CN117241866A - Aav2亲和剂 - Google Patents

Abstract

本公开涉及色谱领域，并且更具体地涉及适用于分离腺相关病毒(AAV)的新型亲和配体和亲和剂。因此，本公开涵盖亲和配体本身、包含根据本公开的亲和配体的色谱分离基质(亲和剂)，以及AAV分离，特别是AAV血清型2(AAV2)分离的过程，其中使用根据本公开的配体。

Description

AAV2亲和剂

相关申请的交叉引用

本PCT申请要求在2021年2月19日提交的美国临时申请号63/151,622的权益，其全部内容以引用的方式并入本文。

发明领域

本公开涉及色谱领域，并且更具体地涉及适用于分离腺相关病毒(AAV)的新型亲和配体和亲和剂。因此，本公开涵盖亲和配体本身、包含根据本公开的亲和配体的色谱分离基质(亲和剂)，以及AAV分离，特别是AAV血清型2(AAV2)分离的过程，其中使用根据本公开的配体。

背景技术

生物产生的治疗剂的纯度受到当局的严格审查和监管，以确保安全性和有效性。因此，需要将生物产生的治疗剂高效纯化至高纯度。

为了支持治疗性蛋白质的临床努力，需要从重组来源高效纯化蛋白质的组合物和方法。亲和纯化是一种通过几个步骤或单个步骤分离和/或获得所需蛋白质纯度的手段。然而，包含与固体支持物结合的亲和配体的分离基质的开发可能是资源密集且耗时的任务，并且因此仅存在针对极少数蛋白质的亲和分离基质。在不存在亲和分离基质的情况下，纯化通常涉及低效过程，诸如多柱过程。

腺相关病毒(AAV)是细小病毒家族的成员，是一种小型无包膜病毒。AAV颗粒包含由60个衣壳蛋白亚基VP1、VP2和VP3构成的AAV衣壳，其中包含约4.7千碱基(kb)的单链DNA基因组。这些VP1、VP2和VP3蛋白以约1:1:10的预测比存在，并以二十面体对称排列。个别粒子仅包装一条DNA分子链，但这可能是正链或负链，两者都具有传染性。与大多数病毒不同，AAV天生无致病性、免疫原性差且具有广泛的嗜性。许多AAV血清型已被鉴定为具有可变嗜性。AAV的组织特异性由病毒衣壳血清型决定。这种特异性允许将感兴趣的基因靶向某些组织和细胞。非致病性、广泛的感染性宿主范围(包括非分裂细胞)和整合的特性使AAV血清型(诸如AAV2)成为一种有吸引力的媒介物。

重组腺相关病毒(rAAV)是研究最多的用于递送人类基因治疗的病毒载体之一。重组AAV缺少病毒整合和复制的两个必需基因。因此，rAAV主要保持附加型，并且可在非分裂细胞中持续很长时间。由于这些特征以及靶向特定组织类型的能力，重组AAV已成为用于研究和基因治疗应用的主要病毒载体之一。AAV血清型表现出各种细胞嗜性和与细胞受体的相互作用，以允许进入细胞并将遗传物质递送到细胞核中进行表达。rAAV的制造既困难又昂贵。细胞培养生产力低，并且通常达到每升10¹³–10¹⁵个病毒衣壳，相当于大约0.1-10mg/L。纯化主要通过使用亲和色谱完成，但只有少数亲和树脂可用于AAV的纯化，包括POROS^TMCaptureSelect^TM AAV9、POROS^TM CaptureSelect^TM AAVX、POROS^TM CaptureSelect^TM AAV8和AVB Sepharose，并且这些并不总是有选择性的，而且价格昂贵。而且，这些树脂有两大缺点，一是不能用氢氧化钠清洗，二是只能重复使用几个循环。这增加了树脂消耗并导致纯化应用的树脂成本高。因此，需要对个别AAV血清型具有特异性的亲和配体和树脂。本公开提供了对AAV2和AAV2变体(包括病毒粒子和衣壳)具有高特异性的碱稳定配体和树脂，以满足AAV2和AAV2变体纯化的需要。

发明概述

本文描述了结合AAV2并可用于分离和/或亲和纯化AAV2病毒颗粒或衣壳和/或AAV2变体病毒颗粒或衣壳的亲和配体和亲和树脂(或亲和剂)。

在一个方面，本公开提供了与AAV2衣壳或AAV2衣壳的变体(或AAV2颗粒或其变体)特异性结合的亲和配体，所述亲和配体包含三螺旋束蛋白，其包含由下式表示的氨基酸序列，从N末端到C末端，

X₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀LNX ₅₃A(SEQ ID NO.51)

其中

X₅是W、Y、D、F、H、I或R，优选W；

X₇是R、A、W、V、H、Y、T、D或Q，优选R；

X₈是D、Q、E、I、T或N，优选D；

X₁₁是F、I、S、Y、L、K、V、W或Q，优选F；

X₁₄是E、D、H、K、S、N、G、A或V，优选E；

X₁₅是除C或P以外的任何氨基酸，优选E；

X₁₈是除C或P以外的任何氨基酸，优选R；

X₄₁是H、Y、R或A，优选H；

X₄₂是S、G、Q、T、F、W、A或N，优选Q；

X₄₃是S、Q、F、Y、A或T，优选S；

X₄₆是N、R、W、S、Q、G、T或Y，优选N；

X₄₉是F、W、S、E、D、Y、N或T，优选S；

X₅₀是Q、N、E、T、R或F，优选Q；

X₅₃是L、G、H、T、A、V、F、Y、E或I，优选L；并且

[Z]是α-螺旋形成肽结构域，并且优选是LPNLTEEQRRAFIESLRDDPSQ；并且

其中亲和配体与腺相关病毒亚型2(AAV2)颗粒或衣壳或AAV2颗粒或衣壳的变体特异性相互作用。

在一些实施方案中，配体的式是以下中的任一项

VDAKX₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀LNX₅₃AQAPK,

VDAKX₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀LNX₅₃AQRAPK

VDAEX₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀LNX₅₃AQAPK，或

VDAEX₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀LNX₅₃ARAPK(分别是SEQID NO.52-55)，其中所有X和Z部分均如前一段中所定义。

在本公开的实施方案中，[Z]部分可包含葡萄球菌A蛋白(SPA)Z-结构域、A-结构域、B-结构域、C-结构域、D-结构域和E-结构域，优选Z-结构域中的任一个的SPA结构域的螺旋2，或其任何碱稳定变体。在某些实施方案中，[Z]可以是氨基酸序列包含以下各项的肽中的任一种：LPNLTEEQRRAFIESLRDDPPQ(SEQ ID NO.38)、L PNLTEERRRAFIESLRDDPSQ(SEQ IDNO.39)、LPNLTEEQRRAF IESLRDGPSQ(SEQ ID NO.40)、LPYLTEEQRRAFIESLRDDPSQ SEQ IDNO.41)、LPNLTEEQRRIFIESLRDDPSQ(SEQ ID NO.42)、LPNLTEEQRRTFIESLRDDPSQ(SEQ IDNO.43)、LPNLTEEQ RRAFIEPLRDDPSQ(SEQ ID NO.44)或LPNLTEEQRRAFIESLRD DPSQ(SEQ IDNO.45)，并且优选是后者的序列。

根据本公开，亲和配体的实施方案独立地包括任何和所有排列，其中配体的N末端之前是M或MAQGT(SEQ ID NO.46)，或者其中配体的C末端之后是VD、VDGEKPEK(SEQ IDNO.47)、VDG LNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO.48)、VDGLNDIFEAQKIEWHE HHHHHH(SEQ IDNO.49)或GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWH EHHHHHH(SEQ ID NO.50)。

在某些实施方案中，亲和配体包含SEQ ID NOS.3-30、32或34-37中的任一项，并且优选包含SEQ ID NO.30。

在再其他实施方案中，本公开的任何亲和配体还包含C末端半胱氨酸或赖氨酸。

本公开的其他方面涉及包含多个根据本公开的亲和配体的多聚体。此类多聚体包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体和九聚体。在一些实施方案中，多聚体的亲和配体包含SEQ ID NO.30。在一些实施方案中，多聚体包含SEQ ID NO.31或33。

在本文所述的其他方面，本文所公开的亲和配体或多聚体还包含至少一种异源剂，其可操作地连接至所述亲和配体或多聚体以形成缀合物或融合蛋白。

本公开的又其他方面涉及分离基质。此类分离基质包含至少一种本公开的亲和配体或至少一种本公开的多聚体以及固体支持物。在实施方案中，配体或多聚体可经由硫醇键联或氨基甲酸酯键联与固体支持物偶联。本公开的此类固体支持物包括色谱树脂或基质、膜、整体柱、珠子等。在一些实施方案中，固体支持物包括琼脂糖。在一些实施方案中，固体支持物是交联琼脂糖基质。

此外，本公开提供了分离腺相关病毒亚型2(AAV2)颗粒或衣壳的方法，其包括使所述AAV2颗粒或衣壳(或两者之一的变体)与本公开的分离基质接触以及回收所述AAV2颗粒或衣壳(或其变体)。

