYN－FIX－011作為模板使用以下循環進行：94℃，2 min；(94℃，30 sec；48℃，30 sec；72℃，2 min)之14次循環；72℃，10 min。自瓊脂糖凝膠切去預期大小(分別為~290及1698 bp)之帶，用Gel Extraction套組將DNA純化，隨後與50 pmol之pEDFl－F及fcclv－R引子一起合併於PCR反應中，如上述運作，在48℃黏接，且繼續14次循環。使用質體pSYN－FIX－011作為模板，及使用PstI(5')及SalI(3')限制位點外部之引子pEDfl－F及fcclv－R於相同類型之3個PCR反應以產生相同FIX胺基酸序列同時併入XbaI限制位點。所得1965 bp片段用PstI/SalI消化，次選殖回pSYN－FIX－011中之相同位點中以產生pSYN－FIX－013(pED.dC/FIX－Fc N297A w/XbaI位點)。隨後，切下Fc N297A序列且用野生型序列替代以產生pSYN－FIX－016(pED.dC/FIX－Fc w/XbaI位點)。

最終FIX－Fc編碼區域(無任何連接子)之序列以相似方式產生。簡要地，黏接於具有相應FIX或Fc懸垂物之Fc或FIX序列之內部引子FIX－Fc δ－F及FIX－Fc δ－R用以移除連接子區域。兩個25 μl PCR反應係使用相似於製造商之標準協定之Expand^TM High Fidelity PoIymerase，代入Failsafe^TM Buffer E中，在快速循環器中之10 μl反應中，用10 pmol之pEDFl－F及FIX－Fc δ－R或FIX－Fc δ－F及rcFc－R進行。兩個反應均用500 ng之pSYN－FIX－016(pED.dC/FIX－Fc w/XbaI)作為模板，使用以下循環進行：94℃，1 min；(94℃，0 sec；52℃，0 sec；72℃，90 sec，斜率6.0)之14次循環；72℃，10 min。自瓊脂糖凝膠切去預期尺寸帶(分別為~1496及710 bp)且用Eppendorf Perfectprep Gel Cleanup Kit將DNA純化，隨後與10 pmol之pEDFl－F及rcFc－R引子一起組合於PCR反應中且如前文一樣運作，並在52℃下黏接且繼續14次循環。用XbaI/RsrII將所得2200 bp片段消化，且將所得1255 bp片段次選殖回pSYN－FIX－016中之相同位點中以產生pSYN－FIX－020(pED.dC/FIX－△連接子－Fc w/XbaI位點)。

隨後，將FIX－△連接子－Fc序列切下且次選殖至pcDNA4/myc－HisC之EcoRI/HindIII位點中以產生pSYN－FIX－021(pcDNA4/FIX－Fc w/XbaI位點)。注意，儘管該載體可用以將myc及His標籤添加至所關注之蛋白質，但是該質體以此方式構築以僅生產未標籤FIX－Fc蛋白質。

包含前原肽(prepropeptide)之pSYN－FIX－021中之FIX－Fc的核苷酸序列提供為SEQ ID NO：65。

第九因子部分中之核苷酸序列自存在於基因庫中之序列修飾以併入XbaI位點而不改變胺基酸編碼。明確地，N59、L60及E61區域中之編碼序列在核苷酸177及180處，自AAC CTT GAG改變至AAT CTA GAG，其添加XbaI限制位點。在核苷酸1341之GTA至GTG之V447處亦存在非編碼改變。在Fc區域中，核苷酸序列經修飾以併入限制核酸內切酶位點同時保存編碼序列。明確地，A472、P473及E474之區域中之密碼子(Fc EU編號231－233)在核苷酸1416及1419處，自基因庫寄存編號Y14735中之IgG1之Fc區域的核苷酸序列中之GCA CCT GAA修飾成GCT CCG GAA以併入BspEI限制位點同時保存胺基酸編碼。又，G477、G478及P479之區域中之密碼子(Fc EU編號236－238)在核苷酸1431處，自GGG GGA CCG修飾成GGC GGA CCG以併入RsrII限制位點同時保存胺基酸編碼。最後，在CTG至TTG之L640處存在非編碼差異。

藉由SEQ ID NO：65編碼之FIX－Fc胺基酸序列提供為SEQ ID NO：66，其中信號序列(28個殘基)以斜體字展示且原肽(18個殘基)以粗體展示。

構築用於共表現FIX－Fc及Fc之單質體 為構築用於表現FIX－Fc及Fc之單質體，使用引子IgFc－NotI－F及Fc－Xho－R將不同限制位點添加至小鼠Ig信號肽－Fc編碼序列。用於該PCR反應之模板為pSYN－Fc－011(無BspEI、RsrII位點之pGEM T－Easy/Ig信號序列－Fc)。10 μl PCR反應係在快速循環器中，使用經Failsafe^TM 緩衝液E補充之Expand^TM High Fidelity聚合酶，用100 ng模板及50 pmol之各引子建立。PCR反應係使用以下循環進行：94℃歷時1 min；(94℃歷時0 min，48℃歷時0 min及72℃歷時1 min)之15次循環，接著72℃歷時10 min之最終延長。在瓊脂糖凝膠上運作PCR產物，且切去具有~700 bp之預期片段且使用QIA快速凝膠萃取套組將DNA純化。將PCR產物選殖至pCR2.1－Topo中。隨後，使用NotI/XhoI限制位點，將小鼠Ig信號肽－Fc編碼序列選殖至pBudCE4.1中。

pBudCE4.1中(以及下文之pSYN－FIX－027及pSYN－FIX－030中)之Fc區域之核苷酸序列提供為SEQ ID NO：67。

將用於pSYN－Fc－015之相同小鼠Ig信號序列用於該構築體。在Fc區域中，核苷酸序列經修飾以併入限制核酸內切酶位點同時保存編碼序列。在Fc區域中，與基因庫寄存編號Y14735中之IgG1之序列或Fc區域比較，存在3個非編碼差異：在核苷酸108處，G236(EU編號)自GGG修飾成GGA，在核苷酸465處，R465(EU編號)自CGG修飾成CGC，且在L640(EU編號)處之非編碼差異為在核苷酸592處，自CTG修飾成TTG。

所得胺基酸序列恆等於pSYN－Fc－015(SEQ ID NO：64)之彼者。

隨後，將FIX－Fc選殖之含有IgFc序列之pBudCE4.1中。使用酶HindIII及EcoRI，自pSYN－FIX－020(上述)切去FIX－Fc且選殖至pBudCE4.1/IgFc中之相同位點中。含有於pBudCE4.1中之CMV啟動子之FIX－Fc下游及EF1α啟動子之IgFc下游的最終質體稱為pSYN－FIX－027。

構築用於共表現FIX－Fc(具有截斷FIX內含子I)及Fc之單質體 產生包含FIX內含子I(基因庫寄存編號NC_000023)之截斷形式之額外FIX－Fc表現構築體，先前已展示其由於存在於前軀物mRNA中之功能性拼接序列而增加FIX表現水平。Kurachi S等人(1995)J Biol Chem. 270：5276－81。FIX內含子I之截斷部分如下藉由PCR初始地分兩步獲得，隨後將其在第三PCR反應中裝配在一起而獲得。兩個50 μl PCR反應係根據製造商之標準協定，在MJ溫度循環器中，使用Expand^TM High Fidelity Polymerase，用45及90 pmol之引子FIXa5及FIXa3或FIXb5及FIXb3進行。兩個反應均用人類染色體組DNA作為模板，使用以下循環進行：94℃，3 min；(94℃，30 sec；58℃，30 sec；72℃，90 sec)之16次循環；72℃，13.5 min。分別獲得具有FIX內含子I之5'及3'末端區域之141及157 bp序列且藉由在如前文一樣進行之第二PCR反應組中之PCR，使用該等產物之混合物作為新穎模板及引子FIXa5及FIXb3來接合。將該片段初始選殖至中間載體pCR2.1 TOPO中以產生pSYN－FIX－028(pcR2.1/FIX迷你內含子1)。隨後，將在FIX CDS("迷你基因")之情形下，含有FIX迷你內含子之HindIII/XbaI片段次選殖至pSYN－FIX－027中以產生pSYN－FIX－030(pBUD/FIX－Fc迷你內含子1/Fc)。

