ES2783376T3 - Conjugados de anticuerpo-fármaco con alta carga de fármaco - Google Patents

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Abstract

Un conjugado de anticuerpo-fármaco específico del sitio mediado por transglutaminasa que comprende la fórmula: anticuerpo-(T-(X-Y-Za)b)c, en la que: T es 1) un marcador que contiene glutamina modificada en un sitio específico, 2) una glutamina endógena, y/o 3) una glutamina endógena que se ha hecho reactiva mediante modificación del anticuerpo o una transglutaminasa modificada; X es una unidad donante de amina; Y es un engarce; y Z es un resto agente; X-Y-Z es un agente donante de amina conjugado de manera específica del sitio con una glutamina de T mediante gamma-carboxamida; a es un número entero de 1 a 6; b es un número entero de 1 a 6; c es un número entero del 1 al 20; y en el que el producto (relación fármaco-anticuerpo) de a, b, y c es al menos 5, que comprende a) sustituciones de aminoácidos en las posiciones N297Q, y K222R, en el que el agente donante de amina está conjugado de manera específica del sitio con la glutamina endógena en la posición 295 y la glutamina sustituida en la posición 297; y b) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina está conjugado de manera específica del sitio con los marcadores que contienen glutamina en un extremo carboxilo de una cadena ligera del anticuerpo, en el que la relación fármaco-anticuerpo es de 5-7.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de anticuerpo-fármaco con alta carga de fármaco
Referencia a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica los beneficios de las solicitudes provisionales de EE. UU. n.° 61/984.645 presentada el 25 de abril de 2014, 62/028.731 presentada el 24 de julio de 2014, 62/103.999 presentada el 15 de enero de 2015, y 62/147.293 presentada el 14 de abril de 2015.
Referencia al listado de secuencias
La presente solicitud se está presentando electrónicamente mediante EFS-Web e incluye un listado de secuencias remitido electrónicamente en formato .txt. El archivo .txt contiene un listado de secuencias titulado "PC7207805SEQLISTING_ST25.txt" creado el 9 de abril de 2015 y que tiene un tamaño de 9 KB. El listado de secuencias contenido en este archivo .txt es parte de la memoria descriptiva.
Campo
La presente invención se refiere en general a conjugados anticuerpo-fármaco mediados por transglutaminasa con una relación fármaco-anticuerpo (DAR ) alta, que comprende 1) marcadores que contienen glutamina, glutaminas endógenas, y/o glutaminas endógenas que se hacen reactivas mediante modificación del anticuerpo o una transglutaminasa modificada (por ejemplo, con una especificidad alterada por el sustrato); y 2) agentes donantes de amina que comprenden unidades donantes de amina, engarces, y restos de agente, como se define en las reivindicaciones adjuntas. La divulgación también se refiere a procedimientos para la fabricación y procedimientos de utilización de dichos conjugados de anticuerpo-fármaco.
Antecedentes
La terapia con anticuerpos proporciona un tratamiento terapéutico dirigido en pacientes con distintos trastornos, tales como cánceres y enfermedades inmunológicas, y por lo tanto han tenido un papel importante en la investigación biológica. Se han explorado diferentes estrategias de terapia de anticuerpos dirigidos, incluyendo los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC). Véase, por ejemplo, Doronina y col., Bioconj. Chem. 19:1960-1963 (2008); y Junutula y col., Nat. Biotechnol. 26: 925-932 (2008).
En el caso de los conjugados de anticuerpo-fármaco (es decir, inmunoconjugados), se unen o conjugan en general unas moléculas pequeñas citotóxicas (fármacos) con anticuerpos para el suministro dirigido local de los restos farmacológicos en los tumores. Los procedimientos de conjugación convencionales para un ADC incluyen la modificación química mediante las aminas de la cadena lateral de la lisina o mediante los grupos sulfhidrilos activados de la cisteína reduciendo los enlaces disulfuro intercatenarios. El ADCETRIS® (brentuximab vedotin) y KAD-CYLA® (ado-trastuzumab emtansina) son dos ejemplos de ADC que utilizan estos procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Tanaka y col, Fe Bs Letters 579:2092-2096 (2005); y Strop, Bioconj. Chem., (en prensa) (2014). Los procedimientos de conjugación de ADC convencionales tienden a dar lugar a mezclas heterogéneas de un número variable de fármacos unidas en posiciones no específicas con perfiles de seguridad, eficacia, y tasa de aclaramiento variables. Véase, por ejemplo, Wang y col., Protein Sci. 14: 2436-2446 (2005); y Firer y Gellerman, J. of Hematology & Oncology, 5:70 (2012). Se ha publicado que los ADC con dos a cuatro fármacos por anticuerpo son en general superiores a los conjugados con mayor carga (por ejemplo, con más de cuatro fármacos por anticuerpo) en términos de eficacia in vivo; tolerancia; y farmacocinética dando como resultado un índice terapéutico mayor. Véase, por ejemplo, Hamblett y col., Clinical Cancer Research, 10: 7063-7070 (2004).
También se han explorado recientemente estrategias enzimáticas que utilizan una transglutaminasa para producir un conjugado anticuerpo-fármaco. Las transglutaminasas (EC2.3.2.13; proteína-glutamina: gamma-glutamiltransferasa; proteína-glutamina: amina Y-glutamiltransferasa; CAS 80146-85-6) pertenecen a una familia de enzimas que catalizan la adición de un acilo a una amina primaria, en la que el grupo gamma-carboxamida del resto Y-glutamilo unido al péptido es el donante de acilo, y la amina primaria es el receptor de acilos y el donante de amina. La conjugación de anticuerpo y fármaco utilizando una transglutaminasa proporciona las ventajas de alta selectividad, procedimientos de reacción simplificados, y condiciones de reacción suaves. Véase, por ejemplo, Strop y col., Chemistry & Biology, 20:161-167 (2013); y Farias y col., Bioconj. Chem. 25(2):240-250 (2014). Los documentos US20130230543 y US2013/0122020 describen la conjugación específica del sitio mediada por transglutaminasa de anticuerpos y moléculas pequeñas.
Grünberg J y col. (PLOS ONE, vol. 8, n.° 4 de abril de 2013, página e60350) desvela la conjugación mediada por transglutaminasa de celados DOTA acoplados a armazones de decalisina mediante Gln295/297 a un anticuerpo para producir inmunoconjugados que tienen 2, 6 o 10 entidades DOTA (página 1, resumen).
El documento US 2013/230543 desvela la conjugación mediada por transglutaminasa de una variedad de cargas útiles de engarce a una IgG1 mediante engarces Q-tag, siendo la carga máxima de 2 o 4 restos por anticuerpo.
Jeger S y col (Angewandte Chemie International Edition, Wiley, vol. 49, n.° 51, diciembre de 2010, páginas 9995-9997) desvela la conjugación mediada portransglutaminasa de tres tipos diferentes de carga útil a un anticuerpo anti-CD20 o anti-L1-CAM. La relación fármaco respecto a anticuerpo se desvela como 2 o 4.
El documento US 2013/122020 desvela un ratón quimérico y anticuerpos anti-Trop-2 humanizados modificados con marcadores ("Q") de transglutaminasa que contienen glutamina y se conjugaron con una variedad de cargas útiles.
Sumario
La presente invención se refiere en general a conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) específicos del sitio mediados por transglutaminasa con una relación fármaco-anticuerpo (DAR ) alta, que comprende 1) marcadores que contienen glutamina, glutaminas endógenas (es decir, glutaminas nativas sin modificar, tal como las glutaminas de los dominios variables, CDR, etc.), y/o glutaminas endógenas que se hacen reactivas mediante modificación del anticuerpo o una transglutaminasa modificada (por ejemplo, con una especificidad alterada por el sustrato); y 2) agentes donantes de amina que comprenden unidades donantes de amina, engarces, y restos de agente. Los inventores han descubierto sorprendentemente que estos ADC específicos del sitio con mayor carga (por ejemplo, DAR de al menos 5 o más) tienen una potencia mayor in vivo y menor citotoxicidad no especifica in vitro en comparación con los ADC convencionales con mayor carga que utilizan un enlace maleimida. Los inventores han descubierto adicionalmente que estos ADC específicos del sitio con mayor carga 1) tienen perfiles farmacocinéticos similares que el anticuerpo de tipo silvestre no conjugado en ratones y perfiles farmacocinéticos mejorados en ratas y 2) mantienen un perfil de seguridad comparable con respecto a los ADC convencionales cargados de manera similar.
La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que se encuentre fuera del ámbito de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos. Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
En un aspecto, esta divulgación proporciona un ADC que comprende la fórmula: anticuerpo-(T-(X-Y-Za)b)c , en la que: T es 1) un marcador que contiene glutamina modificado en un sitio específico, 2) una glutamina endógena, y/o 3) una glutamina endógena que se ha hecho reactiva mediante modificación del anticuerpo o una transglutaminasa modificada; X es una unidad donante de amina; Y es un engarce; y Z es un resto agente; X-Y-Z es un agente donante de amina conjugado específicamente del sitio al marcador que contenía glutamina, la glutamina endógena, y/o la glutamina endógena reactiva; a es un número entero del 1 al 6; b es un número entero del 1 al 6; c es un número entero del 1 al 20; y en la que el producto (relación fármaco-anticuerpo) de a, b y c es al menos aproximadamente 5.
En algunas realizaciones, la T de anticuerpo-(T-(X-Y-Za)b)c comprende al menos 1 glutamina endógena (por ejemplo, una glutamina endógena nativa o reactiva). En algunas realizaciones, la glutamina endógena reactiva se hace reactiva mediante desglicosilación (por ejemplo, desglicosilación enzimática) o mediante modificación de aminoácidos de otro aminoácido del anticuerpo (por ejemplo, la sustitución de un aminoácido en la posición 297 tal como N297Q o N297A (según el esquema de numeración EU)).
En algunas realizaciones, el anticuerpo del ADC de la presente divulgación (por ejemplo, los ADC de alta carga mediada por glutaminasa) comprende adicionalmente una modificación de un segundo aminoácido K222, K340, y/o K370 (por ejemplo, K222R, K340R, y/o K370R).
En algunas realizaciones, el agente donante de amina (X-Y-Z) del ADC está conjugado específicamente del sitio a un marcador que contiene glutamina al menos una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en 1) el extremo carboxilo de cualquiera de duna cadena ligera, una cadena pesada, o ambas cadenas ligera y pesada; 2) el extremo amino de cualquiera de una cadena ligera, una cadena pesada, o ambas cadenas ligera y pesada; y 3) S60-R61, R108, T135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-T225, K222-T223, T223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297, y/o G385 (por ejemplo, como se enumera en la Tabla 1), en el que el marcador que contiene glutamina se inserta en el anticuerpo o sustituye uno o más aminoácidos endógenos del anticuerpo.
El ADC de la presente invención comprende a) sustituciones de aminoácidos en las posiciones N297Q y K222R, en el que el agente donante de amina (X-Y-Z) se conjuga específicamente del sitio a la glutamina endógena en la posición 295 y la glutamina se sustituye en la posición 297; y b) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina está conjugado específicamente del sitio a los marcadores que contienen glutamina en un extremo carboxílico de una cadena ligera del anticuerpo, y en el que la relación fármaco-anticuerpo es de 5-7. En algunas realizaciones, el agente donante de amina se conjuga adicionalmente de manera específica del sitio al marcador que contiene glutamina en una o más posiciones que se seleccionan de entre el grupo que consiste en S60-R61, R108, T135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-T225, K222-T223, T223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297, y G385 (por ejemplo, como se enumera en la Tabla 1), en el que el marcador que contiene glutamina se inserta en el anticuerpo o sustituye uno de los aminoácidos endógenos del anticuerpo, y en el que la relación fármaco-anticuerpo es al menos de aproximadamente 6. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el agente donante de amina se conjuga adicionalmente de manera específica del sitio al marcador que contiene glutamina insertado después de la posición de aminoácido T135 en la cadena pesada de anticuerpo, y en el que la relación de fármaco-anticuerpo es aproximadamente de 6-9. En otras realizaciones, el agente donante de amina se conjuga adicionalmente de manera específica del sitio al marcador que contiene la glutamina en las posiciones de aminoácido G200-S202 en la cadena ligera del anticuerpo, en la que los restos de aminoácido endógenos se remplazan con el marcador que contiene glutamina, y en el que la relación fármaco-anticuerpo es aproximadamente de 6-11.
En algunas realizaciones, el ADC de la presente divulgación comprende un agente donante de amina conjugado de manera específica del sitio al marcador que contiene glutamina a) en un extremo carboxilo de una cadena ligera del anticuerpo; b) después de la posición de aminoácido T135 en la cadena pesada del anticuerpo; y c) en las posiciones de aminoácido G200-S202 de la cadena ligera del anticuerpo, en el que los restos de aminoácido endógenos se remplazan con el marcador que contiene glutamina, y en el que la relación fármaco-anticuerpo es aproximadamente de 5-7.
En algunas realizaciones, el agente donante de amina (X-Y-Z) se selecciona de entre el grupo que consiste en Alexa 488 cadaverina, 5-FITC cadaverina, Alexa 647 cadaverina, Alexa 350 cadaverina, 5-TAMRA cadaverina, 5-FAM cadaverina, SR101 cadaverina, 5,6-TAMRA cadaverina, 5-FAM lisina, Ac-Lis-Gly-(acetilo-lisina-glicina)-MMAD, amino-PEG3-C2-MMAD, amino-PEG6-C2-MMAD, amino-PEG3-C2-amino-nonanoil-MMAD, aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAD, amino-PEG3-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, amino-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lis-Val-Cit-PABC (acetilo-lisina-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilo)-MMAD, aminocaproil-MMAD, Ac-Lys-p-Ala-MMAD, amino-PEG2-C2-MMAE, aminocaproil-MMAE, amino-PEG3-C2-MMAE, aminocaproil-MMAF, aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAE, amino-PEG-6-C2-Val-Cit-PABC-MMAE, Ac-Lis-Val-Cit-PABC-MMAE, aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAF, amino-PEG-6-C2-Val-Cit-PABC-MMAF, Ac-Lis-Val-Cit-PABC-MMAF, amino-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-0101, Ac-Lis-Val-Cit-PABC-0101, putrescinil-geldanamicina, Ac-Lis-putrescinil-geldanamicina, aminocaproil-3377, amino-PEG6-C2-3377, amino-caproil-0131, amino-PEG6-C2-0131, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC-MMAD, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC-MMAE, 2-aminoetoxi-PEG6-NODAGA, y N-2-acetil-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-hidroxi-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4s)-4-hidroxipent-2-enoil]amino}-3,6-dimetiltetrahidro-2H-piran-2-il]-3-metilpenta-1,3-dien-1-il}-1,6-dioxaspiro[2,5]oct-5-il]acetil}hidrazinil)carbonil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida. En algunas realizaciones el agente donante de amina es un polímero biocompatible que comprende una amina reactiva y un resto agente.
En algunas realizaciones, la unidad donante de amina-engarce (X-Y) es lineal o está ramificada. En algunas realizaciones, X-Y se selecciona de entre el grupo que consiste en Ac-Lys-Gly, ácido aminocaproico, Ac-Lys-p-Ala, amino-PEG2-C2, amino-PEG3-C2, amino-PEG6-C2, Ac-Lys-Val-Cit-PABC, amino-PEG6-C2-Val-Cit-pABC, aminocaproil-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC,[(3s,5S)-1-{3-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC, putrescina, y Ac-Lysputrescina.