在一些实施方案中，所述方法包括(a)使本公开的分离基质与包含AAV2颗粒或衣壳(或变体)的组合物接触，(b)用洗涤缓冲液洗涤分离基质，(c)用洗脱缓冲液从分离基质中洗脱AAV2颗粒或衣壳(或变体)，以及(d)回收AAV2颗粒或衣壳(或变体)。这些方法中的任一种还可包括用碱性清洗溶液处理分离基质足够长的时间以清洗残留物质的所述基质以及再生分离基质的至少80％的所述AAV2颗粒或AAV2衣壳结合能力。典型的碱性清洗溶液包含约0.1M NaOH至约0.5M NaOH。

在所述方法的其他实施方案中，当步骤(a)-(d)和清洗步骤[本文也称为步骤(e)]重复至少5次，优选至少10次时，本公开的分离基质保留其AAV2颗粒或AAV2衣壳结合能力的至少80％。在一些实施方案中，本公开的这些方法允许重复使用分离基质至少10次而不损失超过80％的原始结合能力。在一些实施方案中，保留了至少85％、90％和95％的结合能力。此类分离基质是碱稳定的并且降低了纯化成本。

本公开的其他方面涉及编码本公开的亲和配体或本公开的多聚体的核酸或载体以及包含具有亲和配体或多聚体的编码区的那些核酸或载体的表达载体，所述亲和配体或多聚体可操作地连接至一个或多个更多表达控制元件。本公开的另外的实施方案涉及用于重组产生本公开的亲和配体或多聚体的宿主细胞，特别是大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母。

在另一个方面，本公开提供了通过在宿主细胞表达亲和配体或多聚体的时间和条件下培养本公开的宿主细胞来产生所述亲和配体或所述多聚体的方法。

在一些实施方案中，本公开涉及制备分离基质的方法，其包括将根据本公开的配体或根据本公开的多聚体与固体表面缀合。

附图说明

图1示出了AAV2衣壳与对应于SEQ ID NO.27的生物素化配体结合的传感图。

图2示出了亲和树脂与对应于SEQ ID NO:30的配体在1min停留时间下的功能结合能力的测定。

具体实施方式

定义

为了更易于理解本公开，下面定义某些术语。除非本文另有定义，否则本文所使用的技术和科技术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

单位、前缀和符号以其Système International de Unites(SI)可接受的形式表示。数值范围将限定范围的数量包括在内。除非另外指定，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。本文所提供的标题不限制本公开的各个方面或实施方案，其可通过整体参考本说明书而得。因此，如下直接定义的术语通过整体参考说明书被更详细地定义。

需要注意的是，术语“一个或(种)”实体是指所述实体中的一个(种)或多个(种)；例如，“亲和配体”理解为表示一个(种)或多个(种)亲和配体。因此，术语“一个或(种)”、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文可互换使用。

大约或约：如本文所用，术语“大约”或“约”当应用于一个或多个感兴趣的值时，是指与所陈述的参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另外陈述或另外由本文显而易见(除了此类数字将超过可能的值的100％的情况)，否则术语“大约”或“约”是指属于所陈述的参考值在任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更低内的值的范围。

生物活性：如本文所用，术语“生物活性”是指在生物系统中，特别是在生物体中具有活性的任何剂的特征。例如，当施用于生物体时对所述生物体具有生物或生理作用的剂被认为具有生物活性。

变体和突变体：术语“变体”通常在科学文献中定义，并且本文用于指在某种程度上与公认标准在遗传上存在差异的生物体。“变体”也可用于描述非遗传的表型差异(King和Stansfield,2002,A dictionary of genetics,第6版,New York,New York,OxfordUniversity Press。

术语“突变”在大多数词典中都有定义，并且本文用于指将可遗传变化引入基因结构(King和Stansfield,2002)，从而产生“突变体”的过程。在科学和非科学文献中，越来越多地使用术语“变体”来代替术语“突变”。所述术语在本文可互换使用。

保守和非保守取代：“保守”氨基酸取代是其中一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基替换的取代。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H))；酸性侧链(例如，天冬氨酸(D)、谷氨酸(E))；不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸(G)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C))；非极性侧链(例如，丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、蛋氨酸(M)、色氨酸(W)、β-支链侧链(例如，苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I))；和芳族侧链(例如，酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H))。例如，用苯丙氨酸取代酪氨酸是一种保守取代。在一些实施方案中，配体序列中的保守氨基酸取代赋予或改善配体与感兴趣的靶标的特异性结合。在一些实施方案中，配体序列中的保守氨基酸取代不会减少或消除配体与感兴趣的靶标的结合。在一些实施方案中，保守氨基酸取代不会显著影响配体与感兴趣的靶标的特异性结合。鉴定赋予、改变或保持选择性结合亲和力的核苷酸和氨基酸保守取代和非保守取代的方法是本领域已知的(参见例如，Brummell,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks,PNAS 94:412-417(1997))。在一些实施方案中，配体序列中的非保守氨基酸取代赋予或改善配体与感兴趣的靶标的特异性结合。在一些实施方案中，配体序列中的非保守氨基酸取代不会减少或消除配体与感兴趣的靶标的结合。在一些实施方案中，非保守氨基酸取代不会显著影响配体与感兴趣的靶标的特异性结合。

亲和色谱：如本文所用，术语“亲和色谱”是指特定的色谱模式，其中亲和配体以“锁-钥匙”方式经由生物亲和力与靶标相互作用。亲和色谱中有用的相互作用的实例是例如酶-底物相互作用、生物素-抗生物素蛋白相互作用、抗体-抗原相互作用等。

亲和配体和配体：术语“亲和配体”和“配体”在本文中可互换使用。这些术语在本文中用于指能够以高亲和力可逆地结合对其具有特异性的部分，例如多肽或蛋白质或感兴趣的靶标的分子。

基于蛋白质的配体：如本文所用的术语“基于蛋白质的配体”表示包含可逆地结合靶多肽或蛋白质的肽或蛋白质或肽或蛋白质的一部分的配体。应当理解，本公开的“配体”是基于蛋白质的配体。

亲和剂：如本文所用，术语“亲和剂”是指生物特异性亲和配体共价附接到的固体支持物或基质。通常，固体支持物或基质不溶于纯化靶分子的系统。术语“亲和剂”和“亲和分离基质”和“分离基质”在本文中可互换使用。

接头：如本文所用，“接头”是指肽或起到连接其他独立的功能性结构域的作用的其他化学键联。在一些实施方案中，接头位于配体与含有另外独立的功能性或结构性结构域的另一多肽组件之间。在一些实施方案中，接头是位于配体与表面之间的肽或其他化学键联。

天然存在的：术语“天然存在的”当与诸如核酸分子、多肽和宿主细胞的生物材料结合使用时，是指在自然界中发现且未经人类修饰的那些。相反，当与生物材料结合使用时，“非天然”或“合成”是指在自然界中未发现和/或已经人类修饰的那些材料。

“非天然氨基酸”、“氨基酸类似物”和“非标准氨基酸残基”在本文中可互换使用。可在本文所提供的配体中被取代的非天然氨基酸是本领域已知的。在一些实施方案中，非天然氨基酸是可取代脯氨酸的4-羟脯氨酸；可取代赖氨酸的5-羟赖氨酸；可取代组氨酸的3-甲基组氨酸；可取代丝氨酸的高丝氨酸；和可取代赖氨酸的鸟氨酸。可在多肽配体中取代的非天然氨基酸的其他实例包括但不限于分子，诸如：常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、A-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸、γ-氨基丁酸、硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸氟代氨基酸、设计师氨基酸，诸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸和Nα-甲基氨基酸。

“多核苷酸”和“核酸分子”：如在本文可互换使用的，多核苷酸和核酸分子是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。这些术语包括但不限于DNA、RNA、cDNA(互补DNA)、mRNA(信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、shRNA(小发夹RNA)、snRNA(小核RNA)、snoRNA(短核仁RNA)、miRNA(微小RNA)、基因组DNA、合成DNA、合成RNA和/或tRNA(转移RNA)。

可操作地连接：如本文所用，术语“可操作地连接”表示两个或更多个组件被布置成使得这些组件正常地发挥作用并且允许至少一个组件可介导施加在至少一个其他组件上的功能的可能性。无论是直接附接还是间接附接，两个分子都是“可操作地连接”。

肽标签：如本文所用的术语“肽标签”是指作为另一种蛋白质的一部分或附接(例如通过基因工程改造)至另一种蛋白质，以为由此产生的融合提供功能的肽序列。此类功能包括但不限于改变蛋白质的溶解度、调节蛋白质的表达以及促进蛋白质与另一个实体的附接或相互作用。与它们融合的蛋白质相比，肽标签通常(但并非总是)相对较短。在一些实施方案中，肽标签的长度为四个或更多个氨基酸，诸如5、6、7、8、9、10、15、20或25个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，如本文所用的肽标签包括可充当“标签”(例如，GFP)或特定性质的促进剂的第二蛋白质。在一些实施方案中，配体是含有肽标签的蛋白质。具有如本文所提供的用途的许多肽标签是本领域已知的。可以是配体融合蛋白的组分或由配体结合的靶标(例如，配体融合蛋白)的肽标签的实例包括但不限于HA(血凝素)、c-myc、疱疹单纯病毒糖蛋白D(gD)、T7、GST、GFP、MBP、Strep标签、His标签、Myc标签、TAP标签和FLAG标签(Eastman Kodak,Rochester,N.Y.)。同样，针对标签表位的抗体允许在例如亲和纯化、蛋白质印迹、ELISA测定和细胞免疫染色中检测和定位融合蛋白。

