KR20150038511A - 불활성 면역글로불린 Ｆｃ-영역을 갖는 Ｆｃ-융합체로서의 가용성 ＦｃＲ 의 생산 방법 및 그의 용도 - Google Patents

불활성 면역글로불린 Ｆｃ-영역을 갖는 Ｆｃ-융합체로서의 가용성 ＦｃＲ 의 생산 방법 및 그의 용도 Download PDF

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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본원에서 식 R1-FC-R2 (식 중, R1 은 제 1 Fc-수용체를 나타내고, R2 는 제 2 Fc-수용체를 나타내고, FC 는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 나타내고, 여기서 R1 또는 R2 또는 둘다가 존재하고, 여기서 FC 는 R1 및/또는 R2 에 실질적으로 결합하지 않음) 에 따른 융합 폴리펩티드 및 그의 용도가 보고된다.

Description

불활성 면역글로불린 Ｆｃ-영역을 갖는 Ｆｃ-융합체로서의 가용성 ＦｃＲ 의 생산 방법 및 그의 용도 {METHOD FOR PRODUCING SOLUBLE FcR AS Fc-FUSION WITH INERT IMMUNOGLOBULIN Fc-REGION AND USES THEREOF}
본원에서 자가-응집을 방지하는 불활성 면역글로불린 Fc-영역을 갖는 융합 폴리펩티드로서의 가용성 Fc-수용체의 생산 방법 및 그의 용도, 예컨대 FcR 크로마토그래피 칼럼, 낮은 친화도 항체의 FcR 상호작용의 확인이 보고된다.
면역글로불린은 일반적으로 2 개의 폴리펩티드 경쇄 및 2 개의 폴리펩티드 중쇄를 함유한다. 각각의 폴리펩티드 중쇄 및 경쇄는 항원과 상호작용할 수 있는 결합 도메인을 함유하는 가변 영역 (일반적으로 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단 부분) 을 포함한다. 각각의 폴리펩티드 중쇄 및 경쇄는 또한 불변 영역 (일반적으로 카르복실 말단 부분) 을 포함한다. 중쇄의 불변 영역은 예를 들어 Fc 감마 수용체 (FcγR) 를 보유하는 세포, 예컨대 식세포, 또는 Brambell 수용체로서도 알려진 신생아 (neonatal) Fc-수용체 (FcRn) 를 보유하는 세포에 대한 면역글로불린의 결합을 매개하고, 또한 성분 (C1q) 과 같은 고전적 보체계의 인자를 포함하는 일부 인자에 대한 결합을 매개한다.
Hulett 및 Hogarth (Hulett, M.D. 및 Hogarth, P.M., Adv. Immunol. 57 (1994) 1-127) 는 클래스 G 의 면역글로불린의 Fc 부분에 대한 세포외 수용체가 상이한 결합 특이성을 갖는 3 가지 상이한 수용체 유형: FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 을 포함하는 막관통 당단백질의 패밀리라고 보고했다. 유형 I 의 수용체는 비-복합체화된 IgG 와 상호작용하지만, 유형 II 및 III 의 수용체는 바람직하게는 복합체화된 IgG 와 상호작용한다.
인간 FcγRIII (CD 16) 은 2 가지 아이소형 (isoform) 및 2 가지 다형 (polymorphic form) 으로 존재한다. 제 1 아이소형 FcγRIIIa 는 GPI-고정된 (anchored) 막 단백질인, 제 2 아이소형 FcγRIIIb 와 상이한 유전자에 의해 인코딩되는 막관통 분자이다. 다형 V159 는 아미노산 서열의 위치 159 에서 발린 잔기를 갖지만, 다형 F159 는 위치 159 에서 페닐알라닌 잔기를 갖는다.
면역글로불린의 IgG 클래스의 경우, ADCC 및 ADCP 는 Fc-영역과 Fc-감마 (Fcγ) 수용체 (FcγR) 로 언급되는 수용체의 패밀리의 관계에 의해 지배받는다. 인간에서, 이러한 단백질 패밀리는 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) (아이소형 FcγRIIA, FcγRIIB 를 포함), 및 FcγRIIC, 및 FcγRIII (CD16) (아이소형 FcγRIIIA 및 FcγRIIIB 를 포함) 를 포함한다 (Raghavan and Bjorkman, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12 (1996) 181-220; Abes, et al., Expert Reviews (2009) 735-747). FcγR 는 여러 가지 면역 세포 상에서 발현되고, Fc/FcγR 복합체의 형성은 이들 세포를 결합된 항원의 자리로 동원하여, 전형적으로 신호전달 및 후속 면역 반응 예컨대 염증 매기인자의 방출, B-세포 활성화, 엔도사이토시스, 파고사이토시스, 및 세포독성 공격을 초래한다. 게다가, FcγRI, FcγRIIA/C, 및 FcγRIIIA 는 세포내 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM) 를 특징으로 하는 활성화 수용체지만, FcγRIIB 는 저해성 모티프 (ITIM) 를 갖고 그러므로 저해성이다. FcγRI 은 단량체성 IgG 에 높은 친화도로 결합하지만, FcγRIII 및 FcγRII 는 낮은-친화도 수용체이며, 복합체화된 또는 응집된 IgG 와 상호작용한다.
활성화 및 저해성 Fcγ 수용체 또는 보체의 제 1 성분 (C1q) 에 대한 IgG 의 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인에 위치하는 잔기에 좌우된다. CH2 도메인의 2 개의 영역이 FcγR 및 보체 C1q 결합에 결정적이고, 독특한 서열을 갖는다. 위치 233-236 에서의 인간 IgG1 및 IgG2 잔기 및 위치 327, 330 및 331 에서의 IgG4 잔기의 치환은 ADCC 및 CDC 를 크게 감소시켰다 (Armour, et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624; Shields, et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). Idusogie 등 (J. Immunol 166 (2000) 2571-2575) 은 치료적 항체 Rituxan(R) 에 대한 C1q 결합 자리를 지도화했고, Pro329Ala 치환이 C1q 에 결합하고 보체를 활성화시키는 리툭시맙 (Rituximab) 의 능력을 감소시켰음을 밝혔다. Ala 에 의한 Pro329 의 치환은 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIA 수용체에 대한 감소된 결합을 초래하는 것으로 보고되었지만 (Shields, et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604), 이러한 돌연변이는 또한 FcγRI 및 FcγRII 에 대한 야생형-유사 결합 및 FcγRIIIA 수용체에 대한 결합에서 오직 매우 작은 감소를 나타내는 것으로 기재되었다 (EP 1 068 241, Genentech 에서 표 1 및 표 2).
WO 2010/048313 에서 Fc-함유 융합 단백질의 정제를 위한 재조합 FcRn 및 그의 변이체가 보고된다. 포유류 세포에서 Fc-X 융합 단백질의 높은 수준 발현 및 분비가 Lo 등 (Lo, K-M., et al., Prot. Eng. 11 (1998) 495-500) 에 의해 보고된다. Dumont, F.A. 등 (Biodrugs 20 (2006) 151-160) 은 단량체성 Fc-융합체를 보고한다. 수용체-Fc 융합 치료제, 트랩 (trap), 및 MIMETIBODYTM 기술이 Huang, C. (Curr. Opin. Biotechnol. 20 (2009) 592-599) 에 의해 보고된다. WO 01/03737 에서 면역글로불린 융합 단백질이 보고된다. Fc 융합 단백질로서의 항-비만 단백질의 발현 및 외수송이 WO 00/40615 에서 보고된다.
융합된 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않는 Fc-영역을 갖는 융합 폴리펩티드로서 Fc-수용체를 발현시킴으로써 가용성 Fc-수용체가 생산될 수 있다고 밝혀졌다. Fc-수용체의 발현에 융합 폴리펩티드를 사용함으로써 융합 폴리펩티드 형태의 또는 단리된 수용체로서의 Fc-수용체의 수득가능한 수율이 증가된다. 부가적으로 본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드는, 예를 들어 증가된 결합력 (avidity) 을 위해, 단일 분자 내에 Fc-수용체의 1 개 초과 카피를 조합시키는 경우, 또는 단일 분자 내에 상이한 Fc-수용체 (상이한 기원의 또는 상이한 유형의 또는 둘다) 를 조합시키는 경우 증가된 유연성을 제공한다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 하기 식 I 에 따른 융합 폴리펩티드이다:
R1-FC-R2 (식 I)
(식 중,
R1 은 제 1 Fc-수용체를 나타내고,
R2 는 제 2 Fc-수용체를 나타내고,
FC 는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 나타내고,
여기서 R1 또는 R2 또는 둘다가 존재하고,
여기서 FC 는 R1 및/또는 R2 에 실질적으로 결합하지 않음).
하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 하기 식 II 를 갖는다:
R1-CS1-L1-CS2-FC-CS3-L2-CS4-R2 (식 II)
(식 중,
R1 은 제 1 Fc-수용체를 나타내고,
R2 는 제 2 Fc-수용체를 나타내고,
FC 는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 나타내고,
CS1 은 제 1 절단 자리를 나타내고,
CS2 는 제 2 절단 자리를 나타내고,
CS3 은 제 3 절단 자리를 나타내고,
CS4 는 제 4 절단 자리를 나타내고,
L1 은 제 1 개재 아미노산 서열을 나타내고,
L2 는 제 2 개재 아미노산 서열을 나타내고,
여기서 R1 또는 R2 또는 둘다가 존재하고,
여기서 CS1, CS2, CS3, CS4 중 어느 것이든 서로 독립적으로 존재 또는 부재할 수 있고,
여기서 L1 및 L2 는 서로 독립적으로 존재 또는 부재할 수 있고,
여기서 FC 는 R1 및/또는 R2 에 실질적으로 결합하지 않음).
하나의 구현예에서 R1 및 R2 는 서로 독립적으로 인간 Fc감마-수용체, 인간 신생아 Fc-수용체, 쥐 Fc-수용체, 및 토끼 신생아 Fc-수용체의 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 인간 Fc감마-수용체는 인간 FcγRI (CD64), 인간 FcγRII (CD32), 인간 FcγRIIA, 인간 FcγRIIB, 인간 FcγRIIC, 인간 FcγRIII (CD16), 인간 FcγRIIIA, 및 인간 FcγRIIIB 로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 인간 신생아 Fc-수용체는 인간 FcRn 이다.
하나의 구현예에서 쥐 Fc-수용체는 쥐 FcγRI (CD64), 쥐 FcγRII (CD32), 쥐 FcγRIIB, 쥐 FcγRIII (CD16), 쥐 FcγRIII-2 (CD16-2), 및 쥐 FcγRIV 로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 FC 는 인간 IgG 중쇄 폴리펩티드, 쥐 IgG 중쇄 폴리펩티드, 토끼 IgG 중쇄 폴리펩티드의 군으로부터 선택되는 중쇄 폴리펩티드의 변이체이다.
하나의 구현예에서 FC 는 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG2 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG3 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드, 쥐 IgG1 중쇄 폴리펩티드, 쥐 IgG2 중쇄 폴리펩티드, 쥐 IgG2a 중쇄 폴리펩티드, 쥐 IgG3 중쇄 폴리펩티드, 토끼 IgG 중쇄 폴리펩티드의 군으로부터 선택되는 중쇄 폴리펩티드의 변이체이다.
하나의 구현예에서 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 위치 234, 235, 236, 237, 238, 239, 253, 254, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 288, 297, 298, 299, 307, 311, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 434, 및 435 중 하나 이상에서 아미노산 돌연변이를 갖는다.
하나의 구현예에서 Fc-수용체 중 하나 이상은 Fc 감마 수용체이다.
하나의 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 233, 234, 235, 236, 265, 297, 329, 및 331 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 E233P, L234A, L235A, L235E, DG236, D265A, N297A, N297D, P329A, P329G, 및 P331S 중 하나 이상을 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 L234A 및 L235A 및 E233P, L235E, DG236, D265A, N297A, N297D, P329A, P329G, 및 P331S 중 하나 이상을 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 L234A 및 L235A 및 P329A 또는 P329G 를 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 IgG2 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 233, 234, 235, 236, 265, 및 329 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 228, 235, 265, 및 329 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L235E, P329A, 및 P329G 중 하나 이상을 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드는 돌연변이 S228P 및 L235E 및 P329A 또는 P329G 를 갖는다.
하나의 구현예에서 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 아미노산 위치 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 272, 285, 288, 290, 291, 308, 309, 310, 311, 314, 385, 386, 387, 428, 433, 434, 435, 및 436 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
하나의 구현예에서 Fc-수용체 중 하나 이상은 FcRn 이다.