包含內含子之pSYN－FIX－030中之FIX－Fc的核苷酸序列提供為SEQ ID NO：68。除在具有299 bp截斷內含子之pSYN－FIX－030中，大致在信號肽編碼序列與原肽編碼序列之間的插入物外，該核苷酸序列匹配pSYN－FIX－021構築體之彼者(參見SEQ ID NO：65)。

所得FIX－Fc胺基酸序列恆等於pSYN－FIX－021及pSYN－FIX－027之彼者。

實例3

選殖PC5 人類PC5之編碼序列藉由RT－PCR獲得。使用以下引子(黏接於cDNA之區域以粗體指示)：PC5－KpnI－F：5'－ATCTACACCATCTCCATCAGCAGC －3'(SEQ ID NO：40)PC5 NotI－R：5'－AAGGCGGCCGCTCAGCCTTGAAATGTACATGTTTTGC －3'(SEQ ID NO：41)PC5－UTR－F：5'－AGCGAGGGAGCAGCGAGG －3'(SEQ ID NO：42)PC5－HindIII－R：5'－GGTAGTTGACATGGCGGTTGG －3'(SEQ ID NO：43)PC5－Afl2－F：5'－CAGCGACTTAAGCCACCATGGGCTGGGGGAGCCG －3'(SEQ ID NO：44)PC5－KpnI－R：5'－GTAGGTTGTGGCCAGCGTGG －3'(SEQ ID NO：45)

人類PC5(基因庫寄存編號NM_006200)之編碼序列分兩步獲得。3'~1750 bp係根據製造商之標準協定，用具有Platinum Taq套組之Invitrogen Superscript RT－PCR，使用引子PC5－KpnI－F及PC5－NotI－R自人類肝mRNA獲得。用於逆轉錄之循環為在50℃下30 min，接著在94℃下變性2 min及94℃歷時15 sec，54℃歷時30 sec，72℃歷時3 min之35次循環，接著在72℃下延長10 min且隨後在4℃下儲存。其經由終止密碼子自PC5編碼序列中之內部KpnI位點產生具有NotI位點添加在3'末端處之片段。隨後，根據製造商之協定將該片段選殖至pCR2.1 TOPO中以產生pSYN－PC5－001(pCR2.1/PC5(KpnI－NotI))。隨後，使用KpnI及NotI限制位點將該片段次選殖至pcDNA3.1/hygro中以產生pSYN－PC5－002(pcDNA3.1/hygro/PC5(KpnI－NotI))。

PC5之5'~1100 bp係在兩個步驟中獲得。其首先使用如上文之相似條件，並在57℃之黏接溫度下，藉由RT－PCR，使用引子PC5－UTR－F及PC5－HindIII－R擴增以自人類肝mRNA擴增~1520 bp片段。分別在自內部獨特HindIII位點之未轉譯5'序列及序列3'中，該等引子具有對原生PC5序列之完整同源性。注意，由於靜止核苷酸取代，該HindIII位點不存在於最終構築體中。隨後，將該DNA片段凝膠純化且用作模板用於使用將AflII選殖位點，接著Kozak序列添加至在5'末端處之N－末端編碼序列之PC5－Afl2－F及將3'黏接於內部獨特KpnI位點之PC5－KpnI－R之第二PCR反應以產生~1100 bp片段。該反應係根據製造商之標準協定，在MJ溫度循環器中，用Expand^TM High Fidelity System，使用以下循環進行：94℃，2 min；(94℃，30 sec；57℃，30 sec；72℃，2 min)之14次循環，接著72℃，10 min。隨後，使用AflII及KpnI限制位點將該片段次選殖至pSYN－PC5－002中以產生pSYN－PC5－003(pcDNA3.1/hygro/PC5)。

編碼pSYN－PC5－003中之PC5之核苷酸序列具有以下序列(SEQ ID NO：61)：

SEQ ID NO：61含有來自不影響胺基酸編碼序列之基因庫序列之取代。明確地，在位置399(相應於基因庫寄存編號NM_006200之位置876)處之核苷酸為替代C之T，但保存胺基酸Ser 133(相應於基因庫寄存編號NP_006191中之胺基酸編號)；核苷酸位置1473(基因庫位置1950)為替代T之C，但保存胺基酸Ala 491；且核苷酸位置1485(基因庫位置1962)為替代G之A，但保存胺基酸Ser 496；注意，在位置1473處之核苷酸改變消除HindIII限制位點。

實例4

選殖PACE－SOL 人類PACE之編碼序列藉由RT－PCR獲得。使用以下引子(黏接於cDNA之區域以粗體指示)：PACE－F1：5'－GGTAAGCTTGCCATGGAGCTGAGGCCCTGGTTGC －3'(SEQ ID NO：46)PACE－R1：5'－GTTTTCAATCTCTAGGACCCACTCGCC －3'(SEQ ID NO：47)PACE－F2：5'－GCCAGGCCACATGACTACTCCGC －3'(SEQ ID NO：48)PACE－R2：5'－GGTGAATTCTCACTCAGGCAGGTGTGAGGGCAGC －3'(SEQ ID NO：49)

引子PACE－F1將HindIII位點添加至以起始密碼子前之3個核苷酸開始之PACE序列的5'末端，而引子PACE－R2將終止密碼子添加在胺基酸715後，其發生在PACE之細胞外域之末端處，以及將EcoRI位點添加至終止密碼子之3'末端。PACE－R1及PACE－F2引子分別黏接於內部BamHI位點之3'側及5'側。隨後，兩個RT－PCR反應係根據製造商之協定，在使用具有PLATINUMTaq系統(Invitrogen,Carlsbad,CA)之SuperScript^TM One－Step RT－PCR之50 μl RT－PCR反應中，使用25 pmol之PACE－F1/R1或PACE－F2/R2與20 ng之成年人人類肝RNA(Clontech；Palo Alto,CA)的引子對之各者來建立。反應係使用以下循環，在MJ溫度循環器中進行：50℃，30分鐘；94℃，2分鐘；(94℃，30秒；58℃，30秒；72℃，2分鐘)之30次循環，接著72℃，10分鐘。將該等片段各自接合至載體pGEM T－Easy(Promega,Madison,WI)中且完全編序。隨後，使用BamHI/EcoRI位點將F2－R2片段次選殖至pcDNA6 V5/His(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，且隨後，使用HindIII/BamHI位點將F1－R1片段選殖至該構築體中。最終質體，即pcDNA6－PACE產生PACE(胺基酸1－715)之可溶形式，因為跨膜區域已刪除。pcDNA6－PACE中之PACE之序列本質上如Harrison S等人(1998)Semin Hematol 35(2 Suppl 2)：4－10中所述。

實例5

選殖Kex2－SOL 酵母內蛋白酶KEX2之編碼序列，藉由RT－PCR，使用以下引子(黏接於cDNA之區域以粗體指示)自釀酒酵母polyA＋mRNA(BD Clontech,cat# 6999－1)獲得：KEX2－F：5'－GCGCTAGCCGTACGGCCGCCACCATGAAAGTGAGGAAATA－TATTACTTTATGC －3'(SEQ ID NO：50)KEX2－BglII－F：5'－GCTATTGATCACAAAGATCTACATCCTCC －3'(SEQ ID NO：51)KEX2－BglII－R：5'－GGAGGATGTAGATCTTTGTGATCAATAGC －3'(SEQ ID NO：52)KEX2－675－R：5'－GCGAATTCCGGTCCGTCATTGCCTAGGGCTCGAGAG－TTTTTTAGGAGTGTTTGGATCAG －3'(SEQ ID NO：53)