多肽：如本文所用的术语“多肽”是指经由肽键连接在一起的连续氨基酸链。所述术语用于指任何长度的氨基酸链，但本领域的普通技术人员将理解所述术语不限于长链并且可指包含经由肽键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如本领域技术人员所知，多肽可被加工和/或修饰。

蛋白质：如本文所用的术语“蛋白质”是指一种或多种充当离散单元的多肽。如果单个多肽是离散的功能单元并且不需要与其他多肽永久或暂时的物理缔合以形成离散的功能单元，则术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用。如果离散功能单元由多于一种彼此物理缔合的多肽组成，则术语“蛋白质”是指物理偶联并作为离散单元一起发挥作用的多个多肽。

特异性结合：如本文所用，关于配体，术语“特异性结合”或“对......具有选择性亲和力”表示配体相比于与替代物质(包括不相关的蛋白质)的反应或缔合更频繁地、更快速地、以更长的持续时间、以更大的亲和力或以上的组合与特定表位、蛋白质或靶分子反应或缔合。由于不同物种中同源蛋白质之间的序列同一性，特异性结合可包括识别多于一个物种中的蛋白质或靶标的结合剂，例如，是双特异性或三特异性的。同样，由于不同蛋白质的多肽序列的某些区域内的同源性，特异性结合可包括识别多于一种蛋白质或靶标的结合剂。应当理解，在某些实施方案中，特异性结合第一靶标的结合剂可能会或可能不会特异性结合第二靶标。因此，“特异性结合”不一定需要(尽管其可包括)排他性结合，即与单一靶标结合。因此，在某些实施方案中，配体或亲和剂可特异性结合多于一个靶标。在某些实施方案中，多个靶标可被亲和剂上的相同结合位点结合。

基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出总体或接近总体范围或程度的感兴趣的特征或特性的定性情况。生物学领域的普通技术人员应当理解的是生物学以及化学现象很少(如果有的话)会达到完成，和/或进行到完成或实现或避免绝对的结果。因此，术语“基本上”在本文中被用来获得在许多生物学以及化学现象中潜在地缺少的内在的完全性。

AAV2亲和配体

本公开的各个方面和实施方案的亲和配体提供可逆地结合AAV2衣壳和/或AAV2变体衣壳的蛋白质配体。如本文所用，与AAV2衣壳的结合与与AAV2颗粒或AAV2病毒粒子或其变体的结合同义。许多AAV2变体是本领域已知的。(例如，AAV变体(Y444F、Y730F、Y500F、Y272F、Y704F、Y252F)和AAV2.7m8变体；GeneMedi)。另参见Davidson等人,(2019Proc.Natl.Acad.Sci.USA116:27053-27062。目标AAV2可以是天然存在的或重组的病毒颗粒。目标分子的非限制性用途包括治疗和诊断用途。

本公开的亲和配体是三螺旋束蛋白，其包含由下式表示的氨基酸序列，从N末端到C末端，

X₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀LNX ₅₃A(SEQ ID NO.51)，

其中

X₅是W、Y、D、F、H、I或R；

X₇是R、A、W、V、H、Y、T、D或Q；

X₈是D、Q、E、I、T或N；

X₁₁是F、I、S、Y、L、K、V、W或Q；

X₁₄是E、D、H、K、S、N、G、A或V；

X₁₅是除C或P以外的任何氨基酸；

X₁₈是除C或P以外的任何氨基酸；

X₄₁是H、Y、R或A；

X₄₂是S、G、Q、T、F、W、A或N；

X₄₃是S、Q、F、Y、A或T；

X₄₆是N、R、W、S、Q、G、T或Y；

X₄₉是F、W、S、E、D、Y、N或T；

X₅₀是Q、N、E、T、R或F；

X₅₃是L、G、H、T、A、V、F、Y、E或I；并且

[Z]是α-螺旋形成肽结构域；并且

其中亲和配体与腺相关病毒亚型2(AAV2)颗粒或衣壳或AAV2颗粒或衣壳的变体特异性相互作用。

在一些实施方案中，亲和配体包含由下式表示的氨基酸：VDAKX₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀L NX₅₃AQAPK(SEQ ID NO.52)，

VDAKX₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀LNX₅₃ARAPK(SEQ IDNO.53)，

VDAEX₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀LNX₅₃AQAPK(SEQ IDNO.54)或

VDAEX₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀LNX₅₃ARAPK(SEQ IDNO.55)，其中每个X部分和[Z]如上所定义。

如所指定的，本公开的[Z]部分包含α-螺旋形成肽结构域并且优选是碱稳定的。形成α-螺旋结构的肽结构域是本领域众所周知的并且可从多种来源获得。在一些实施方案中，[Z]部分的长度范围为19-24个氨基酸，并且优选为21、22或23个，并且更优选为22个氨基酸长。在一些实施方案中，α-螺旋形成肽结构域是葡萄球菌A蛋白(SPA)结构域。在某些实施方案中，SPA结构域包含SPA Z-结构域、A-结构域、B-结构域、C-结构域、D-结构域或E-结构域中任一个的SPA结构域的螺旋2。(参见例如，Nilsson等人(1987)Prot.Eng.1:107-113)，以及美国专利号6534628、6831161、7834158、9187555、9663558、9683013、10308690、10501557和10703774)。SPA结构域的螺旋2通常存在于残基19-40(基于本文式中使用的编号，其中氨基酸VDAK或其等效物是所述结构域的氨基酸1-4并从那里继续)。

在某些实施方案中，[Z]包含氨基酸序列LPNLTEEQRRAFIESLRDDPPQ(SEQ IDNO.38)、LPNLTEERRRAFIESLRDDPSQ(SEQ ID NO.39)、LPNLTEEQRRAFIESLRDGPSQ(SEQ IDNO.40)、LPYLTEEQRRAFIESLRDDPSQ(SEQ ID NO.41)、LPNLTEEQRRIFIESLRDDPSQ(SEQ IDNO.42)、LPNLTEEQRRTFIESLRDDPSQ(SEQ ID NO.43)、LPNLTEEQRRAFIEPLRDDPSQ(SEQ IDNO.44)或LPNLTEEQRRAFIESLRDDPSQ(SEQ ID NO.45)，并且优选是LPNLTEEQRRAFIESLRDDPSQ(SEQ ID NO.45)。

在任何前述实施方案中，本公开的亲和配体的N末端之前可以是M或MAQGT(SEQ IDNO.46)。

在本公开的亲和配体的任何前述实施方案中，配体的C末端之后可以是氨基酸VD、VDGEKPEK(SEQ ID NO.47)、VDGLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO.48)、VDGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO.49)或GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ IDNO.50)。此类另外的氨基酸包括促进亲和配体与固体支持物的偶联的肽标签和氨基酸。

在一些实施方案中，本发明的亲和配体包含SEQ ID NO.3-30、32或34-37，并且优选是SEQ ID NO.30。

本公开的任何亲和配体可包含肽标签。此类肽标签包括但不限于血凝素、c-myc、单纯疱疹病毒糖蛋白D、T7、GST、GFP、MBP、strep标签、His标签、Myc标签、TAP标签或FLAG标签。

在任何前述实施方案中，本公开的亲和配体还包含C末端半胱氨酸或赖氨酸。此类残基促进与固体支持物的偶联。

本公开的另一个方面提供包含多个本公开的亲和配体的多聚体。此类多个可以是均质的(即本公开的单一配体)或异质的(即包括两个或更多个不同的本公开的配体)。在实施方案中，多聚体可以是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。本发明的多聚体的实例包括分别是二聚体和四聚体的亲和配体SEQ ID NO.31和33。

在本公开的其他方面，亲和配体或其多聚体还包含至少一种异源剂，其可操作地连接至所述亲和配体从而形成缀合物或融合蛋白。异源剂的实例包括但不限于一种或多种小分子诊断剂或治疗剂；肽标签(如本文所定义)；DNA、RNA或杂交DNA-RNA分子；可追踪标记；放射性剂；抗体；单链可变结构域；或免疫球蛋白片段。可通过本领域已知的方法制备此类缀合物和融合蛋白。

与AAV2病毒粒子或衣壳(或两者的变体)结合的配体

可使用本领域已知的用于评定此类活性的已知或改进的测定、生物测定和/或动物模型来确定与靶标，诸如AAV2病毒粒子或衣壳结合的配体或多聚体的特征。

如本文所用，诸如“对靶标的结合亲和力”、“与靶标的结合”、“与AAV2病毒粒子或衣壳的结合”等的术语是指例如，可通过亲和常数的测定(例如，在给定浓度下缔合和解离的配体量)直接测量的本公开的配体的特性。有几种方法可用于表征此类分子相互作用，例如，竞争分析、平衡分析和微量热分析，以及基于表面等离子体共振相互作用的实时相互作用分析(例如使用BIACORE仪器)。这些方法是本领域技术人员众所周知的，并在诸如Neri D等人(1996)Tibtech 14:465-470和Jansson M等人(1997)J Biol Chem 272:8189-8197的出版物中进行了讨论。