하나의 구현예에서 인간 IgG 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439, 및/또는 447 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
하나의 구현예에서 FcRn 에 대한 감소된 결합을 갖는 인간 IgG 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439, 및/또는 447 에서 하나 이상의 아미노산 변경을 갖는다.
하나의 구현예에서 FcRn 에 대한 감소된 결합을 갖는 인간 IgG 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 I253A, H310A, 및 H435A 를 갖는다.
하나의 구현예에서 개재 (intervening) 아미노산 서열은 (G3S)3, (G3S)4, (G3S)5, (G3S)6, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5, (G5S)2, (G5S)3, 및 (G5S)4 를 포함하는 제 1 군으로부터, 또는 Arg-태그, Avi-태그, His-Avi-태그, His-태그, Flag-태그, 3xFlag-태그, Strep-태그, Nano-태그, SBP-태그, c-myc-태그, S-태그, 칼모둘린-결합-펩티드, 셀룰로스-결합-도메인, 키틴-결합-도메인, GST-태그, 또는 MBP-태그 를 포함하는 제 2 군으로부터, 또는 이들 군의 2 가지 요소의 조합으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 절단 자리는 IgA-프로테아제 프로테아제 절단 자리, 그란자임 (Granzyme) B 프로테아제 절단 자리, Tev 프로테아제 절단 자리, 프레시션 (PreScission) 프로테아제 절단 자리, 트롬빈 (Thrombin) 절단 자리, Faktor10a 프로테아제 자리, Ides 프로테아제 절단 자리, 엔테로키나제 (Enterokinase) 절단 자리, 또는 SUMO 프로테아제 절단 자리로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 부가적 프로테아제 절단 자리를 포함하지 않고, 고유의 (inherent) 프로테아제 절단 자리, 예컨대 예를 들어 파파인 절단 자리, 펩신 절단 자리, 또는 Ides 프로테아제 절단 자리를 포함한다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 본원에서 보고되는 2 개의 융합 폴리펩티드를 포함하는 이합체성 융합 폴리펩티드이다.
하나의 구현예에서 제 1 FC 는 돌연변이 T366W 및 임의로 돌연변이 S354C 를 포함하고, 제 2 FC 는 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 및 임의로 돌연변이 Y349C 를 포함한다.
하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 하기를 특징으로 한다:
a) 제 1 및 제 2 폴리펩티드의 R1 및 R2 는 동일하고,
b) 제 1 융합 폴리펩티드의 R1 및 R2 는 동일하고, 제 2 융합 폴리펩티드의 R1 및 R2 는 동일하나 제 1 융합 폴리펩티드의 R1 및 R2 와 상이하고,
c) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R1 은 동일하고, 제 1 및 제 2 폴리펩티드의 R2 는 동일하나 R1 과 상이하고,
d) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R1 은 동일하고 R2 는 둘다 부재하고,
e) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R1 은 상이하고 R2 는 둘다 부재하고,
f) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R2 는 동일하고 R1 은 둘다 부재하고,
g) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R2 는 상이하고 R1 은 둘다 부재하고,
h) 제 1 융합 폴리펩티드의 R1 및 제 2 폴리펩티드의 R2 는 상이하고, 제 1 융합 폴리펩티드의 R2 는 부재하고 제 2 폴리펩티드의 R1 은 부재함.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 가용성 Fc-수용체의 생산 방법이다:
a) 본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,
b) 세포 또는 배양 배지로부터 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계,
c) 임의로 융합 폴리펩티드를 프로테아제로 절단하고,
그에 의해 가용성 Fc-수용체를 생산하는 단계.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 친화도 크로마토그래피 리간드로서의 본원에서 보고되는 고정 (immobilized) 융합 폴리펩티드 또는 고정 이합체성 융합 폴리펩티드의 용도이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 항체의 Fc-수용체 결합을 확인하기 위한 본원에서 보고되는 고정 융합 폴리펩티드 또는 고정 이합체성 융합 폴리펩티드의 용도이다.
하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 고체 상에 결합된다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 약제의 제조에 있어서 본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드의 용도이다.
하나의 구현예에서 약제는 염증성 질환의 치료를 위한 것이다.
하나의 구현예에서 질환은 증가된 항체 수준을 특징으로 하는 질환이다.
하나의 구현예에서 질환은 자가면역 질환이다.
하나의 구현예에서 질환은 류머티스 관절염이다.
도 1 융합 폴리펩티드 발현 플라스미드의 플라스미드 지도.
도 2 파파인 절단의 분석적 SDS-PAGE 겔.
도 3 12% Bis Tris 겔 + / -DTT; 각각 프레시션 프로테아제 (레인 3, 8) 및 IgA 프로테아제 (레인 2, 7) 에 의한 Fc감마RIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G 의 절단: PP 에 의한 비특이적 절단을 볼 수 있다 (레인 3, 8).
도 4 항-Her 항체 (야생형, 상부에) 및 당조작된 (glycoengineered) 항-Her 항체의 상이한 당화 형태의 분리 및 정량화.
도 5 Fc감마RIIIaV158 및 Fc tagged Fc감마RIIIaV158 을 사용하는 친화도 칼럼의 비교.
도 6 Fc감마RIIIaV158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드의 반응의 BIAcore 센서그램 (sensorgram) 은 100 초과의 반응 단위 (Response units) 를 나타내고, 이에 비해 Fc감마RIIIaV158 은 40 RU 를 나타내고; FcγRIIIa V 158_008 은 비-절단된 융합 폴리펩티드를 나타내고, FcγRIIIa V 158_007 은 FcγRIIIa 의 짧아진 비-기능적 변이체를 나타내고 (=대조군), FcγRIIIa V 158_jf323 은 FcγRIIIa 의 기능적 변이체를 포함하는 무손상 HisAvi-태그를 나타낸다.
도 7 Fc감마 수용체 V158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 (도 7a), Fc감마 수용체 V158 (도 7b), 절단된 Fc감마 수용체 V158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 (도 7c), 비-기능적 Fc감마 수용체 V158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 (도 7d) (=대조군) 의 센서그램.
정의
용어 "Fc-수용체에 대한 결합" 은, 예를 들어, BIAcore(R) 검정 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) 에서, Fc 수용체에 대한 Fc-영역의 결합을 의미한다.
BIAcore(R) 검정에서 Fc 수용체는 표면에 결합되어 있고, 분석물, 예를 들어, 융합 폴리펩티드를 포함하는 Fc-영역 또는 항체의 결합은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 에 의해 측정된다. 결합의 친화도는 용어 ka (연합 상수: Fc-영역/Fc 수용체 복합체를 형성하는 Fc-영역 융합 폴리펩티드 또는 접합체의 연합에 대한 속도 상수), kd (해리 상수; Fc-영역/Fc 수용체 복합체로부터의 Fc-영역 융합 폴리펩티드 또는 접합체의 해리에 대한 속도 상수), 및 KD (kd/ka) 에 의해 정의된다. 대안적으로, SPR 센서그램의 결합 신호는, 공명 신호 높이 및 해리 거동에 관하여, 레퍼런스의 반응 신호와 직접 비교될 수 있다.
용어 "CH2 도메인" 은 대략 EU 위치 231 에서부터 EU 위치 340 (Kabat 에 따른 EU 번호지정 시스템) 까지 이르는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 의미한다. 하나의 구현예에서 CH2 도메인은 SEQ ID NO: 01 (APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK) 의 아미노산 서열을 갖는다. CH2 도메인은 또다른 도메인과 가까이에서 짝을 이루고 있지 않다는 점에서 독특하다. 대신에, 2 개의 N-연결된 분지형 탄화수소 사슬이 온전한 선천 Fc-영역의 2 개의 CH2 도메인 사이에 끼어 들어가 있다. 상기 탄수화물은 도메인-도메인 짝짓기를 대체하고 CH2 도메인 안정화를 도울 수 있다고 추측되었다 (Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206).
용어 "CH3 도메인" 은 대략 EU 위치 341 에서부터 EU 위치 446 까지 이르는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 의미한다. 하나의 구현예에서 CH3 도메인은 SEQ ID NO: 02 (GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG) 의 아미노산 서열을 갖는다.
용어 항체의 "클래스" 는 그것의 중쇄에 의해 보유되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. 항체의 5 가지 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 가 존재하고, 이들 중 여럿은 서브클래스 (동형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 로 호칭된다.
용어 "Fc-영역" 은 면역글로불린의 C-말단 영역을 의미한다. Fc-영역은 2 개의 다이설파이드-연결된 항체 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드 (Fc-영역 폴리펩티드 사슬) 를 포함하는 이합체 분자이다. Fc-영역은 온전한 (전장) 항체의 파파인 소화, 또는 IdeS 소화, 또는 트립신 소화에 의해 생성될 수 있거나 재조합적으로 생산될 수 있다.
전장 항체 또는 면역글로불린으로부터 수득가능한 Fc-영역은 적어도 전장 중쇄의 잔기 226 (Cys) 에서 C-말단까지를 포함하고, 따라서, 힌지 영역의 일부 및 2 개 또는 3 개의 불변 도메인, 즉, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 임의로 CH4 도메인을 포함한다. US 5,648,260 및 US 5,624,821 로부터 Fc-영역 내의 정의된 아미노산 잔기의 수식은 표현형 효과를 초래하는 것이 알려져 있다.
2 개의 동일한 또는 동일하지 않은 항체 중쇄 분절을 포함하는 이합체 Fc-영역의 형성은 포함된 CH3 도메인의 비-공유적 이합체화에 의해 매개된다 (관여하는 아미노산 잔기에 대해 예를 들어, Dall'Acqua, Biochem. 37 (1998) 9266-9273 참고). Fc-영역은 힌지 영역 내의 다이설파이드 결합의 형성에 의해 공유적으로 안정화된다 (예를 들어, Huber, et al., Nature 264 (1976) 415-420; Thies, et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 67-79 참고). CH3-CH3 도메인 상호작용의 이합체화를 파괴하기 위한 CH3 도메인 내의 아미노산 잔기 변화의 도입은 FcRn 결합에 악영향을 미치지 않는데, 그 이유는 CH3-CH3-도메인 이합체화에 관여하는 잔기는 CH3 도메인의 내부 경계면에 위치하지만, Fc-영역-FcRn 상호작용에 관여하는 잔기는 CH2-CH3 도메인의 외부에 위치하기 때문이다.
Fc-영역 연관되는 효과기 기능은 Fc-영역과 효과기 기능 특이적 세포 표면 수용체의 상호작용에 의해 개시된다. 주로 IgG1 동형의 항체는 수용체 활성화를 달성할 수 있지만, IgG2 및 IgG4 동형의 항체는 효과기 기능을 갖지 않거나 제한된 효과기 기능을 갖는다.
효과기 기능 유발 수용체는 Fc 수용체 유형 (및 하위-유형) FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 이다. IgG1 동형과 연관되는 효과기 기능은 FcγR 및 C1q 결합에 관여하는, 하부 힌지 영역, 예컨대 L234A 및/또는 L235A 에 특정 아미노산 변화를 도입함으로써 감소될 수 있다. 또한, 특히 CH2 및/또는 CH3 도메인 내에 위치하는, 특정 아미노산 잔기는 혈류 내의 항체 분자 또는 Fc-영역 융합 폴리펩티드의 순환 반감기와 연관된다. 순환 반감기는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 에 대한 Fc-영역의 결합에 의해 결정된다.
항체의 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 번호지정은 Kabat 의 EU 인덱스에 따른다 (Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.).
용어 "인간 기원의 Fc-영역" 은 적어도 힌지 영역의 일부, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 함유하는 인간 기원의 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 의미한다. 하나의 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226, 또는 Pro230 에서, 중쇄의 카르복실-말단까지 이른다. 그러나, Fc-영역의 C-말단 라이신 (Lys447) 은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 다르게 명시되지 않으면, Fc-영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 번호지정은 Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242 에 기재된 바와 같은, EU 인덱스로도 호칭되는, EU 번호지정 시스템에 따른다.