En alguna realización, el resto agente (Z) es un agente citotóxico seleccionado de entre el grupo que consiste en una antraciclina, auristatina, camptotecina, una combretastatina, una dolastatina, una duocarmicina, una enedina, una geldanamicina, un dímero indolino-benzodiacepina, una maytansina, una puromicina, un dímero pirrolobenzodiacepina, un taxano, un alcaloide de la vinca, una tubulisina, una hemiasterlina, una empalmoestatina, un pladienólido, y los esteroisómeros, isósteros, análogos o derivados de los mismos.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de ADC con mayor carga como se describe en el presente documento, en el que la media de relación fármaco-anticuerpo es al menos de aproximadamente 5,0. En una variación, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de ADC, en la que al menos un ADC es el ADC con mayor carga como se describe en el presente documento, y en el que la relación media de fármaco-anticuerpo es de al menos aproximadamente 4,1. En otra variación la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende el ADC con mayor carga como se describe en el presente documento, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para la preparación del ADC como se describe en el presente documento, que comprende las etapas de: a) proporcionar una molécula de anticuerpo-T que comprende el anticuerpo y el marcador que contiene glutamina; y/o el anticuerpo con la glutamina endógena reactiva; b) poner en contacto el agente donante de amina que comprende la unidad donante de amina, el engarce, y el reto agente (X-Y-Z) con la molécula de anticuerpo-T en presencia de una transglutaminasa; y c) permitir que el anticuerpo-T se una covalentemente al agente donante de amina para formar el conjugado anticuerpo-fármaco. En algunas realizaciones, el conjugado tiene una eficacia de conjugación de al menos aproximadamente un 51 %.
En alguna realización, los procedimientos que se proporcionan en el presente documento comprenden adicionalmente una etapa de purificación, en la que el ADC se purifica mediante una etapa de cromatografía.
En algunas realizaciones, la transglutaminasa es una transglutaminasa microbiana, purificada o modificada.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento de un cáncer en un sujeto que lo necesite, que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende el ADC como se describe en el presente documento.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento de inhibición del crecimiento o la progresión de un tumor en un sujeto que lo necesite, que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende el ADC como se describe en el presente documento.
En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento de diagnóstico del cáncer en un sujeto sospechoso de padecer cáncer, que comprende a) poner en contacto una muestra del sujeto con el ADN descrito en el presente documento en condiciones que den como resultado la unión del ADN con una proteína relacionada con el cáncer, y b) determinar la unión del ADC a la proteína relacionada con el cáncer.
En algunas realizaciones, el anticuerpo en el ADC como se describe en el presente documento es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico, un minicuerpo, un diacuerpo, o un fragmento de anticuerpo.
En algunas realizaciones, el marcador que contiene glutamina del ADC como se describe en el presente documento comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en Q, LQG, LLQGG (SEQ ID NO: 1), LLQG (SEQ ID NO: 2), LSLSQG (SEQ ID NO: 3), GGGLLQGG (SEQ ID NO: 4), GLLQG (SEQ ID NO: 5), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID NO: 6), GLLQGGG (SEQ ID NO: 7), GLLQGG (SEQ ID NO: 8), GLLQ (SEQ ID NO: 9), LLQLLQGA (SEQ ID NO: 10), LLQGA (SEQ ID NO: 11), LLQYQGA (SEQ ID NO: 12), LLQGSG (SEQ ID NO: 13), LLQYQG (SEQ ID NO: 14), LLQLLQG (SEQ ID NO: 15), SLLQG (SEQ ID NO: 16), LLQLQ (SEQ ID NO: 17), LLQLLQ (SEQ ID NO: 18), LLQGR (SEQ ID NO: 19), LLQGPP (SEQ ID NO: 20), LLQGPA (SEQ ID NO: 21), GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22), GGLLQGA (SEQ ID NO: 23), LLQGPGK (SEQ ID NO: 25), LLQGPG (SEQ ID NO: 26), LLQGP (SEQ ID NO: 27), LLQP (SEQ ID NO: 28), LLQPGK (SEQ ID NO: 29), LLQAPGK (SEQ ID NO: 30), LLQGAPG (SEQ ID NO: 31), LLQGAP (SEQ ID NO: 32), y LLQLQG (SEQ ID NO: 36).
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la citotoxicidad de ADC específicos del sitio con DAR crecientes en las células BxPC3 con alta expresión de diana en comparación con los ADC conjugados convencionalmente con una DAR de 7,2. m7E6 es un anticuerpo anti-Trop2 (antígeno 2 de superficie celular del trofoblasto, también conocido como M1S1, GA733-1, EGP-1, o TACs Td 2), H7c, L11b, TG6, y LCQ04 representan el marcador transglutaminasa que contiene glutamina y la localización de dicho marcador en el anticuerpo (véase la Tabla 1); N297Q representa la sustitución de aminoácidos de N a Q en la posición 297 del anticuerpo Trop2; y K222R representa la sustitución de aminoácidos de K a R en la posición 222 del anticuerpo Trop2; maleimido representa un procedimiento de conjugación convencional mediante la conjugación con cisteína. Estas abreviaturas se aplican a las otras figuras descritas en el presente documento.
La Figura 2 muestra la toxicidad de los ADC específicos del sitio con DAR crecientes en células Colo205 con expresión de diana media en comparación con los ADC conjugados convencionalmente con una DAR de 7,2. La Figura 3 muestra la toxicidad de los ADC específicos del sitio con DAR crecientes en células CF-PAC1 con baja expresión de diana en comparación con los ADC conjugados convencionalmente con una DAR de 7,2. La Figura 4 muestra la toxicidad no específica de los ADC específicos del sitio con DAR crecientes en células SW620 sin expresión de diana en comparación con los ADC conjugados convencionalmente con una DAR de 7,2. La Figura 5 muestra la citotoxicidad de los ADC específicos del sitio con mayor carga de la presente invención en las células Colo205 con expresión moderada de la diana en comparación con los ADC conjugados convencionalmente con DAR similares.
La Figura 6 muestra la eficacia de los ADC específicos del sitio con mayor carga de la presente invención en la inducción de la detención a largo plazo del tumor de modelo de xenoinjerto Colo205 en comparación con los ADC conjugados convencionalmente con una DAR de 7,2.
La Figura 7 muestra la eficacia de los ADC específicos del sitio con mayor carga de la presente invención en la inducción de la detención a largo plazo del tumor de modelo de xenoinjerto Colo205 en comparación con los ADC conjugados convencionalmente con una DAR de 7,2.
Las figuras 8(a)-8(h) muestran los perfiles PK en ratones y ratas de los ADC específicos del sitio con mayor carga de la presente invención en comparación con el anticuerpo de tipo silvestre no conjugado y los ADC convencionales con una DAR similar.
Las Figuras 9(a)-9(b) muestra los perfiles PK en ratas de los ADC específicos del sitio con mayor carga de la presente invención con DAR de 7,76 y 7,7 con diferentes combinaciones de sitios de conjugación.
Las Figuras 10(a)-10(d) muestra la toxicología de los ADC con mayor carga en ratones C57B1/6. La Figura 10(a) muestra la toxicocinética de ADC de los ADC conjugados convencionalmente con una DAR de 7,8 y ADC específicos del sitio con una DAR de 7,76 dosificados a 200 mg/kg. La Figura 10(b) muestra la ganancia de peso corporal de los ratones dosificados a 200 mg/kg con los ADC específicos del sitio con mayor carga con una DAR de 5,85 y con una DAR de 7,71, y una ADC conjugada convencionalmente con una DAR de 7,8. Las Figuras 10(c) y 10(d) muestran la actividad de las enzimas hepáticas y los parámetros de patología clínica de muestras obtenidas el día 14 de ratones dosificados a 200 mg/kg con los ADC con alta carga específicos del sitio (SS) "DAR 6" (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD; DAR 5,85), y SS "DAR 8" (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD; DAR 7,76), y el ADC convencional "Cys DAR 8" (m7E6 maleimido PEG6-C2-MMAD; DAR 7,8). AP, AST y ALT representa la aspartato aminotransferasa, alanina transaminasa, y fosfatasa alcalina, respectivamente.
La Figura 11 muestra los análisis cinéticos de las interacciones diana/IgG en distintos ADC, incluyendo de WT (m7E6-no jugado), SS DAR 2 (LC) (específico del sitio m7E6 LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD), SS DAR 4 (m7E6 N297Q/K222R amino-PEG6-C2-MMAD), SS DAR 6 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD), SS DAR 8 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD), y Cys DAR 8 (m7E6 maleimido PEG6-C2-MMAD). Cada panel representa un análisis global de una IgG determinada con concentraciones de la diana (Trop humano) de 1,2, 3,7, 11, 33, y 100 nM. Las líneas negras representan los datos medidos, y las líneas rojas representan los ajustes globales; los restantes se muestran debajo de cada gráfico cubierto.
Las Figuras 12(a)-12(c) muestran el engarce y/o el análisis de estabilidad de la carga útil mediante espectrometría de masas de muestras de ratón in vivo. Las figuras comparan la estabilidad del engarce (Figura 12(a)), estabilidad del fármaco (Figura 12(b); estabilidad del extremo C de MMAD conjugado), y estabilidad combinada del engarcefármaco (Figura 12(c)) entre el ADC conjugado convencionalmente con una DAR de 8 y los ADC con carga alta específicos del sitio con una DAR de 6 y una DAR de 8. "Cys DAR 8" representa m7E6 maleimido PEG6-C2-MMAD; "SS DAR 6" representa m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD; y SS "DAR 8_1" representa m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD.
Las Figuras 13(a)-13(b) muestra la toxicocinética del ADC conjugado convencionalmente ("Cys DAR 8": m7E6 maleimido PEG6-C2-MMAD) y ADC con alta carga específicos del sitio DAR 6 (m7E6 N297q /K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD) y DAR 8_1 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD) en ratones a distintas concentraciones de anticuerpo y medida en diferentes momentos.
La Figura 14 muestra la citotoxicidad de los ADC específicos del sitio con DAR crecientes en células BxPC3 con alta expresión de diana en comparación con los ADC específicos del sitio con una DAR menor (por ejemplo, de 1,96 y 3,9).
La Figura 15 muestra la citotoxicidad de los ADC específicos del sitio con DAR crecientes en células Colo205 con expresión moderada de la diana en comparación con los ADC específicos del sitio con una DAR menor (por ejemplo, de 1,96 y 3,9).
La Figura 16 también muestra la citotoxicidad de los ADC específicos del sitio con DAR crecientes en células CF-PAC1 con baja expresión de diana en comparación con los ADC específicos del sitio con una DAR menor (por ejemplo, de 1,96 y 3,9).
La Figura 17 también muestra la ausencia de citotoxicidad no específica de los ADC específicos del sitio con DAR crecientes en células SW620 sin expresión de diana en comparación con los ADC específicos del sitio con una DAR menor (por ejemplo, de 1,96 y 3,9).
Las Figuras 18A y 18B muestran la eficacia in vitro de los ADC específicos del sitio con DAR crecientes en comparación con los ADC específicos del sitio con una DAR menor (por ejemplo, de 1,9 y 3,7) en células L363 y MM1.S con expresión baja y media de la diana.
Descripción detallada
La presente invención se refiere en general a conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) específicos del sitio mediados por transglutaminasa con una relación fármaco-anticuerpo (DAR ) alta, que comprende 1) marcadores que contienen glutamina, glutaminas endógenas (es decir, glutaminas nativas sin modificar, tal como las glutaminas de dominios variables, CDR, etc.), y/o glutaminas endógenas que se hacen reactivas mediante modificación del anticuerpo o una transglutaminasa modificada; y 2) agentes donantes de amina que comprenden unidades donantes de amina, engarces, y restos de agente, en el que el DAR es de al menos 5. Se había descubierto previamente que los conjugados de anticuerpo-fármaco que utilizan el enlace convencional de maleimida con una DAR de dos a cuatro eran superiores a sus equivalentes con mayor carga en términos de eficacia in vivo, tolerancia, y farmacocinética dando como resultado un índice terapéutico mayor. Se describen en el presente documento ADC específicos del sitio con mayor carga (por ejemplo, con una DAR de al menos 5 o más) que tengan una potencia mayor in vivo y menor citotoxicidad no especifica in vitro en comparación con los ADC convencionales con mayor carga. Una única dosis de un ADC con mayor carga específico del sitio que se desvela en el presente documento supera significativamente los ADC convencionales con DAR similares en términos de detención del crecimiento tumoral a largo plazo. Además, estos ADC específicos del sitio con mayor carga tienen perfiles farmacocinéticos similares al anticuerpo de tipo silvestre no conjugado en ratones y un perfil PK mejorado sobre los ADC con mayor carga convencionales con una DAR similar en la rata. Estos ADC específicos del sitio con mayor carga también mantienen un perfil de seguridad comparable a los ADC convencionales con una carga farmacológica equivalente.
En consecuencia, se proporcionan ADC específicos del sitio con mayor carga comprendiendo cada ADC la fórmula: anticuerpo-(T-(X-Y-Za)b)c , en la que: T es 1) un marcador que contiene glutamina modificado en un sitio específico, 2) una glutamina endógena, y/o 3) una glutamina endógena que se ha hecho reactiva mediante modificación del anticuerpo o una transglutaminasa modificada; X es una unidad donante de amina; Y es un engarce; y Z es un resto agente; X-Y-Z es un agente donante de amina conjugado específicamente del sitio al marcador que contenía glutamina, la glutamina endógena, y/o la glutamina endógena reactiva; a es un número entero del 1 al 6; b es un número entero del 1 al 6; c es un número entero del 1 al 20; y en la que el producto (relación fármaco-anticuerpo) de a, b y c es al menos aproximadamente 5.
También se proporcionan procedimientos de tratamiento de un cáncer, inhibición del crecimiento o progresión tumoral, inhibición de metástasis de células cancerosas o tumorales, o inducción de la regresión tumoral en un individuo que lo necesite, que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de la composición farmacéutica que comprende los ADC que se describen en el presente documento.
También se proporcionan procedimientos para la preparación del ADC como se describe en el presente documento, que comprende las etapas de: a) proporcionar una molécula de anticuerpo-T que comprende el anticuerpo y el marcador que contiene glutamina; y/o el anticuerpo con la glutamina endógena y/o endógena reactiva; b) poner en contacto el agente donante de amina con la molécula de anticuerpo-T en presencia de una transglutaminasa; y c) permitir que el anticuerpo-T se una covalentemente al agente donante de amina para formar el ADC. En algunas realizaciones, la transglutaminasa es una transglutaminasa modificada.
Técnicas generales y definiciones
A menos de que se defina otra cosa en el presente documento, los términos científicos y técnicos utilizando en conexión con la presente invención tendrán los significados que se entienden comúnmente por los expertos habituados en la técnica. Además, a menos de que se necesite otra cosa según el contexto, los términos en singular incluyen las pluralidades y los términos en plural incluyen el singular. En general, la nomenclatura que se utiliza en conexión con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química proteica y de ácido nucleico e hibridación descritas en el presente documento son bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica.
Los procedimientos y técnicas de la presente invención se llevan a cabo generalmente de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en distintas referencias generales y más específicas que se citan y exponen a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos de que se indique otra cosa. Véase, por ejemplo, Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow y Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); y Coligan y col., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante, según se consigue comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. La nomenclatura utilizada en conexión con, y en los procedimientos de laboratorio y técnicas de, biología molecular, bioquímica, inmunología, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritos en el presente documento son bien conocidos y utilizados comúnmente en la técnica. A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, la palabra "comprender", o las variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión del número entero establecido o grupo de números enteros, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.
La expresión "marcador que contiene glutamina", "marcador de glutamina", "marcador que contiene Q", "marcador Q", o "marcador transglutaminasa", como se utiliza en el presente documento se refiere a un polipéptido o una proteína que contiene uno o más restos de Gln que actúa como un receptor de amina o un donante de acilo en la reacción de transglutaminasa.