给定配体结合事件的亲和力要求取决于多种因素，包括但不限于结合基质的组成和复杂性、配体和靶分子的价态和密度，以及配体的功能应用。在一些实施方案中，本公开的配体以小于或等于5×10^-3M、10^-3M、5×10^-4M、10^-4M、5×10^-5M或10^-5M的解离常数(KD)结合AAV2病毒粒子或衣壳。在一些实施方案中，配体以小于或等于5×10^-6M、10^-6M、5×10^-7M、10^{- 7}M、5×10^-8M或10^-8M的KD结合感兴趣的靶标。在一些实施方案中，配体以小于或等于5×10^{- 9}M、10^-9M、5×10^-10M、10^-10M、5×10^-11M、10^-11M、5×10^-12M、10^-12M、5×10^-13M、10^-13M、5×10^-14M、10^-14M、5×10^-15M或10^-15M的KD结合感兴趣的靶标。在一些实施方案中，通过本文所公开的方法产生的配体具有以下解离常数：约10^-4M至约10^-5M、约10^-5M至约10^-6M、约10^-6M至约10^-7M、约10^-7M至约10^-8M、约10^-8M至约10^-9M、约10^-9M至约10^-10M、约10^-10M至约10^-11M或约10^-11M至约10^-12M。

在一些实施方案中，本公开的配体或多聚体以在以下范围内的koff特异性结合AAV2病毒粒子或衣壳：0.1至10^-7秒-1、10^-2至10^-7秒^-1或0.5×10^-2至10^-7秒-1。在一些实施方案中，配体以小于以下的解离速率(koff)结合感兴趣的靶标：5×10^-2秒^-1、10^-2秒^-1、5×10^-3秒-1或10^-3秒^-1。在一些实施方案中，配体以小于以下的解离速率(koff)结合感兴趣的靶标：5×10^-4秒^-1、10^-4秒^-1、5×10^-5秒^-1或10^-5秒^-1、5×10^-6秒^-1、10^-6秒^-1、5×10^-7秒^-1或10^-7秒^-1。

在一些实施方案中，配体或多聚体以在以下范围内的kon特异性结合AAV2病毒粒子或衣壳：10³至10⁷M^-1秒^-1、10³至10⁶M^-1秒^-1或10³至10⁵M^-1秒^-1。在一些实施方案中，配体(例如，配体融合蛋白)以大于以下的缔合速率(kon)结合感兴趣的靶标：10³M^-1秒^-1、5×10³M^-1秒^-1、10⁴M^-1秒^-1或5×10⁴M^-1秒^-1。在一个另外的实施方案中，配体以大于以下的kon结合感兴趣的靶标：10⁵M^-1秒^-1、5×10⁵M^-1秒^-1、10⁶M^-1秒^-1、5×10⁶M^-1秒^-1或10⁷M^-1秒^-1。

接头

术语“接头”和“间隔物”在本文中可互换使用，指肽或其他化学键联，其起到连接其他独立的功能性结构域的功能。在一些实施方案中，接头位于配体与含有另外独立的功能性结构域的另一多肽组件之间。用于偶联两个或更多个连接的配体的合适接头通常可以是本领域中用于连接肽、蛋白质或其他有机分子的任何接头。在一些实施方案中，此接头适用于构建意图用于药物用途的蛋白质或多肽。

用于在单链氨基酸序列中可操作地连接配体和配体融合蛋白的另外的组分的合适接头包括但不限于多肽接头，诸如甘氨酸接头、丝氨酸接头、混合甘氨酸/丝氨酸接头、富含甘氨酸和丝氨酸的接头或主要由极性多肽片段构成的接头。

在一些实施方案中，接头包含大部分选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在一些实施方案中，接头包含大部分选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺和赖氨酸。在一些实施方案中，配体接头由大部分不受空间位阻的氨基酸组成。在一些实施方案中，接头包含大部分选自甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸的氨基酸。在一些实施方案中，接头选自聚甘氨酸(诸如(Gly)5和(Gly)8)、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。

接头可具有任何大小或组成，只要它们能够以允许配体结合感兴趣的靶标的方式可操作地连接配体即可。在一些实施方案中，接头为约1至50个氨基酸、约1至20个氨基酸、约1至15个氨基酸、约1至10个氨基酸、约1至5个氨基酸、约2至20个氨基酸、约2至15个氨基酸、约2至10个氨基酸或约2至5个氨基酸。应该清楚的是，接头的长度、柔性程度和/或其他特性可能会影响用于亲和剂的配体的某些特性，诸如对感兴趣的靶标、或一种或多种其他感兴趣的靶蛋白、或不感兴趣的蛋白质(即非靶蛋白)的亲和力、特异性或亲合力。在一些实施方案中，使用两个或更多个接头。在一些实施方案中，两个或更多个接头是相同的。在一些实施方案中，两个或更多个接头是不同的。

在一些实施方案中，接头是非肽接头诸如烷基接头或PEG接头。例如，可使用烷基接头，诸如-NH-(CH2)s-C(0)-，其中s＝2-20。这些烷基接头还可被任何非空间位阻基团取代，诸如低级烷基(例如，C1C6)、低级酰基、卤素(例如，CI、Br)、CN、NH2、苯基等。示例性的非肽接头是PEG接头。在一些实施方案中，PEG接头具有约100至5000kDa或约100至500kDa的分子量。

可使用本文所述的和/或本领域已知的其他技术来评估接头。在一些实施方案中，接头不改变(例如，不破坏)配体结合靶分子的能力。

包含缀合配体的亲和剂：亲和分离基质

促进与感兴趣的靶标特异性结合的配体或多聚体可与色谱中使用的多种表面，例如珠子、树脂、凝胶、膜、整体柱等化学缀合，以制备亲和剂。本公开的亲和剂特别适用于纯化AAV2病毒粒子、衣壳或任何前述的变体，以及用于涉及这些部分的制造应用。

在一些实施方案中，本公开的配体(例如，配体融合蛋白)含有至少一个反应性残基。反应性残基可用作例如缀合物，诸如化疗药物或诊断剂的附接位点。示例性的反应性氨基酸残基包括例如赖氨酸或半胱氨酸。反应性残基可添加到配体的任一端或在配体序列内，和/或可取代配体序列内的另一个氨基酸。合适的反应性残基(例如，赖氨酸、半胱氨酸等)也可位于经鉴定配体的序列内，而无需添加或取代。

附接至固体表面

“固体表面”、“支持物”或“基质”在本文中可互换使用，并且指代但不限于任何柱(或柱材料)、珠子、试管、微量滴定盘、固体颗粒(例如，琼脂糖或sepharose)、微芯片(例如，硅、硅玻璃或金芯片)或起源膜(合成的(例如，过滤器)或生物的(例如，脂质体或囊泡))，本公开的配体或多聚体可直接或间接(例如，通过其他结合伴侣中间体，诸如接头)附接(即，偶联、连接或粘附)到其上，或配体或多聚体可嵌入其中(例如，通过受体或通道)。用于将多肽附接至固体支持物的试剂和技术是本领域众所周知的，例如氨基甲酸酯偶联。合适的固体支持物包括但不限于色谱树脂或基质(例如，SEPHAROSE-4 FF琼脂糖珠)、塑料微量滴定盘中的孔壁或孔底、二氧化硅基生物芯片、聚丙烯酰胺、琼脂糖、二氧化硅、硝化纤维、纸、塑料、尼龙、金属和它们的组合。配体和其他组合物可使用本领域已知的试剂和技术通过非共价缔合或通过共价键合附接在支持物材料上。在一些实施方案中，配体使用接头与色谱材料偶联。

在一个方面，本公开提供了一种由与不溶性支持物偶联的如上所述的配体或多聚体组成的亲和剂(亲和分离基质)。此支持物可以是一种或多种颗粒，诸如珠子；膜；过滤器；毛细管；整体柱；以及色谱中常用的任何其他形式。在亲和分离基质的有利实施方案中，支持物由基本上球形的颗粒(也称为珠子)组成。合适的粒度可在5-500μm，诸如10-100μm，例如20-80μm的直径范围内。在替代实施方案中，支持物是膜。为了获得高吸附能力，支持物优选是多孔的，并且配体可与外表面以及孔表面偶联。在这个方面的有利实施方案中，支持物是多孔的。

在另一个方面，本公开涉及一种制备色谱亲和剂的方法，所述方法包括提供如上所述的配体，以及将所述配体与支持物偶联。例如可经由配体的氮或硫原子进行偶联。配体可直接或经由在支持物表面与配体之间提供适当距离的间隔元件间接偶联至支持物。用于将蛋白质配体固定到多孔或无孔表面的方法在本领域是众所周知的。