용어 "Fc-영역의 FcRn 결합 부분" 은 대략 EU 위치 243 에서 EU 위치 261 까지 및 대략 EU 위치 275 에서 EU 위치 293 까지 및 대략 EU 위치 302 에서 EU 위치 319 까지 및 대략 EU 위치 336 에서 EU 위치 348 까지 및 대략 EU 위치 367 에서 EU 위치 393 및 EU 위치 408 까지 및 대략 EU 위치 424 에서 EU 위치 440 까지 이르는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분을 나타낸다. 하나의 구현예에서 Kabat 의 EU 번호지정에 따른 하기 아미노산 잔기 중 하나 이상은 변경된 F243, P244, P245 P, K246, P247, K248, D249, T250, L251, M252, I253, S254, R255, T256, P257, E258, V259, T260, C261, F275, N276, W277, Y278, V279, D280, V282, E283, V284, H285, N286, A287, K288, T289, K290, P291, R292, E293, V302, V303, S304, V305, L306, T307, V308, L309, H310, Q311, D312, W313, L314, N315, G316, K317, E318, Y319, I336, S337, K338, A339, K340, G341, Q342, P343, R344, E345, P346, Q347, V348, C367, V369, F372, Y373, P374, S375, D376, I377, A378, V379, E380, W381, E382, S383, N384, G385, Q386, P387, E388, N389, Y391, T393, S408, S424, C425, S426, V427, M428, H429, E430, A431, L432, H433, N434, H435, Y436, T437, Q438, K439, 및 S440 (EU 번호지정) 이다.
IgG1 동형의 야생형 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 03).
돌연변이 L234A, L235A 를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 04).
T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 05).
T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 06).
L234A, L235A 및 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 07).
L234A, L235A 및 T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 08).
P329G 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 09).
L234A, L235A 및 P329G 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 10).
P239G 및 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 11).
P329G 및 T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 12).
L234A, L235A, P329G 및 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 13).
L234A, L235A, P329G 및 T366W 돌연변이를 갖는 IgG1 동형의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14).
IgG4 동형의 야생형 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 15).
S228P 및 L235E 돌연변이를 갖는 IgG4 동형의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 16).
S228P, L235E 및 P329G 돌연변이를 갖는 IgG4 동형의 변이체 인간 Fc-영역의 폴리펩티드 사슬은 하기 아미노산 서열을 갖는다:
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 17).
용어 "Fc 수용체", 약어 "FcR" 은 Fc-영역에 결합하는 수용체를 의미한다. 하나의 구현예에서 FcR 은 선천 서열 인간 FcR 이다. 더욱이, 하나의 구현예에서 FcR 은 IgG 항체에 결합하는 FcR (Fc 감마 수용체) 이고, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를, 대립유전자 변이체 및 대안적으로 그의 스플라이싱된 형태 (spliced form) 를 포함하여, 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해 수용체") 를 포함하고, 이들은 주로 그의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR 은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492, Capel, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34, de Haas, et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341 에서 리뷰되어 있다. 그 밖의 FcR 은 본원에서의 용어 "FcR" 에 포괄된다. 상기 용어는 또한 신생아 수용체, FcRn 을 포함하며, 이는 어머니 IgG 의 태아로의 전달을 책임진다 (예를 들어, Guyer, et al., J. Immunol. 117 (1976) 587; Kim, et al., J. Immunol. 24 (1994) 249 참고).
용어 "Fc 감마 수용체", 약어 "FcγR" 또는 "Fc감마R" 은 IgG 항체 Fc-영역에 결합하는 단백질의 패밀리의 임의의 일원을 의미하고, FcγR 유전자에 의해 인코딩된다. 인간에서 이러한 패밀리는 FcγRI (CD64), 예를 들어 동형 (isoform) FcγRIA, FcγRIB, 및 FcγRIC, FcγRII (CD32), 예를 들어 동형 FcγRIIA 예컨대 동종이인자형 H131 및 R131, FcγRIIB 예컨대 FcγRIIB-1 및 FcγRIIB-2, 및 FcγRIIC, 및 FcγRIII (CD16), 예를 들어 동형 FcγRIIIA 예컨대 동종이인자형 V158 및 F158; Swiss-Prot entry P08637; N-말단-MRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLVGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQ-C-말단; SEQ ID NO: 18 및 FcγRIIIB 예컨대 동종이인자형 FcγRIIB-NA1 및 FcγRIIB-NA2 (예를 들어, Jefferis, et al., Immunol. Lett. 82 (2002) 57-65 참고, 전문이 참조로 포함됨), 뿐만 아니라 FcγR 동형 또는 동종이인자형을 포함하나 그에 제한되지 않는다. FcγR 은, 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 및 원숭이를 포함하나 그에 제한되지 않는, 임의의 유기체에서 기원할 수 있다. 마우스 FcγR 은 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16), 및 FcγRIII-2 (CD16-2), 뿐만 아니라 FcγR 동형 또는 동종이인자형을 포함하나 그에 제한되지 않는다. Fc-영역-FcγR 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기는 234-239 (하부 힌지 영역), 265-269 (B/C 루프), 297-299 (D/E 루프), 및 327-332 (F/G) 루프이다 (Sondermann, et al., Nature 406 (2000) 267-273). FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, 및/또는 FcγRIIIA 에 대한 감소된 결합/친화도를 초래하는 아미노산 돌연변이는 N297A (부수적으로 감소된 면역원성 및 연장된 반감기 결합/친화도와 함께) (Routledge, et al., Transplantation 60 (1995) 847; Friend et al., Transplantation 68 (1999) 1632; Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (1995) 6591), 잔기 233-236 (Ward and Ghetie, Ther. Immunol. 2 (1995) 77; Armour et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613) 를 포함한다. 일부 예시적 아미노산 치환이 US 7,355,008 및 US 7,381,408 에 기재되어 있다.
용어 "신생아 Fc 수용체", 약어 "FcRn" 은 IgG 항체 Fc-영역에 결합하는 단백질을 의미하고, 적어도 부분적으로 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. FcRn 은 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 및 원숭이를 포함하나 그에 제한되지 않는 임의의 유기체에서 기원할 수 있다. 기술분야에서 알려져 있는 바와 같이, 기능적 FcRn 단백질은, 흔히 중쇄 및 경쇄로 언급되는, 2 개의 폴리펩티드를 포함한다. 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고, 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. 본원에서 다르게 언급되지 않으면, FcRn 또는 FcRn 단백질은 FcRn 중쇄와 베타-2-마이크로글로불린의 복합체를 언급한다. Fc-영역과 FcRn 의 상호작용 아미노산 잔기는 CH2 및 CH3 도메인의 연결지점 (junction) 근처에 있다. Fc-영역-FcRn 접촉 잔기는 모두 단일 IgG 중쇄 내에 있다. 관여하는 아미노산 잔기는 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311, 및 314 (모두 CH2 도메인 내) 및 아미노산 잔기 385-387, 428, 및 433-436 (모두 CH3 도메인 내) 이다. FcRn 에 대한 증가된 결합/친화도를 초래하는 아미노산 돌연변이는 T256A, T307A, E380A, 및 N434A 를 포함한다 (Shields et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591).
종에 걸쳐 보존되는 신생아 Fc 수용체의 아미노산 잔기는 Fc-영역 내의 위치 310 및 435 에서의 히스티딘 잔기이다. 이들 잔기는 Fc-영역 FcRn 상호작용의 pH 의존성의 원인이다 (예를 들어, Victor, G., et al., Nature Biotechnol. 15 (1997) 637-640); Dall'Acqua, W. F., et al. J. Immunol. 169 (2002) 5171-5180 참고). FcRn 와의 상호작용을 약화시키는 Fc-영역 돌연변이는 항체 반감기를 감소시킬 수 있다.
용어 "힌지 영역" 은 CH1 도메인 및 CH2 도메인을 연결하는 항체 중쇄 폴리펩티드의 부분, 예를 들어 Kabat 의 EU 번호 시스템에 따른 위치 216 근처에서부터 위치 230 근처까지를 의미한다. 힌지 영역은 보통 동일한 아미노산 서열을 갖는 2 개의 폴리펩티드로 이루어지는 이합체 분자이다. 힌지 영역은 일반적으로 약 25 아미노산 잔기를 포함하고, 유연하여 항원 결합 영역이 독립적으로 움직이는 것을 허용한다. 힌지 영역은 3 개의 도메인으로 하위분류될 수 있다: 상부, 중간, 및 하부 힌지 도메인 (Roux, et al., J. Immunol. 161 (1998) 4083).
용어 Fc-영역의 "하부 힌지 영역" 은 힌지 영역의 바로 C-말단에 있는 아미노산 잔기의 스트레치 (stretch), 즉, Kabat 의 EU 번호지정에 따른 Fc-영역의 잔기 233 내지 239 를 의미한다.
용어 "야생형 Fc-영역" 은 자연에서 발견되는 Fc-영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 의미한다. 야생형 인간 Fc-영역은 선천 인간 IgG1 Fc-영역 (비-A 및 A 동종이인자형), 선천 인간 IgG2 Fc-영역, 선천 인간 IgG3 Fc-영역, 및 선천 인간 IgG4 Fc-영역 뿐만 아니라 그의 자연 발생적 변이체를 포함한다.
용어 "약학적 조성물" 은 그안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이고, 제형이 투여될 대상에게 수용불가능할 정도로 독성인 부가적 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다.
"약학적으로 허용가능한 담체" 는 대상에게 비독성인, 활성 성분 이외의, 약학적 조성물 내의 성분을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나, 그에 제한되지 않는다.
용어 "폴리펩티드" 는 자연적으로 또는 합성적으로 생성되는, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 이루어지는 중합체를 의미한다. 약 20 개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩티드는 "펩티드" 로서 언급될 수 있는 한편, 100 개 초과의 아미노산 잔기의 하나의 폴리펩티드를 포함하거나 둘 이상의 폴리펩티드로 이루어지는 분자는 "단백질" 로서 언급될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 비-아미노산 성분, 예컨대 탄수화물 기, 금속 이온 또는 카르복시산 에스테르를 포함할 수 있다. 비-아미노산 성분은 폴리펩티드가 발현되는 세포에 의해 첨가될 수 있고, 세포의 유형에 따라 다를 수 있다. 폴리펩티드는 본원에서 그의 아미노산 백본 구조 또는 이를 인코딩하는 핵산의 면에서 정의된다. 탄수화물 기와 같은 부가물은 일반적으로 명시되지 않으나, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
용어 "아미노산 서열 태그 (tag)" 는 특이적 결합 특성을 갖는 펩티드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산 잔기의 서열을 나타낸다. 하나의 구현예에서 아미노산 서열 태그는 친화도 또는 정제 태그이다. 하나의 구현예에서 아미노산 서열 태그는 Arg-태그, His-태그, Avi-태그, His-Avi-태그, Flag-태그, 3xFlag-태그, Strep-태그, Nano-태그, SBP-태그, c-myc-태그, S-태그, 칼모둘린-결합-펩티드, 셀룰로스-결합-도메인, 키틴-결합-도메인, GST-태그, 및 MBP-태그 를 포함하는 군에서 선택된다. 하나의 구현예에서 아미노산 서열 태그는 SEQ ID NO: 19 (RRRRR), SEQ ID NO: 20 (RRRRRR), SEQ ID NO: 21 (Avi-태그), SEQ ID NO: 22 (His-Avi-태그), SEQ ID NO: 23 (HHHHHH), SEQ ID NO: 24 (KDHLIHNVHKEFHAHAHNK), SEQ ID NO: 25 (DYKDDDDK), SEQ ID NO: 26 (DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK), SEQ ID NO: 27 (AWRHPQFGG), SEQ ID NO: 28 (WSHPQFEK), SEQ ID NO: 29 (MDVEAWLGAR), SEQ ID NO: 30 (MDVEAWLGARVPLVET), SEQ ID NO: 31 (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP), SEQ ID NO: 32 (EQKLISEEDL), SEQ ID NO: 33 (KETAAAKFERQHMDS), SEQ ID NO: 34 (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL), SEQ ID NO: 35 (셀룰로스 결합 도메인), SEQ ID NO: 36 (셀룰로스 결합 도메인), SEQ ID NO: 37 (TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEP SNVPALWQLQ), SEQ ID NO: 38 (GST-태그), 및 SEQ ID NO: 39 (MBP-태그) 를 포함하는 군에서 선택된다.
용어 "효소 절단 자리" 는 프로테아제에 의해 특이적으로 절단될 수 있는 펩티드 결합을 통해 서로 연결된 아미노산 잔기의 서열을 나타낸다. 하나의 구현예에서 프로테아제는 IgA-프로테아제, 그란자임 B, Tev 프로테아제, 프레시션 프로테아제, 트롬빈, Faktor10a, Ides 프로테아제, 또는 엔테로키나제 이다.