La expresión "agente donante de amina" o "receptor de acilo" como se utiliza en el presente documento se refiere a un agente que contiene una o más aminas reactivas (por ejemplo, aminas primarias). Por ejemplo, el agente donante de amina puede comprender una unidad donante de amina (por ejemplo, una amina primaria NH2), un engarce (por ejemplo, una molécula que se une a una unidad donante de amina y contiene una funcionalidad adicional para unirse a una carga útil tal como una molécula pequeña, un polipéptido, o un polímero biocompatible), y un resto agente (por ejemplo, una carga útil tal como una molécula pequeña). El agente donante de amina también puede ser un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) o un polímero biocompatible que contiene una o más lisinas reactivas, extremos N, o aminas reactivas.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "especificidad del sitio", "conjugado de manera específica del sitio", o "entrecruzado de manera específica del sitio" se refiere a la conjugación o entrecruzamiento específicos del agente donante de amina al anticuerpo en un sitio específico (por ejemplo, en distintas posiciones enumeradas en la Tabla 1) mediante un marcador que contiene glutamina, una glutamina endógena, y/o una glutamina endógena que se ha hecho reactiva mediante la modificación del anticuerpo o una transglutaminasa modificada. La especificidad del sitio se puede medir mediante distintas técnicas, incluyendo, pero sin limitarse a, espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas con ionización desorción láser asistida por matriz (MALDI-MS), espectrometría de masas por ionización con electropulverización (ESI-MS), espectrometría de masas en tándem (MS-MS), y espectrometría de masas con tiempo de vuelo (TOF-MS), cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de intercambio iónico, mutagénesis dirigida al sitio, marcado con fluorescencia, cromatografía de exclusión por tamaño, y cristalografía de rayos X.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "una glutamina endógena (Q) hecha reactiva" se refiere a una glutamina endógena que se ha hecho accesible, expuesta, o reactiva al agente donante de amina en presencia de una transglutaminasa mediante modificación de anticuerpo (por ejemplo, desglicosilación enzimática y/o modificación de aminoácidos) o mediante una transglutaminasa modificada.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "polímero biocompatible" se refiere a un polímero (por ejemplo, una repetición de unidades monoméricas o estructurales) que es adecuado para el tratamiento terapéutico o médico en un receptor (por ejemplo, un ser humano) sin desencadenar ningún efecto local o sistémico no deseable en el receptor. Un polímero biocompatible (sintético, recombinante o nativo) puede ser un polímero hidrosoluble o insoluble en agua. Un polímero biocompatible también puede ser un polímero lineal o ramificado.
Como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a una diana, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se utiliza en el presente documento, a menos de que se indique otra cosa por el contexto, el término tiene la intención de englobar no solo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), de cadena sencilla (scFV) y dominios de anticuerpo, incluyendo anticuerpos de tiburón y camélidos), y proteínas de fusión que comprendan una parte de anticuerpo, anticuerpos multivalentes (por ejemplo, COVX-BODY™), anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos a condición de que presenten la actividad biológica deseada) y fragmentos de anticuerpo como se describe en el presente documento, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA, o IgM (o subclases de las mismas), y no es necesario que el anticuerpo sea de una clase en particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de anticuerpo del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Existen cinco clases de inmunoglobulinas principales: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulina se llaman alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. En un aspecto, la inmunoglobulina es una inmunoglobulina humana, murina, de mono o de conejo.
La expresión "polipéptido que contiene un Fab" como se utiliza en el presente documento se refiere a un polipéptido que comprende un fragmento Fab, un fragmento Fab', o un "fragmento (Fab')2". Un polipéptido que comprende un Fab puede comprender parte o toda una secuencia de bisagra de tipo silvestre (en general en el extremo carboxilo de la parte Fab del polipéptido). Un polipéptido que contienen un Fab se puede obtener o derivar a partir de cualquier inmunoglobulina adecuada, tal como a partir de al menos uno de los distintos subtipos IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4, o a partir de una IgA, IgE, IgD o IgM. Un polipéptido que contiene un Fab puede ser un polipéptido de fusión que contiene un Fab, en el que se han unido uno o más polipéptidos a un polipéptido que contiene un Fab. Una fusión Fab combina el polipéptido Fab de una inmunoglobulina con una pareja de fusión, que en general puede ser cualquier proteína, polipéptido, o molécula pequeña. Se puede unir prácticamente cualquier proteína o molécula pequeña al polipéptido Fab para generar el polipéptido de fusión que contiene un Fab. Las parejas de fusión que contienen un Fab pueden incluir, pero no se limitan a, la región de unión a la diana de un receptor, una molécula de adhesión, un ligando, una enzima, una citocina, una quimiocina, o alguna otra proteína o dominio proteico.
Un "fragmento Fab" está comprendido por una cadena ligera y las regiones CH1 y variable de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula de Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada.
Un "fragmento Fab'" contiene una cadena ligera y una parte de cadena pesada que contiene el dominio VH y el dominio CH1 y también la región entre los dominios CH1, y CH2, de manera que se puede formar un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula de F(ab')2.
Un "fragmento F(ab')2" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una parte de la región constante entre los dominios CH1, y CH2, de manera que se forma un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas. Un fragmento F(ab')2 por lo tanto está compuesto por dos fragmentos Fab' que se mantienen unidos mediante un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas.
Los "fragmentos de anticuerpo" como se utilizan en el presente documento comprenden solo una parte de un anticuerpo intacto, en el que la parte mantiene preferentemente al menos una, preferentemente la mayoría o todas las funciones asociadas normalmente con esa parte cuando está presente en un anticuerpo intacto.
Una "anticuerpo multiespecífico" es el que se dirige a más de un antígeno o epítopo. Un anticuerpo "biespecífico", "específico dual" o "bifuncional" es un anticuerpo híbrido que tiene dos sitios de unión al antígeno diferentes. Los anticuerpos biespecíficos son una especie de anticuerpo multiespecífico y puede producirse mediante una variedad de procedimientos que incluyen, pero no se limitan a, fusión de hibridomas, unión de fragmentos Fab', o mutaciones en la bisagra del anticuerpo y los dominios CH3. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol.
79:315-321 (1990); Kostelny y col., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992); y Strop y col., J. Mol. Biol. 420(3):204-219 (2012). Los dos sitios de unión de un anticuerpo biespecífico se unirán a dos epítopos diferentes, que pueden residir en la misma o en diferentes dianas proteicas.
La expresión "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único antígeno. Adicionalmente, al contrario que en las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen normalmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante del antígeno.
Los anticuerpos monoclonales del presente documento pueden, en ciertas realizaciones, incluir específicamente anticuerpos "quiméricos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga con secuencias correspondientes de los anticuerpos derivados de una especie en particular, o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el resto de las cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como a los fragmentos de dichos anticuerpos, a condición de que presenten la actividad biológica deseada (Pat. de EE. UU. N.° 4.816.567; y Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
Las formas "humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una mínima secuencia derivada de una inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los restos de una región hipervariable del receptor se han sustituido por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región marco conservada (FR) de las inmunoglobulinas humanas se sustituyen por restos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden, además, comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente la actuación de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables se corresponden con los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véase también los siguientes artículos de revisión y las referencias citadas en ellos: Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
Un "anticuerpo humano" es el que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponde con la del anticuerpo producido por un ser humano y/o que se ha producido utilizando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos como se desvela en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprenda restos de unión al antígeno no humanos.
La "región bisagra", "secuencia bisagra", y variaciones de las mismas, como se utiliza en el presente documento, incluye el significado conocido en la técnica, que se ilustra, por ejemplo, en Janeway y col., ImmunoBiology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4a ed., 1999); Bloom y col., Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys y col., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202.
La expresión "polipéptido que contiene una Fc" como se utiliza en el presente documento se refiere a un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo o una inmunoadhesina) que comprende secuencias polipeptídicas del extremo carboxílico de una cadena pesada de inmunoglobulina. El polipéptido que contiene una Fc puede comprender regiones (es decir, secuencias) Fc nativas o variantes. La región Fc de una inmunoglobulina comprende en general dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio CH4. Un polipéptido que comprende una Fc puede comprender parte o toda una secuencia de bisagra de tipo silvestre (en general en el extremo amino del polipéptido que contiene una Fc). Un polipéptido que contiene una Fc también puede ser un dímero. Un polipéptido que contienen una Fc se puede obtener o derivar a partir de cualquier inmunoglobulina adecuada, tal como a partir de al menos uno de los distintos subtipos IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4, o a partir de una IgA, IgE, IgD o IgM. Sin embargo, los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, por ejemplo, la región Fc de cadena pesada de IgG humana se define normalmente por un tramo desde el resto de aminoácido de la posición Glu216, o desde la Ala231, hasta el extremo carboxilo de la misma. La numeración de los restos de la región Fc es la del índice EU como en Kabat. Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991.
Un polipéptido que contiene una Fc puede ser un polipéptido de fusión que contiene una Fc, en el que se han unido uno o más polipéptidos a un polipéptido que contiene una Fc. Una fusión Fc combina el polipéptido Fc de una inmunoglobulina con una pareja de fusión, que en general puede ser cualquier proteína, polipéptido, o molécula pequeña. Se puede unir prácticamente cualquier proteína o molécula pequeña al polipéptido Fc para generar el polipéptido de fusión que contiene una Fc. Las parejas de fusión que contienen una Fc pueden incluir, pero no se limitan a, la región de unión a la diana de un receptor, una molécula de adhesión, un ligando, una enzima, una citocina, una quimiocina, o alguna otra proteína o dominio proteico.
Como se utiliza en el presente documento, el término "inmunoadhesina" designa moléculas tipo anticuerpo o tipo inmunoglobulina que combinan el "dominio de unión" de una proteína heteróloga (una "adhesina", por ejemplo, un receptor, ligando o enzima) con el componente efector de los dominios constantes de inmunoglobulina (es decir, el dominio Fc). Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de la secuencia de aminoácidos de la adhesina con la especificidad de unión deseada que es distinta del sitio de reconocimiento y unión al antígeno (sitio de combinación con el antígeno) de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga") y una secuencia de un dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia del dominio constante de inmunoglobullina de la inmunoadhesina se puede obtener a partir de cualquier inmunoglobulina tal como los subtipos IgG1, IgG2, IgG3, o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM.
Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan en el presente documento de manera intercambiable para hacer referencia a cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, preferentemente, relativamente cortas (por ejemplo, de 10-100 aminoácidos). La cadena puede ser lineal o ramificada, y puede comprender aminoácidos modificados, y/o puede interrumpirse por no aminoácidos. Los términos también engloban una cadena de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente marcador. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que los polipéptidos pueden existir como cadenas sencillas o cadenas asociadas.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "aminoácido de tipo silvestre", "IgG de tipo silvestre" y "mAb de tipo silvestre" se refiere a una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos que es de origen natural dentro de una cierta población (por ejemplo, de seres humanos, ratones, ratas, células, etc.).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "eficacia de conjugación" o "eficacia de entrecruzamiento" es la relación entre las cantidades del ADC medido experimentalmente como se describe en el presente documento divididas por la cantidad de ADC máxima esperada. La eficacia de conjugación o eficacia de entrecruzamiento se puede medir mediante distintas técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, tal como la cromatografía de interacción hidrofóbica. La eficacia de conjugación también se puede medir a diferentes temperaturas, tales como la temperatura ambiente o 37 °C.
La expresión "función efectora" se refiere a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc de un anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), unión al receptor Fc, citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), fagocitosis, unión a C1q, y regulación negativa de receptores de superficie celular (por ejemplo, el receptor de linfocito B; BCR). Véase, por ejemplo, la Pat. de EE. UU. N.° 6.737.056. Dichas funciones efectoras necesitan la región Fc para combinarse con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y se puede evaluar utilizando distintos ensayos conocidos en la técnica para la evaluación de dichas funciones efectoras de anticuerpo. Una medición ejemplar de la función efectora es mediante la unión a Fcy3 y/o C1q.
Como se utiliza en el presente documento "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en las que células citotóxicas no específicas que expresan receptores de Fc (FcR) (por ejemplo, células citolíticas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido a una célula diana y posteriormente producen la lisis de la célula diana. La actividad ADCC de una molécula de interés se puede evaluar utilizando un ensayo de ADCC in vitro, tal como el que se describe en la Patente de EE. UU. N.° 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células NK. De manera alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el que se desvela en Clynes y col., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.
La "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere al lisado de una diana en presencia del complemento. La ruta de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que forma un complejo con un antígeno equivalente. Para evaluar la evaluación del complemento, se puede llevar a cabo un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996).
Como se utiliza en el presente documento, un "receptor de Fc" y "FcR" describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es una secuencia nativa de FcR humano. Además, un FcR preferido es el que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, FcyRIII, y FcyRIV, incluyendo las variantes alélicas y las formas de corte y empalme alternativas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen el FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que se diferencian primariamente en los dominios citoplásmicos de los mismos. Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel y col., 1994, Immunomethods, 4:25-34; de Haas y col., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41; Nimmerjahn y col., 2005, Immunity 23:2-4. Los "FcR" también incluyen el receptor neonatal, FcRn, que es el responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer y col., 1976, J. Immunol., 117:587; y Kim y col., 1994, J. Immunol., 24:249).
Como se utiliza en el presente documento, "tratamiento" es una estrategia para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de la presente invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: reducción de la proliferación (o destrucción) de células neoplásicas o cancerosas, inhibición de la metástasis de células neoplásicas, contracción o disminución del tamaño del tumor, remisión del cáncer, disminución de los síntomas del cáncer, aumento de la calidad de vida de los que padecen el cáncer, disminución de la dosis de otras medicaciones necesarias para tratar el cáncer, retraso de la progresión del cáncer, curación del cáncer, y/o prolongación de la supervivencia de los pacientes de un cáncer.
Como se utiliza en el presente documento, una "dosificación eficaz" o "cantidad eficaz" de fármaco, compuesto, o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para efectuar uno o más de cualquiera de los resultados beneficiosos o deseados. Para su uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen la eliminación o reducción del riesgo, la disminución de la gravedad, o el retraso del inicio de la enfermedad, incluyendo los síntomas bioquímicos, histológicos y/o del comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y los fenotipos patológicos intermedios que se presenten durante el desarrollo de la enfermedad. Para su uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como la reducción de la incidencia o la mejora de uno o más síntomas de distintas enfermedades o afecciones relacionadas con el cáncer (tales como en los cánceres gástrico, de cabeza y cuello, pulmón, ovárico, y pancreático), disminución de la dosis de otras medicaciones necesarias para tratar la enfermedad aumentando el efecto de otras medicaciones, y/o el retraso de la progresión del cáncer en los pacientes. Una dosificación eficaz se puede administrar en una o más administraciones. Para los fines de la presente invención, una dosificación eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para conseguir un tratamiento profiláctico o terapéutico sea directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una dosificación eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede conseguirse o no en conjunción con otro fármaco, compuesto, o composición farmacéutica. Por lo tanto, una "dosificación eficaz" puede considerarse en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y un agente único se puede considerar que se da en una cantidad eficaz si, junto con uno o más de otros agentes, se puede conseguir o se consigue un resultado deseable.
El término "purificar", y las variaciones gramaticales del mismo se utiliza para significar la retirada, sea completa o parcialmente de al menos una impureza de una mezcla que contiene el ADC y una o más impurezas, que mejora de esta manera el nivel de pureza del ADC en la composición (es decir, disminuyendo la cantidad (ppm) de impurezas en la composición).
La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) realizaciones que se refieren a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X". Los intervalos numéricos incluyen los números que definen en intervalo.
Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero, más preferentemente un ser humano. Los mamíferos incluyen también, pero no se limitan a, animales de granja, animales deportivos, mascotas, primates, caballos, perros, gatos, ratones y ratas.
Se entiende que en cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento con la expresión "que comprende", también se proporcionan realizaciones de otra manera análogas descritas en términos de "que consiste en" y/o "que consisten esencialmente en".
Cuando los aspectos o realizaciones de la invención se describen en términos de un grupo de Markush u otro agrupamiento de alternativas, la presente invención no solo engloba el grupo entero enumerado como un todo, pero cada miembro del grupo individualmente y todos los subgrupos posibles del grupo principal, sino también el grupo principal que carece de uno o más miembros del grupo. La presente invención también concibe la exclusión explícita de uno o más de cualquiera de los miembros del grupo de la invención reivindicada.
Las denominaciones de restos de la presente solicitud se basan en el esquema de numeración EU del dominio constante (Edelman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63(1):78-85 (1969).
A menos de que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que entiende un experto en la técnica a la que la presente invención pertenece. Los procedimientos y materiales ejemplares se describen en el presente documento, aunque también se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente solicitud, incluyendo las definiciones. Aunque se citan varios documentos en el presente documento, esta mención no constituye una admisión de que cualquiera de estos documentos forme parte del conocimiento general común en la técnica. A lo largo de la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, la palabra "comprender", o las variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros establecido, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros. A menos de que se necesite otra cosa según el contexto, los términos en singular incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Los materiales, procedimientos, y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes
Conjugados de anticuerpo-fármaco con alta carga de fármaco
Los conjugados de anticuerpo-fármaco del presente documento comprenden un anticuerpo conjugado específicamente del sitio a un agente donante de amina (por ejemplo, una molécula pequeña acoplada a un engarce con una unidad donante de amina) mediante un marcador que contiene glutamina modificado, una glutamina endógena (es decir, glutaminas nativas sin modificar, tal como las glutaminas de los dominios variables, CDR, etc.), y/o una glutamina endógena reactiva, en el que la relación fármaco-anticuerpos (DAR ) es al menos de aproximadamente 5 (por ejemplo, al menos 5 fármacos/cargas útiles por anticuerpo). La glutamina endógena puede hacerse reactiva (es decir, la capacidad para formar un enlace covalente como un donante de acilo en presencia de una amina y una transglutaminasa) modificando uno o más aminoácidos (por ejemplo, por eliminación, inserción, sustitución o mutación de aminoácidos) del anticuerpo, mediante desglicosilación enzimática, o mediante la reacción con una transglutaminasa modificada. En consecuencia, en un aspecto, se proporciona un conjugado de anticuerpofármaco (ADC) que comprende la fórmula: anticuerpo-(T-(X-Y-Za)b)c , en la que: T es 1) un marcador que contiene glutamina modificado en un sitio específico, 2) una glutamina endógena, y/o 3) una glutamina endógena que se ha hecho reactiva mediante modificación del anticuerpo o una transglutaminasa modificada; X es una unidad donante de amina; Y es un engarce; y Z es un resto agente; X-Y-Z es un agente donante de amina conjugado específicamente del sitio al marcador que contenía glutamina, la glutamina endógena, y/o la glutamina endógena reactiva; a es un número entero del 1 al 6; b es un número entero del 1 al 6; c es un número entero del 1 al 20; y en la que el producto (relación fármaco-anticuerpo) de a, b y c es al menos aproximadamente 5. Tanto el marcador que contiene glutamina, la glutamina endógena, y/o la glutamina reactiva del anticuerpo, y el agente donante de amina (X-Y-Z) descritos en el presente documento, son sustratos de la transglutaminasa, y el enlace entre el marcador que contiene glutamina y/o la glutamina endógena/reactiva, y el agente donante de amina, tiene la fórmula CH2-CH2-CO-NH-, en la que NH- está unida a un engarce y un resto agente.
Las transglutaminasas son proteína-glutamina-Y-glutamiltransferasas (EC 2.3.2.13), que normalmente catalizan la transamidación dependiente del pH de restos de glutamina con restos de lisina. La transglutaminasa que se utiliza en la invención descrita en el presente documento se puede obtener o fabricar a partir de una variedad de fuentes, o modificarse para que catalice la transamidación de uno o más restos de glutamina endógenos con uno o más restos de lisina o agentes donantes de amina que contengan una o más aminas reactivas. En algunas realizaciones, la transglutaminasa es una transglutaminasa dependiente del calcio que necesita calcio para inducir cambios de conformación de la enzima y permitir la actividad enzimática. Por ejemplo, la transglutaminasa se puede derivar del hígado de cobayas y obtenerse mediante fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma-Aldrich (St Louis, MO) y MP Biomedicals (Irvine, CA)). En algunas realizaciones, el polipéptido mTGasa se deriva de una proteína fúngica (por ejemplo, de transglutaminasas de Oomycetes, Actinomycetes, Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Monascus, o Rhizopus). En algunas realizaciones, el polipéptido mTGasa se deriva de Myxomycetes (por ejemplo, transglutaminasa de Physarum polycephalum). En algunas realizaciones, el polipéptido mTGasa se deriva de una proteína bacteriana, tal como la transglutaminasa de Streptoverticillium sp. o Streptomyces sp. (por ejemplo, Streptomyces mobarensis o Streptoverticillium mobarensis). En algunas realizaciones, el polipéptido mTGasa se deriva de una proteína bacteriana tal como la transglutaminasa de, pero sin limitarse a, Streptoverticillium mobarensis, Streptoverticillium griseocarneum, Streptoverticillium ladakanum, Streptomyces mobarensis, Streptomyces viridis, Streptomyces ladakanum, Streptomyces caniferus, Streptomyces platensis, Streptomyces hygroscopius, Streptomyces netropsis, Streptomyces fradiae, Streptomyces roseovertivillatus, Streptomyces cinnamaoneous, Streptomyces griseocarneum, Streptomyces lavendulae, Streptomyces lividans, Streptomyces lydicus, Streptomyces sioyansis, Actinomadura sp., Bacillus (por ejemplo, Bacillus circulans, Bacillus subtilis, etc.), Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium glutamicum, Clostridium, Enterobacter sp., Micrococcus, Providencia sp., o aislados de los mismos. En algunas realizaciones, la transglutaminasa es una transglutaminasa independiente del calcio que no necesita calcio para inducir cambios de conformación de la enzima y permitir la actividad enzimática. En algunas realizaciones, el polipéptido mTGasa se deriva de S. mobarensis. Una transglutaminasa independiente del calcio disponible en el mercado tal como ACTIVA™ (Ajinomoto, Japón) también es adecuada para la presente invención.
En algunas realizaciones, la transglutaminasa que se utiliza en la invención descrita en el presente documento es una transglutaminasa modificada que cataliza la transamidación de uno o más restos de glutamina endógena del anticuerpo con uno o más restos de lisina o aminas reactivas del agente donante de amina. Por ejemplo, se puede eliminar o remplazar o sustituir uno o más restos de aminoácido de tipo silvestre en la transglutaminasa de origen natural, con otro resto de aminoácido para fabricar la transglutaminasa modificada.
En algunas realizaciones, la transglutaminasa utilizada en la invención descrita en el presente documento también puede ser una proteína recombinante producida utilizando técnicas recombinantes conocidas por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, la transglutaminasa que se utiliza en la invención descrita en el presente documento puede ser una proteína purificada. Por ejemplo, la transglutaminasa purificada es al menos aproximadamente un 50 % pura. Como se utiliza en el presente documento, proteína "pura" o "purificada" se refiere a una proteína (por ejemplo, una transglutaminasa) libre de otros contaminantes proteicos. En algunas realizaciones, la transglutaminasa purificada es al menos aproximadamente cualquiera de entre un 55 %-60 %, 60 %-65 %, 65 %-70 %, 70 %-75 %, 75 %-80 %, 80 %-85 %, 85 %-90 %, 90 %-95 %, 95 %-98 %, o 99 % pura. En algunas realizaciones, la transglutaminasa purificada es aproximadamente cualquiera de entre un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % pura.
En algunas realizaciones, el marcador que contiene glutamina del ADC como se describe en el presente documento no está adyacente en el espacio a una Lys reactiva en el anticuerpo. Por ejemplo, el marcador que contiene glutamina no está adyacente en el espacio a una Lys reactiva en el extremo carboxilo, el extremo amino, o ambos extremos carboxilo y amino del polipéptido.
En algunas realizaciones, el ADC de la presente invención comprende al menos 1 glutamina endógena que se ha hecho reactiva en una reacción de transamidación mediante modificación del anticuerpo o mediante una transglutaminasa modificada. En algunas realizaciones, la modificación del anticuerpo es la desglicosilación del anticuerpo (por ejemplo, la desglicosilación enzimática); o la modificación de aminoácidos incluyendo la eliminación, inserción, sustitución, mutación de aminoácidos, o cualquier combinación de los mismos en el anticuerpo. Por ejemplo, el aminoácido Asn (N) de tipo silvestre en la posición 297 de un anticuerpo se sustituye o remplaza con el aminoácido Ala (A), dando como resultado una aglicosilación de la posición 297 y una glutamina endógena reactiva (Q) en la posición 295. En otro ejemplo, a modificación de aminoácidos del anticuerpo es una sustitución de aminoácido de N por Q en la posición 297, dando como resultado una aglicosilación en la posición 297, una Q reactiva endógena en la posición 295, y conjugación específica del sitio entre N297Q, y Q295. Y uno o más agentes donantes de amina en estos dos sitios en presencias de una transglutaminasa.
En algunas realizaciones, el ADC de la presente divulgación comprende un marcador que contiene glutamina modificado en al menos una o más posiciones que incluyen, pero no se limitan a, 1) el extremo carboxilo de cualquiera de una cadena ligera, una cadena pesada, o ambas cadenas ligera y pesada; 2) el extremo amino de cualquiera de una cadena ligera, una cadena pesada, o ambas cadenas ligera y pesada; y 3)S60-R61, R108, T135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-T225, K222-T223, T223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297, y/o G385, en el que el marcador que contiene glutamina se inserta en el anticuerpo o sustituye uno o más aminoácidos endógenos del anticuerpo, en el que la relación fármaco-anticuerpo es al menos de aproximadamente 5. Ejemplos del marcador que contiene glutamina específico y la posición modificada correspondiente se proporcionan en la Tabla 1. En consecuencia, en algunas realizaciones, el ADC de la presente divulgación comprende una DAR de al menos aproximadamente 5 (por ejemplo, 5 fármacos/cargas útiles por anticuerpo) y un marcador que contiene glutamina modificado en una cualquiera o más de las posiciones que se enumeran en la Tabla 1.
Tabla 1
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continuación
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En algunas realizaciones del ADC de la presente divulgación comprende adicionalmente una segunda modificación de aminoácido en las posiciones 222, 340 y/o 370 (numeración EU) con respecto al anticuerpo de tipo silvestre en la misma posición. En algunas realizaciones, la modificación es una eliminación, inserción, sustitución, mutación de aminoácidos, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la sustitución comprende la sustitución de un aminoácido de tipo silvestre por otro (por ejemplo, un aminoácido de tipo no silvestre). En algunas realizaciones, el otro aminoácido (por ejemplo, de tipo no silvestre) es Arg (por ejemplo, K222R, K340R, o K370R). En algunas realizaciones, el otro aminoácido (por ejemplo, de tipo no silvestre) es Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.
En consecuencia, en algunas realizaciones, el ADC de la presente invención comprende a) sustituciones de un aminoácido en las posiciones N297Q y K222R, en el que el agente donante de amina se conjuga de manera específica del sitio a la glutamina endógena en la posición 295 y la glutamina se sustituye en la posición 297; y b) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina está conjugado de manera específica del sitio a los marcadores que contienen glutamina en un extremo carboxílico de una cadena ligera del anticuerpo, y en el que la relación fármaco-anticuerpo (DAR ) es de 5-7. En algunas realizaciones, el marcador que contiene glutamina en el extremo carboxilo de la cadena ligera del anticuerpo es GGLLQGA (SEQ ID NO: 23) o GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22).
En algunas realizaciones, el ADC de la presente invención comprende a) sustituciones de un aminoácido en las posiciones N297Q y K222R, en el que el agente donante de amina se conjuga de manera específica del sitio a la glutamina endógena en la posición 295 y la glutamina sustituida en la posición 297; b) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina se conjuga de manera específica del sitio al marcador que contiene glutamina en un extremo carboxilo de una cadena ligera del anticuerpo; c) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina se conjuga adicionalmente de manera específica del sitio con el marcador que contiene glutamina en una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en S60-R61, R108, T135, S160, S168, S190-S192, P189-S192, G200-S202, K222-T225, K222-T223, T223, L251-S254, M252-I253, E294-N297, E293-N297, N297, y G385 en el anticuerpo, en el que el marcador que contiene glutamina se inserta en el anticuerpo o remplaza uno o más aminoácidos endógenos del anticuerpo; y en el que la relación fármacoanticuerpo es de al menos aproximadamente 6. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el ADC de la presente invención también comprende a) sustituciones de un aminoácido en las posiciones N297Q y K222R, en el que el agente donante de amina se conjuga de manera específica del sitio a la glutamina endógena en la posición 295 y la glutamina se sustituye en la posición 297; b) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina está conjugado de manera específica del sitio a los marcadores que contienen glutamina en un extremo carboxílico de una cadena ligera del anticuerpo; c) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina está conjugado de manera específica del sitio al marcador que contiene glutamina en un extremo carboxílico de una cadena pesada del anticuerpo; y en el que la relación fármaco-anticuerpo (DAR ) es de 6­ 9. En algunas realizaciones, el marcador que contiene glutamina en el extremo carboxilo de la cadena ligera del anticuerpo es GGLLQGA (SEQ ID NO: 23) o GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22; y el marcador que contiene glutamina en el extremo carboxilo de la cadena pesada del anticuerpo es LLQGA (SEQ ID NO: 11) o LLQGPP (SEQ ID NO: 20).
En una variación, el ADC de la presente invención comprende a) sustituciones de un aminoácido en las posiciones N297Q y K222R, en el que el agente donante de amina se conjuga de manera específica del sitio a la glutamina endógena en la posición 295 y la glutamina se sustituye en la posición 297; b) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina está conjugado de manera específica del sitio a los marcadores que contienen glutamina en un extremo carboxílico de una cadena ligera del anticuerpo; c) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina está conjugado adicionalmente de manera específica del sitio al marcador que contiene glutamina después de la posición de aminoácidos T135 en una cadena pesada del anticuerpo; y en el que la relación fármaco-anticuerpo (DAR ) es de 6-9. En algunas realizaciones, el marcador que contiene glutamina en el extremo carboxilo de la cadena ligera del anticuerpo es GGLLQGA (SEQ ID NO: 23) o GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22; y el marcador que contiene glutamina insertado después de T135 de la cadena pesada del anticuerpo es LLQG (SEQ ID NO: 2).
En otra variación, el ADC de la presente invención comprende a) sustituciones de un aminoácido en las posiciones N297Q y K222R, en el que el agente donante de amina se conjuga de manera específica del sitio a la glutamina endógena en la posición 295 y la glutamina se sustituye en la posición 297; b) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina está conjugado de manera específica del sitio a los marcadores que contienen glutamina en un extremo carboxílico de una cadena ligera del anticuerpo; c) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina está conjugado adicionalmente de manera específica del sitio al marcador que contiene glutamina en la posición de aminoácidos T135 en una cadena pesada del anticuerpo; y en el que la relación fármaco-anticuerpo (DAR ) es de 6-9. En algunas realizaciones, el marcador que contiene glutamina en el extremo carboxilo de la cadena ligera del anticuerpo es GGLLQGA (SEQ ID NO: 23) o GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22); y el marcador que contiene glutamina en la posición de aminoácidos T135 de la cadena ligera del anticuerpo es LLQG (SEQ ID NO: 2).