配体的产生

可使用本领域已知的用于化学合成、半合成方法和重组DNA方法的多种标准技术来产生可用于实践本公开的若干实施方案的配体和多聚体。还提供了用于产生配体和多聚体的方法，所述配体或多聚体单独或作为多结构域融合蛋白的一部分作为可溶性剂和细胞相关蛋白。在一些实施方案中，配体或多聚体的总体产生方案包括获得参考蛋白支架和鉴定支架内的多个残基以进行修饰。根据实施方案，参考支架可包含具有一个或多个α-螺旋区域的蛋白质结构或其他三级结构。一旦被鉴定，就可，例如通过一个或多个氨基酸的取代修饰多个残基中的任一个。在一些实施方案中，进行一个或多个保守取代。在一些实施方案中，进行一个或多个非保守取代。在一些实施方案中，天然氨基酸(例如，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸中的一种)被取代到目标位置的参考支架中进行修饰。在一些实施方案中，修饰不包括取代半胱氨酸或脯氨酸。在特定实施方案所需的经鉴定位置进行修饰后，所得修饰的多肽(例如，候选配体)可例如在质粒、细菌、噬菌体或其他载体中重组表达(例如，以增加每个修饰的多肽的数目)。然后可纯化和筛选修饰的多肽以鉴定那些具有与感兴趣的特定靶标(例如，AAV2病毒粒子或衣壳)特异性结合的修饰的多肽。与参考支架相比，修饰的多肽可显示出对AAV2病毒粒子或衣壳的增强的结合特异性，或者可表现出很少或没有与给定感兴趣的靶标(或非靶蛋白)的结合。在一些实施方案中，根据感兴趣的靶标，参考支架可显示与感兴趣的靶标的一些相互作用(例如，非特异性相互作用)，而某些修饰的多肽将表现出至少约两倍、至少约五倍、至少约十倍、至少约20倍、至少约50倍或至少约100倍(或更多)增加的对感兴趣的靶标的结合特异性。下面更详细地提供了关于配体的产生、选择和分离的额外细节。

配体的重组表达

在一些实施方案中，诸如配体融合蛋白的配体是“重组产生的”(即，使用重组DNA技术产生)。可用于合成配体融合蛋白的示例性重组方法包括但不限于基于聚合酶链反应(PCR)的合成、串联体化、无缝克隆和递归定向连接(RDL)(参见例如，Meyer等人,Biomacromolecules 3:357-367(2002)；Kurihara等人,Biotechnol.Lett.27:665-670(2005)；Haider等人,Mol.Pharm.2:139-150(2005)；以及McMillan等人,Macromolecules32(11):3643-3646(1999)。

在另一个方面，还提供了包含编码根据本文所公开的实施方案的配体或多聚体的多核苷酸序列的核酸。因此，本公开涵盖本发明核酸序列的所有形式，诸如编码多肽(配体)或多聚体的RNA和DNA。本公开提供了载体，诸如质粒，其除了编码序列之外还包含用于表达根据本公开的多肽或多聚体所需的信号序列。此类多核苷酸任选地还包含一种或多种表达控制元件。例如，多核苷酸可包含一种或多种作为表达控制元件的启动子或转录增强子、核糖体结合位点、转录终止信号和聚腺苷酸化信号。可将多核苷酸插入任何合适的载体内，所述载体可包含在任何合适的宿主细胞内用于表达。在一个实施方案中，载体包含编码根据本公开的多聚体的核酸，其中编码每个单元的单独核酸可具有同源或异源DNA序列。

编码配体和多聚体的核酸的表达通常通过将编码配体的核酸可操作地连接至表达载体中的启动子来实现。典型的表达载体含有可用于调节所需核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。可用于在大肠杆菌中的表达的示例性启动子包括例如T7启动子。

本领域已知的方法可用于构建含有编码配体的核酸序列以及适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括但不限于体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/基因重组。多核苷酸的表达可在本领域已知的任何合适的表达宿主中进行，包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，编码配体的核酸序列可操作地连接至合适的启动子序列，使得所述核酸序列在宿主中被转录和/或翻译成配体。

可以利用多种宿主表达载体系统来表达编码配体的核酸。含有编码配体(例如，单个配体亚基或配体融合体)或其部分或片段的核酸的载体包括质粒载体、单链和双链噬菌体载体，以及单链和双链RNA或DNA病毒载体。噬菌体和病毒载体也可使用已知的感染和转导技术以包装或封装病毒的形式引入宿主细胞。此外，病毒载体可以是有复制能力的，或者也可以是复制缺陷型的。可选地，无细胞翻译系统也可用于使用来源于DNA表达构建体的RNA来产生蛋白质(参见例如，WO86/05807和WO89/01036；以及美国专利号5,122,464)。

通常，任何类型的细胞或培养的细胞系都可用于表达本文所提供的配体或多聚体。在一些实施方案中，用于产生工程化宿主细胞的背景细胞系是噬菌体、细菌细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。多种宿主表达载体系统可用于表达配体融合蛋白的编码序列。哺乳动物细胞可用作用含有感兴趣的靶标编码序列和融合多肽编码序列的重组质粒DNA或粘粒DNA表达载体转染的宿主细胞系统。细胞可以是来自具有转化或转基因性质的生物体、培养物或细胞系的初级分离物。

合适的宿主细胞包括但不限于微生物，诸如用含有配体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；用含有配体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；用含有配体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有配体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统。

可在产生配体中用作宿主细胞的原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，诸如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。用于原核宿主细胞的表达载体通常含有一种或多种表型选择标记基因(例如，编码赋予抗生素抗性或提供自养需求的蛋白质的基因)。有用的原核宿主表达载体的实例包括pKK223-3(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、pGEMl(Promega,Wis.,USA)、pET(Novagen,Wis.,USA)和pRSET(Invitrogen,Calif.,USA)系列载体(参见例如，Studier,J.Mol.Biol.219:37(1991)和Schoepfer,Gene 124:83(1993))。原核宿主细胞表达载体中经常使用的示例性启动子序列包括T7(Rosenberg等人,Gene 56:125-135(1987))、β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖启动子系统(Chang等人,Nature 275:615(1978))；以及Goeddel等人,Nature 281:544(1979))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人,Nucl.Acids Res.8:4057,(1980))和tac启动子(Sambrook等人,1990,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。

在一些实施方案中，使用真核宿主细胞系统，包括用含有配体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母细胞。可用于产生本公开的组合物的示例性酵母包括来自酵母属、毕赤酵母属、放线菌属和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的酵母。酵母载体通常含有来自2mu酵母质粒的复制起点序列、自主复制序列(ARS)、启动子区域、聚腺苷酸化序列、转录终止序列和选择标记基因。酵母表达构建体中启动子序列的实例包括来自以下各项的启动子：金属硫蛋白、3-磷酸甘油激酶(Hitzeman,J.Biol.Chem.255:2073(1980))和其他糖酵解酶，诸如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。用于酵母表达的其他合适的载体和启动子以及酵母转化方案是本领域已知的。参见例如，Fleer,Gene 107:285-195(1991)和Hinnen,PNAS 75:1929(1978)。

昆虫和植物宿主细胞培养系统也可用于产生本公开的组合物。此类宿主细胞系统包括例如用含有配体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有配体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统，包括但不限于美国专利号6,815,184；美国公布号60/365,769和60/368,047；以及WO2004/057002、WO2004/024927和WO2003/078614中教导的表达系统。

在一些实施方案中，可以使用宿主细胞系统，包括用重组病毒表达载体(例如，腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒)感染的动物细胞系统，包括经工程改造以含有编码在双微染色体中稳定扩增(CHO/dhfr)或不稳定扩增的配体的DNA的多个拷贝的细胞系(例如，鼠细胞系)。在一些实施方案中，包含编码配体的多核苷酸的载体是多顺反子的。可用于产生这些组合物的示例性哺乳动物细胞包括293细胞(例如，293T和293F)、CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6(Crucell,Netherlands)细胞VERY、Hela细胞、COS细胞、MDCK细胞、3T3细胞、W138细胞、BT483细胞、Hs578T细胞、HTB2细胞、BT20细胞、T47D细胞、CRL7O30细胞、HsS78Bst细胞、杂交瘤细胞和其他哺乳动物细胞。可用于实施本公开的实施方案的其他示例性哺乳动物宿主细胞包括但不限于T细胞。示例性表达系统和选择方法是本领域已知的，并且包括在以下参考文献和其中引用的参考文献中描述的那些：Borth等人,Biotechnol.Bioeng.71(4):266-73(2000)；Werner等人,Arzneimittelforschung/Drug Res.48(8):870-80(1998)；Andersen等人,Curr.Op.Biotechnol.13:117-123(2002)；Chadd等人,Curr.Op,Biotechnol.12:188-194(2001)，以及Giddings,Curr.Op.Biotechnol.12:450-454(2001)。表达系统和选择方法的其他实例描述于Logan等人,PNAS 81:355-359(1984)；Birtner等人MethodsEnzymol.153:51-544(1987))中。哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译控制序列通常来源于病毒基因组。哺乳动物表达载体中常用的启动子序列和增强子序列包括来源于多瘤病毒、腺病毒2、猿猴病毒40(SV40)和人巨细胞病毒(CMV)的序列。用于哺乳动物宿主细胞的示例性可商购获得的表达载体包括pCEP4(Invitrogen)和pcDNA3(Invitrogen)。

用于将核酸引入宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见例如，Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。