용어 "IgA-프로테아제" 는 하기 서열 중 하나를 포함하는 인지 자리를 갖는 네이세리아 고노로에아에 (Neisseria gonorrhoeae) 에서 유래하는 프로테아제를 의미하고, 여기서 "↓" 는 절단된 결합의 위치를 나타낸다:
Pro-Ala-Pro ↓ Ser-Pro (SEQ ID NO: 40),
Pro-Pro ↓ Ser-Pro (SEQ ID NO: 41),
Pro-Pro ↓ Ala-Pro (SEQ ID NO: 42),
Pro-Pro ↓ Thr-Pro (SEQ ID NO: 43),
Pro-Pro ↓ Gly-Pro (SEQ ID NO: 44),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Thr-Pro (SEQ ID NO: 45),
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓ Ala-Pro (SEQ ID NO: 46),
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓ Ser-Pro (SEQ ID NO: 47),
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓ Thr-Pro (SEQ ID NO: 48),
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓ Gly-Pro (SEQ ID NO: 49),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Thr-Pro (SEQ ID NO: 50),
Ala-Pro-Pro-Ala ↓ Ala-Pro (SEQ ID NO: 51),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Ala-Pro (SEQ ID NO: 52),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Ser-Pro (SEQ ID NO: 53),
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Gly-Pro (SEQ ID NO: 54).
본 출원에서 사용되는 용어 "링커" 또는 "펩티드 링커" 는 자연 및/또는 합성 기원의 펩티드 링커를 의미한다. 그들은 20 개의 자연 발생적 아미노산이 단량체 빌딩 블록인 선형 아미노산 사슬로 이루어진다. 사슬은 1 내지 50 개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 28 개의 아미노산, 특히 바람직하게는 3 내지 25 개의 아미노산의 길이를 갖는다. 링커는 반복적 아미노산 서열 또는 자연 발생적 폴리펩티드의 서열, 예컨대 힌지-기능을 하는 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 링커는 펩티드가 정확히 폴딩되고 (fold) 적절히 제시되는 것을 허용함으로써 항-CD4 항체에 접합된 펩티드가 그것의 생물학적 활성을 확실히 수행할 수 있게 하는 기능을 한다. 바람직하게는 링커는 글라이신, 글루타민 및/또는 세린 잔기가 풍부하도록 지정된 "합성 펩티드 링커" 이다. 이들 잔기는 예를 들어 5 개 이하의 아미노산의 작은 반복 단위, 예컨대 GGGGS, QQQQG, 또는 SSSSG 로 배열된다. 이러한 작은 반복 단위는 2 내지 5 회 반복되어 다합체 단위를 형성할 수 있다. 다합체 단위의 아미노- 및/또는 카르복시-말단 끝에 6 개 이하의 부가적 임의적, 자연 발생적 아미노산이 부가될 수 있다. 기타 합성 펩티드 링커는 10 내지 20 회 반복되는 단일 아미노산으로 구성되고, 아미노- 및/또는 카르복시-말단 끝에 6 개 이하의 부가적 임의적, 자연 발생적 아미노산을 포함할 수 있다. 모든 펩티드 링커는 핵산 분자에 의해 인코딩될 수 있고, 그러므로 재조합적으로 발현될 수 있다.
본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드
융합된 Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않는 Fc-영역을 갖는 융합 폴리펩티드로서 Fc-수용체를 발현시킴으로써 가용성 Fc-수용체가 생산될 수 있다고 밝혀졌다.
용어 "Fc-수용체에 실질적으로 결합하지 않는" 은 Fc-수용체가 융합되어 있는 Fc-영역이 Fc-수용체에 응집물이 형성될 정도로 결합하지 않음을 의미한다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 하기 식 I 에 따른 융합 폴리펩티드이다:
R1-FC-R2 (식 I)
(식 중,
R1 은 제 1 Fc-수용체를 나타내고,
R2 는 제 2 Fc-수용체를 나타내고,
FC 는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 나타내고,
여기서 R1 또는 R2 또는 둘다가 존재하고,
여기서 FC 는 R1 및/또는 R2 에 실질적으로 결합하지 않음).
본원에서 보고되는 하나의 양상은 하기 식 II 에 따른 융합 폴리펩티드이다:
R1-CS1-L1-CS2-FC-CS3-L2-CS4-R2 (식 II)
(식 중,
R1 은 제 1 Fc-수용체를 나타내고,
R2 는 제 2 Fc-수용체를 나타내고,
FC 는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 나타내고,
CS1 은 제 1 절단 자리를 나타내고,
CS2 는 제 2 절단 자리를 나타내고,
CS3 은 제 3 절단 자리를 나타내고,
CS4 는 제 4 절단 자리를 나타내고,
L1 은 제 1 개재 아미노산 서열을 나타내고,
L2 는 제 2 개재 아미노산 서열을 나타내고,
여기서 R1 또는 R2 또는 둘다가 존재하고,
여기서 CS1, CS2, CS3, CS4 중 어느 것이든 서로 독립적으로 존재 또는 부재할 수 있고,
여기서 L1 및 L2 는 서로 독립적으로 존재 또는 부재할 수 있고,
여기서 FC 는 R1 및/또는 R2 에 실질적으로 결합하지 않음).
본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드에 함유된 Fc-수용체는 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 및 원숭이를 포함하나 그에 제한되지 않는 임의의 종으로부터의 임의의 Fc-수용체일 수 있다.
하나의 구현예에서 Fc-수용체는 Fc감마-수용체 및 신생아 Fc-수용체를 포함하는 군으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서 Fc-수용체는 인간 Fc감마-수용체, 인간 신생아 Fc-수용체, 쥐 Fc-수용체, 및 토끼 신생아 Fc-수용체이다.
하나의 구현예에서 인간 Fc감마-수용체는 인간 FcγRI (CD64), 인간 FcγRII (CD32), 인간 FcγRIIA, 인간 FcγRIIB, 인간 FcγRIIC, 인간 FcγRIII (CD16), 인간 FcγRIIIA, 및 인간 FcγRIIIB 로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 인간 신생아 Fc-수용체는 인간 FcRn 이다.
하나의 구현예에서 쥐 Fc-수용체는 쥐 FcγRI (CD64), 쥐 FcγRII (CD32), 쥐 FcγRIIB, 쥐 FcγRIII (CD16), 쥐 FcγRIII-2 (CD16-2), 및 쥐 FcγRIV 로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 FC 는 인간 IgG 중쇄 폴리펩티드, 쥐 IgG 중쇄 폴리펩티드, 토끼 IgG 중쇄 폴리펩티드의 군으로부터 선택되는 중쇄 폴리펩티드의 변이체이다.
하나의 구현예에서 FC 는 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG2 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG3 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드, 쥐 IgG1 중쇄 폴리펩티드, 쥐 IgG2 중쇄 폴리펩티드, 쥐 IgG2a 중쇄 폴리펩티드, 쥐 IgG3 중쇄 폴리펩티드, 토끼 IgG 중쇄 폴리펩티드의 군으로부터 선택되는 중쇄 폴리펩티드의 변이체이다.
본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드에 포함된 Fc-영역은 그에 융합된 Fc-수용체(들) 중 어느 것에도 실질적으로 결합하지 않을 것이다.
하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 효과기 기능을 실질적으로 보유하지 않으며, 이는 그 융합 폴리펩티드를 특정 효과기 기능이 불필요하거나 유해한 응용물에 대해 바람직한 후보로 만든다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행되어 효과기 기능의 감소/결핍을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc-수용체 (FcR) 결합 검정이 수행되어 융합 폴리펩티드가 FcγR 결합을 결여 (따라서 아마도 ADCC 활성을 결여) 하는 것을 확인할 수 있다. ADCC 를 매개하기 위한 일차 세포, NK 세포는 FcγRIII 만 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현이 Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492 의 페이지 464 에서 표 3 에 요약되어 있다. 관심의 분자의 ADCC 활성을 평가하는 시험관내 검정의 비제한적 예가 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어 Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; 및 Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502 참고); 미국 특허 번호 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 참고) 에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (예를 들어, 유세포분석을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및 CytoTox 96® 비-방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI) 참고). 그러한 검정에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 관심의 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656 에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. FcRn 결합 및 생체내 청소/반감기 확인이 또한 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769 참고).
Fc-영역의 그것의 리간드에 대한 친화도 및 결합 특성은 평형 방법 (예를 들어 효소-결합 면역 흡착 검정 (ELISA) 또는 방사성면역검정 (RIA)), 또는 반응속도 (예를 들어 BIACORE® 분석), 및 기타 방법 예컨대 간접 결합 검정, 경쟁적 저해 검정, 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 겔 전기영동 및 크로마토그래피 (예를 들어, 겔 여과) 를 포함하나 그에 제한되지 않는, Fc-영역/FcR 상호작용, 즉, FcγR 에 대한 Fc-영역의 특이적 결합을 확인하기 위한 당업계에 알려진 여러 가지 시험관내 검정 방법 (생화학 또는 면역학 기반 검정) 에 의해 확인될 수 있다. 이들 및 기타 방법은 조사되는 하나 이상의 성분 상의 라벨을 이용하고/거나 발색, 형광, 발광, 또는 동위원소 라벨을 포함하나 그에 제한되지 않는 여러 가지 탐지 방법을 이용할 수 있다. 결합 친화도 및 반응속도의 상세한 설명이 Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999) 에 기재되어 있다.
하나의 구현예에서 FC 는 Fcγ 수용체 (예를 들어 FcγRIIIa) 결합이 일어나지 않도록 수식된, 서브클래스 IgG4 의 인간 기원의 Fc-영역 또는 서브클래스 IgG1, IgG2, 또는 IgG3 의 인간 기원의 Fc-영역이다. 하나의 구현예에서 FC 는, 특히 인간 IgG4 서브클래스로부터의, 인간 기원의 Fc-영역, 또는 인간 IgG1 서브클래스로부터의 돌연변이된 Fc-영역이다. 하나의 구현예에서 FC 는 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 인간 IgG1 서브클래스에 속한다. 하나의 구현예에서 FC 는 돌연변이 S228P 를 갖는 인간 IgG4 서브클래스에 속한다. IgG4 는 감소된 Fcγ 수용체 (FcγRIIIa) 결합을 보이지만, 다른 IgG 서브클래스의 항체는 강한 결합을 보인다. 그러나 Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 탄수화물의 소실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, 또는/및 His435 는, 변경되는 경우, 또한 감소된 Fcγ 수용체 결합을 제공하는 잔기이다 (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434). 하나의 구현예에서 FC 는 Fcγ 수용체 결합에 관하여 IgG4 서브클래스, 또는 IgG1 또는 IgG2 서브클래스에 속하고, L234, L235, 및/또는 D265 에서 돌연변이를 갖고/거나, 및/또는 PVA236 돌연변이를 함유한다. 하나의 구현예에서 FC 는 돌연변이 S228P, L234A, L235A, L235E, 및/또는 PVA236 (PVA236 은 IgG1 의 아미노산 위치 233 에서 236 까지의 아미노산 서열 ELLG (한 글자 아미노산 코드로 제시됨) 또는 IgG4 의 EFLG 이 PVA 로 대체되어 있음을 의미함) 중 하나 이상을 포함한다. 하나의 구현예에서 돌연변이는 IgG4 의 경우 S228P 이고, 및 IgG1 의 경우 L234A 및 L235A 이다.
Fc-영역 결합 자리는 당업계에 알려져 있고 예를 들어 Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434 에 기재되어 있다. Fc-영역 결합 자리는, 예를 들어, 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, 및 P329 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 번호지정) 을 특징으로 한다.
감소된 효과기 기능을 갖는 Fc-영역은 Fc-영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 그러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 둘 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함하며, 예를 들어 잔기 265 의 치환을 갖는 소위 "DA" Fc 돌연변이체 및 잔기 265 및 297 의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR 에 대한 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 특정 Fc-영역 변이체가 기재되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 참고).
일부 구현예에서, 예를 들어, US 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184 에 기재된 바와 같이, Fc-영역에 변경이 도입되어 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC) 이 초래된다.
또한 Fc 영역 변이체의 다른 예에 대해 Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; 및 WO 94/29351 을 참고한다.
하나의 구현예에서 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 위치 234, 235, 236, 237, 238, 239, 253, 254, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 288, 297, 298, 299, 307, 311, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 434, 및 435 중 하나 이상에서 아미노산 돌연변이를 갖는다. 하나의 구현예에서 Fc-수용체 중 하나 이상은 Fc 감마 수용체이다.
하나의 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 233, 234, 235, 236, 265, 297, 329, 및 331 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 E233P, L234A, L235A, L235E, DG236, D265A, N297A, N297D, P329A, P329G, 및 P331S 중 하나 이상을 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 L234A 및 L235A 및 E233P, L235E, DG236, D265A, N297A, N297D, P329A, P329G, 및 P331S 중 하나 이상을 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 돌연변이 L234A 및 L235A 및 P329A 또는 P329G 를 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 IgG2 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 233, 234, 235, 236, 265, 및 329 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 228, 235, 265, 및 329 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드는 돌연변이 S228P, L235E, P329A, 및 P329G 중 하나 이상을 갖는다.
하나의 구현예에서 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드는 돌연변이 S228P 및 L235E 및 P329A 또는 P329G 를 갖는다.