該等引子用以以相似於用於PACE－SOL，上文實例4之彼者之方式，分兩步獲得KEX2，即PACE之酵母同系物之編碼序列(胺基酸1－675)；同樣地，移除跨膜區域以產生蛋白質之可溶形式。

實例6

選殖PC7－SOL PC7之編碼序列藉由RT－PCR，使用以下引子(黏接於cDNA之區域以粗體指示)自人類成年人肝mRNA獲得：PC7－BamMut－F：5'－GCATGGACTC CGATCCCAACG －3'(SEQ ID NO：54)PC7－BamMut－R：5'－CGTTGGGATC GGAGTCCATGC －3'(SEQ ID NO：55)PC7－F：5'－GGTAAGCTTGCCGCCACCATGCCGAAGGGGAGGCAGAAAG －3'(SEQ ID NO：56)PC7－SOL－R：5'－TTTGAATTCTCAGTTGGGGGTGATGGTGTAACC －3'(SEQ ID NO：57)PC7－Xma－F：5'－GGCACCTGAATAACCGACGG －3'(SEQ ID NO：58)PC7－Xma－R：5'－CGTCACGTTGATGTCCCTGC －3'(SEQ ID NO：59)

該等引子用以以相似於用於PACE－SOL，上文實例4之彼者之方式，分三步獲得PC7之編碼序列(胺基酸1－663)；同樣地，移除跨膜區域以產生蛋白質之可溶形式。

實例7

原肽抗體之產生 合成具有相應於FIX之18個胺基酸原肽序列之序列TVFLDHENANKILNRPKRC(SYN1117；SEQ ID NO：60)，同時Cys殘基添加在C末端以與匙孔螺血氰蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)(KLH)共軛之肽。將該肽與KLH共軛，使兩隻New Zealand白兔免疫且收集抗血清。

根據製造商之協定，將肽SYN 1117與UltralinkIodoacetyl Gel(Pierce,Rockford,IL)共軛。隨後，將凝膠鍵聯肽封裝至柱中且隨後，經固定原肽柱，藉由重力流將抗體親和力純化。經由0.2 μm無菌針筒過濾器過濾之10 ml之抗血清以移除微粒物質。隨後，將抗血清以1.5 ml溶離份方式應用於柱，使其各者結合樹脂1小時。用PBS洗滌柱，且將純化抗體溶離於100 mM甘胺酸，pH 2.8中，隨後用1 M Tris，pH 9.0中和。彙集含抗體溶離份(如藉由A280所測定)且透析至PBS中且添加0.2%疊氮化鈉用於儲存。

實例8

轉染品系 HEK 293轉染 使HEK 293H細胞適合於使用含血清培養基之黏著培養物。將懸浮液細胞轉移至含有用10%胎牛血清(FBS)及0.1 mM非基本胺基酸補充之Dulbecco's改質Eagle培養基(DMEM)(高葡萄糖)之T75燒瓶中且作為固定培養物，在37℃/5% CO₂ 下生長。每隔3至4天將黏著HEK 293H細胞繼代培養。繼代培養係藉由經輕輕用滴管將培養基上下吸取而自燒瓶底部將細胞變位來執行。

10－cm ² 培養皿 在轉染前一天，用於10 ml黏著生長培養基中之2.5×10⁶ 細胞將10－cm² 培養皿接種。使用磷酸鈣Profection轉染試劑(Promega,Madison,WI)進行轉染。在轉染前3小時，用10 ml新鮮生長培養基置換培養基。對各轉染而言，將500 μl之2×HEPES緩衝鹽水(2×HBS)添加至無菌管。在第二無菌管中，將20 μg之DNA(9 μg FIX－021/9μg Fc－015/2 μg PC5－003，或9 μg FIX－027/9μg Fc－015/2 μg PC5－003，或9 μg FIX－030/9μg Fc－015/2 μg PC5－003)與62 μl之2M CaCl₂ 混合且用無菌水將總體積增加至500 μl。將DNA/CaCl₂ 混合物逐滴添加至2×HBS同時渦旋。在室溫下，將DNA混合物培育30分鐘且隨後再次暫時渦旋，之後逐滴添加至細胞。在37℃/5% CO₂ 下，用DNA混合物將細胞培育16小時，之後移除轉染溶液，用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)洗滌細胞且隨後，將10 ml新鮮生長培養基添加至細胞。

轉染後48至72小時，藉由用滴管上下吸取將細胞自10－cm² 培養皿移除且各者呈5 ml新鮮生長培養基分裂於10－cm² 培養皿中或分裂於具有每孔100 μl生長培養基之96孔培養盤中。塗佈後24小時，藉由添加相等體積之含有適當抗生素之生長培養基以得到200 μg/ml之濕黴素或25、75及25 μg/ml之Zeocin、遺傳黴素(Geneticin)及濕黴素之最終濃度來起始選擇。一旦抗生素抗力細胞之群落開始形成，用選殖環將細胞自10－cm² 培養皿分離或自96孔培養盤延展至24孔培養盤，隨後延展至T25燒瓶及T75燒瓶，之後使細胞系返回適應不含血清懸浮液之培養物。當細胞自96孔培養盤及10－cm² 培養皿轉移至24孔培養盤時，抗生素濃度降低一半且隨後，在該減少抗生素之培養基中維持細胞。

6孔培養皿 在轉染前一天，用於2 ml黏著生長培養基中之5×10⁵ 細胞將6孔培養皿接種。使用磷酸鈣Profection轉染試劑(Promega,Madison,WI)進行轉染。在轉染前3小時，用2 ml新鮮生長培養基置換培養基。對各轉染而言，將83 μl之2×HBS添加至無菌管。在第二無菌管中，將4 μg之DNA(3.6 μg FIX－027/0.4μg PC5－003)與10 μl之2M CaCl₂ 混合且用無菌水將總體積增加至83 μl。將DNA/CaCl₂ 混合物逐滴添加至2×HBS同時渦旋。在室溫下，將DNA混合物培育30分鐘且隨後再次暫時渦旋，之後逐滴添加至細胞。在37℃/5% CO₂ 下，用DNA混合物將細胞培育16小時，之後移除轉染溶液，用HBSS洗滌細胞且隨後，將2 ml新鮮生長培養基添加至細胞。

轉染後40至72小時，藉由用滴管上下吸取將細胞自6孔培養盤移除且將細胞轉移至T75燒瓶。塗佈後24小時，藉由添加相等體積之含有200 μg/ml之最終濃度的濕黴素之生長培養基來起始選擇。一旦經穩定選擇細胞之池產生，將細胞計數且在96孔培養盤中，稀釋至1細胞/孔。當無性細胞系變成長滿時，將細胞自96孔培養盤延展至24孔培養盤、T25及T75燒瓶且隨後如上文所述，返回適應不含血清懸浮液之培養物。

所有其他HEK轉染係以相似方式，代入表現PC5之質體之Kex2－SOL或PC7－SOL中進行。對該等轉染而言，根據製造商之協定使用Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)轉染試劑替代磷酸鈣。

CHO轉染係以相似方式，利用相似FIX－Fc表現質體與相同處理酶表現質體進行。在一些狀況下，根據製造商之協定使用SuperFect(Qiagen,Valencia,CA)轉染試劑替代磷酸鈣。