用于将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体并且尤其是逆转录病毒载体已成为将基因插入哺乳动物(例如，人)细胞的最广泛使用的方法。其他病毒载体可来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。

用于将感兴趣的DNA和RNA多核苷酸引入宿主细胞的方法包括细胞的电穿孔，其中将电场施加到细胞以增加细胞膜的渗透性，从而允许将化学品、药物或多核苷酸引入细胞。可使用电穿孔将含有DNA或RNA构建体的配体引入哺乳动物细胞或原核细胞。

在一些实施方案中，细胞的电穿孔导致配体-CAR在T细胞、NK细胞、NKT细胞的表面上的表达。此种表达在细胞的整个生命周期中可以是瞬时的或稳定的。电穿孔可用本领域已知的方法完成，包括MaxCyte和转染系统(MaxCyte,Gaithersburg,MD,USA)。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠子和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在一些实施方案中，核酸与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可封装在脂质体的水性内部、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸缔合的连接分子附接到脂质体、包载在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质结合、作为悬浮液包含在脂质中、包含或与胶束复合或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以双层结构、胶束或“塌陷”结构存在。它们也可简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的一类化合物。

适合于使用的脂质可从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸二鲸蜡脂(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可储存在约-20℃下。氯仿可用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是一个通用术语，涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质媒介物。脂质体的特征在于具有带磷脂双层膜和内部水介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分隔的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前进行自我重排，并在脂质双层之间包载水和溶解的溶质(Ghosh等人,Glycobiology5:505-510(1991))。然而，也涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可假定具有胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。

不管用于将外源核酸引入宿主细胞的方法如何，宿主细胞中重组核酸序列的存在可通过本领域已知的多种测定法常规地确认。此类测定包括例如“分子生物学”测定，诸如DNA和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生化”测定，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定来鉴定落入本公开范围内的剂。

报告基因用于鉴定潜在的转染细胞和评估调控序列的功能性。一般而言，报告基因是不存在于受体生物体、组织或细胞中或不由其表达且编码多肽的基因，所述多肽的表达通过一些易于检测的特性例如酶活性来证明。在将DNA引入受体细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因包括但不限于编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,FEBSLett.479:79-82(2000))。合适的表达系统是本领域已知的并且可使用已知技术制备或商购获得。一般而言，具有显示报告基因最高表达水平的最小5'侧接区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区域可常规地连接至报告基因并用于评估剂调节启动子驱动的转录的能力。

许多选择系统可用于哺乳动物宿主-载体表达系统中，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人,Cell22:817(1980))基因。另外，抗代谢物抗性可用作选择例如dhfr、gpt、neo、hygro、trpB、hisD、ODC(鸟氨酸脱羧酶)和谷氨酰胺合酶系统的基础。

在一些实施方案中，起始子N末端蛋氨酸包含在配体的NH末端处。在许多情况下，分离的配体没有N末端蛋氨酸残基，推测所述残基在表达过程中被切割。在许多情况下，获得的混合物只有一部分纯化的配体含有N末端蛋氨酸。对于本领域技术人员显而易见的是，N末端蛋氨酸的存在或不存在不影响本文所述的配体和亲和剂的功能性。

配体纯化

一旦通过重组表达产生了配体或配体融合蛋白或多聚体，就可通过本领域已知的重组蛋白纯化方法进行纯化，例如通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法和尺寸排阻柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过任何其他用于纯化蛋白质的标准技术来对其进行纯化。在一些实施方案中，配体任选地与本文具体公开的或本领域已知的异源多肽序列融合以促进纯化。在一些实施方案中，在使用本领域已知的技术最终制备配体之前，从组合物中去除用于亲和纯化的配体亲和柱的配体(例如，抗体和其他亲和基质)以及任选地配体或由这些配体结合的配体融合组合物的其他组分。

配体的化学合成

除了重组方法之外，还可使用本领域已知的多种液相和固相化学方法，使用所需多肽的有机化学合成来进行配体产生。各种自动合成仪是可商购获得的并且可根据已知方案使用。参见例如，Tam等人,J.Am.Chem.Soc.,105:6442(1983)；Merrifield,Science,232:341-347(1986)；Barany和Merrifield,The Peptides,Gross and Meienhofer,编辑,Academic Press,New York,1-284；Barany等人,Int.J.Pep.Protein Res.,30:705 739(1987)；Kelley等人Genetic Engineering Principles and Methods,Setlow,J.K.,编辑Plenum Press,NY.1990,第12卷,第1-19页；Stewart等人,Solid-Phase PeptideSynthesis,W.H.Freeman Co.,San Francisco,1989。这些方法的优点之一是它们允许将非天然氨基酸残基掺入配体序列中。

在本公开的方法中使用的配体和多聚体可在合成或翻译期间或之后被修饰，例如通过糖基化、乙酰化、苄基化、磷酸化、酰胺化、聚乙二醇化、甲酰化、通过已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解裂解、与抗体分子的键联、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、泛素化等(参见例如，Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties,第2版(W.H.Freemanand Co.,N.Y.,1992)；Postranslational Covalent Modification of Proteins,Johnson,编辑(Academic Press,New York,1983),第1-12页；Seifter,Meth.Enzymol.,182:626-646(1990)；Rattan,Ann.NY Acad.Sci.,663:48-62(1992))。在一些实施方案中，肽在N末端乙酰化和/或在C末端酰胺化。

许多化学修饰中的任一种可通过已知技术进行，包括但不限于乙酰化、甲酰化等。另外，衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。

在一些实施方案中，肽主链的环化或大环化通过侧链与侧链键联的形成来实现。用于实现这一点的方法是本领域众所周知的并且可能涉及天然和非天然氨基酸。途径包括二硫化物形成、羊毛硫氨酸形成或硫醇烷基化(例如，迈克尔加成(Michael addition))、氨基与羧酸侧链之间的酰胺化、点击化学(例如，叠氮化物-炔烃缩合)、肽装订、闭环复分解和酶的使用。

用于纯化的亲和剂

在基于亲和色谱的纯化中，感兴趣的靶标(例如，蛋白质或分子)根据其特异性和可逆地结合配体的能力被选择性地分离，所述配体通常共价偶联至色谱基质。本公开的亲和配体可用作用于从澄清的细胞培养液(CCCF)或诸如生物样品的天然来源亲和纯化AAV2病毒粒子或衣壳(或两者的变体)的试剂。

在一些实施方案中，特异性结合AAV2病毒粒子或衣壳(或两者的变体)的配体或多聚体固定在诸如琼脂糖珠的珠子上，以形成亲和分离基质，并且然后用于亲和纯化靶标。

将蛋白质共价偶联至表面的方法是本领域技术人员已知的，并且可用于将配体附接至固体表面的肽标签是本领域技术人员已知的。此外，可使用本领域已知的任何试剂或技术将配体附接(即偶联、连接或粘附)至固体表面。在一些实施方案中，固体支持物包括珠子、玻璃、载玻片、芯片和/或明胶。因此，一系列配体可用于使用本领域已知的技术在固体表面上制作阵列。例如，美国公布号2004/0009530公开了用于制备阵列的方法，所述专利以引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，配体或多聚体用于通过亲和色谱分离AAV2病毒粒子或衣壳(或两者之一的变体)。在一些实施方案中，将配体或多聚体固定在固体支持物上。可使用本文所述的或本领域已知的其他技术和试剂将配体或多聚体固定在固体支持物上。合适的固体支持物在本文中描述或是本领域中已知并且在特定实施方案中适用于填充色谱柱。亲和剂可填充在各种尺寸的柱中并以各种线速度运行，或者可在有利于在配体与AAV2病毒粒子或衣壳(或两者之一的变体)之间形成复合物的条件下使固定的亲和配体与溶液接触。可洗掉未结合的材料。合适的洗涤条件可容易地由本领域技术人员确定。合适的洗涤条件的实例描述于Shukla和Hinckley,Biotechnol Prog.2008年9月至10月；24(5):1115-21.doi:10.1002/btpr.50。

在一些实施方案中，色谱通过混合含有感兴趣的靶标和配体的溶液，然后分离感兴趣的靶标和配体(例如含有AAV2病毒粒子或衣壳(或两者的变体)的裂解液和配体)的复合物来进行。例如，将配体或多聚体固定在诸如珠子的固体支持物上，然后通过过滤与AAV2病毒粒子或衣壳(或两者之一的变体)一起从溶液中分离出来。在一些实施方案中，配体或多聚体是含有肽标签的融合蛋白，诸如聚His尾或链霉亲和素结合区，其可用于在复合物形成后使用固定化金属亲和色谱树脂或链霉亲和素包被的底物来分离配体或多聚体。一旦分离，AAV2病毒粒子或衣壳(或两者的变体)可在洗脱条件下从配体或多聚体中释放出来，并以纯化的形式回收。

在一些实施方案中，本公开的配体或多聚体偶联至可用于生物过程应用的高度交联的琼脂糖基础基质。配体或多聚体与基础基质的附接可通过柔性间隔物来确保配体可及性并随后导致高结合能力。本公开的配体和多聚体的亲和力确保了AAV2病毒粒子或衣壳(或两者之一的变体)的特异性结合。此外，本公开的配体被设计用于增强碱稳定性，使得能够在原位清洗(CIP)和消毒应用中重复使用0.1M至0.5M NaOH。