하나의 구현예에서 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드는 위치 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 272, 285, 288, 290, 291, 308, 309, 310, 311, 314, 385, 386, 387, 428, 433, 434, 435, 및 436 중 하나 이상에서 아미노산 돌연변이를 갖는다. 하나의 구현예에서 Fc-수용체 중 하나 이상은 FcRn 이다.
하나의 구현예에서 인간 IgG 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439, 및/또는 447 중 하나 이상에서 돌연변이를 갖는다.
하나의 구현예에서 FcRn 에 대한 감소된 결합을 갖는 인간 IgG 중쇄 폴리펩티드는 아미노산 위치 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439, 및/또는 447 에서 하나 이상의 아미노산 변경을 갖는다.
융합 폴리펩티드는 Fc-수용체와 Fc-영역 사이에 링커 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 링커 폴리펩티드를 사용하여 Fc-수용체와 Fc-영역 사이의 거리를 조정하여 2 개의 영역이 의도하는 방식으로 기능하게 할 수 있다.
하나의 구현예에서 링커 폴리펩티드는 (G3S)3, (G3S)4, (G3S)5, (G3S)6, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5, (G5S)2, (G5S)3, 및 (G5S)4 및 그들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
부가적으로, 융합 폴리펩티드는 Fc-수용체와 Fc-영역 사이에, 예를 들어 친화도 정제 또는 고정에 적합한, 태그를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서 태그는 Arg-태그, Avi-태그, His-Avi-태그, His-태그, Flag-태그, 3xFlag-태그, Strep-태그, Nano-태그, SBP-태그, c-myc-태그, S-태그, 칼모둘린-결합-펩티드, 셀룰로스-결합-도메인, 키틴-결합-도메인, GST-태그, MBP-태그, 스트렙타비딘 또는 아비딘, 비오틴, 렉틴, 다당류, 스테로이드, 스테로이드 결합 단백질, 호르몬, 및 호르몬 수용체를 포함하는 군으로부터 선택된다.
링커 폴리펩티드 및 태그는 Fc-수용체와 Fc-영역 사이에 위치하는 개재 아미노산 서열 내에 조합될 수 있다.
하나의 구현예에서 개재 아미노산 서열은 (G3S)3, (G3S)4, (G3S)5, (G3S)6, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5, (G5S)2, (G5S)3, 및 (G5S)4 를 포함하는 제 1 군으로부터, 또는 Arg-태그, Avi-태그, His-Avi-태그, His-태그, Flag-태그, 3xFlag-태그, Strep-태그, Nano-태그, SBP-태그, c-myc-태그, S-태그, 칼모둘린-결합-펩티드, 셀룰로스-결합-도메인, 키틴-결합-도메인, GST-태그, 또는 MBP-태그 를 포함하는 제 2 군으로부터, 또는 이들 군의 2 가지 요소의 조합으로부터 선택된다.
개재 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드 내의 절단 자리 앞에 또는 뒤에 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서 절단 자리는 효소 절단 자리이다. 하나의 구현예에서 효소 절단 자리는 IgA-프로테아제 프로테아제 절단 자리, 그란자임 B 프로테아제 절단 자리, Tev 프로테아제 절단 자리, 프레시션 프로테아제 절단 자리, 트롬빈 절단 자리, Faktor10a 프로테아제 자리, Ides 프로테아제 절단 자리, SUMO 프로테아제 절단 자리 및 엔테로키나제 절단 자리를 포함하는 군으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서 절단 자리는 IgA 프로테아제 절단 자리, 프레시션 프로테아제 절단 자리, 그란자임 B 절단 자리, 및 Ides 프로테아제 절단 자리의 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 프로테아제 파파인, 또는 프로테아제 펩신, 또는 Ides 프로테아제의 고유의 절단 자리를 포함한다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 본원에서 보고되는 2 개의 융합 폴리펩티드를 포함하는 이합체성 융합 폴리펩티드이다.
본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드는 면역글로불린 힌지 영역을 포함하는 Fc-영역을 포함하므로, 이합체성 융합 폴리펩티드는 제 1 융합 폴리펩티드와 제 2 융합 폴리펩티드를 공유적으로 연결하는 하나 이상의 다이설파이드 가교를 포함한다.
이합체성 융합 폴리펩티드는 동종이합체성 융합 폴리펩티드 또는 이종이합체성 융합 폴리펩티드일 수 있다.
부가적으로 이합체성 융합 폴리펩티드는 하기 식 I 또는 식 II 에 따른 제 1 융합 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 여기서 이합체성 융합 폴리펩티드의 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드는 서로 독립적으로 식 I 및 식 II 로부터 선택될 수 있다:
R1-FC-R2 (식 I)
(식 중,
R1 은 제 1 Fc-수용체를 나타내고,
R2 는 제 2 Fc-수용체를 나타내고,
FC 는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 나타내고,
여기서 R1 또는 R2 또는 둘다가 존재하고,
여기서 FC 는 R1 및/또는 R2 에 실질적으로 결합하지 않음),
R1-CS1-L1-CS2-FC-CS3-L2-CS4-R2 (식 II)
(식 중,
R1 은 제 1 Fc-수용체를 나타내고,
R2 는 제 2 Fc-수용체를 나타내고,
FC 는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 나타내고,
CS1 은 제 1 절단 자리를 나타내고,
CS2 는 제 2 절단 자리를 나타내고,
CS3 은 제 3 절단 자리를 나타내고,
CS4 는 제 4 절단 자리를 나타내고,
L1 은 제 1 개재 아미노산 서열을 나타내고,
L2 는 제 2 개재 아미노산 서열을 나타내고,
여기서 R1 또는 R2 또는 둘다가 존재하고,
여기서 CS1, CS2, CS3, CS4 중 어느 것이든 서로 독립적으로 존재 또는 부재할 수 있고,
여기서 L1 및 L2 는 서로 독립적으로 존재 또는 부재할 수 있고,
여기서 FC 는 R1 및/또는 R2 에 실질적으로 결합하지 않음).
이합체성 융합 폴리펩티드가 2 가지 상이한 융합 폴리펩티드를 포함할 수 있는 경우, 이종이합체화를 보장하는 메카니즘이 사용되어야 한다.
하나의 구현예에서 제 1 FC 는 돌연변이 T366W 및 임의로 돌연변이 S354C 를 포함하고, 제 2 FC 는 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 및 임의로 돌연변이 Y349C 를 포함한다.
하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 하기를 특징으로 한다:
a) 제 1 및 제 2 폴리펩티드의 R1 및 R2 는 동일하고,
b) 제 1 융합 폴리펩티드의 R1 및 R2 는 동일하고, 제 2 융합 폴리펩티드의 R1 및 R2 는 동일하나 제 1 융합 폴리펩티드의 R1 및 R2 와 상이하고,
c) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R1 은 동일하고, 제 1 및 제 2 폴리펩티드의 R2 는 동일하나 R1 과 상이하고,
d) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R1 은 동일하고 R2 는 둘다 부재하고,
e) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R1 은 상이하고 R2 는 둘다 부재하고,
f) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R2 는 동일하고 R1 은 둘다 부재하고,
g) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R2 는 상이하고 R1 은 둘다 부재하고,
h) 제 1 융합 폴리펩티드의 R1 및 제 2 폴리펩티드의 R2 는 상이하고, 제 1 융합 폴리펩티드의 R2 는 부재하고 제 2 폴리펩티드의 R1 은 부재함.
본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드의 응용
본원에서 보고되는 하나의 양상은 친화도 크로마토그래피 리간드로서의 본원에서 보고되는 고정 융합 폴리펩티드의 용도이다.
하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 고체 상에 결합된다. 하나의 구현예에서 고체 상은 크로마토그래피 재료이다. 하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 비오티닐화되고, 고체 상은 스트렙타비딘으로 유도체화된다.
하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 Fc-수용체와 Fc-영역 사이에 절단 자리를 포함한다. 하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 비오티닐화 전에 절단된다.
하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 Fc-수용체와 절단 자리 사이에 고정 태그를 포함한다. 하나의 구현예에서 고정 태그는 His-Avi-태그이다.
매트릭스 결합된 크로마토그래피 기능기가 본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 매트릭스 및 매트릭스 결합된 크로마토그래피 기능기를 포함하는 친화도 크로마토그래피 칼럼이 또한 보고된다.
하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 Fc-수용체와 Fc-영역 사이에 절단 자리를 포함한다. 하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 비오티닐화 전에 절단된다.
하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 Fc-수용체와 절단 자리 사이에 고정 태그를 포함한다. 하나의 구현예에서 고정 태그는 Avi-태그이다.
본원에서 보고되는 하나의 양상은 항체의 Fc-수용체 결합을 확인하기 위한 본원에서 보고되는 고정 융합 폴리펩티드의 용도이다.
하나의 구현예에서 항체는 낮은 친화도 항체이다.
하나의 구현예에서 확인은 표면 플라스몬 공명에 의한다. 하나의 구현예에서 항체는 단량체성 Fc-수용체에 의해 포획된다. 하나의 구현예에서 항체는 이합체성 항체에 의해 포획된다.
재조합 방법
본원에서 보고되는 하나의 양상은 하기 단계를 포함하는 가용성 Fc-수용체의 생산 방법이다:
a) 본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,
b) 세포 또는 배양 배지로부터 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계,
c) 임의로 융합 폴리펩티드를 프로테아제로 절단하고,
그에 의해 가용성 Fc-수용체를 생산하는 단계.
본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 당업자에게 알려진 방법 및 기술이 예를 들어 Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I to III (1997), Wiley and Sons; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold　Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) 에 기재되어 있다.
본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 재조합 발현 후에 융합 폴리펩티드는 당업자에게 알려진 방법에 의해 정제될 수 있다. 이들 방법은 잘 확립되어 있고, 면역글로불린 정제에 널리 사용되고, 단독으로 또는 조합으로 이용된다. 그러한 방법은, 예를 들어, 미생물-유래 단백질을 사용하는 친화도 크로마토그래피 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화도 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 (카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합-방식 교환 크로마토그래피), 친황성 흡착 (예를 들어 베타-메르캅토에탄올 및 기타 SH 리간드를 이용함), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어 페닐-세파로스, 아자-아레노필릭 (arenophilic) 수지, 또는 m-아미노페닐보론산을 이용함), 금속 킬레이트 친화도 크로마토그래피 (예를 들어 Ni(II)- 및 Cu(II)-친화도 재료를 이용함), 크기 배제 크로마토그래피, 및 분취용 전기영동 방법 (예컨대 겔 전기영동, 모세관 전기영동) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) 이다. 크로마토그래피 정제 전에 또는 크로마토그래피 정제 후에 융합 폴리펩티드는 효소로 절단되어 Fc-수용체를 해리시킬 수 있다. 발현 카세트는 프로모터, 분비 신호 서열을 인코딩하는 DNA 분절, 구조 유전자, 및 종료자/폴리아데닐화 신호를 포함한다. 상기 요소들은 모든 필요한 상이한 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 하나의 플라스미드에, 또는 하나의 융합 폴리펩티드를 각각 인코딩하는 둘 이상의 플라스미드에 작동적으로 연결된 형태로 조립된다. 구조 유전자의 발현을 위해, 플라스미드(들)은 적합한 숙주 세포 내로 도입된다. 단백질은 포유류 세포 예컨대 CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, HEK 세포, K562 세포, BHK 세포, PER.C6® 세포 등에서 생산된다. 하나의 구현예에서 융합 폴리펩티드는 CHO 세포, 또는 BHK 세포, 또는 HEK 세포에서 발현된다. 플라스미드의 조절 요소는 선택된 숙주 세포에서 기능적이도록 선택되어야 한다. 발현된 융합 폴리펩티드는 기능적으로 조립된다.
"발현 플라스미드" 는 숙주 세포에 포함된 구조 유전자(들)의 발현에 필요한 모든 요소들을 제공하는 핵산이다. 전형적으로, 발현 플라스미드는 원핵생물 플라스미드 증식 단위, 예를 들어 대장균의 경우, 복제 원점, 및 선택 마커, 진핵생물 선택 마커, 및 프로모터, 구조 유전자 및 전사 종료자 예컨대 폴리아데닐화 신호를 각각 포함하는 관심의 구조 유전자(들)의 발현을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 포함한다. 유전자 발현은 보통 프로모터의 제어 하에 놓이고, 그러한 구조 유전자는 프로모터에 "작동가능하게 연결되어 있다" 고 언급된다. 유사하게, 조절 요소가 코어 프로모터의 활성을 조정하는 경우에, 조절 요소 및 코어 프로모터는 작동가능하게 연결되어 있다.