實例9

分析瞬間及穩定細胞系：西方墨點法 為分析所有瞬間轉染，具有PC5之FIX－Fc之CHO穩定轉染及具有PC7之FIX－Fc之HEK 293穩定轉染，使來自細胞之改良性培養基經受蛋白質A免疫沉澱反應。簡要地，將細胞培養上清液與大致40 μl之蛋白質A－瓊脂糖50%漿液混合且在4℃下，搖動下培育1小時，隨後離心以造粒蛋白質A珠粒。將珠粒再懸浮於1 ml之PBS或相似緩衝液中，離心且緩衝抽吸，且將處理重複1－2次。隨後，用加載染料之經還原或未經還原十二烷基硫酸鈉－聚丙烯醯胺凝膠電泳法(SDS－PAGE)使珠粒再懸浮，加熱30 sec至5 min，離心且將於染料中之溶離蛋白質加載於SDS－PAGE凝膠上且根據標準協定運作。將凝膠轉移至硝化纖維膜且如下文所述執行西方墨點。

為分析所有其他穩定轉染，先將蛋白質在西方墨點中分析前純化。經蛋白質A將具有PACE或PC7之經單獨轉染之CHO生產的FIX－Fc純化，溶離，在SDS－PAGE上運作，轉移至硝化纖維且執行西方墨點。使具有PC5之HEK生產之FIX－Fc經受3－柱純化(參見下文)且以相似方式分析。

Fc西方墨點 用於Fc西方墨點法實驗之抗體為山羊抗人類IgG(Fc特異)－辣根過氧化物酶共軛物(Pierce ImmunoPure抗體，目錄# 31416)。在PBS－T(具有0.1% Tween－20之PBS)中，將該抗體1：10,000稀釋且在室溫下，輕微搖動下，用膜培育1小時。在各具有大致20 ml之PBS－T中之3次10分鐘洗滌後，執行化學螢光偵測。

FIX西方墨點 對FIX西方墨點法實驗，使用山羊抗人類FIX－辣根過氧化物酶共軛物(Enzyme Research Laboratories，目錄# FIX－EIA－130D)。在PBS－T中，將抗體1：1000稀釋且在室溫下，輕微搖動下，用膜培育1小時。在各大致20 ml之3次10分鐘洗滌後，將膜準備好用於化學螢光偵測。

FIX原肽西方墨點 對原肽西方墨點而言，在PBS－T中，將兔抗FIX原肽抗體(參見實例7)1：10,000稀釋且在室溫下，輕微搖動下，用膜培育1小時。隨後，使膜置於各大致20 ml之3次10－分鐘洗滌中。第二(偵測)抗體為在PBS－T中1：20,000稀釋之山羊抗兔IgG－辣根過氧化物酶共軛物(Southern Biotechnology Associates，目錄# 4010－05)。在室溫下，用膜將第二抗體培育30分鐘至1小時，且隨後，在大致20 ml之PBS－T緩衝液中洗滌3次歷時15分鐘，各自在用於化學螢光偵測之製劑中。

化學螢光偵測 根據製造商之說明書，使用ECL加西方墨點偵測系統(ECL Plus Western Blotting Detection System)(Amersham Biosciences catalog # RPN2132)執行所有免疫墨點之偵測。在Storm 840 Phosphorimager(Molecular Devices)上執行信號觀測。

實例10

原肽處理實驗之概述：西方墨點法 初始在CHO細胞中之瞬間轉染指示，雖然單獨轉染之FIX－Fc保留原肽，但是FIX－Fc與PC5、PACE－SOL、PC7－SOL或KEX2－SOL之共轉染足以完全移除原肽。如圖4 中所示，初始在CHO細胞中之瞬間轉染之FIX(上部面板)及FIX原肽(下部面板)西方墨點指示，單獨轉染之FIX－Fc保留原肽(帶存在於FIX及原肽西方墨點，色帶1及5上)。相反，初始在CHO細胞中之瞬間轉染之西方墨點指示，FIX－Fc與PC5(色帶4)、PACE－SOL(色帶2及6)、PC7－SOL(色帶3及7)或KEX2－SOL(色帶8)之共轉染足以完全移除原肽(帶存在於FIX中但不存在於原肽西方墨點中)。然而，注意，與KEX2－SOL(色帶8)之共轉染產生額外、更小之含FIX帶(上部面板)，可能歸因於藉由該更混雜之酶(Rockwell等人(2002)Chem.Rev. 102：4525－48)在FIX中之額外位點處之隱藏分解。

圖5 證實，在穩定轉染之CHO細胞系中，PACE－SOL能夠完全處理原肽，而PC7－SOL不能。在來自穩定表現與PACE－SOL或PC7－SOL共轉染之FIX－Fc二聚體、單體及Fc之CHO細胞系的蛋白質A－純化物質之間進行比較。以與PACE－SOL之共轉染開始，面板A中之SDS－PAGE凝膠之色帶1識別所有3種物質，面板B中之FIX西方墨點之色帶1確認二聚體及單體帶含有FIX，且面板C中之原肽西方墨點之色帶1證實(由於不存在帶)原肽藉由PACE完全處理。相反，關於與PC7－SOL之共轉染，面板A中之SDS－PAGE凝膠之色帶2再次識別所有3物質，面板B中之FIX西方墨點之色帶2再次確認二聚體及單體帶含有FIX，但是面板C中之原肽西方墨點之色帶2證實(藉由存在帶)原肽仍存在於與PC7－SOL共轉染之FIX－Fc二聚體及單體中。

圖6 證實，在穩定轉染CHO細胞系中，PC5能夠完全處理原肽。在圖6 中，色帶1、2及3展示，自穩定表現與PC5共轉染之FIX－Fc二聚體、單體及Fc之細胞系下拉的蛋白質A之FIX西方墨點(上部面板)及原肽西方墨點(下部面板)結果。色帶1、2及3相應於分別經25、50及100 nM甲胺喋呤擴增之穩定細胞系。在FIX西方墨點中，指示FIX－Fc二聚體及單體帶，且Fc帶未反應。原肽西方墨點確認，二聚體及單體帶不含有原肽(未發現顯著帶)。在圖6 中，色帶4及5展示，自對照組、經FIX－Fc單獨轉染(色帶4)或經FIX－Fc連同PACE－SOL轉染(色帶5)之CHO細胞系下拉之蛋白質A的FIX西方墨點(上部面板)及原肽西方墨點(下部面板)結果。如色帶5中所示，自經PACE－SOL轉染(色帶5)之CHO細胞系純化之FIX－Fc已完全處理(注意，在FIX西方墨點，上部面板中，存在強帶，但在原肽西方墨點，下部面板中僅存在弱背景帶)。相反，色帶4展示，原肽仍存在於自無任何共轉染處理酶之CHO細胞系純化之FIX－Fc中(注意，分別在FIX及原肽西方墨點，上部及下部面板中存在強帶)。

總之，穩定轉染CHO細胞系之檢驗證實，僅PACE－SOL(圖5 )及PC5(圖6 )能完全處理原肽，而單獨轉染之FIX－Fc(圖6 )或經PC7－SOL轉染之FIX－Fc(圖5 )產生proFIX－Fc。

亦在HEK 293細胞中檢驗該等各種酶移除原肽之能力。圖7 展示，PC5而非PC7－SOL自得自瞬間轉染HEK 293細胞之FIX－Fc完全移除原肽。對圖7 中所示結果而言，HEK 293－H細胞經FIX－Fc及單獨Fc；經FIX－Fc、Fc及PC5；或經FIX－Fc、Fc及PC7－SOL瞬間轉染。使所得改良性培養基經受蛋白質A下拉，還原SDS－PAGE及Fc西方墨點法(左邊面板)或原肽西方墨點法(右邊面板)。如圖7 中所示，如自帶存在於Fc及原肽西方墨點法中可見，如與PC7－SOL共轉染之FIX－Fc所得(來自執行四次之轉染之色帶8－11)，得自不經任何處理酶之轉染之FIX－Fc蛋白質保留原肽(色帶3，"－")。相反，如藉由帶僅存在於Fc西方墨點，但不存在於原肽西方墨點中所指示，PC5完全移除原肽(來自執行四次之轉染之色帶4－7)。作為該等西方墨點之對照組，分析自單獨轉染(色帶1)或經PACE－SOL轉染(色帶2)之CHO細胞純化之FIX－Fc二聚體。原肽存在於不經任何處理酶轉染之FIX－Fc中(兩個西方墨點之色帶1中之帶)，但不存在於與PACE－SOL共轉染之FIX－Fc中(色帶2，帶存在於Fc西方墨點中，但僅弱背景帶存在於原肽西方墨點中)。