在另一个方面，本公开提供了一种分离AAV2病毒粒子或衣壳(或两者之一的变体)的方法，其中使用如上所公开的分离基质。在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)使包含AAV2病毒粒子或衣壳(或两者的变体)的液体样品与如上所公开的分离基质接触，(b)用洗涤液洗涤分离基质，(c)用洗脱液从分离基质洗脱AAV2病毒粒子或衣壳(或两者的变体)，以及(d)用清洗液(其也可称为原位清洗(CIP)液)清洗分离基质，例如以至少一分钟，例如一至四分钟或更长时间的接触(孵育)时间。

液体样品、洗涤液和洗脱液的合适组成，以及进行分离的一般条件是亲和色谱领域众所周知的。包含AAV2病毒粒子或衣壳(或两者的变体)的液体样品可包含宿主细胞蛋白(HCP)，例如HEK293T细胞。宿主细胞蛋白质可在步骤(b)期间解吸。

AAV2病毒粒子或衣壳(或两者之一的变体)的结合已在接近中性pH(6-9)且离子强度范围很广(例如100-400mM NaCl)的缓冲液中得到证明。常规缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、Tris，可用于平衡和上样。

在一些实施方案中，在使溶液与分离基质接触之前，例如通过超滤浓缩含有AAV2病毒粒子或衣壳(或两者的变体)的溶液或样品。例如，含有AAV2的溶液，例如澄清细胞培养料，可浓缩至多20倍。AAV2病毒粒子或衣壳(或两者之一的变体)的浓缩减少了亲和色谱的上样时间。由于热力学平衡效应，浓度的增加也可能对结合能力产生积极影响，这可能使纯化所需的分离基质体积减少。浓缩包含AAV2的补料流也能够使处理时间的显著减少。

可选地，含有AAV2病毒粒子或衣壳(或两者的变体)的溶液或样品是非浓缩或稀释的溶液，例如澄清细胞培养料(CCCF)。本公开的亲和分离基质的特征在于能够以高体积流速处理CCCF，从而使从稀释的CCCF料流中捕获成为可能。

可用于AAV亲和纯化的洗涤溶液的实例包括分离基质平衡缓冲液，诸如PBS，含0.01％泊洛沙姆P188(或其他AAV2兼容表面活性剂)的PBS，50mM Tris、400mM NaCl(pH7.5)或50mM Tris、250mM NaCl(pH 8.3)。洗涤溶液的任选的添加剂可用于降低HCP，所述添加剂包括例如50-250mM的精氨酸；0.25-1M的离液剂(例如，尿素、胍)；0.2–1M的高盐(例如，NaCl、MgCl2)；25-100mM的辛酸(羊脂酸)；0.5-1M的四甲基氯化铵(TMAC)。在某些情况下，5％-20％的有机醇(例如，丙二醇、1,6-己二醇、乙醇)以及5％-20％的渗透保护剂诸如海藻糖、蔗糖或甘氨酸甜菜碱是有用的。

AAV2病毒粒子和衣壳的洗脱通常通过降低pH(例如，降低至pH 2.0-3.0)来实现，但也可使用更高的pH值。本领域技术人员可容易地确定用于洗脱AAV2病毒粒子或衣壳(或两者之一的变体)的最佳条件。

本公开的亲和剂是耐碱的，能够使用浓度高达0.5M的NaOH进行清洗。在某些实施方案中，例如每个循环暴露于0.5M NaOH至多30至60分钟的CIP方案可确保数个循环(例如，15-30个循环)的色谱性能一致，包括至多70％-90％初始结合能力以及低残留DNA和HCP水平，以及流动能力基本没有变化。

虽然已经通过说明的方式描述了本发明的一些实施方案，但是显而易见的是，在不脱离本发明的精神或超出权利要求的范围的情况下，本发明可通过许多修改、变化和改编以及使用本领域技术人员范围内的许多等效方案或替代解决方案来付诸实践。

所有出版物、专利和专利申请均以引用方式整体并入本文，其程度犹如每个单独出版物、专利或专利申请具体地且单独地被指示为以引用方式整体并入一样。

实施例

本文所呈现的实施例代表本发明的某些实施方案。然而，应当理解，这些实施例仅出于说明目的，并不意图也不应被解释为完全限定本发明的条件和范围。实施例使用标准技术进行，其是本领域技术人员众所周知和常规的，除非另有详细描述。

实施例1.一般方法

通过标准Fmoc固相肽合成技术合成肽，并通过制备型反相HPLC纯化肽。肽的纯度通过具有紫外和四极杆飞行时间质谱检测的RP-UPLC进行评估。

使用标准技术在大肠杆菌中表达重组亲和配体。使用多柱色谱纯化配体。对于His标记的配体，固定化金属亲和色谱(IMAC)用作主要捕获步骤。使用AviTag^TM系统(Avidity,Aurora,CO)产生生物素化配体。通过省略外源生物素来制备带有AviTag^TM序列的非生物素化配体。重组蛋白配体的纯度和身份通过SDS-PAGE、RP UPLC、四极杆飞行时间质谱和尺寸排阻色谱(Sephadex S75,Cytiva,Marlborough,MA)的组合进行评估。在许多情况下，分离的配体没有N末端蛋氨酸残基，推测所述残基在表达过程中被切割。

实施例3.AAV2亲和配体的产生

在T7启动子(Millipore/Sigma)的控制下，将AAV2配体克隆到质粒pET28a(+)中，并使用T7表达系统在BL21细胞(New England Biolabs)中表达。使用IMAC和离子交换色谱纯化His标记的配体。

实施例3.示例性AAV2亲和配体

本实施例使用生物层干涉测量法(ForteBio,Menlo park,CA.)证明了生物素化配体与AAV2衣壳的结合。将生物素化亲和配体固定在传感器上并与含有在10mM磷酸钠、100mM氯化钠、0.01％(重量/体积)牛血清白蛋白和0.1％(体积/体积)Triton X-100中5×10¹¹vp/mL的AAV2溶液(pH 7.0)一起孵育。包括空白传感器作为对照。

缔合阶段显示响应的初始线性增加，这是AAV的典型特征。随着传感器变得饱和，传感图显示出更大的曲率。对于每个配体，在3600秒孵育时间后测量响应，并示于表1中。图1提供了典型的传感图(配体27)。

表1.AAV2结合响应

实施例3.亲和配体的碱性稳定性

本实施例证明了生物素化亲和配体的氢氧化钠稳定性。将指定的亲和配体在0.1MNaOH中孵育24小时，并且然后中和。如实施例2中所述测量NaOH处理的配体的结合并与未处理的配体进行比较。根据以下公式计算保留的结合：

％保留的结合＝

(NaOH处理后的实测响应)÷(未处理的实测响应)×100

表2中的数据表明，许多亲和配体在测试条件下表现出高稳定性。

表2.AAV2结合响应

实施例4.示例性亲和树脂的构建

本实施例证明了包含本公开的配体的亲和树脂的产生和表征。经由配体中的单个游离硫醇将配体与溴乙酰基活化的琼脂糖珠缀合来制备亲和树脂。因此，将RAPID RUN 6％琼脂糖珠(ABT,Madrid,Spain)和Jetted A50珠(Purolite,King of Prussia,PA)用碳酸二琥珀酰亚胺酯活化，与乙二胺反应，接着用溴乙酸盐洗涤以使游离胺功能化。将亲和配体在室温下使用EDC活化(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)经由羧基末端半胱氨酸与溴乙酰基活化的珠子缀合。目标配体密度在1-8g/L之间变化。洗涤后，用过量的硫代甘油使珠子失活。实际配体密度根据以下公式使用减法RP-HPLC方法测量：

实际配体密度＝(补料中测得的[配体]–流出物中测得的[配体])。

实施例5.AAV2纯化

本实施例证明了亲和树脂在短停留时间内亲和捕获病毒颗粒的功能结合能力。使用含有滴度为1.15×10¹²vp/mL总衣壳的病毒衣壳的澄清细胞培养补料流(CCCF)以5mg/mL的配体密度上样到由配体30制备的亲和树脂上。将树脂装入0.3×5cm柱中，并如表3所示操作。将洗脱的材料通过SDS-PAGE与剥离级分一起进行分析。

此柱的动态结合能力针对指定的病毒载量确定了1分钟的停留时间(图2)，并且在这些条件下为大约1×10¹⁴vp/mL色谱树脂。

表3.AAV2衣壳的亲和纯化

表3和表4的缩写。CV，柱体积；Res.，停留。

实施例6.三种含有AAV2的补料流的纯化

来自三个不同制造商的三种不同补料流，每种都含有AAV2衣壳，在如实施例5中制备并如表4中所述操作的柱上进行纯化。如表5所示，针对每种补料使用不同的上样体积和条件。总衣壳ELISA用于量化衣壳量。分别使用Cygnus^TM CHO宿主细胞蛋白第三代(CHO HostCell Proteins 3rd Generation)测定和ThermoFisher Quant-iT^TM PicoGreen^TM测定收集每个纯化循环的级分并针对残留宿主细胞蛋白(HCP)和残留宿主细胞DNA(HCDNA)进行分析。纯化的病毒衣壳的分析示于表5中。

表4.AAV2衣壳的亲和纯化

表5.不同补料流的上样和纯化特征

属性	1号	2号	3号
				停留时间(min)	1.4	2	2
上样体积(mL)	292	353	200
				载量(vp/mLRES)	3.5×1014	5.5×1014	9.7×1013
产量(vp/mLRES)	2.5×1014	4.5×1014	7.4×1013
				HCP(ppm)	900	200	120
HCDNA(ppm)	1800	20	250

实施例7.使用多聚体配体的纯化

如实施例4中所述将各种单体和多聚体亲和配体偶联至树脂。测定每种树脂的静态结合能力(SBC)。结果示于表6中。

表6.