항체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 에 기재된 바와 같이, 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 융합 폴리펩티드 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 하나의 구현예에서, 그러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어 발현 벡터) 가 제공된다. 추가의 구현예에서, 그러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 하나의 구현예에서, 숙주 세포는: (1) 제 1 융합 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열 및 제 2 융합 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 제 1 융합 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 제 2 융합 폴리펩티드를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다(예를 들어, 그것으로 형질전환된다). 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 진핵세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프양 세포 (예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포) 이다. 하나의 구현예에서, 융합 폴리펩티드의 제조 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 상기 제공된 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 융합 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지) 로부터 융합 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
본원에 보고되는 융합 폴리펩티드의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 위에 기재된 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 단리되고, 숙주 세포에서의 후속 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 그러한 핵산은 종래의 절차를 사용하여 (예를 들어, 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다.
융합 폴리펩티드-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않을 때, 융합 폴리펩티드는 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 분절 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들어, US　5,648,237, US　5,789,199 및 US　5,840,523 을 참고한다 (또한 Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254 (대장균에서의 항체 분절의 발현을 기재함) 참고). 발현 후에, 융합 폴리펩티드는 박테리아 세포 페이스트로부터 가용성 분획 중에 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물 예컨대 사상 진균 또는 효모가 융합 폴리펩티드-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 글리코실화 경로가 "인간화" 되어, 일부 또는 전부 인간 글리코실화 패턴을 갖는 융합 폴리펩티드의 생산을 초래하는 진균 및 효모 균주를 포함한다 (Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215 참고).
글리코실화된 융합 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포성 유기체 (무척추동물 및 척추동물) 에서 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 특히 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 트랜스펙션을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 수많은 바큐로바이러스 균주가 식별되었다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 이용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체의 생산을 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 기재함) 참고).
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장하도록 적응된 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7); 인간 배아 신장 라인 (예를 들어, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74 에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252 에서 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부암 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); TRI 세포 (예를 들어 Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68 에서 기재된 바와 같음); MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 기타 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0 를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 리뷰에 대해, 예를 들어, Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268 을 참고한다.
진단 및 탐지를 위한 방법 및 조성물
특정 구현예에서, 본원에서 제공되는 임의의 융합 폴리펩티드는 생물학적 샘플 중 Fc-영역 함유 분자의 존재를 탐지하는데 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "탐지" 는 정량적 또는 정성적 탐지를 망라한다.
하나의 구현예에서, 진단 또는 탐지 방법에서 사용하기 위한 본원에 보고되는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 추가의 양상에서, 생물학적 샘플 중 Fc-영역 함유 분자의 존재의 탐지 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 Fc-영역 함유 분자에 대한 융합 폴리펩티드의 결합을 허용하는 조건 하에 생물학적 샘플을 본원에 보고되는 융합 폴리펩티드와 접촉시키고, 융합 폴리펩티드와 Fc-영역 함유 분자 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 탐지하는 것을 포함한다. 그러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다.
특정 구현예에서, 라벨링된 융합 폴리펩티드가 제공된다. 라벨은 직접 탐지되는 라벨 또는 모이어티 (moiety) (예컨대 형광, 발색, 전자-밀집, 화학발광, 및 방사성 라벨), 뿐만 아니라 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접 탐지되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나 그에 제한되지 않는다. 예시적 라벨은 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그것의 유도체, 로다민 및 그것의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시퍼라제, 예를 들어 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 호오스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 당류 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 헤테로시클릭 옥시다제 예컨대 우리카제 및 잔틴 옥시다제 (과산화수소를 이용하는 효소와 커플링되어 HRP 와 같은 염료 전구체를 산화시킴), 락토퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 라벨, 박테리오파지 라벨, 안정적 자유 라디칼 등을 포함하나 그에 제한되지 않는다.
약학적 조성물
본원에 보고되는 융합 폴리펩티드의 약학적 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 상기 융합 폴리펩티드를 하나 이상의 임의적 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)), 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 이용되는 투여량 및 농도에서 수령자에게 비독성이고, 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 산화방지제 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리(비닐피롤리돈); 아미노산 예컨대 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당류 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함하나 그에 제한되지 않는다. 본원에서 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 사이질성 (interstitial) 약물 분산제 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.) 를 추가로 포함한다. 특정 예시적 sHASEGP 및 사용 방법 (rhuPH20 을 포함함) 이 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968 에 기재되어 있다. 하나의 양상에서, sHASEGP 는 하나 이상의 부가적 글리코사미노글리카나제 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형이 미국 특허 번호 6,267,958 에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO 2006/044908 에 기재된 것들을 포함하고, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료되는 특정 증상에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 그러한 활성 성분들은 적합하게는 의도되는 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다.
활성 성분은, 예를 들어, 코아세르베이션 (coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에 포함될 수 있다. 그러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980) 에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 융합 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균성은, 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 보고되는 임의의 융합 폴리펩티드는 치료 방법에서 사용될 수 있다.
하나의 양상에서, 약제로서 사용하기 위한 융합 폴리펩티드가 제공된다. 추가의 양상에서, 상승된 항체 수준을 특징으로 하는 질환의 치료에 사용하기 위한 융합 폴리펩티드가 제공된다. 하나의 구현예에서 질환은 자가면역 질환이다. 특정 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 융합 폴리펩티드가 제공된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 융합 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 상승된 항체 수준을 특징으로 하는 질환을 갖는 개체의 치료 방법에 사용하기 위한융합 폴리펩티드를 제공한다. 하나의 그러한 구현예에서, 본 발명의 방법은 개체에게 유효량의 하나 이상의 부가적 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 항체 수준을 저하시키는데 사용하기 위한 융합 폴리펩티드를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 융합 폴리펩티드를 투여하여 항체 수준을 저하시키는 것을 포함하는 개체에서 항체 수준을 저하시키는 방법에서 사용하기 위한 융합 폴리펩티드를 제공한다. 임의의 상기 구현예에 따른 "개체" 는 바람직하게는 인간이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 약제의 생산 또는 제조에 있어서의 융합 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 하나의 구현예에서, 약제는 상승된 항체 수준을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서 질환은 자가면역 질환이다. 추가의 구현예에서, 약제는 상승된 항체 수준을 특징으로 하는 질환을 갖는 개체에게 유효량의 약제를 투여하는 것을 포함하는 상승된 항체 수준의 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 그러한 구현예에서, 본 발명의 방법은 개체에게 유효량의 하나 이상의 부가적 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 약제는 항체 수준을 저하시키기 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 약제는 개체에게 유효량의 약제를 투여하여 항체 수준을 저하시키는 것을 포함하는 개체에서 항체 수준을 저하시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 구현예에 따른 "개체" 는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 상승된 항체 수준을 특징으로 하는 질환의 치료 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서 질환은 자가면역 질환이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 상승된 항체 수준을 특징으로 하는 질환을 갖는 개체에게 유효량의 융합 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다. 하나의 그러한 구현예에서, 본 발명의 방법은 개체에게 유효량의 하나 이상의 부가적 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의의 상기 구현예에 따른 "개체" 는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 개체에서 항체 수준을 저하시키는 방법을 제공한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 개체에게 유효량의 융합 폴리펩티드를 투여하여 항체 수준을 저하시키는 것을 포함한다. 하나의 구현예에서, "개체" 는 인간이다.
추가의 양상에서, 본 발명은, 예를 들어, 임의의 상기 치료 방법에서 사용하기 위한 임의의 본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 하나의 구현예에서, 약학적 조성물은 임의의 본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또다른 구현예에서, 약학적 조성물은 임의의 본원에서 보고되는 융합 폴리펩티드 및 하나 이상의 부가적 치료제를 포함한다.
본 발명의 융합 폴리펩티드는 치료요법에서 단독으로 또는 기타 작용제와 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 부가적 치료제와 동시-투여될 수 있다.
위에 언급된 그러한 조합 치료요법은 조합된 투여 (둘 이상의 치료제가 동일한 또는 별도의 제형에 포함됨), 및 별도의 투여 (이 경우 본 발명의 융합 폴리펩티드의 투여는 부가적 치료제 및/또는 아주반트 전에, 그와 동시에, 및/또는 후에 실시될 수 있음) 를 망라한다.
본 발명의 융합 폴리펩티드 (및 임의의 부가적 치료제) 는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 비경구, 폐내, 및 비강내, 및 국부 치료에 필요한 경우, 병변내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 부분적으로 투여가 단기 또는 장기인지 여부에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주입, 예컨대 정맥내 또는 피하 주입에 의해 실시될 수 있다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스 (bolus) 투여, 및 펄스 주입을 포함하나 그에 제한되지 않는 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 융합 폴리펩티드는 합법적 의료 행위 (good medical practice) 와 일치하는 방식으로 제형화, 투약, 및 투여될 수 있다. 이러한 맥락에서 고려되는 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 자리, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의사에게 알려진 기타 인자들을 포함한다. 융합 폴리펩티드는 문제의 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형화될 필요는 없으나, 그와 함께 임의로 제형화된다. 그러한 기타 작용제의 유효량은 제형에 존재하는 융합 폴리펩티드의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 위에 논의된 기타 인자들에 좌우된다. 이들은 일반적으로 동일한 투여량으로, 본원에 기재된 투여 경로에 의해, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99% 로, 또는 경험적으로/임상적으로 적절하다고 결정되는 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 융합 폴리펩티드의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 기타 부가적 치료제와 조합으로 사용될 때) 은 치료되는 질환의 유형, 융합 폴리펩티드의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 융합 폴리펩티드가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료요법, 환자의 임상 이력 및 융합 폴리펩티드에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 좌우될 것이다. 융합 폴리펩티드는 적합하게는 환자에게 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어 0.5 mg/kg　-　10　mg/kg) 의 융합 폴리펩티드가 예를 들어 하나 이상의 별도의 투여에 의해, 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적 1 일 투여량은 위에 언급한 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 수 있다. 상태에 따라, 수일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여 동안, 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 수 있다. 융합 폴리펩티드의 하나의 예시적 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10　mg/kg 일 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10　mg/kg (또는 그들의 임의의 조합) 의 하나 이상의 투여량이 환자에게 투여될 수 있다. 그러한 투여량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3 주마다 (예를 들어 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어 약 6 회 투여량의 융합 폴리펩티드를 수령하도록) 투여될 수 있다. 초기의 더 높은 로딩 투여량, 그에 뒤이어 하나 이상의 더 낮은 투여량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여 섭생법이 유용할 수 있다. 이러한 치료요법의 진행은 종래의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 융합 폴리펩티드 대신 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 실시될 수 있다고 이해된다.
제조 물품
본 발명의 또다른 양상에서, 위에 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 재료를 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 이와 연관된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기는 조성물 단독 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또다른 조성물과 조합된 조성물을 함유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 중 하나 이상의 활성제는 본 발명의 융합 폴리펩티드이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 상태의 치료에 사용됨을 나타낸다. 더욱이, 제조 물품은 (a) 조성물을 함유하는 제 1 용기 (여기서 상기 조성물은 본 발명의 융합 폴리펩티드를 포함함); 및 (b) 조성물을 함유하는 제 2 용기 (여기서 상기 조성물은 추가의 세포독성 또는 그렇지 않으면 치료제를 포함함) 를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 구현예의 제조 물품은 조성물이 특정 상태를 치료하는데 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대 세균발육저지 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제 2 (또는 제 3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제조 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 필터, 주사바늘, 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조 물품은 융합 폴리펩티드 대신 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있다고 이해된다.
하기 실시예, 도면 및 서열은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구항에 제시되어 있다. 본 발명의 취지에서 벗어나지 않으면서 제시된 절차에 변경이 가해질 수 있다고 이해된다.
실시예
실시예 1
발현 플라스미드의 생성
a) Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드에 대한 발현 플라스미드의 생성
Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드 인코딩 유전자를, i) 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열 (MGWSCIILFLVATATGVHS: SEQ ID NO: 55), ii) 아미노산 잔기 2-193 (즉, 출발 메티오닌을 배제함) 로부터의 인간 Fc 감마 수용체 IIIa V158 및 iii) 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 를 갖는 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변 영역 (힌지-CH2-CH3) 을 코딩하는 화학적으로 합성된 DNA 절편을 융합시켜 조립했다.
HEK293 세포에서의 Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드 발현 카세트 외에도 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 원점, 및 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함했다. 상세하게는, Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드 인코딩 유전자의 전사 단위는 하기 기능적 요소들을 포함한다:
- 인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 조기발현 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 영역 (5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 야생형 인간 Fc 감마 수용체 III V158 단백질의 아미노산 위치 2-193 으로부터의 가용성 인간 Fc 감마 수용체 III V158 폴리펩티드,
- 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변 영역 (힌지-CH2-CH3, LALA P329G), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH 폴리 A 신호 서열).