圖8 展示，KEX2－SOL不能處理得自經FIX－Fc瞬間轉染之HEK 293細胞之proFIX－Fc。使來自經FIX－Fc、Fc及KEX2－SOL瞬間轉染之HEK 293細胞之改良性培養基經受蛋白質A下拉及非還原SDS－PAGE及Fc西方墨點法(上部面板)或還原SDS－PAGE及原肽西方墨點法(下部面板)。如圖8 中所示，如藉由在該物質中存在原肽可見(色帶3及4，帶存在於兩個墨點上)，與KEX2－SOL共轉染之FIX－Fc未受處理。在所有3種物質(二聚體、單體及單獨Fc)中，色帶3物質具有野生型Fc，而色帶4物質具有N297A Fc。作為對照組，分析自單獨轉染(色帶1)或經PACE－SOL轉染(色帶2)之CHO細胞純化之FIX－Fc二聚體，確認原肽存在於不經任何處理酶轉染之FIX－Fc中(兩個西方墨點，色帶1中之帶)，但不存在於與PACE－SOL共轉染之FIX－Fc中(色帶2，帶存在於Fc西方墨點中，但僅背景帶存在於原肽西方墨點中)。

總之，在瞬間轉染HEK 293細胞中，僅PC5證實完全移除原肽之能力(圖7 )，而相似於不經任何處理酶轉染之FIX－Fc(圖7 )，PC7－SOL(圖7 )及KEX2－SOL(圖8 )不能處理proFIX－Fc。

亦在穩定轉染HEK 293細胞中檢驗該等酶移除原肽之能力。圖9 證實，在穩定轉染細胞系中，PC5能夠完全處理原肽(1a/b ：FIX－Fc/Fc/PACE－SOL蛋白質A溶離；2a/b ：FIX－Fc/Fc/PC7－SOL蛋白質A溶離；3a/b ：參見Blue Plus2預染色分子量標記物；4a/b ：FIX－Fc單體/PC5；5a/b ：FIX－Fc單體/PC5)。將來自穩定表現與PC5共轉染之FIX－Fc二聚體、單體及Fc之HEK 293－H細胞系的2批純化FIX－Fc單體(參見純化方法之實例11)，在SDS－PAGE凝膠上，在非還原條件下運作兩次(色帶4a/b及5a/b)，隨後轉移至墨點且用FIX(圖9B )或原肽(圖9C )抗體探測。隨後，在轉移後，用Gelcode Blue(Pierce,Rockford,IL)將凝膠汙損(圖9A )。圖之分析證實，如藉由在面板C，即原肽西方墨點，色帶4b及5b中不存在帶所指示，原肽藉由PC5完全處理。如自面板A可見，色帶4a/b及5a/b全部經相等量之蛋白質加載，如面板B中，色帶4a及5a可見，其確認為FIX－Fc二聚體及單體。作為對照組，分析來自與PACE－SOL(色帶1a/b)或PC7－SOL(色帶2a/b)共轉染之CHO細胞系之蛋白質A－純化FIX－Fc二聚體、單體及Fc。該等對照組確認，原肽存在於與PC7共轉染之物質中(帶存在於面板C，色帶2b中，以及面板B，色帶2a中)，但不存在於與PACE－SOL共轉染之物質中(帶不存在於面板C，色帶2b中，但存在於面板B，色帶2a中)。

圖10 證實，與PC5相反，PC7－SOL不能處理穩定轉染HEK 293細胞系中之原肽。如圖10 中所示，使來自經FIX－Fc及單獨Fc，或經FIX－Fc、Fc及PC7－SOL穩定轉染之HEK 293－H細胞之培養基經受蛋白質A下拉且藉由還原SDS－PAGE及Fc西方墨點法(上部面板)或FIX原肽西方墨點法(下部面板)分析。用呈FIX－Fc與Fc表現質體之相等比率(色帶3及5)或1：8比率(色帶4及6)之FIX－Fc及Fc之N297A版本，分別單獨(色帶3及4)或與PC7－SOL表現質體之1/10總DNA(色帶5及6)一起將細胞轉染。該等分析展示，如藉由Fc西方墨點(上部面板)及原肽西方墨點(下部面板)中之帶可見，無論是否經(色帶5及6)或不經(色帶3及4)PC7－SOL穩定轉染，FIX－Fc蛋白質保留原肽。作為該等西方墨點之對照組，分析自單獨轉染(色帶1)或經PACE－SOL轉染(色帶2)之CHO細胞純化之FIX－Fc二聚體，確認原肽存在於不經任何處理酶轉染之FIX－Fc上(兩個西方墨點，色帶1中之帶)，但不存在於與PACE－SOL共轉染之FIX－Fc中(色帶2，帶存在於Fc西方墨點中，但僅弱背景帶存在於原肽西方墨點中)。

總之，穩定HEK 293細胞系似乎瞬間轉染一樣，因為PC5能夠完全處理原肽(圖9 )而PC7不能(圖10 )。

下文表2概述如藉由西方墨點法所評估之處理酶及FIX－Fc蛋白質之不同組合的結果。

實例11

蛋白質純化 蛋白質A層析 根據製造商之說明書，用MabSelect培養基填充5 cm×6 cm底料高度柱(117 ml體積，XK 5柱，Amersham)。用PBS使柱平衡且隨後以150 cm/h，用濃縮培養基加載，提供2.4分鐘之滯留時間。加載後，先用3－4體積之PBS，隨後3－4體積之PBS＋0.9 M NaCl將柱洗滌。最後，在溶離前，用3體積之PBS使傳導率降低。用3－4體積之25 mM檸檬酸鈉＋150 mM NaCl，pH 3.4將結合蛋白質溶離。溶離後，用3 M胍HCl將柱剝離。用2 M Tris鹼(每100 ml之溶離液~8 ml)中和溶離物質。藉由量測中和池(10份中之1份)於PBS中之三倍稀釋液來估計所溶離蛋白質之量。使用以下方程式確定濃度：mg/ml＝(吸光度280－吸光度320)/1.34其中1.34為基於色胺酸、酪胺酸及二硫化物鍵於FIX－Fc單體中之數目之理論莫耳吸光度係數。Gill等人(1989)Analytical Biochem 182：319。

使用Fractogel DEAE之陰離子交換層析 用25 mM Tris＋150 mM NaCl，pH 7.5將中和蛋白質A溶離液1：1稀釋且加載於2.6 cm×7 cm底料高度Fractogel DEAE柱上(37 ml體積，XK 2.6柱，Amersham)。根據製造商之說明書填充Fractogel DEAE柱，其包含在藉由高流動填充後之25%底料壓縮。

用6柱體積(CV)之25 mM Tris＋150 mM NaCl，pH 7.5使柱平衡，且以~230 cm/h加載。用4 CV之平衡緩衝液，接著4 CV之25 mM Tris＋350 mM乙酸銨，pH 7.5，接著3 CV之平衡緩衝液洗滌加載物。

用25 mM Tris＋600 mM乙酸銨，pH 7.5(~5 CV)溶離FIX－Fc單體。隨後，用5體積之0.1 M氫氧化鈉將柱剝離，接著用4 CV之25 mM Tris＋150 mM NaCl，pH 7.5再平衡。