En algunas realizaciones, el ADC de la presente invención comprende a) sustituciones de un aminoácido en las posiciones N297Q y K222R, en el que el agente donante de amina se conjuga de manera específica del sitio a la glutamina endógena en la posición 295 y la glutamina se sustituye en la posición 297; b) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina está conjugado de manera específica del sitio a los marcadores que contienen glutamina en un extremo carboxílico de una cadena ligera del anticuerpo; c) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina adicionalmente está conjugado de manera específica del sitio al marcador que contiene glutamina en las posiciones de aminoácido G200-S202 en una cadena ligera del anticuerpo; d) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina está conjugado adicionalmente de manera específica del sitio al marcador que contiene glutamina en la posición de aminoácidos T135 en una cadena pesada del anticuerpo; y en el que la relación fármaco-anticuerpo (DAR ) es de 9­ 11. En algunas realizaciones, el marcador que contiene glutamina en el extremo carboxilo de la cadena ligera del anticuerpo es GGLLQGA (SEQ ID NO: 23) o GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22); el marcador que contiene glutamina en la posición de aminoácidos G200-S202 de la cadena ligera del anticuerpo es LLQG (SEQ ID NO: 2); y el marcador que contiene glutamina insertado después de T135 en la cadena pesada del anticuerpo también es LLQG (SEQ ID NO: 2).
En algunas realizaciones, el ADC de la presente invención también comprende un agente donante de amina conjugado de manera específica del sitio al marcador que contiene glutamina a) en un extremo carboxilo de una cadena ligera del anticuerpo; b) después de la posición de aminoácido T135 en la cadena pesada del anticuerpo; y c) en las posiciones de aminoácido G200-S202 de la cadena ligera del anticuerpo, en el que los restos de aminoácido endógenos se remplazan con el marcador que contiene glutamina, y en el que la relación fármaco-anticuerpo es aproximadamente de 5-7. En algunas realizaciones, el marcador que contiene glutamina en el extremo carboxilo de la cadena ligera del anticuerpo es GGLLQGA (SEQ ID NO: 23) o Gg Ll QGPP (SEQ ID NO: 22); el marcador que contiene glutamina en la posición de aminoácidos G200-S202 de la cadena ligera del anticuerpo es LLQG (SEQ ID NO: 2); y el marcador que contiene glutamina insertado después de T135 en la cadena pesada del anticuerpo también es LLQG (SEQ ID NO: 2).
La relación fármaco-anticuerpo (DAR) del ADC de la presente divulgación es aproximadamente de 5 a aproximadamente 720. En algunas realizaciones, la DAR es al menos aproximadamente cualquiera de entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, y 710.
En algunas realizaciones, el marcador que contiene glutamina del ADC descrito en el presente documento comprende una secuencia de aminoácidos XXQX (SEQ ID NO: 37), en la que X puede ser un aminoácido convencional o no convencional, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, L (Leu), A (Ala), G (Gly), S (Ser), V (Val), F (Phe), Y (Tyr), H (His), R (Arg), N (Asn), E (Glu), D (Asp), C (Cys), Q (Gln), I (Ile), M (Met), P (Pro), T (Thr), K (Lys), o W (Trp). En algunas realizaciones, el marcador que contiene glutamina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en Q, LQG, LLQGG (SEQ ID NO: 1), LLQG (SEQ ID NO: 2), LSLSQG (SEQ ID NO: 3), GGGLLQGG (SEQ ID NO: 4), GLLQG (SEQ ID NO: 5), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID NO: 6), GLLQGGG (SEQ ID NO: 7), GLLQGG (SEQ ID NO: 8), GLLQ (SEQ ID NO: 9), LLQLLQGA (SEQ ID NO: 10), LLQGA (SEQ ID NO: 11), LLQYQGA (SEQ ID NO: 12), LLQGSG (SEQ ID NO: 13), LLQYQG (SEQ ID NO: 14), LLQLLQG (SEQ ID NO: 15), SLLQG (SEQ ID NO: 16), LLQLQ (SEQ ID NO: 17), LLQLLQ (SEQ ID NO: 18), LLQGR (SEQ ID NO: 19), LLQGPP (SEQ ID NO: 20), LLQGPA (SEQ ID NO: 21), GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22), GGLLQGA (SEQ ID NO: 23), LLQGPGK (SEQ ID NO: 25), LLQGPG (SEQ ID NO: 26), LLQGP (SEQ ID NO: 27), LLQP (SEQ ID NO: 28), LLQPGK (SEQ ID NO: 29), LLQAPGK (SEQ ID NO: 30), LLQGAPG (SEQ ID NO: 31), LLQGAP (Se Q ID NO: 32), y LLQLQG (SEQ ID NO: 36). En algunas realizaciones, el marcador que contiene glutamina comprende una secuencia de aminoácidos LLQGA (SEQ ID NO: 11), LQG, GGLLQGA (SEQ ID NO: 23), LLQGPA (SEQ ID NO: 21), LLQGPP (SEQ ID NO: 20), GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22), LLQGSG (SEQ ID NO: 13), LLQG (SEQ ID NO: 2), LLQYQG (SEQ ID NO: 14), LLQLLQG (SEQ ID NO: 15), LLQLQG (SEQ ID NO: 36), LLQLLQ (SEQ ID NO: 18), LLQLQ (SEQ ID NO: 17), LLQGR (SEQ ID NO: 19), LLQYQGA (SEQ ID NO: 12), SLLQG (SEQ ID NO: 16), o LLQLLQGA (SEQ ID NO: 10). En algunas realizaciones, el marcador que contiene glutamina donante de acilo no comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en LGGQGGG (SEQ ID NO: 38), GGGQGGL (SEQ ID NO: 39), GXGQGGG (SEQ ID NO: 40), GGXQGGG (SEQ ID NO: 41), GGGQXGG (SEQ ID NO: 42), y GGGQGXG (SEQ ID NO: 43), en la que X es G, A, S, L, V, F, Y, R, N o E). También se han descrito otros marcadores ejemplares, por ejemplo, en los documentos US20130230543 y US2013/0122020.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de los ADC como se describen en el presente documento comprende una modificación de aminoácidos en la última posición de aminoácido del extremo carboxilo con respecto a un anticuerpo de tipo silvestre en la misma posición. En algunas realizaciones, la modificación es una eliminación, inserción, sustitución, mutación de aminoácidos, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la sustitución comprende la sustitución de un aminoácido de tipo silvestre por otro (por ejemplo, un aminoácido de tipo no silvestre). En algunas realizaciones, la inserción comprende la inserción de uno o más aminoácidos (por ejemplo, inserción de uno, dos, tres o más aminoácidos). En algunas realizaciones, el otro aminoácido (por ejemplo, de tipo no silvestre) o que se ha insertado es Arg. En algunas realizaciones, el otro aminoácido (por ejemplo, de tipo no silvestre) es Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el último aminoácido del extremo carboxilo del anticuerpo (por ejemplo, la cadena pesada de un anticuerpo) se puede eliminar, y el marcador que contiene glutamina modificado en el extremo C del polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos LLQGA (SEQ ID NO: 11) o LLQGPP (SEQ ID NO: 20).
En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una modificación de aminoácidos en la primera posición de aminoácido del extremo amino con respecto a un anticuerpo de tipo silvestre en la misma posición. En algunas realizaciones, la modificación es una eliminación, inserción, sustitución, mutación de aminoácidos, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la sustitución comprende la sustitución de un aminoácido de tipo silvestre por otro aminoácido (por ejemplo, un aminoácido de tipo no silvestre). En algunas realizaciones, la inserción comprende la inserción de un aminoácido. En algunas realizaciones, el aminoácido de tipo no silvestre o que se ha insertado es Arg. En algunas realizaciones, el otro aminoácido (por ejemplo, de tipo no silvestre o insertado) es Ala, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, o Val.
En algunas realizaciones, el ADC descrito en el presente documento comprende una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo de longitud completa. En algunas realizaciones, el anticuerpo que se describe en el presente documento es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico, un minicuerpo, un diacuerpo, o un fragmento de anticuerpo.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es una IgG. En algunas realizaciones, la IgG se selecciona de entre el grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3, y IgG4.
En algunas realizaciones, el anticuerpo es una IgA, IgE, IgD, o IgM.
En algunas realizaciones, la función efectora (por ejemplo, según se mide mediante la unión a Fcy3 y/o C1q) de los ADC descritos en el presente documento disminuyo no más de aproximadamente cualquiera de entre 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, o 5 veces con respecto a un anticuerpo de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el anticuerpo del ADC es una IgG, en la que la función efectora de la IgG disminuye no más de aproximadamente 2 vez con respecto a una IgG de tipo silvestre. En otras realizaciones, la función efectora de la IgG disminuye aproximadamente 2 veces con respecto a una IgG de tipo silvestre. En otras realizaciones, la función efectora de la IgG disminuye más de aproximadamente 2 veces con respecto a una IgG de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el anticuerpo del ADC es una IgG, en la que la función efectora de la IgG disminuye no más de aproximadamente 1 vez con respecto a una IgG de tipo silvestre. En otras realizaciones, la función efectora de la IgG disminuye aproximadamente 1 veces con respecto a una IgG de tipo silvestre. En otras realizaciones, la función efectora de la IgG disminuye más de aproximadamente cualquiera de entre 1 vez, 3 veces, 4 veces, o 5 veces con respecto a una IgG de tipo silvestre.
En algunas realizaciones, la función efectora (por ejemplo, según se mide mediante la unión a Fcy3 y/o C1q) de los ADC descritos en el presente documento aumenta al menos aproximadamente de 1 vez a 3000 veces con respecto a un anticuerpo de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la función efectora del ADC aumenta al menos aproximadamente cualquiera de 1 a 5 veces, 6 a 10 veces, 11 a 15 veces, 16 a 20 veces, 21 a 25 veces, 26 a 30 veces, 31 a 35 veces, 36 a 40 veces, 41 a 45 veces, 46 a 50 veces, 51 a 55 veces, 56 a 60 veces, 61 a 65 veces, 66 a 70 veces, 71 a 75 veces, 76 a 80 veces, 81 a 85 veces, 86 a 90 veces, 91 a 95 veces, 96 a 100 veces, 101 a 200 veces, 201 a 300 veces, 301 a 500 veces, 501 a 1000 veces, 1001 a 1500 veces, 1501 a 2000 veces, 2001 a 2500 veces, 2501 a 3000 veces con respecto a un anticuerpo de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el anticuerpo del ADC es una IgG, en la que la función efectora de la IgG aumenta aproximadamente de 1 vez a 300 veces con respecto a una IgG de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la función efectora del ADC aumenta aproximadamente cualquiera de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 40 veces, 60 veces, 80 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 250 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces, 1500 veces, 2000 veces, 2500 veces, o 3000 veces con respecto a un anticuerpo de tipo silvestre.
En algunas realizaciones, el agente donante de amina tiene la fórmula: X-Y-Z, en la que X es una unidad donante de amina; Y es un engarce; y Z es un resto agente.
El número de agentes donantes de amina que se pueden conjugar con el anticuerpo depende de 1) el número de marcadores que contienen glutamina que están unidos/insertados en el anticuerpo así como el número de glutaminas en el marcador que contiene glutamina; y/o 2) el número de glutaminas endógenas del anticuerpo (es decir, las glutaminas nativas sin modificar, tales como las glutaminas en los dominios variables, CDR, etc.) y/o 3) el número de glutaminas endógenas que se hacen reactivas por la modificación del anticuerpo como se describe en el presente documento o una transglutaminasa modificada. Por ejemplo, dos agentes donantes de amina pueden conjugarse de manera específica del sitio con un anticuerpo en los extremos carboxílicos de las dos cadenas ligeras, y se pueden conjugar de manera específica del sitio cuatro agentes donantes de amina al anticuerpo en las posiciones Q295 y N297Q. En algunas realizaciones, el agente donante de amina puede ser el mismo o diferente en cada posición de conjugación.
La unidad donante de amina de la presente invención es una amina primaria (NH2) que proporciona un sustrato para la transglutaminasa que permite la conjugación del resto agente al anticuerpo mediante el marcador que contiene glutamina, la glutamina endógena, y/o la glutamina endógena reactiva. En consecuencia, la unión entre el marcador que contiene glutamina, la glutamina endógena, y/o la glutamina endógena reactiva; y la unidad donante de amina tiene la fórmula CH2-CH2-CO-NH-, en la que un NH- está unido a un engarce y uno o más restos agentes.
El engarce de la presente invención puede ser un engarce escindible o no escindible. Por ejemplo, el engarce (con la unidad donante de amina) o el agente donante de amina se puede liberar del anticuerpo. En algunas realizaciones, el engarce puede ser un engarce peptídico (por ejemplo, con aminoácidos convencionales y/o no convencionales) y/o un engarce no peptídico. Ejemplos de un engarce no peptídico incluyen un engarce alquilo y un engarce p Eg (polietilenglicol).
En algunas realizaciones, la unidad donante de amina-engarce (X-Y) es una unidad lineal que comprende un resto agente. En otras realizaciones, la unidad donante de amina-engarce es una unidad ramificada (por ejemplo, al menos 2 unidades) que comprenden al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o más restos agentes. En una variación, el resto agente de un engarce ramificado puede ser el mismo resto agente o uno diferente.
Las unidades donantes de amina-engarces X-Y ejemplares incluyen, pero no se limitan a Ac-Lys-Gly, ácido aminocaproico, Ac-Lys-p-Ala, amino-PEG2-C2, amino-PEG3-C2, amino-PEG6-C2, Ac-Lys-Val-Cit (citrulina)-PABC (paminobenciloxicarbonilo), amino-PEG3-C2-Val-Cit-PABC, amino-PEG6-C2-Val-Cit-pABC, aminocaproil-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC, [(3S,5S)-1-{3-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC, Ac-Lys-putrescina, o 2-aminoetoxi.
El resto agente del polipéptido modificado de la presente invención incluye una molécula pequeña, una proteína o polipéptido, y un polímero biocompatible.
En algunas realizaciones, la molécula pequeña es un agente citotóxico, un agente inmunosupresor, o un agente de creación de imágenes (por ejemplo, un fluoróforo). En algunas realizaciones, el agente citotóxico es un agente quimioterápico.
Ejemplos de un agente citotóxico incluyen, pero no se limitan a, antraciclina, una auristatina, una dolastatina, una combretastatina, una duocarbamicina, un dímero de pirrolobenzodiacepina, un dímero indolino-benzodiacepina, una enedina, una geldamicina, una maitansina, una puromicina, un taxano, un alcaloide de la vinca, una camptotecina, una tubulisina, una hemiasterlina, una empalmoestatina, un pladienólido, y estereoisómeros, isósteros, análogos, derivados de los mismos.
Las antraciclinas se derivan de bacterias Streptomyces y se han utilizado para tratar un amplio intervalo de cánceres, tales como leucemias, linfomas, canceres de mama, uterinos, ováricos, y de pulmón. Las antraciclinas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, daunorrubicina, doxorrubicina (es decir, adriamicina), epirrubicina, idarrubicina, valrrubicina, y mitoxantrona.