성숙 Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00001
(SEQ ID NO: 56).
하기 융합 폴리펩티드가 유사하게 수득될 수 있다:
- Fc감마RIIa-LR(H131)-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드:
Figure pct00002
(SEQ ID NO: 57).
- Fc감마RIIb-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드:
Figure pct00003
(SEQ ID NO: 58).
- Fc감마RIIIb-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드:
Figure pct00004
(SEQ ID NO: 59).
- 최소 Fc감마RIIIa-Avi-Fc LALA p239G 융합 폴리펩티드 (프로테아제 절단 자리를 포함하지 않음):
Figure pct00005
(SEQ ID NO: 60).
c) 이합체 Fc-수용체 융합 폴리펩티드에 대한 "놉-인투-홀 (knob-into-hole)" 발현 플라스미드의 생성
HEK293 세포에서의 Fc-수용체 Fc-영역 융합 폴리펩티드 (홀) 의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 상기 항목 a) 에 기재된 발현 벡터로부터 유도했다. 그것은 그로부터 인간 감마-1 중쇄 불변 영역 내에 홀 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C 를 갖는 Fc-영역을 코딩하는 DNA 서열로 분화되었다.
HEK293 세포에서의 Fc-수용체 Fc-영역 융합 폴리펩티드 (놉) 의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 상기 항목 a) 에 기재된 발현 벡터로부터 유도했다. 그것은 그로부터 인간 감마-1 중쇄 불변 영역 내에 놉 돌연변이 T366W 및 S354C 를 갖는 Fc-영역을 코딩하는 DNA 서열로 분화되었다.
HEK293 에서의 Fc-수용체 Fc-영역 융합 폴리펩티드 (놉/홀) 의 일시적 발현을 위한 발현 플라스미드는 융합 폴리펩티드 (놉/홀) 발현 카세트 외에도 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 원점, 및 대장균에서 암피실린 저항성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 포함했다. 상세하게는, 융합 폴리펩티드 (놉/홀) 인코딩 유전자의 전사 단위는 하기 기능적 요소들을 포함한다:
- 인트론 A 를 포함하는 인간 사이토메갈로바이러스 (P-CMV) 로부터의 조기발현 인핸서 및 프로모터,
- 인간 중쇄 면역글로불린 5'-미번역 영역 (5'UTR),
- 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 인간 감마-1 중쇄 불변 영역 내에 홀 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 및 Y349C 또는 놉 돌연변이 T366W 및 S354C 를 갖는 인간 Fc-감마-1-중쇄 불변 영역 (힌지-CH2-CH3), 및
- 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 (BGH 폴리 A 신호 서열).
실시예 2
Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드의 일시적 발현, 정제 및 분석적 특성분석
융합 폴리펩티드를 F17 배지 (Invitrogen Corp.) 에서 배양된 HEK293 세포 (인간 배아 신장 세포주 293-유래) 의 일시적 트랜스펙션에 의해 수득했다. 트랜스펙션을 위해 "293-Free" 트랜스펙션 시약 (Novagen) 을 사용했다. 놉-인투-홀 융합 폴리펩티드 쌍을 트랜스펙션시 등몰 플라스미드 비율을 사용하여 2 개의 상이한 플라스미드로부터 발현시켰다. 트랜스펙션을 제조사의 지침에 명시된 바와 같이 수행했다. 융합 폴리펩티드-함유 세포 배양물 상청액을 트랜스펙션 후 7 일에 수확했다. 상청액을 정제 전까지 감소된 온도에서 저장했다.
예를 들어 HEK293 세포에서의 인간 면역글로불린의 재조합 발현에 대한 일반 정보는 Meissner, P., et al., Biotechnol.　Bioeng. 75 (2001) 197-203 에 제시되어 있다.
융합 폴리펩티드-함유 배양물 상청액을 2 개의 크로마토그래피 단계에 의해 여과 및 정제했다. 융합 폴리펩티드를 PBS (1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH 7.4 로 평형시킨 HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare) 을 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 포획했다. 미결합 단백질을 평형 완충제로 세정하여 제거하고, 융합 폴리펩티드를 0.05 M 시트레이트 완충제, pH 3 으로 회수하고, 용리 직후 1 M Tris-염기, pH 9.0 에 의해 pH 6.5 로 중화시켰다. Superdex 200TM (GE Healthcare) 에서의 크기 배제 크로마토그래피를 제 2 정제 단계로서 사용했다. 크기 배제 크로마토그래피를 2　mM MOPS 완충제, 0.125 M NaCl, pH 7.2 중에서 수행했다. 용리된 융합 폴리펩티드를 Biomax-SK 막 (Millipore, Billerica, MA) 을 갖춘 Ultrafree-CL 원심분리 필터 유닛으로 농축하고 -80℃ 에서 저장했다.
이러한 프로토콜에 따라 4 개의 상이한 Fc감마RIIIa-Fc 융합 폴리펩티드를 정제했다:
a) Fc감마RIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G (절단 자리를 포함하지 않음)
b) 최소 Fc감마RIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G (절단 자리를 포함하지 않음)
c) Fc감마RIIIaV158-Avi-프레시션 프로테아제(PP)-Fc LALA P239G
d) Fc감마RIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P239G
아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정하여, 융합 폴리펩티드의 단백질 농도를 측정했다. 융합 폴리펩티드의 순도 및 적절한 이합체 형성을 환원제 (5 mM 1.4-디티오트레이톨) 의 존재 및 부재 하에 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie brilliant blue) 로 염색하여 SDS-PAGE 에 의해 분석했다. 융합 폴리펩티드 제제의 응집물 함량을 Superdex 200TM 분석적 크기-배제 칼럼 (GE Healthcare) 을 사용하여 고성능 SEC 에 의해 측정했다. 환원된 융합 폴리펩티드의 아미노산 백본의 완전성을 뉴라미니다제, O-글리카나제 및 펩티드-N-글리코시다제 F (Roche Applied Science) 의 조합에 의한 효소 처리에 의해 N-글리칸을 제거한 후 Nano Electrospray QTOF 질량 분석에 의해 확인했다.
실시예 3
파파인에 의한 절단
효소 절단 자리를 포함하지 않는 Fc감마RIIIa-Fc 융합 폴리펩티드는 파파인에 의해 절단될 수 있다. Fc감마RIIIa-Fc 융합 폴리펩티드를 37℃ 에서 1 시간 동안 시스테인 및 0.1 mU/mg 융합 폴리펩티드 파파인 (Carica papaya, Roche Diagnostics GmbH) 을 첨가하여 절단했다. 후속 정제를 실시예 2 에 기재된 바와 같이 수행했다. 분석적 SDS-PAGE 겔이 도 2 에 제시되어 있다.
실시예 4
Ides 프로테아제에 의한 절단
Ides 프로테아제에 의한 Fc감마RIIIaV158-Avi-Fc LALA P239G 융합 폴리펩티드의 절단은 매우 비효율적이고, 그러므로 이 경우에 유용하지 않다.
실시예 5
프레시션 프로테아제에 의한 절단
50 mM Tris, 150 NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT pH 7.4 에 대한 투석 후에, 실온에서 밤새 1-15 U 프레시션 프로테아제 (GE Healthcare)/100㎍ 융합 폴리펩티드를 첨가하여 Fc감마RIIIa-(PP)-Fc 융합 폴리펩티드를 절단했다. 단백질의 일부만 절단될 수 있었다. 한편, PP 절단 자리를 포함하지 않는 수용체의 프레시션 프로테아제에 의한 비특이적 절단이 관찰되었다.
실시예 6
IgA 프로테아제에 의한 절단
Slide-a-lyzer 투석 카세트를 사용하는 50 mM Tris pH 8 에 대한 투석 후에, 21℃ 에서 밤새 w(프로테아제)/w(융합 폴리펩티드) 1:100 의 비율로 IgA 프로테아제 (Roche Diagnostics GmbH) 를 첨가하여 Fc감마RIIIa-Fc 융합 폴리펩티드를 절단했다. 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (SEC, Superdex 75; GE Healthcare) 에 의해 절단을 제어했다. 절단 후에, Superdex 75TM (GE Healthcare) 에서의 분취용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 IgA 프로테아제로부터, 그리고 HiTrap MabSelectSuRe (GE　Healthcare) 칼럼에 의해 Fc-태그로부터 Fc감마RIIIa 수용체를 분리했다. 분석적 SDS-Page 겔이 도 3 에 제시되어 있다.
표: 상이한 Fc감마RIIIa V158 포함 융합 폴리펩티드의 발효 및 정제의 수율.
Figure pct00006
실시예 7
Fc감마RIIIaV158 친화도 칼럼의 제조
Fc감마RIIIaV158 을 포함하는 친화도 칼럼을 Avi-태그의 시험관내 비오티닐화 및 후속적인 스트렙타비딘 세파로스에 대한 커플링에 의해 제조했다. 이는 Fc-영역을 절단해낸 후에 온전한 융합 폴리펩티드 뿐만 아니라 수용체로 수행될 수 있다. 이는 분석용 및 분취용 친화도 칼럼을 제조하는 매우 신속한 효율적 방법이다.
수용체의 비오티닐화
HEK293 세포에서 발현된 Avi 태그를 포함하는 Fc감마RIIIaV158 의 가용성 세포외 도메인을 하기 프로토콜에 따라 정제 후에 비오티닐화했다: 2　mM MOPS 중 태깅된 (tagged) 1.2 내지 12 mg Fc감마RIIIaV158 또는 2.4 내지 24 mg Fc감마RIIIaV158 Fc-영역 융합 폴리펩티드, 125　mM NaCl pH 7.2, 0.02% Tween, 및 1 정제 Complete 프로테아제 저해제 (Roche) (3 ml PBS 중) 를 Avidity 사제 비오티닐화 키트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 비오티닐화했다. 비오티닐화 반응을 실온에서 밤새 수행했다. 수식된 폴리펩티드를 4℃ 에서 밤새 20 mM 나트륨 포스페이트 완충제, 150 mM NaCl pH 7.5 에 대해 투석하여 과량의 비오틴을 제거했다.
스트렙타비딘 세파로스에 대한 커플링
1 g 스트렙타비딘 세파로스 (GE Healthcare) 를 비오티닐화되고 투석된 수용체에 첨가하고, 진탕하면서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 최종적으로 1 ml XK 칼럼 (GE Healthcare) 에 충전했다.
실시예 8
크로마토그래피 방법
일반적 조건:
평형 완충제 A: 20 mM 시트르산 / 150 mM NaCl pH 6.0　
용리 완충제 B: 20 mM 시트르산 / 150 mM NaCl pH 3.0　
용리: 5 분 100 % A
60 분에 100 % B 로,
0.1 분 100 % B,
6 분 100 % A
샘플량: 50 ㎍ 이상
푸코실화 및 비-푸코실화 항체의 분리
FcγRIIIa 칼럼 상의 항체의 크로마토그래피에 의해, 항체의 완전 푸코실화 및 비-푸코실화 분획을 정량할 수 있다. 항체의 비-푸코실화 분획은 항체 제제의 ADCC 와 연관된다.
도 4 에 Fc-FcγRIIIa 칼럼 상의 항-Her 항체 (야생형, 상부) 및 당조작된 항-Her 항체의 상이한 글리코실화 형태의 분리 및 정량이 나타나 있다. 분석 시간은 분해능을 유지하면서 구배를 변화시켜 단축될 수 있다.
Fc감마RIIIaV158 및 Fc 태깅된 Fc감마RIIIaV158 을 사용하는 친화도 칼럼의 비교
등몰량의 두 가지 수용체 구축물을 커플링한 후에, 친화도 칼럼은 완전 푸코실화 및 비-푸코실화 항체의 분리에서 동일하게 거동한다 (도 5: 검은색: Fc감마RIIIaV158; 파란색: Fc감마RIIIaV158-Fc).
실시예 9
FcγRIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P329G - IgG 상호작용 측정
BIAcore® 시스템은 분자 상호작용의 연구에 대해 잘 확립되어 있다. 그것은 리간드/분석물 결합의 연속적 실시간 모니터링 및 그에 따른 연합 속도 상수 (ka), 해리 속도 상수 (kd), 및 평형 상수 (KD) 의 결정을 허용한다. 굴절률의 변화는 고정 리간드와 용액에 주입된 분석물의 상호작용에 의해 야기된 표면 상의 질량 변화를 나타낸다. 분자가 표면 상의 고정 리간드에 결합하는 경우에는 질량이 증가하고, 해리의 경우에는 질량이 감소한다.
Fc감마RIIIaV158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드의 활성 측정을 위해, 직접 결합 검정을 사용했다.