使用Q瓊脂糖FF之假親和力(pseudoaffinity)層析 假親和力陰離子交換層析涉及CaCl₂ 溶離自柱之固定FIX－Fc。CaCl₂ 之添加據信引起分子之FIX部分之構形改變，其使該分子自Q瓊脂糖FF培養基溶離。Yan SB等人(1996)J Mol Recognit. 9：211－8；Harrison S等人(1998)Semin Hematol 35(2 Suppl 2)：4－10。

用25 mM Tris＋150 mM NaCl，pH 7.5將DEAE溶離液稀釋總共4倍。用25 mM Tris＋150 mM NaCl，pH 7.5(9 CV)使1.6 cm×11 cm底料高度Q Seph FF柱(22 ml體積，XK 1.6柱，Amersham)平衡。隨後，以200 cm/h加載該柱且用15 CV之平衡緩衝液洗滌。為確保FIX－Fc活性物質之足夠結合，現用25 mM Tris＋120 mM NaCl，pH 7.5將新穎物質之DEAE加載物稀釋1：4，其現變成柱平衡緩衝液。剩餘程序仍為相同的。

用25 mM Tris＋7 mM CaCl₂ ＋150 mM NaCl，pH 7.5(5 CV)溶離最活性之FIX－Fc單體物質。用25 mM Tris＋10 mM CaCl₂ ＋150 mM NaCl，pH 7.5(5 CV)溶離較低活性物質，而用25 mM Tris＋600 mM乙酸銨，pH 7.5溶離最小活性之FIX－Fc物質。

自溶離開始(UV信號達到~100 mAU)至當UV信號在溶離峰(~30 mL)之後端處，達到最大值峰吸光度之20%時，收集rFIX－Fc峰。

隨後，用0.1 M氫氧化鈉(5 CV)將柱剝離且隨後用25 mM Tris＋150 mM NaCl，pH 7.5再平衡。

最終蛋白質製劑之緩衝液交換 使Q Seph FF溶離份相對PBS緩衝液交換。將蛋白質注射於預濕潤125 ml Slide－A－lyzers(Pierce)中且相對PBS緩衝液之兩次改變而透析，每次呈超過蛋白質溶液之200倍PBS過量。

實例12

分析穩定細胞系及肽映射 對肽映射而言，執行胰蛋白酶消化且藉由LC/MS分析所得肽以確定命名為原肽指示肽或PIP(TVFLDHENANK；SEQ ID NO：18)之原肽之片段的存在，其將僅存在於不完全原肽處理之狀況下。

用Speed Vac將大致100－200 μg之蛋白質乾燥至體積縮減，隨後使用Eppendorf熱混合器，在30℃，800 rpm下，將其再懸浮於100－200 μl之消化緩衝液中(50 mM重碳酸銨)30 min。隨後，在熱混合器上，在56℃，800 rpm下，藉由添加10 μl還原劑(於消化緩衝液中之10 mM二硫蘇糖醇)將樣本還原30 min。使樣本冷卻，隨後添加10 μl之烷基化劑(於消化緩衝液中之55 mM碘乙醯胺)且在室溫下，在暗處使其培育30 min。隨後，以100：1至200：1受質與酶重量比，添加於50 mM重碳酸銨中之0.1 μg/μl之Promega Sequencing Grade Modified Trypsin，隨後在37℃，800 rpm下培育16小時。按需要，用Speed Vac將樣本稍微乾燥以減小體積，且在－20℃下儲存樣本，直至準備好用於如下文所述之分析。

HPLC－UV分析－物質及設備： ．具有恆溫自動取樣器(thermostatted autosampler)、二極體陣列偵測器(Diode Array Detector)及柱加熱器之Agilent 1100二元HPLC泵．Phenomenex Jupiter HPLC柱，250 mm×2.00 mm,C18,300,5 μm dp．緩衝液A：0.01%(v/v)三氟乙酸，0.05%(v/v)甲酸，(室內HPLC級水，分析級試劑)．緩衝液B：於85% HPLC級乙腈中之緩衝液A．HPLC－UV－MS分析－物質及設備： ．具有恆溫自動取樣器(thermostatted autosampler)、二極體陣列偵測器(Diode Array Detector)及柱加熱器之Agilent 1100二元HPLC泵．Thermo Finnigan Ion Trap質譜儀．Phenomenex Jupiter HPLC柱，250 mm×2.00 mm,C18,300,5 μm dp．緩衝液A：0.01%(v/v)三氟乙酸，0.05%(v/v)甲酸，(室內HPLC級水，分析級試劑)．緩衝液B：於85% HPLC級乙腈中之緩衝液A

HPLC－UV分析－程序： ．梯度程式：．流率：0.250 ml/min；．偵測：二極體陣列偵測器，UV，214 nm及280 nm；．柱溫度：30℃。

HPLC－UV－MS分析－程序： ．梯度程式、流率、柱溫度及UV偵測如上文。

．MS偵測：Thermo Finnigan LCQ Advantage Ion Trap質譜儀串聯連接於二極體陣列偵測器後且以電噴霧電離(ESI)模式操作。質譜協定視分析目標而變化，但通常為用於識別肽之"三次操作"(連續全掃描、範圍掃描及MSMS掃描)或僅全掃描以產生質量層析圖。

實例13

原肽處理實驗之概述：肽映射 藉由肽映射確認穩定轉染蛋白質之西方墨點法結果。在單獨轉染之CHO FIX－Fc中，以UV跡線及選定離子跡線偵測原肽指示肽(PIP)(圖11A )，但在與PC5共轉染之純化FIX－Fc單體中為不可偵測的(圖11B )。如UV跡線所指示，亦在與PC7共轉染之CHO FIX－Fc蛋白質中發現ProFIX－Fc(圖12A )，儘管其可能為較低含量的。在PACE－SOL(BeneFIX)存在下產生之單獨FIX(圖13A )似乎與用PC5所產生之FIX－Fc單體一樣(圖13B )，並不顯示可偵測PIP。

等價者前文所寫之說明書視為足以使熟習此項技術者能實踐本發明。本發明不欲藉由所提供之實例而限制範疇，因為實例欲作為本發明之一態樣之單說明且其他功能性等效實施例在本發明之範疇內。除本文所展示及描述之彼等者外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言，將自前文描述而變得明顯且落在附加申請專利範圍之範疇內。本發明之優點及目標不必由本發明之各實施例涵蓋。貫穿該申請案所引用之所有參照案(包含文獻參照案、頒予專利、公開專利申請案及同在申請中專利申請案)之全部內容在此明確地以引用之方式併入。

圖1為prepro第九因子之圖解圖示，其包含以下域：前肽(PRE)、原肽(PRO)、Gla域(GLA)、H域(H)、EGF－B及EGF－A域、活化肽及催化域。成熟第九因子缺乏前肽及原肽域。成熟、活化第九因子(IXa因子)另外缺乏活化肽且催化域仍經由二硫化物鍵聯與EGF－A域締合。

圖2A為FIX－Fc同型二聚體之結構之圖解圖示。

圖2B為FIX－Fc單體－二聚體雜合物之結構之圖解圖示。

圖3為PACE、PACE4、PC7及PC5A(分別從上至下)之圖解圖示，其展示以下域：信號肽、原肽、枯草菌蛋白樣催化域、同源B域、Cys富集域及(僅PACE及PC7)跨膜域。所展示百分比指示與各相應域內之PACE一致之胺基酸百分比。

圖4展示自單獨或經PACE－SOL、PC7－SOL、PC5或KEX2－SOL之瞬間轉染中國倉鼠卵巢(CHO)細胞之FIX－Fc的蛋白質A免疫沉澱之FIX及FIX原肽西方墨點(還原SDS－PAGE)。