Las dolastatinas y sus análogos peptídicos y sus derivados, las auristatinas, son agentes antimicóticos altamente potentes que se ha demostrado que tienen una actividad anticancerosa y antifúngica. Véase, por ejemplo, la Pat. de EE. UU. N.° 5.663.149; y Pettit y col., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965, 1998. Las dolastatinas y auristatinas incluyen, pero no se limitan a, dolastatina 10, auristatina E, auristatnina EB (AEB), auristatina EFP (AEFP), MMAD (Monometil auristatina D o monometil dolastatina 10), MMAF (Monometil Auristatin F o N-metilvalina-valinadolaisoleucina-dolaproina-fenilalanina), MMAE (Monometil Auristatina E o N-metilvalina-valina-dolaisoleucinadolaproína-norefecrina), ácido 5-benzoilvalérico-éster AE (AEVB), y otras nuevas auristatinas (tales como las descritas en la Publicación de EE. UU. N.° 2013/0129753). En algunas realizaciones, la auristatina es 0101 (2-metilalanil-W-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-W-metil-L-valinamida) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000018_0001
En algunas realizaciones, la auristatina es 3377 (N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-car-boxil-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metoxi-1-[(1S)-1-metilpropil]-4-ox-obutil}-N-metil-L-valinamida) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000018_0002
En algunas realizaciones, la auristatina es 3377-OMe (N,2-dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000018_0003
En algunas realizaciones, la auristatina es 0131 (2-metil-L-proli-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxi-2-feniletil]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000018_0004
En algunas realizaciones, la auristatina es 0121 (2-metil-L-proli-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-metoxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metoxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metoxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida) que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000019_0001
La camptotecina es un alcaloide quinolina citotóxico que inhibe la enzima topoisomerasa I. Ejemplos de camptotecinas y sus derivados incluyen, pero no se limitan a, topotecan e irinotecan, y sus metabolitos, tales como el SN-38.
Las combretastatinas son fenoles naturales con propiedades de alteración vascular en tumores. La combretastatinas ejemplares y sus derivados incluyen, pero no se limitan a, combretastatina A-4 (CA-4) y ombrabulina.
La duocarmicina y CC-1065 son agentes alquilantes de ADN con potencia citotóxica. Véase Boger y Johnson, PNAS 92:3642-3649 (1995). La duocarmicina ejemplar y CC-1065 incluyen, pero no se limitan a (+)-duocarmicina A y (+)-duocarmicina SA, (+)-CC-1065, y los compuestos que se desvelan en la solicitud internacional PCT/IB2015/050280 que incluye, pero no se limita a, N~2— acetil-L-lisil-L-valil-N~5— carbamoil-N-[4-({[(2-{[({(1S)-1-(clorometil)-3-[(5-{[(1S)-1-(clorometil)-5-(fosfonooxi)-1,2-dihidro-3H-benzo[e]indol-3-il]carbonil}tiofen-2-il)carbonil]-2,3-dihidro-1H-benzo[e]indol-5-il}oxi)carbonil](metil)amino}etil)(metil)carbamoil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida que tiene la estructura:
Figure imgf000019_0002
N~2— acetil-L-lisil-L-valil-N~5— carbamoil-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(clorometil)-6-[(3-{[(1S)-1-(clorometil)-8-metil-5-(fosfonooxi)-1,6-dihidropirrolo[3,2-e]indol-3(2H)-il]carbonil}biciclo[1.1.1]pent-1-il)carbonil]-1-metil-3,6,7,8-tetrahidropirrolo[3,2-e]indol-4-il}oxi)carbonil](metil)amino}etil)(metil)carbamoil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida que tiene la estructura:
Figure imgf000019_0003
N~2— acetil-L-lisil-L-valil-N~5— carbamoil-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(clorometil)-6-[(4-{[(1S)-1-(clorometil)-8-metil-5-(fosfonooxi)-1,6-dihidropirrolo[3,2-e]indol-3(2H)-il]carbonil}pentaciclo[4.2.0.0~2,5~0~3,8~0~4,7-]oct-1-il) carbonil] 1-metil-3,6,7,8-tetrahidropirrolo[3,2-e]indol-4-il}oxi)carbonil](metil)amino}etil)(metil)carbamoil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida que tiene la estructura:
Figure imgf000020_0001
Las enedinas son una clase de productos antitumorales bacterianos caracterizados por anillos de nueve y diez miembros o la presencia de un sistema cíclico de enlaces triples-doble-triples. Las enedinas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, caliqueamicina, esperamicina, uncialamicina, dinemicina, y sus derivados.
Las geldanamicinas son benzoquinonas ansamicinas antibióticas que se unen a la Hsp90 (Proteína 90 de choque térmico) y se han utilizado como fármacos antitumorales. Las geldanamicinas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, 17-AAG (17-N-Alilamino-17-Demetoxigeldanamicina) y 17-DMAG (17-Dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina).
La hemiasterlina y sus análogos (por ejemplo, HTI-286) se unen a la tubulina, alteran la dinámica de microtúbulos normal, y, en cantidades estequiométricas, despolimeriza los microtúbulos.
Las maitansinas o sus derivados maitansinoides inhiben la proliferación celular inhibiendo la formación de microtúbulos durante la mitosis mediante la inhibición de la polimerización de tubulina. Véase Remillard y col., Science 189:1002-1005 (1975). Las maitansinas y maitansinoides ejemplares incluyen, pero no se limitan a, mertansina (DM1) y sus derivados, así como ansamitocina.
Los dímeros de pirrolobenzodiacepina (PBD) y los dímeros de indolino-benzodiacepina (IGN) son agentes antitumorales que contienen uno o más grupos imina funcionales, o sus equivalentes, que se unen a un dúplex de ADN. Las moléculas de PBD e IGN se basan en el producto natural antramicina, e interactúan con el ADN de una manera selectiva de la secuencia, con una preferencia para las secuencias purina-guanina-purina. Los PBD ejemplares y sus análogos incluyen, pero no se limitan a, SJG-136.
Las empalmoestatinas y pladienólidos son compuestos antitumorales que inhiben el corte y empalme e interactúan con el empalmosoma, SF3b. Los ejemplos de empalmoestatinas incluyen, pero no se limitan a, empalmoestatina A, FR901464, y (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-hidrazinil-2-oxoetil)-4-hidroxi-1,6-dioxaspiro[2.5]oct-5-il]-3-metilpenta-2,4-dien-1-il}-2,5-dimetiltetrahidro-2H-piran-3-il]amino}-5-oxopent-3-en-2-il acetato que tienen la siguiente estructura
Figure imgf000020_0002
Los ejemplos de planienólidos incluyen, pero no se limitan a, Pladienólido B, Pladienólido D y E7107.
Los taxanos son diterpernos que actúan como agentes antitubulina o inhibidores mitóticos. Los taxanos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel (por ejemplo, TAXOL®) y docetaxel (TAXOTERE®).
Las tubulisinas son productos naturales aislados de una cepa de micobacterias que se ha demostrado que despolimerizan los microtúbulos e inducen la detención mitótica. Las tubulisinas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, tubulisina A, tubulisina B, y tubulisina D.
Los alcaloides de la vinca también son agentes antitubulina. Los alcaloides ejemplares de la vinca incluyen, pero no se limitan a, vincristina, vinblastina, vindesina, y vinorelbina.
En algunas realizaciones, el resto agente es un agente inmunosupresor. Los ejemplos de un agente inmunosupresor incluyen, pero no se limitan a, ganciclovier, etanercept, tacrolimus, sirolimus, voclosporin, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolgato mofetilo, metrotrexato, y glucocorticoides y sus análogos y derivados.
En algunas realizaciones, el resto agente es un agente para creación de imágenes (por ejemplo, un fluoróforo o un quelante), tal como fluoresceína, rodamina, fósforos lantánidos, y sus derivados, o un radioisótopo unido a un quelante.
Los ejemplos de fluoróforos incluyen, pero no se limitan a, isotiocianato de fluoresceína (FITC) (por ejemplo, 5-FITC), fluoresceína amidita (FAM) (por ejemplo, 5-FAM), eosina, carboxifluoresceína, eritrosina, Alexa Fluor® (por ejemplo,
Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700, o 750), carboxitetrametilrodamina (TAMRA) (por ejemplo, 5-TAMRA), tetrametilrodamina (TMR), y sulforodamina (SR) (por ejemplo, SR101). Los ejemplos de quelantes incluyen, pero no se limitan a, ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"'-tetraacético (DOTA), ácido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA), 1,4,7-triazaciclononano, ácido
1-glutárico-ácido 4,7-acético (deferoxamina), ácido dietilenetriaminapentaacético (DTPA), y ácido 1,2-bis(oaminofenoxi) etano-N,N,N',N'-tetra acético ) (BAPTA).
En algunas realizaciones, el resto agente es un polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido es un anticuerpo, tal como un anticuerpo humanizado, humano, quimérico, o monoclonal murino.
En algunas realizaciones, el resto agente es una toxina polipeptídica (o una toxina proteica). Los ejemplos de una toxina polipeptídica incluyen, pero no se limitan a, cadena A de difteria, fragmentos activos de no unión de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina, cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantinas, proteínas de Phitolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcin, crotin, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, tricotecenes, péptidos inhibidores del nudo de cistina (ICK) (por ejemplo, ceratotoxinas), y conotoxina (por ejemplo, KIIIA o Smllla).
En algunas realizaciones, los radioisótopos u otros marcadores se pueden incorporar en el resto agente (por ejemplo, mediante la unión a un quelante) para la conjugación de un anticuerpo a un agente donante de amina que lleva un quelante. Los ejemplos de radioisótopos u otros marcadores incluyen, pero no se limitan a, 3H, 14C, 15N, 35S, 18F, 32P,
33P, 64Cu, 68Ga, 89Zr, 90Y, 99Tc, 123I, 124I, 125I, 131I, 111In, 131In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, y 153Pb
En algunas realizaciones, el resto agente es un polímero biocompatible. El anticuerpo se puede conjugar con el polímero biocompatible mediante el marcador que contiene glutamina, una glutamina endógena, y/o una glutamina endógena reactiva, para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la semivida en el suero y la bioactividad, y/o para extender las semividas in vivo. Los ejemplos de polímeros biocompatibles incluyen polímeros hidrosolubles, tales como el polietilenglicol (PEG) o sus derivados y polímeros compatibles que contienen zwitterion (por ejemplo, un polímero que contiene una fosforilcolina).
En algunas realizaciones, el agente donante de amina (X-Y-Z) es
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en la que X es NH2 (es decir, formando de esta manera un enlace covalente con la glutamina como CH2-CH2-CO-NH-), m es un 0 a 20, n es 1 a 8, p es 0 a 3, q es 0 o 1, el aminoácido es cualquier aminoácido convencional o no convencional, y Z es un agente citotóxico o un agente de creación de imágenes.
Los aminoácidos convencionales o de origen natural se dividen en grupos basándose en las propiedades de cadenas laterales comunes: (1) no polar: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) polar sin carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos (cargados negativamente): Asp, Glu; (4) básicos (cargados positivamente): Lys, Arg; y (5) restos que tienen influencia sobe la orientación de la cadena: Gly, Pro; y (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe, His. Los aminoácidos convencionales incluyen la estereoquímica L o D.
Los aminoácidos no convencionales son aminoácidos no de origen natural. Los ejemplos de un aminoácido no convencional incluyen, pero no se limitan a, ácido aminoadípico, beta-alanina, ácido beta-aminopropiónico, ácido aminobutírico, ácido piperidínico, ácido aminocaproico, ácido aminoheptanoico, ácido aminoisobutírico, ácido aminopimélico, citrulina, ácido diaminobutírico, desmosina, ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, sarcosina, N-metilisoleucina, N-metil-valina, norvalina, norleucina, ornitina, 4-hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetillisina, £-N-acetil lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, 6-N-metilarginina, y otros aminoácidos similares y derivados de aminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina).
En algunas realizaciones el agente donante de amina es un polímero biocompatible que comprende una amina reactiva y un resto agente.
En algunas realizaciones, el agente donante de amina se selecciona de entre el grupo que consiste en Alexa 488 cadaverina, 5-FITC cadaverina, Alexa 647 cadaverina, Alexa 350 cadaverina, 5-TAMRA cadaverina, 5-FAM cadaverina, SR101 cadaverina, 5,6-TAMRA cadaverina, 5-FAM lisina, Ac-Lys-Gly-MMAD, amino-PEG3-C2-MMAD, amino-PEG6-C2- MMAD, amino-PEG3-C2-amino-nonanoil-MMAD, aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-p-Ala-MMAD, Aminocaproil-MMAD, amino-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101, amino-PEG3-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, amino-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-0101, aminocaproil-MMAE, amino-PEG3-C2-MMAE, amino-PEG2-C2-MMAE, aminocaproil-MMAF, aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAE, amino-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAF, aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAF, amino-PEG2-C2-MMAF, amino-PEG3-C2-MMAF, putrescinil-geldanamicina, Ac-Lys-putrescinil-geldanamicina, aminocaproil-3377, aminocaproil-0131, amino-PEG6-C2-0131, amino-PEG6-C2-3377, aminocaproil-0121, amino-PEG6-C2-0121, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-aminoetoxi) etoxi] propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC-MMAD, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-aminoetoxi) etoxi] propanoil} piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC-MMAE,2-aminoetoxi-PEG6-NODAGA (o ácido 2,2'-(7-(1-amino-28-carboxi-25-oxo-3,6,9,12,15,18,21-heptaoxa-24-azaoctacosan-28-il)-1,4,7-triazonano-1,4-diil) diacético), y N-2-acetil-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-hidroxi-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-hidroxipent-2-enoil]amino}-3,6-dimetiltetrahidro-2H-piran-2-il]-3-metilpenta-1,3-dien-1-il}-1,6-dioxaspiro[2.5]oct-5-il]acetil} hidrazinil) carbonil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida. En algunas realizaciones, el agente donante de amina es Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101, o amino-PEG6-C2-MMAD. En algunas realizaciones, el marcador que contiene glutamina donante de acilos comprende la secuencia de aminoácidos GGLLQGA (SEQ ID NO: 23) o GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22), y adicionalmente LLQGA (SEQ ID NO: 11), LLQGPP (SEQ ID NO: 20) o LLQG (SEQ ID NO: 2), y el agente donante de amina es Ac-Lys-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lys-Val-Cit-PABC-0101, o amino-PEG6-C2-MMAD. Las estructuras ejemplares del agente donante de amina se enumeran en la Tabla 2.
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Procedimientos para hacer el conjugado anticuerpo-fármaco con mayor carga
También se proporcionan los procedimientos para hacer los ADC descritos en el presente documento. En un aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para la preparación de un ADC que comprende la fórmula: anticuerpo-(T-(X-Y-Za)b)c , en la que: T es 1) un marcador que contiene glutamina modificado en un sitio específico, 2) una glutamina endógena, y/o 3) una glutamina endógena que se ha hecho reactiva mediante modificación del anticuerpo o una transglutaminasa modificada; X es una unidad donante de amina; Y es un engarce; y Z es un resto agente; X-Y-Z es un agente donante de amina conjugado de manera específica del sitio con un marcador que contiene glutamina, la glutamina endógena, y/o la glutamina endógena reactiva; a es un número entero del 1 al 6; b es un número entero del 1 al 6; c es un número entero del 1 al 20; y en el que el producto (relación fármaco-anticuerpo) de a, b, y c es al menos aproximadamente 5, que comprende las etapas de: a) proporcionar una molécula de anticuerpo-T que comprende el anticuerpo y el marcador que contiene glutamina; y/o el anticuerpo con la glutamina endógena y/o endógena reactiva; b) poner en contacto el agente donante de amina con la molécula de anticuerpo-T en presencia de una transglutaminasa (por ejemplo, una transglutaminasa modificada o una transglutaminasa purificada); y c) permitir que el anticuerpo -T se una covalentemente al agente donante de amina para formar el conjugado anticuerpofármaco. En algunas realizaciones, la molécula de anticuerpo-T se expresa en células CHO.