实施例8.螺旋2的作用

表1和表2中配体13、16、18、19、26、27、29和30的配体结合数据证明了序列变异在螺旋2中的作用。这些结果表明，在螺旋2中进行的修饰维持配体结合。

受益于前述描述和相关附图中呈现的教导，这些公开所属领域的技术人员将想到本文所阐述的公开的许多修改和其他实施方案。因此，应当理解，本公开不限于所公开的具体实施方案，并且修改和其他实施方案意图包括在所附权利要求和本文所公开的实施方案列表的范围内。尽管本文采用特定术语，但是仅在一般意义和描述性意义上而不是出于限制的目的使用这些术语。

本文所公开的任何方法不需要以列举顺序进行。本文所公开的方法包括从业者采取的某些行动；但是，它们也可包括任何第三方对这些行为的指示，无论是明示的还是暗示的。

表7.序列信息

**SEQ ID NO.1、2和51-55中的每个X在具体实施方式中的标题为“AAV2亲和配体”的部分中定义。

Claims (33)

1.一种亲和配体，其包含三螺旋束蛋白，所述三螺旋束蛋白包含由下式表示的氨基酸序列，从N末端到C末端，

X₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀LNX ₅₃A(SEQ ID NO.51)

其中

X₅是W、Y、D、F、H、I或R，优选W；

X₇是R、A、W、V、H、Y、T、D或Q，优选R；

X₈是D、Q、E、I、T或N，优选D；

X₁₁是F、I、S、Y、L、K、V、W或Q，优选F；

X₁₄是E、D、H、K、S、N、G、A或V，优选E；

X₁₅是除C或P以外的任何氨基酸，优选E；

X₁₈是除C或P以外的任何氨基酸，优选R；

X₄₁是H、Y、R或A，优选H；

X₄₂是S、G、Q、T、F、W、A或N，优选Q；

X₄₃是S、Q、F、Y、A或T，优选S；

X₄₆是N、R、W、S、Q、G、T或Y，优选N；

X₄₉是F、W、S、E、D、Y、N或T，优选S；

X₅₀是Q、N、E、T、R或F，优选Q；

X₅₃是L、G、H、T、A、V、F、Y、E或I，优选L；

[Z]是α-螺旋形成肽结构域，并且优选是LPNLTEEQRRAFIESL RDDPSQ；并且

所述亲和配体特异性地与腺相关病毒亚型2(AAV2)颗粒或衣壳或AAV2颗粒或衣壳的变体相互作用。

2.如权利要求1所述的亲和配体，其中所述式是以下中的任一项：

VDAKX₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀LNX₅₃AQAPK,

VDAKX₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀LNX₅₃AQRAPK，

VDAEX₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀LNX₅₃AQAPK，或

VDAEX₅DX₇X₈LEX₁₁ARX₁₄X₁₅IEX₁₈-[Z]-X₄₁X₄₂X₄₃LLX₄₆EAX₄₉X₅₀LNX₅₃ARAPK(分别是SEQ IDNO.52-55)。

3.如权利要求1或2所述的亲和配体，其中[Z]包含葡萄球菌A蛋白(SPA)Z-结构域、A-结构域、B-结构域、C-结构域、D-结构域和E-结构域中的任一个，优选Z-结构域的SPA结构域的螺旋2，或其任何碱稳定变体。

4.如权利要求1-3中任一项所述的亲和配体，其中[Z]选自具有包含以下的氨基酸序列的肽中的任一种：LPNLTEEQRRAFIESLRDD PPQ(SEQ ID NO.38)、LPNLTEERRRAFIESLRDDPSQ(SEQ ID NO.39)、LPNLTEEQRRAFIESLRDGPSQ(SEQ ID NO.40)、LPY LTEEQRRAFIESLRDDPSQ(SEQ ID NO.41)、LPNLTEEQRRIFIES LRDDPSQ(SEQ ID NO.42)、LPNLTEEQRRTFIESLRDDPSQ(SE Q ID NO.43)、LPNLTEEQRRAFIEPLRDDPSQ(SEQ ID NO.44)或LPNLTEEQRRAFIESLRDDPSQ(SEQ ID NO.45)。

5.如权利要求1-4中任一项所述的亲和配体，其中所述配体的N末端之前是M或MAQGT(SEQ ID NO.46)。

6.如权利要求1-5中任一项所述的亲和配体，其中所述配体的C末端之后是VD、VDGEKPEK(SEQ ID NO.47)、VDGLNDIFEAQ KIEWHE(SEQ ID NO.48)、VDGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO.49)或GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ IDNO.50)。

7.如权利要求1所述的亲和配体，其中所述配体包含SEQ ID NO.3-30、32或34-37中的任一项。

8.如权利要求7所述的亲和配体，其中所述配体包含SEQ ID NO.30。

9.如权利要求1-8中任一项所述的亲和配体，其包含肽标签，任选地，其中所述标签是血凝素、c-myc、单纯疱疹病毒糖蛋白D、T7、GST、GFP、MBP、strep标签、His标签、Myc标签、TAP标签或FLAG标签。

10.如权利要求1-9中任一项所述的亲和配体，其还包含C末端半胱氨酸或赖氨酸。

11.一种多聚体，其包含如权利要求1-10中任一项所述的多个亲和配体。

12.如权利要求12所述的多聚体，其是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。

13.如权利要求11或12所述的多聚体，其中所述亲和配体包含SEQ ID NO.30。

14.如权利要求11所述的多聚体，其包含SEQ ID NO.31或33。

15.如权利要求1-14中任一项所述的亲和配体或多聚体，其中所述配体或多聚体还包含至少一种异源剂，所述异源剂可操作地连接至所述亲和配体从而形成缀合物或融合蛋白。

16.如权利要求15所述的亲和配体或多聚体，其中所述异源剂选自由以下组成的组：一种或多种小分子诊断剂或治疗剂；肽标签；DNA、RNA或杂交DNA-RNA分子；可追踪标记；放射性剂；抗体；单链可变结构域；和免疫球蛋白片段。

17.一种分离基质，其包含如权利要求1-14中任一项所述的至少一种亲和配体或多聚体。

18.如权利要求17所述的分离基质，其中所述亲和配体或所述多聚体与固体支持物偶联。

19.如权利要求18所述的分离基质，其中所述亲和配体或多聚体经由硫醇键联与所述固体支持物偶联。

20.如权利要求17-19中任一项所述的分离基质，其中所述固体支持物是色谱树脂或基质。

21.如权利要求20所述的分离基质，其中所述固体支持物是交联琼脂糖基质。

22.一种分离腺相关病毒亚型2(AAV2)颗粒或衣壳的方法，其包括将所述AAV2颗粒或衣壳与如权利要求17-21中任一项所述的分离基质接触以及回收所述AAV2颗粒或衣壳。

23.如权利要求22所述的方法，其包括(a)使如权利要求17-21中任一项所述的分离基质与包含所述AAV2颗粒或衣壳的组合物接触，(b)用洗涤缓冲液洗涤所述分离基质，(c)用洗脱缓冲液从所述分离基质中洗脱所述AAV2颗粒或衣壳，以及(d)回收所述AAV2颗粒或衣壳。

24.如权利要求22或23所述的方法，其还包括(e)用碱性清洗溶液处理所述分离基质足够长的时间以清洗残留物质的所述基质并再生所述分离基质的至少80％的所述AAV2颗粒或AAV2衣壳结合能力。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述碱性清洗溶液包含约0.1M NaOH至约0.5MNaOH。

26.如权利要求24或25所述的方法，其中当步骤(a)-(e)重复至少5次，并且优选至少10次时，所述分离基质保留其AAV2颗粒或AAV2衣壳结合能力的至少80％。

27.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其中步骤(a)-(e)用单批次的分离基质重复至少10次。

28.一种核酸或载体，其编码如权利要求1-14中任一项所述的亲和配体或多聚体。

29.一种表达载体，其包含如权利要求28所述的核酸或载体，其中所述亲和配体或多聚体的编码区可操作地连接至一个或多个表达控制元件。

30.一种宿主细胞，其包含如权利要求28或29所述的核酸或载体。

31.如权利要求30所述的宿主细胞，其中宿主细胞是大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母。

32.一种产生亲和配体或多聚体的方法，其包括在如权利要求30或31所述的宿主细胞表达所述亲和配体或所述多聚体的时间和条件下培养所述宿主细胞。

33.一种制备分离基质的方法，其包括将如权利要求1-14中任一项所述的亲和配体或多聚体与固体表面缀合。