圖5展示自經FIX－Fc、Fc及PACE－SOL或PC7－SOL穩定轉染之CHO細胞之蛋白質A純化蛋白質的FIX(B)及FIX原肽(C)西方墨點及相應SDS－PAGE凝膠(A，B之凝膠)(全部在非還原條件下)。MWM，分子量標記物。

圖6展示自經FIX－Fc、Fc及PC5(色帶1－3)穩定轉染之CHO細胞，或單獨經FIX－Fc(色帶4)或經PACE－SOL(色帶5)穩定轉染之CHO細胞之蛋白質A免疫沉澱的FIX及FIX原肽西方墨點(全部在非還原條件下)。

圖7展示自經FIX－Fc及Fc瞬間轉染，不經處理酶(色帶3，"－")瞬間轉染或經PC5(色帶4－7)或PC7－SOL(色帶8－11)瞬間轉染之HEK 293細胞的蛋白質A免疫沉澱之FIX(A)及FIX原肽(B)西方墨點。使用來自經(色帶2)轉染或不經(色帶1)PACE－SOL轉染之CHO細胞之純化FIX－Fc作為對照組。色帶1及2，分子量標記物。

圖8展示來自經KEX2－SOL(色帶3及4)之瞬間轉染HEK 293細胞之FIX－Fc二聚體、單體－二聚體雜合物(單體)及Fc的蛋白質A免疫沉澱之FIX(非還原，A)及FIX原肽(還原，B)西方墨點。使用來自經(色帶2)轉染或不經PACE(色帶1)轉染之CHO細胞之純化FIX－Fc同型二聚體作為對照組。

圖9展示來自經FIX－Fc、Fc及PC5穩定轉染之HEK 293細胞之純化FIX－Fc單體－二聚體雜合物(單體)的FIX(B)及FIX原肽(C)西方墨點及相應SDS－PAGE凝膠(A)(全部在非還原條件)。使用來自經PACE－SOL或PC7－SOL轉染之CHO細胞之純化FIX－Fc同型二聚體作為對照組。

圖10展示來自單獨(色帶3及4)或經PC7－SOL(色帶5及6)穩定轉染之HEK 293細胞之FIX－Fc二聚體、單體－二聚體雜合物(單體)及Fc的蛋白質A免疫沉澱之FIX(A)及FIX原肽(B)西方墨點(還原條件)。使用來自經(色帶2)轉染或不經(色帶1)PACE－SOL轉染之CHO細胞之純化FIX－Fc同型二聚體作為對照組。色帶7，分子量標準。

圖11展示肽映射資料，其指示proFIX－Fc存在於無任何處理酶之純化、經CHO生產之FIX－Fc中(圖11A)，且不存在來自具有PC5之純化、經HEK生產之FIX－Fc單體－二聚體雜合物(單體)的proFIX－Fc(圖11B)。TVFLDHENANKILNRPKR，SEQ ID NO：17；YGIYTK，SEQ ID NO：19。

圖12展示肽映射資料，其指示proFIX－Fc存在於具有PC7－SOL之純化、經CHO產生之FIX－Fc(圖12A)中，且不存在來自具有PC5之純化、經HEK生產之FIX－Fc單體－二聚體雜合物(單體)的proFIX－Fc(圖12B)。TVFLDHENANKILNRPKR，SEQ ID NO：17；YGIYTK，SEQ ID NO：19。

圖13展示肽映射資料，其指示不存在來自具有PC5之純化、經HEK產生之FIX－Fc單體－二聚體雜合物(單體)(圖13B)及單獨來自經CHO產生之第九因子之原肽(圖13A)。TVFLDHENANKILNRPKR，SEQ ID NO：17；YGIYTK，SEQ ID NO：19。

<110> 美商辛托尼斯製藥公司<120> 作為第九因子(FACTOR IX)原肽處理酶之PC5 <130> S1383.70013WO00 <140> 096110158 <141> 2007－03－23 <150> US 60/785,421 <151> 2006－03－24 <160> 68 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 913 <212> PRT <213> 智人<220> <223> 人類PC5A <400> 1 <210> 2 <211> 2739 <212> DNA <213> 智人<220> <223> 人類PC5A <400> 2 <210> 3 <211> 461 <212> PRT <213> 智人<220> <223> 人類第九因子前體蛋白<400> 3 <210> 4 <211> 1383 <212> DNA <213> 智人<220> <223> 人類第九因子前體蛋白<400> 4 <210> 5 <211> 227 <212> PRT <213> 智人<220> <223> 人類Fc γ <400> 5 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> 智人<400> 6<210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽<400> 7<210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽；關於位置2－10，任何一或多個Gly單元可不存在<400> 8<210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽；關於位置3－20，任何一或多個Gly－Ala單元可不存在<400> 9<210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽；關於位置4－30，任何一或多個Gly－Gly－Ser單元可不存在<400> 10<210> 11 <211> 50 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽；關於位置6－50，任何一或多個Gly－Gly－Gly－Gly－Ser單元可不存在<400> 11<210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽<400> 12<210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽<400> 13<210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽<400> 14<210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽<400> 15<210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽<400> 16 <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> 智人<400> 17<210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> 智人<400> 18<210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> 智人<400> 19 <210> 20 <211> 69 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 20<210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 21<210> 22 <211> 102 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 22<210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 23<210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 24<210> 25 <211> 9 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 25<210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 26<210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 27<210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 28<210> 29 <211> 37 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 29<210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 30<210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 31<210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 32<210> 33 <211> 42 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 33<210> 34 <211> 37 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 34<210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 35<210> 36 <211> 51 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 36<210> 37 <211> 35 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 37<210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 38<210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 39<210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 40<210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 41<210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 42<210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 43<210> 44 <211> 34 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 44<210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 45<210> 46 <211> 34 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 46<210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 47<210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 48<210> 49 <211> 34 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 49<210> 50 <211> 53 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 50<210> 51 <211> 29 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 51<210> 52 <211> 29 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 52<210> 53 <211> 59 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 53<210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 54<210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 55<210> 56 <211> 40 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 56<210> 57 <211> 33 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 57<210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 58<210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 59<210> 60 <211> 19 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽<400> 60<210> 61 <211> 2739 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 61 <210> 62 <211> 681 <212> DNA <213> 智人<220> <223> 人類Fc γ 1 <400> 62<210> 63 <211> 741 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 63<210> 64 <211> 247 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽<400> 64 <210> 65 <211> 2064 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸；FIX－Fc <400> 65 <210> 66 <211> 688 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成肽<400> 66 <210> 67 <211> 741 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸<400> 67<210> 68 <211> 2363 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成低聚核苷酸；FIX－Fc <400> 68

(無元件符號說明)