En algunas realizaciones, el ADC preparado utilizando los procedimientos descritos en el presente documento tienen una eficacia de conjugación de al menos aproximadamente un 51 %. En algunas realizaciones, el ADC tiene una eficacia de conjugación de al menos aproximadamente cualquiera de entre un 51 %-60 %, un 61 %-70 %, un 71 %-80%, un 81 %-90 %, o un 91 %-100%. En algunas realizaciones, el ADN tiene una eficacia de conjugación de aproximadamente cualquiera de entre un 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 %, 99.6 %, 99.7 %, 99.8 %, 99.9 %, o 100 %.
En algunas realizaciones, la relación de concentraciones molares entre el agente donante de amina que se pone en contacto y la molécula de anticuerpo-T que se pone en contacto es desde aproximadamente 4:1 a aproximadamente 10000:1. Por ejemplo, la relación de concentraciones molares entre el agente donante de amina (por ejemplo, un fármaco citotóxico) y el anticuerpo (por ejemplo, unido a un marcador que contiene glutamina o que contiene una glutamina nativa/reactiva) cargado o utilizado para la reacción de conjugación catalizada por la transglutaminasa puede ser de aproximadamente 20:1. En algunas realizaciones, la relación de concentración entre el agente donante de amina que se pone en contacto y la molécula de anticuerpo-T que se pone en contacto es aproximadamente cualquiera de entre 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1,200:1, 300:1,400:1, 500:1,600:1, 700:1, 800:1, 900:1, 1000:1, 2000:1, 3000:1,4000:1, 5000:1,6000:1, 7000:1, 8000:1, 9000:1, o 10000:1.
En algunas realizaciones, cuando se conjuga un anticuerpo con un agente donante de amina mediante un marcador que contiene glutamina, una glutamina endógena, y/o una glutamina endógena reactiva en un sitio específico, el ADC es más estable (por ejemplo, con una semivida del ADC in vivo más larga) y/o tiene una mayor exposición. Por ejemplo, el ADC que comprende modificaciones de aminoácidos N297Q, y K222R; marcadores que contienen glutamina en el extremo carboxilo de la cadena ligera y/o la cadena pesada del anticuerpo, y/o una o más posiciones de la cadena ligera o la cadena pesada del anticuerpo (por ejemplo, véase la Tabla 1) como se describe en el presente documento, es más estable que el ADC convencional con el enlace maleimida.
En algunas realizaciones, los procedimientos proporcionados en el presente documento comprenden adicionalmente una etapa de purificación. Los ADC descritos en el presente documento se pueden purificar utilizando distintos procedimientos de purificación, tal como, por ejemplo, cromatografía con hidroxiapatita; diálisis; cromatografía de afinidad; cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) (por ejemplo, fraccionamiento sobre una HIC); precipitación en sulfato de amonio; precipitación en polietilenglicol o un derivado del polietilenglicol; cromatografía de intercambio aniónico o catiónico; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice; cromatoenfoque; SDS-PAGE, filtración en gel, cromatografía de exclusión por tamaño, y cromatografía de partición débil.
En algunas realizaciones, al menos una etapa de purificación comprende una etapa de un procedimiento de cromatografía de afinidad. Se puede utilizar un ligando de Proteína A (sintética, recombinante o nativa) para purificar por afinidad los conjugados del polipéptido que contiene Fc modificados descritos en el presente documento. El ligando de Proteína A sintético o recombinante puede adquirirse en el mercado en GE Healthcare (Piscataway, NJ), Pierce (Rockford, IL), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), o Applied Biosystems (Foster City, CA), y el ligando de Proteína A nativo (por ejemplo, MABSELECT™, PROSEP™ Va, y PROSe P™ Ultra Plus) puede adquirirse en el mercado en GE Healthcare (Piscataway, NJ) o Millipore (Billerica, MA).
En algunas realizaciones, el ADC purificado como se describe en el presente documento que resulta de la etapa de purificación es altamente puro, es decir, al menos aproximadamente cualquiera de entre un 70 %-75 %, 75 %-80 %, 80 %-85 %, 85 %-90 %, 90 %-95 %, 95 %-98 %, o 99 % puro. Por ejemplo, el ADC purificado es aproximadamente cualquiera de entre un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % puro.
Procedimiento de utilización de conjugados de anticuerpo-fármaco con alta carga de fármaco
Los ADC de la presente invención son útiles en distintas aplicaciones que incluyen, pero no se limitan a, procedimientos de tratamiento terapéutico y procedimientos de tratamiento diagnóstico.
En un aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento del cáncer en un sujeto. En consecuencia, en algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento de tratamiento de un cáncer en un sujeto que lo necesite, que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende el ADC como se describe en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, los cánceres incluyen, pero no se limitan a, un cáncer sólido (tal como un cáncer de vejiga, mama, cuello uterino, coriocarcinoma, de colon, esofágico, gástrico, glioblastoma, de cabeza y cuello, riñón, hígado, pulmón (por ejemplo, un cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)), oral, ovárico, pancreático, de próstata, y de piel); y un cáncer líquido (tal como una leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia de células pilosas (HCL), leucemia prolinfocítica de linfocitos T (T-PLL), leucemia linfocítica granular grande, mieloma múltiple, linfoma no de Hodgkin (NHL) (incluyendo el linfoma folicular (FL) y el linfoma de linfocitos B grandes difuso (DLBCL)), y leucemia de linfocitos T de adulto).
En algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento de inhibición del crecimiento o la progresión de un tumor en un sujeto que lo necesite, que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una composición que comprende los ADC como se describe en el presente documento. En otras realizaciones, se proporciona un procedimiento de inhibición de la metástasis de células cancerosas o tumores (por ejemplo, tumores sólidos o líquidos) en un sujeto que lo necesite, que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una composición que comprende los ADC como se describe en el presente documento. En otras realizaciones, se proporciona un procedimiento de inducción de la regresión de un tumor en un sujeto que lo necesite, que comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una composición que comprende los ADC como se describe en el presente documento.
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento de detección, diagnóstico, y/o monitorización de una afección asociada con una proteína relacionada con el cáncer (por ejemplo, Trop-2, BRCA1, BRCA2, HER2, VEGF, CD20, CD25, EFGR, 5T4, CD22, etc.) in vivo o in vitro. En consecuencia, en algunas realizaciones, se proporciona un procedimiento de diagnóstico del cáncer en un sujeto sospechoso de padecer cáncer, que comprende a) poner en contacto una muestra del sujeto con el ADC descrito en el presente documento en condiciones que den como resultado la unión del ADC con una proteína relacionada con el cáncer, y b) determinar la unión del ADC a la proteína relacionada con el cáncer.
El resto agente de los ADC que se describen en el presente documento puede ser un resto detectable tal como un agente de creación de imágenes y un sustrato enzimático marcador. Los ADC que se describen en el presente documento también se pueden utilizar para ensayos diagnósticos in vivo, tales como creación de imágenes in vivo (por ejemplo, PET o SPECT), o un reactivo de tinción.
En algunas realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento comprenden adicionalmente una etapa de tratamiento de un sujeto con una forma adicional de terapia. En algunas realizaciones, la forma adicional de terapia es una terapia anticáncer adicional que incluye, pero no se limita a, quimioterapia, radiación, cirugía, terapia hormonal, y/o inmunoterapia adicional.
En algunas realizaciones, la forma adicional de terapia comprende la administración de uno o más agentes terapéuticos además del ADC descrito en el presente documento. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, un segundo ADC (por ejemplo, un ADC convencional tal como el brentuximab vedotin (ADCETRIS®) y adotrastuzumab emtansina (KADCYLA®)), un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF, un anticuerpo anti-HER2, un anticuerpo anti-CD25, y/o un anticuerpo anti-CD20), un inhibidor de la angiogénesis, un agente citotóxico (por ejemplo, docetaxel, cisplatino, doxorrubicina, mitomicina, tamoxifeno, o fluorouracilo), y un agente antiinflamatorio (por ejemplo, prednisona, y progesterona).
Composiciones farmacéuticas
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende los ADC con mayor carga como se describe en el presente documento en un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ADC se pueden administrar solos o en combinación con uno o más de otros ADC de la presente invención o en combinación con uno o más de otros fármacos (o como cualquier combinación de los mismos). Por ejemplo, los ADC de la presente invención se pueden administrar en combinación con ADC convencionales (por ejemplo, con una DAR de 1-4) o ADC específicos del sitio utilizando una tecnología de conjugación mediada por la transglutaminasa como se describe en el presente documento con unas DAR de 1-4. Los procedimientos y usos de la divulgación también engloban por lo tanto las realizaciones de las combinaciones (coadministraciones) con otros agentes activos, como se detalla posteriormente.
Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "co-administración", "co-administrado", o "en combinación con" tienen la intención de significar y hacen referencia a lo siguiente: (i) la administración simultánea de una combinación de un ADC desvelado en el presente documento y un agente(s) terapéutico(s) a un paciente que lo necesite , cuando dichos componentes se han formulado en conjunto en una forma de dosificación única que libera dichos componentes sustancialmente al mismo tiempo en dicho paciente; (ii) la administración sustancialmente simultánea de dicha combinación de un ADC desvelado en el presente documento y un agente terapéutico a un paciente que necesite el tratamiento, cuando dichos componentes se formulan por separado en formas de dosificación diferentes que se toman sustancialmente al mismo tiempo por dicho paciente, donde dichos componentes se liberan sustancialmente al mismo tiempo en dicho paciente; (iii) la administración secuencial de dicha combinación de un ADC desvelado en el presente documento y un agente terapéutico a un paciente que necesite el tratamiento, cuando dichos componentes se formulan por separado en formas de dosificación diferentes que se toman en momentos consecutivos por dicho paciente con un intervalo de tiempo significativo entre cada administración, donde dichos componentes se liberan sustancialmente en diferentes momentos en dicho paciente; y (iv) la administración secuencial de dicha combinación de un ADC desvelado en el presente documento y un agente terapéutico a un paciente que necesite el tratamiento, cuando dichos componentes se formulan juntos en una forma de dosificación única que libera dichos componentes de una manera controlada donde se liberan concurrente, consecutiva, y/o solapadamente al mismo tiempo o en momentos diferentes en dicho paciente.
En general, los ADC desvelados en el presente documento son adecuados para administrarse como una formulación en asociación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El término 'excipiente' se utiliza en el presente documento para escribir cualquier ingrediente distintos de los compuestos de la invención. La elección de los excipientes depende hasta cierto punto de factores tales como el modo de administración en particular, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y la estabilidad, y la naturaleza de la forma de dosificación. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y los similares que sean fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables son agua, solución salina, solución salina tampón de fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones se incluyen agentes isotónicos, que incluyen, pero no se limitan a, azúcares, polialcoholes (por ejemplo, manitol, sorbitol) o cloruro sódico en la composición farmacéutica. Ejemplos adicionales de sustancias farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que aumenten la vida de almacenamiento o la eficacia del anticuerpo.
La presente divulgación también proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de ADC con mayor carga de la presente divulgación como se describe en el presente documento, en el que la media de relación fármaco-anticuerpo (DAR ) es de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 720,0. En algunas realizaciones, la DAR media es al menos aproximadamente de 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6 ,6 , 6,7, 6 ,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 80,0, 90,0, 100,0, 110,0, 120,0, 130,0, 140,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0, 350,0, 400,0, 450,0, 500,0, 550,0, 600,0, 650,0, o 700,0.
En una variación, la presente divulgación proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de ADC, en la que al menos un ADC es el ADC con mayor carga de la presente divulgación como se describe en el presente documento, y en el que la relación media de fármaco-anticuerpo es de aproximadamente 4,1 a aproximadamente 720,0. En algunas realizaciones, la DAR media es al menos aproximadamente de 4,1, 4,2, 4,3, 4 ,4 , 4,5, 4 ,6 , 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6 ,6 , 6,7, 6 ,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6 , 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20.0, 30,0, 40,0, 50,0, 60,0, 70,0, 80,0, 90,0, 100,0, 110,0, 120,0, 130,0, 140,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0, 350,0, 400.0, 450,0, 500,0, 550,0, 600,0, 650,0, o 700,0. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender uno o más ADC específicos del sitio que tienen una DAR de al menos aproximadamente 5 como se describe en el presente documento y uno o más ADC específicos del sitio (utilizando una tecnología de conjugación mediada por transglutaminasa como se describe en el presente documento) que tienen una DAR de 1, 2, 3, o 4. Como otro ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender 1) uno o más ADC específicos del sitio que tienen una DAR de al menos aproximadamente 5 como se describe en el presente documento, 2) uno o más ADC específicos del sitio (utilizando una tecnología de conjugación mediada por transglutaminasa como se describe en el presente documento) que tienen una DAR de 1, 2, 3, o 4 y 3) uno o más ADC convencionales con el enlace maleimida con DAR de 1,2, 3, 4, o más.
En algunas realizaciones, los ADC descritos en el presente documento se pueden desinmunizar para reducir la inmunogenicidad al administrar a un sujeto dichas técnicas conocidas tales como las descritas, por ejemplo, en la publicación PCT WO 98/52976 y WO 00/34317.
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación y los procedimientos para su preparación son fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Dichas composiciones y procedimientos para su preparación se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 22a Edición (Mack Publishing Company, 2012). Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferentemente en condiciones GMP.
Una composición farmacéutica de la invención se puede preparar, envasar, o vender a granel, como una unidad de dosis única, o como una pluralidad de unidades de dosis únicas. Como se utiliza en el presente documento, una "dosis unitaria" es una cantidad separada de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del principio activo es igual en general a la dosificación del principio activo que se administraría a un sujeto o una fracción conveniente de dicha dosificación tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de dicha dosificación. Se puede emplear adecuadamente cualquier procedimiento para la administración de péptidos, proteínas o anticuerpos aceptado en la técnica para los conjugados de polipéptido modificados desvelados en el presente documento.
Las composiciones farmacéuticas de la invención son normalmente adecuadas para la administración parenteral. La administración parenteral de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por la punción del tejido de un sujeto y la administración de la composición farmacéutica a través de la punción en el tejido, que resulta generalmente en la administración directa en la corriente sanguínea, en el músculo, o en un órgano interno. Por ejemplo, la administración parenteral incluye, pero no se limita a, la administración de una composición farmacéutica mediante inyección de la composición, mediante la aplicación de la composición a través de una incisión quirúrgica, mediante la aplicación de la composición a través de una herida no quirúrgica penetrante del tejido, y similares. En particular, se contempla que la administración parenteral incluya, pero no se limita a, la inyección o infusiones subcutáneas, intraperitoneal, intramuscular, intraesternal, intravenosa, intraarterial, intratecal, intraventricular, intrauretral, intracraneal, intrasinovial, y técnicas de infusión dialíticas renales. En algunas realizaciones, la administración parenteral es la vía intravenosa o subcutánea.