포획 시스템 (20 ㎍/ml 인간 Fab 포획 키트 GE Healthcare, 28-9583-25) 의 약 400 공명 단위 (RU) 를 GE 에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0 에서 CM5 칩 (GE Healthcare BR1005-30) 에 커플링시켰다. 샘플 및 시스템 완충제는 HBS-P+ pH 7.4 (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Surfactant P20) 였다. 유동 셀을 25℃ 로 설정하고 샘플 블록을 12℃ 로 설정했다. 10 ㎕/분의 유속으로 360 초 동안 50 nM 용액을 주입하여 항체를 포획했다. 연합에 대해서는 50　㎕/분의 유속으로 180 초 동안, 해리에 대해서는 360 초 동안 50 nM 의 Fc감마RIIIa 융합 폴리펩티드를 주입하여 결합을 측정했다. 20 ㎕/분의 유속으로 글라이신 pH 2.1 용액으로 60 초 세정하여 표면을 재생했다. 구축물의 활성 평가를 위해, 신호 높이 및 해리 거동을 비교했다.
도 6 에 나타난 바와 같이, Fc감마RIIIaV158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드의 반응은 100 RU 초과 반응 단위를 나타냈고, 이에 비해 Fc감마RIIIaV158 은 40 RU 를 나타냈다.
실시예 10
절단 전 및 후 FcγRIIIaV158-Avi-IgA 프로테아제-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 IgG 동적 상호작용 측정
절단된 Fc감마RIIIaV158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드의 활성 측정을 위해 직접 결합 검정을 사용했다.
포획 시스템 (20 ㎍/ml 인간 Fab 포획 키트 GE Healthcare, 28-9583-25) 의 약 400 공명 단위 (RU) 를 GE 에 의해 공급된 아민 커플링 키트를 사용하여 pH 5.0 에서 CM5 칩 (GE Healthcare BR1005-30) 에 커플링시켰다. 샘플 및 시스템 완충제는 HBS-P+ pH 7.4 (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Surfactant P20) 였다. 유동 셀을 25℃ 로 설정하고 샘플 블록을 12℃ 로 설정했다. 10 ㎕/분의 유속으로 80 초 동안 50 nM 용액을 주입하여 항체를 포획했다.
0 내지 250 nM (1:2 희석) 범위의 상이한 농도의 항체를 30 ㎕/분의 유속으로 유동 셀을 통과시켜 25℃ 에서 120 초 동안 연합을 측정했다. 샘플 용액을 러닝 완충제 (running buffer) 로 바꿔어, 해리 상을 420 초 동안 모니터링했다. 20 ㎕/분의 유속으로 글라이신 pH 2.1 용액으로 60 초 세정하여 표면을 재생했다.
포획된 FcγRIIIaV158 이 없는 표면으로부터 수득된 반응을 뺄샘하여, 벌크 굴절률 차이를 보정했다. 블랭크 완충제 주입물을 또한 뺄샘했다 (=이중 참조).
BIAevaluation 소프트웨어 패키지를 사용하여 여러 상이한 농도로 수득된 센서그램 곡선을 분석하여, ka/kd 로서 정의되는 평형 해리 상수 (KD) 를 결정했다. 데이터 피팅 (fitting) 은 적합한 결합 모델에 따랐다. 도 7 에서 Fc감마 수용체 V158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 (도 7a), Fc감마 수용체 V158 (도 7b), 절단된 Fc감마 수용체 V158-Fc LALA P329G 융합 폴리펩티드 (도 7c) 의 센서그램이 나타나 있다.
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Method for producing soluble FcR as Fc-Fusion with inert immunoglobulin Fc-region and uses thereof <130> 31131 WO <150> EP12179025 <151> 2012-08-02 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Trp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60 Glu Ser Thr Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 65 70 75 80 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 85 90 95 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 3 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 4 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with the mutations L234A, L235A <400> 4 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 5 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a hole mutation <400> 5 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 6 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a knob mutation <400> 6 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 7 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a L234A, L235A and hole mutation <400> 7 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly 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<213> Artificial Sequence <220> <223> variant human Fc-region of the IgG1 isotype with a P239G and hole mutation <400> 11 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys 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Ala Glu 225 230 235 240 Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp 245 250 255 Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val 260 265 270 Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu 275 280 285 Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu 290 295 300 Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn 305 310 315 320 Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu 325 330 335 Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys 340 345 350 Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala 355 360 365 Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp 370 375 380 Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Arg Ile Thr Lys 385 390 395 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 40 Pro Ala Pro Ser Pro 1 5 <210> 41 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protease cleavage site <400> 41 Pro Pro 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Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 20 25 30 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 50 55 60 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 65 70 75 80 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 85 90 95 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 100 105 110 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 115 120 125 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 130 135 140 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 145 150 155 160 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 165 170 175 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 180 185 190 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Leu 195 200 205 Val Val Ala Pro Pro Ala Pro Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 340 345 350 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 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Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu 180 185 190 Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Leu Val Val Ala Pro Pro Ala Pro 195 200 205 Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 210 215 220 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 225 230 235 240 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 245 250 255 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 260 265 270 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 275 280 285 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 290 295 300 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 305 310 315 320 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 325 330 335 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 340 345 350 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 355 360 365 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 370 375 380 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 385 390 395 400 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 405 410 415 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 420 425 430 Ser Pro Gly Lys 435 <210> 58 <211> 423 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcyRIIb-Avi-IgA Protease-Fc LALA P239G fusion polypeptide <400> 58 Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Gln Trp Ile Asn Val 1 5 10 15 Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Arg Gly Thr His Ser Pro 20 25 30 Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu Ile Pro Thr 35 40 45 His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn Asp Ser Gly 50 55 60 Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp Pro Val His 65 70 75 80 Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro His Leu Glu 85 90 95 Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Val Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asp 100 105 110 Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys Ser Lys Lys 115 120 125 Phe Ser Arg Ser Asp Pro Asn Phe Ser Ile Pro Gln Ala Asn His Ser 130 135 140 His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr Thr Leu Tyr 145 150 155 160 Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Ala Pro Gly Leu Asn Asp 165 170 175 Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Leu Val Val Ala Pro 180 185 190 Pro Ala Pro Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 195 200 205 Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 210 215 220 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 225 230 235 240 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 245 250 255 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 260 265 270 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 275 280 285 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 290 295 300 Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 305 310 315 320 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 325 330 335 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 340 345 350 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 355 360 365 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 370 375 380 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 385 390 395 400 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 405 410 415 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420 <210> 59 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcyRIIIb-Avi-IgA Protease-Fc LALA P239G fusion polypeptide <400> 59 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 1 5 10 15 Gln Trp Tyr Ser Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 20 25 30 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 50 55 60 Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 65 70 75 80 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 85 90 95 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 100 105 110 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 115 120 125 Gly Lys Asp Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe His Ile Pro 130 135 140 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 145 150 155 160 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 165 170 175 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Ser Pro Pro Gly Tyr Gln 180 185 190 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Leu 195 200 205 Val Val Ala Pro Pro Ala Pro Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 340 345 350 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 60 <211> 346 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> minimal FcyRIIIa-Avi-Fc LALA p239G fusion polypeptide <400> 60 Gly Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp 1 5 10 15 Pro Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys 20 25 30 Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn 35 40 45 Ser Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr 50 55 60 Phe Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val 65 70 75 80 Asn Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe 85 90 95 Phe Pro Pro Gly Tyr Gln Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys 100 105 110 Ile Glu Trp His Glu Leu Glu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 115 120 125 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 130 135 140 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 145 150 155 160 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 165 170 175 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 180 185 190 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 195 200 205 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 210 215 220 Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 225 230 235 240 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 245 250 255 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 260 265 270 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 275 280 285 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 290 295 300 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 305 310 315 320 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 325 330 335 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 340 345

Claims (15)

  1. 하기 식 I 에 따른 융합 폴리펩티드:
    R1-FC-R2 (식 I)
    (식 중,
    R1 은 제 1 Fc-수용체를 나타내고,
    R2 는 제 2 Fc-수용체를 나타내고,
    FC 는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 나타내고,
    여기서 R1 또는 R2 또는 둘다가 존재하고,
    여기서 FC 는 R1 및/또는 R2 에 실질적으로 결합하지 않음).
  2. 제 1 항에 있어서, 하기 식 II 를 갖는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드:
    R1-CS1-L1-CS2-FC-CS3-L2-CS4-R2 (식 II)
    (식 중,
    R1 은 제 1 Fc-수용체를 나타내고,
    R2 는 제 2 Fc-수용체를 나타내고,
    FC 는 중쇄 Fc-영역 폴리펩티드를 나타내고,
    CS1 은 제 1 절단 자리를 나타내고,
    CS2 는 제 2 절단 자리를 나타내고,
    CS3 은 제 3 절단 자리를 나타내고,
    CS4 는 제 4 절단 자리를 나타내고,
    L1 은 제 1 링커를 나타내고,
    L2 는 제 2 링커를 나타내고,
    여기서 R1 또는 R2 또는 둘다가 존재하고,
    여기서 CS1, CS2, CS3, CS4 중 어느 것이든 서로 독립적으로 존재 또는 부재할 수 있고,
    여기서 L1 및 L2 는 서로 독립적으로 존재 또는 부재할 수 있고,
    여기서 FC 는 R1 및/또는 R2 에 실질적으로 결합하지 않음).
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, R1 및 R2 가 서로 독립적으로 인간 Fc감마-수용체, 인간 신생아 (neonatal) Fc-수용체, 쥐 Fc-수용체, 및 토끼 신생아 Fc-수용체의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, FC 가 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG2 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG3 중쇄 폴리펩티드, 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드, 쥐 IgG1 중쇄 폴리펩티드, 쥐 IgG2 중쇄 폴리펩티드, 쥐 IgG2a 중쇄 폴리펩티드, 쥐 IgG3 중쇄 폴리펩티드, 및 토끼 IgG 중쇄 폴리펩티드의 군으로부터 선택되는 중쇄 폴리펩티드의 변이체인 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, FC 가 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G 를 갖는 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드, 돌연변이 S228P 및 L235E 를 갖는 인간 IgG4 중쇄 폴리펩티드, 돌연변이 I253A, H310A 및 A435A 를 갖는 인간 IgG1 중쇄 폴리펩티드로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드 .
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드 2 개를 포함하는 이합체성 융합 폴리펩티드.
  7. 제 6 항에 있어서, 제 1 FC 가 돌연변이 T366W 및 임의로 돌연변이 S354C 를 포함하고, 제 2 FC 가 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 및 임의로 돌연변이 Y349C 를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    a) 제 1 및 제 2 폴리펩티드의 R1 및 R2 는 동일하고,
    b) 제 1 융합 폴리펩티드의 R1 및 R2 는 동일하고, 제 2 융합 폴리펩티드의 R1 및 R2 는 동일하나 제 1 융합 폴리펩티드의 R1 및 R2 와 상이하고,
    c) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R1 은 동일하고, 제 1 및 제 2 폴리펩티드의 R2 는 동일하나 R1 과 상이하고,
    d) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R1 은 동일하고 R2 는 둘다 부재하고,
    e) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R1 은 상이하고 R2 는 둘다 부재하고,
    f) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R2 는 동일하고 R1 은 둘다 부재하고,
    g) 제 1 및 제 2 융합 폴리펩티드의 R2 는 상이하고 R1 은 둘다 부재하고,
    h) 제 1 융합 폴리펩티드의 R1 및 제 2 폴리펩티드의 R2 는 상이하고, 제 1 융합 폴리펩티드의 R2 는 부재하고 제 2 폴리펩티드의 R1 은 부재하는
    것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
  9. 하기 단계를 포함하는 가용성 Fc-수용체의 생산 방법:
    a) 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 단계,
    b) 세포 또는 배양 배지로부터 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계,
    c) 임의로 융합 폴리펩티드를 프로테아제로 절단하고,
    그에 의해 가용성 Fc-수용체를 생산하는 단계.
  10. 친화도 크로마토그래피 리간드로서의, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 고정 (immobilized) 융합 폴리펩티드의 용도.
  11. 항체의 Fc-수용체 결합을 확인하기 위한, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 고정 융합 폴리펩티드의 용도.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 융합 폴리펩티드가 고체 상에 결합되는 것을 특징으로 하는 용도.
  13. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물.
  14. 약제의 제조에 있어서, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드의 용도.
  15. 제 14 항에 있어서, 약제가 염증성 질환의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 용도.
KR20157005311A 2012-08-02 2013-07-31 불활성 면역글로불린 Ｆｃ-영역을 갖는 Ｆｃ-융합체로서의 가용성 ＦｃＲ 의 생산 방법 및 그의 용도 KR20150038511A (ko)

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