Claims

一種宿主細胞，其包括編碼第九因子之前體蛋白(proprotein)(proFIX)或其融合蛋白質之第一表現載體，及編碼功能性PC5之第二表現載體。
如請求項1之宿主細胞，其中該功能性PC5包括由SEQ ID NO：1提供之胺基酸序列。
如請求項1之宿主細胞，其中該第一表現載體編碼proFIX。
如請求項1之宿主細胞，其中該融合蛋白質為proFIX-FcRn結合搭配物(partner)融合蛋白質。
如請求項4之宿主細胞，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質包括一個將proFIX與FcRn結合搭配物連接之連接子。
如請求項4之宿主細胞，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質為proFIX-Fc融合蛋白質。
如請求項6之宿主細胞，其中該proFIX-Fc融合蛋白質包括人類Fc γ。
如請求項6之宿主細胞，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質包括一個將proFIX與Fc連接之連接子。
如請求項6之宿主細胞，其中該proFIX-Fc融合蛋白質為proFIX-Fc同型二聚體(homodimer)。
如請求項6之宿主細胞，其中該proFIX-Fc融合蛋白質為proFIX-Fc單體-二聚體雜合物(hybrid)。
如請求項1之宿主細胞，其中該融合蛋白質為proFIX-白蛋白融合蛋白質。
如請求項11之宿主細胞，其中該proFIX-白蛋白融合蛋白質包括一個將proFIX與白蛋白連接之連接子。
如請求項1之宿主細胞，其中該融合蛋白質為proFIX-轉鐵蛋白融合蛋白質。
如請求項13之宿主細胞，其中該proFIX-轉鐵蛋白融合蛋白質包括一個將proFIX與轉鐵蛋白連接之連接子。
如請求項1之宿主細胞，其中該宿主細胞為真核細胞或原核細胞。
如請求項1之宿主細胞，其中該宿主細胞為哺乳動物細胞。
如請求項1之宿主細胞，其中該宿主細胞為HEK 293細胞。
如請求項1之宿主細胞，其中該宿主細胞為CHO細胞。
如請求項1之宿主細胞，其中編碼該proFIX或其融合蛋白質之表現載體，及編碼該功能性PC5之表現載體為單一表現載體。
一種表現載體，其包括編碼第九因子之前體蛋白(proFIX)或其融合蛋白質之第一聚核苷酸序列，可操作地與允許該proFIX或其融合蛋白質表現之表現控制序列聯接，及編碼功能性PC5之第二聚核苷酸序列，可操作地與允許該功能性PC5表現之表現控制序列聯接。
如請求項20之表現載體，其中該功能性PC5包括由SEQ ID NO：1提供之胺基酸序列。
如請求項20之表現載體，其中該第一聚核苷酸序列編碼proFIX。
如請求項20之表現載體，其中該融合蛋白質為proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質。
如請求項23之表現載體，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質包括一個將proFIX與FcRn結合搭配物連接之連接子。
如請求項23之表現載體，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質為proFIX-Fc融合蛋白質。
如請求項25之表現載體，其中該proFIX-Fc融合蛋白質包括人類Fc γ。
如請求項25之表現載體，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質包括一個將proFIX與Fc連接之連接子。
如請求項25之表現載體，其中該proFIX-Fc融合蛋白質為proFIX-Fc同型二聚體。
如請求項25之表現載體，其中該proFIX-Fc融合蛋白質為proFIX-Fc單體-二聚體雜合物。
如請求項20之表現載體，其中該融合蛋白質為proFIX-白蛋白融合蛋白質。
如請求項30之表現載體，其中該proFIX-白蛋白融合蛋白質包括一個將proFIX與白蛋白連接之連接子。
如請求項20之表現載體，其中該融合蛋白質為proFIX-轉鐵蛋白融合蛋白質。
如請求項32之表現載體，其中該proFIX-轉鐵蛋白融合蛋白質包括一個將proFIX與轉鐵蛋白連接之連接子。
一種自第九因子之前體蛋白(proFIX)或其融合蛋白質產生含有成熟第九因子之多肽的方法，該方法包括：在容許該proFIX或其融合蛋白質及功能性PC5表現之條件下培養如請求項1之宿主細胞，及由該功能性PC5處理該proFIX或其融合蛋白質。
如請求項34之方法，其中該第一表現載體編碼proFIX。
如請求項34之方法，其中該融合蛋白質為proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質。
如請求項36之方法，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質包括一個將proFIX與FcRn結合搭配物連接之連接子。
如請求項36之方法，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質為proFIX-Fc融合蛋白質。
如請求項38之方法，其中該proFIX-Fc融合蛋白質包括人類Fc γ。
如請求項38之方法，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質包括一個將proFIX與Fc連接之連接子。
如請求項38之方法，其中該proFIX-Fc融合蛋白質為proFIX-Fc同型二聚體。
如請求項38之方法，其中該proFIX-Fc融合蛋白質為proFIX-Fc單體-二聚體雜合物。
如請求項34之方法，其中該融合蛋白質為proFIX-白蛋白融合蛋白質。
如請求項43之方法，其中該proFIX-白蛋白融合蛋白質包括一個將proFIX與白蛋白連接之連接子。
如請求項34之方法，其中該融合蛋白質為proFIX-轉鐵蛋白融合蛋白質。
如請求項45之方法，其中該proFIX-轉鐵蛋白融合蛋白質包括一個將proFIX與轉鐵蛋白連接之連接子。
一種增加獲自第九因子之前體蛋白(proFIX)或其融合蛋白質的含有成熟第九因子之多肽產量的方法，該方法包括：在容許該proFIX或其融合蛋白質及功能性PC5表現之條件下培養如請求項1之宿主細胞，及由該功能性PC5處理該proFIX或其融合蛋白質，其中與未經該功能性PC5處理而在類似條件下產生之含有成熟第九因子之多肽之產量相比，該含有成熟第九因子之多肽之產量增加。
如請求項47之方法，其中該第一表現載體編碼proFIX。
如請求項47之方法，其中該融合蛋白質為proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質。
如請求項49之方法，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質包括一個將proFIX與FcRn結合搭配物連接之連接子。
如請求項49之方法，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質為proFIX-Fc融合蛋白質。
如請求項51之方法，其中該proFIX-Fc融合蛋白質包括人類Fc γ。
如請求項51之方法，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質包括一個將proFIX與Fc連接之連接子。
如請求項51之方法，其中該proFIX-Fc融合蛋白質為proFIX-Fc同型二聚體。
如請求項51之方法，其中該proFIX-Fc融合蛋白質為proFIX-Fc單體-二聚體雜合物。
如請求項47之方法，其中該融合蛋白質為proFIX-白蛋白融合蛋白質。
如請求項56之方法，其中該proFIX-白蛋白融合蛋白質包括一個將proFIX與白蛋白連接之連接子。
如請求項47之方法，其中該融合蛋白質為proFIX-轉鐵蛋白融合蛋白質。
如請求項58之方法，其中該proFIX-轉鐵蛋白融合蛋白質包括一個將proFIX與轉鐵蛋白連接之連接子。
一種自第九因子之前體蛋白(proFIX)或其共軛物產生含有成熟第九因子之多肽的方法，該方法包括將該proFIX或其共軛物與有效量之功能性PC5接觸。
如請求項60之方法，其中該proFIX或其共軛物為聚乙二醇化proFIX。
如請求項60之方法，其中該proFIX或其共軛物為proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質。
如請求項62之方法，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質包括一個將proFIX與FcRn結合搭配物連接之連接子。
如請求項63之方法，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質為proFIX-Fc融合蛋白質。
如請求項64之方法，其中該proFIX-Fc融合蛋白質包括人類Fc γ。
如請求項64之方法，其中該proFIX-FcRn結合搭配物融合蛋白質包括一個將proFIX與Fc連接之連接子。
如請求項64之方法，其中該proFIX-Fc融合蛋白質為proFIX-Fc同型二聚體。
如請求項64之方法，其中該proFIX-Fc融合蛋白質為proFIX-Fc單體-二聚體雜合物。
如請求項60之方法，其中該proFIX或其共軛物為proFIX-白蛋白融合蛋白質。
如請求項69之方法，其中該proFIX-白蛋白融合蛋白質包括一個將proFIX與白蛋白連接之連接子。
如請求項60之方法，其中該proFIX或其共軛物為proFIX-轉鐵蛋白融合蛋白質。
如請求項71之方法，其中該proFIX-轉鐵蛋白融合蛋白質包括一個將proFIX與轉鐵蛋白連接之連接子。
8、12或14中任一項之宿主細胞，其中該連接子為GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：16)。
如請求項24、27、31或33中任一項之表現載體，其中該連接子為GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：16)。
如請求項37、40、44、46、50、53、57、59、63、66、70或72中任一項之方法，其中該連接子為GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：16)。
如請求項34或47之方法，其中該宿主細胞為真核細胞或原核細胞。
如請求項76之方法，其中該真核細胞為HEK 293細胞。