Las formulaciones de una composición farmacéutica adecuada para la administración parenteral normalmente comprenden en general el ingrediente activo combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable., tal como agua estéril o solución salina isotónica estéril. Dichas formulaciones se pueden preparar, envasar, o vender en una forma adecuada para la administración en embolada o para administración continua. Las formulaciones inyectables se pueden preparar, envasar o vender en forma de dosificación unitaria, tal como en ampollas o en recipientes multi dosis que contengan un conservante. Las formulaciones para la administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y similares. Dichas formulaciones pueden comprender adicionalmente uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero no se limitan a, agentes suspensores, estabilizantes, o dispersantes. En una realización de una formulación para la administración parenteral, el principio activo se proporciona en forma seca (es decir, en polvo o gránulos) para la reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Las formulaciones parenterales también incluyen soluciones acuosas que pueden contener excipientes tales como sales, carbohidratos y agentes tampón (preferentemente a un pH de desde 3 a 9), pero, para algunas aplicaciones, pueden formularse más adecuadamente como una solución no acuosa estéril o como una forma seca para utilizarse en conjunción con un vehículo adecuado tal como agua libre de pirógenos, estéril. Las formas de administración parenteral ejemplares incluyen soluciones o suspensiones en soluciones acuosas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas de propilenglicol o dextrosa. Dichas formas de dosificación pueden estar tamponadas adecuadamente, si se desea. Otras formulaciones que se pueden administrar por vía parenteral que son útiles incluyen las que comprenden el principio activo en forma microcristalina, o en una preparación liposómica. Las formulaciones para la administración parenteral pueden formularse para la liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen formulaciones de liberación controlada, retrasada, sostenida, pulsada, dirigida y programada. Por ejemplo, en un aspecto, se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando el polipéptido que contiene Fc modificado, por ejemplo, el conjugado anticuerpo-fármaco o el anticuerpo biespecífico, en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido por una esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el principio activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son el secado al vacío y el secado por congelación que dan lugar a un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución esterilizada por filtración previamente. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada. Por ejemplo, se puede administrar una única embolada, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente como indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria, como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades separadas físicamente adecuadas como dosificaciones unitarias para los pacientes/sujetos que se van a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario. La especificación para las formas de dosificación unitaria de la invención se dicta en general y depende directamente de (a) las características únicas del resto agente (por ejemplo, moléculas pequeñas tales como un agente citotóxico) y el efecto terapéutico particular que se va a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de dicho principio activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Por lo tanto, el experto apreciará, basándose en la divulgación proporcionada en el presente documento, que la dosis y régimen de dosificación se ajusta de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Es decir, se puede establecer rápidamente la dosis máxima tolerable, y también se puede determinar la cantidad eficaz que proporciona un beneficio terapéutico para un paciente, como las necesidades temporales para la administración de cada agente para proporcionar un beneficio terapéutico al paciente. En consecuencia, aunque se ejemplifican en el presente documento ciertas dosis y régimen de administración que pueden proporcionarse a un paciente en la práctica de la presente invención.
Se tiene que señalar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y gravedad de la afección que se va a aliviar, y pueden incluir dosis únicas o múltiples. Se tiene que entender además que, para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos se deberían ajustar a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad del individuo y el juicio del profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación que se exponen en el presente documento son ejemplares solamente y no pretenden limitar el ámbito o práctica de la composición reivindicada. Adicionalmente, el régimen de dosificación con las composiciones de la presente invención puede basarse en una variedad de factores, que incluyen el tipo de enfermedad, la edad, peso, sexo, afección médica del paciente, la gravedad de la afección, la vía de administración, y el anticuerpo en particular que se emplee. Por lo tanto, el régimen de dosificación puede variar ampliamente, pero se puede determinar de manera rutinaria utilizando procedimientos convencionales. Por ejemplo, se pueden ajustar las dosis sobre parámetros farmacocinéticos o farmacodinámicos, que pueden incluir efectos clínicos tales como efectos tóxicos y/o valores de laboratorio. Por lo tanto, la presente invención engloba la escalada de dosis intrapaciente como determine el experto. La determinación de dosificaciones y regímenes apropiados son bien conocidos en la técnica relevante y se entendería que lo englobe el experto una vez que se proporcionen las enseñanzas desveladas en el presente documento.
Para la administración a sujetos humanos, la dosis mensual total de un ADC desvelado en el presente documento está normalmente en el intervalo de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1200 mg por paciente, dependiendo, por supuesto, del modo de administración. Por ejemplo, en una dosis intravenosa mensual puede ser necesario aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 mg/paciente. La dosis mensual total se puede administrar en una dosis única o en dosis divididas y puede, a discreción del médico, estar fuera del intervalo típico que se ha dado en el presente documento.
Un intervalo ejemplar, no limitante de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un ADC como se desvela en el presente documento es de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1000 mg/paciente/mes. En ciertas realizaciones, el ADC se puede administrar de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 o de aproximadamente 1 a aproximadamente 150 mg/paciente/mes. En algunas realizaciones, el paciente es un ser humano.
Kits
La divulgación también proporciona kits (o artículos de fabricación) para su uso en el tratamiento de los trastornos descritos anteriormente. Los kits de la divulgación incluyen uno o más recipientes que comprenden un ADC purificado e instrucciones para la utilización del conjugado para el tratamiento de una enfermedad. Por ejemplo, las instrucciones comprenden una descripción de la administración del ADC para tratar una enfermedad tal como el cáncer (por ejemplo, un cáncer sólido o líquido). El kit puede comprender adicionalmente una descripción de la selección de un individuo adecuado para el tratamiento basándose en la identificación de si ese individuo tiene la enfermedad y el estadio de la enfermedad.
Las instrucciones relativas al uso del ADC incluyen generalmente información de cómo dosificar, el calendario de dosificación, y la vía de administración del tratamiento pretendido. Los recipientes pueden ser dosis unitarias, envases a granel (por ejemplo, envases multidosis) o dosis subunitarias. Las instrucciones suministradas con los kits de la divulgación son normalmente instrucciones escritas en una etiqueta o prospecto (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), pero también son aceptables las instrucciones que puede leer una máquina (por ejemplo, instrucciones que están en un disco de almacenamiento magnético u óptico).
Los kits de la presente divulgación están en un envase adecuado. El envase adecuado incluye, pero no se limita a, viales, botellas, jarras, envasado flexible (por ejemplo, Mylar sellado o bolsas de plástico), y similares. También se contemplan envases para su uso en combinación con un dispositivo específico, tal como un inhalador, dispositivo de administración nasal (por ejemplo, un atomizador) o un dispositivo de infusión tal como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El recipiente también puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un principio activo de la composición es el ADC con mayor carga como se describe en el presente documento. El recipiente puede comprender adicionalmente un segundo agente farmacéuticamente activo.
Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales tales como tampones e información de interpretación. Normalmente, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado con el recipiente.
Ejemplos
Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos en el presente documento son con fines solamente ilustrativos y que se van a incluir distintas modificaciones y cambios que sugerirán los expertos en la técnica a la luz de los mismos dentro del espíritu y ámbito de la presente solicitud.
Ejemplo 1: Citotoxicidad de los ADC anti-Trop-2 cargados cada vez más, conjugados de manera específica del sitio en células con alta expresión de la diana (BxPC3, Trop2 ++)
Este ejemplo ilustra la citotoxicidad in vitro de ADC con mayor carga (específicos del sitio y convencionales) en células BxPC3 con alta expresión de la diana.
Conjugación anticuerpo-fármaco
a. conjugación anticuerpo-fármaco mediada por transalutaminasa
Se expresaron los anticuerpos anti-Trop-2 quiméricos de ratón como subtipos IgG1 modificados con marcadores transglutaminasa ("Q") que contienen glutamina en distintas posiciones de aminoácido (por ejemplo, TG6, LCQ04, H7c, L11b, véase la Tabla 1) y se conjugaron con distintos engarces y cargas útiles (por ejemplo, aminocaproil-vc-PABC-MMAD (aminocaproil-Valina-Citrulina-p-aminobenciloxicarbonil-MMAD); amino-PEG6-C2-MMAD). En un caso, los marcadores transglutaminasa se modificaron tanto en los extremos C de la cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo, así como en la posición 297 de la IgG humana (esquema de numeración EU) (por ejemplo, el aminoácido asparagina (N) de tipo silvestre se sustituyó con glutamina en la posición 297 del anticuerpo Trop-2 (N297Q)). La combinación de marcadores modificados en la cadena ligera y la cadena pesada, o los múltiples sitios dentro de la cadena pesada o ligera de los anticuerpos, llevaban múltiples sitios de conjugación por anticuerpo (por ejemplo, DAR de 4-10). La conjugación del anticuerpo anti-Trop-2 con una carga útil (por ejemplo, MMAD) se alcanzó entonces mediante reacción de transamidación catalizada por la transglutaminasa microbiana entre el anticuerpo anti-Trop-2 que lleva un marcador que contiene glutamina en el sitio específico (por ejemplo, el extremo carboxilo y/o el extremo amino de la cadena pesada o la cadena ligera, posición 297, y/o en otro sitio del anticuerpo) y un engarce que contiene amina unido a una carga útil (por ejemplo, MMAD). En algunos casos, el aminoácido lisina de tipo silvestre en la posición 222 (esquema de numeración EU) del anticuerpo se sustituyó por el aminoácido arginina ("K222R"). Por ejemplo, se descubrió que la sustitución K222R tenía el efecto sorprendente de que daba como resultado una composición de conjugado de anticuerpo y carga útil más homogénea, y/o una disminución significativa del entrecruzamiento intercatenario con el marcador glutamina del extremo C de la cadena ligera del anticuerpo. En la reacción de transamidación, la glutamina del anticuerpo actuaba como un donante de acilos, y el compuesto que contenía amina actuaba como un receptor de acilos (donante de amina). El anticuerpo anti-Trop-2 purificado con una concentración de 33 mM se incubó con un exceso de 10-100 M de receptor de acilos que variaba entre 33-3300 mM, en presencia de un 1-3 % (p/v) de transglutaminasa de Streptoverticillium mobaraense (ACTIVA™, Ajinomoto, Japón) en 150 mM de cloruro sódico o sulfato sódico, y 25 mM de MES, HEPES [ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperacinetanosulfónico] o tampón Tris HCl con un intervalo de pH de 6,2-9,2. Las condiciones de reacción se ajustaron para los derivados de receptor de acilo individuales, y se observó una eficacia y especificidad óptimas normalmente para 33 mM de anticuerpo, 660 mM de derivado, y un 2 % (p/v) de transglutaminasa en 150 mM de NaCl, 25 mM de Tris HCl, pH 8,5. Después de la incubación a 37 °C durante 16-20 horas, se purificó el anticuerpo en una resina MabSelect SuRe™ o Butyl Sepharose™ High Performance (GE Healthcare, Piscataway, NJ) utilizando procedimientos de cromatografía convencional conocidos por los expertos en la técnica, tal como una cromatografía de afinidad y cromatografía de interacción hidrofóbica comerciales de GE Healthcare.
b. conjugación anticuerpo-fármaco convencional
Para generar un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-Trop-2 quimérico de ratón (m7E6) conjugado con PEG6-C2-MMAD mediante la unión maleimida convencional con una carga media de fármaco de 4 (por ejemplo, 4 MMAD por molécula de anticuerpo), se redujo primero el anticuerpo a 5 mg/ml con 7,5 equivalentes molares de TCEP (tris (2-carboxietil)fosfina) en un tampón que contenía 25 mM de Tris, pH 7,5, 150 mM de NaCl durante 2 h a 37 °C. Se añadió un exceso de 7,5 molar de maleimido-PEG6-C2-MMAD al anticuerpo reducido a temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C) y se incubó durante 1 hora. La mezcla de reacción se dializó contra PBS (solución salina tampón de fosfato) a 4 °C y se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,2 |jm. Para generar el m7E6 con maleimido-PEG6-C2-MMAD hasta una carga de fármaco de 8, se redujo el anticuerpo con un exceso de 10 molar de TCEP en un tampón de reacción como anteriormente con la inclusión de 50 mM de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). Se añadió un exceso de 12 molar de maleimido-PEG6-C2-MMAD al anticuerpo reducido y el material se procesó como anteriormente. Para generar el m7E6 conjugado con maleimido-PEG6MMAD hasta una carga de fármaco de 6 el anticuerpo se redujo con un exceso molar de 8 veces de TCEP en tampón como para la reducción de DAR 8, seguido por la adición de un exceso molar de 8 veces de maleimido-PEG6-C2-MMAD. Para purificar la especie de DAR 6, se diluyó la mezcla de reacción para obtener una composición de tampón de 0,75 M de sulfato amónico, 25 mM de fosfato potásico, pH 7 (Tampón A). El material se aplicó a 2 x 1 ml Buty1HP Hi Trap (GE Healthcare) conectadas en serie, se lavó con 2 VC (volumen de columna) de Tampón A, y se eluyó con un gradiente lineal de 20 VC en 25 mM de fosfato potásico, pH 7, con un 20 % de isopropanol. Las fracciones que contenían una DAR de 6 se agruparon, se dializaron contra PBS, se concentraron utilizando una unidad de filtro de ultracentrífuga Amicon de 10 kDa (Millipore Corporation).
Estudios in vitro
Los estudios de citotoxicidad in vitro de los anticuerpos anti-Trop2 quiméricos m7E6 H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, específico del sitio), m7E6 L11b amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, específico del sitio), m7E6 TG6 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,99, específico del sitio), m7E6 LCQ04/K222R amino PEG6-C2-MMAD (DAR 1,97, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,83, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,85, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,71, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,80, específico del sitio) y m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,20, convencional) se llevaron a cabo en células BxPC3 que expresaban la diana. El número de DAR en este ejemplo y los otros ejemplos como se describe en el presente documento se refiere a la relación de carga útil por molécula de anticuerpo. El engarce que se utilizó era PEG6, y la carga útil utilizada era MMAD. La línea celular BxPc3 es de un cáncer con una alta expresión de niveles de la diana (Trop-2 ++). Las células se sembraron en placas con paredes blancas y fondo transparente con 2000 células por pocillo durante 24 horas antes del tratamiento. Las células se trataron con conjugados de anticuerpo-fármaco diluidos en serie 4 veces por triplicado. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® 96 (Promega, Madison, WI) 96 horas después del tratamiento. La viabilidad celular relativa se determinó como el porcentaje del control sin tratar. Las CI50 y la concentración de ADC a las que se produce el 50 % de la destrucción celular (es decir, la citotoxicidad) se calculó con el software GraphPad Prism 5 y se expresó como la concentración (nM), la máxima destrucción celular observada a la concentración de ADC ensayado más alta se expresó como el porcentaje del control sin tratar. Los resultados del ensayo de citotoxicidad se muestran en la Figura 1 y se resumen en la Tabla 3. Tres moléculas específicas del sitio con DAR de 7,71 m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 amino- PEG6-C2-MMAD), 7,76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD) y 7,80 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b amino- PEG6-C2-MMAD) eran tan potentes como el ADC conjugado de manera convencional con una DAR de 7,20 (m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD).
Estos resultados demuestran que, aunque todos los ADC conseguían la destrucción celular casi completa independientemente de su carga de carga útil en las células BxPC3 con alta expresión de diana, los conjugados con mayor carga eran más potentes en comparación con los conjugados con menor carga.
Tabla 3
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Ejemplo 2: Citotoxicidad de los ADC anti-Trop-2 cargados cada vez más, conjugados de manera específica del sitio en células con expresión moderada de la diana (Colo205, Trop2 )
Este ejemplo ilustra la citotoxicidad in v itro de ADC con mayor carga (específicos del sitio y convencionales) en células Colo205 con expresión media de la diana.
Los estudios de citotoxicidad in vitro de los anticuerpos anti-Trop2 quiméricos m7E6 H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, específico del sitio), m7E6 L11b amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, específico del sitio), m7E6 TG6 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,99, específico del sitio), m7E6 LCQ04/K222R amino PEG6-C2-MMAD (DAR 1,97, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,83, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,85, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,71, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,80, específico del sitio) y m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,20, convencional) se llevaron a cabo en células Colo205 que expresaban la diana; la línea celular Colo205 es de un cáncer con niveles de expresión de la diana moderados (Trop-2 ). Las células se sembraron en placas con paredes blancas y fondo transparente con 2000 células por pocillo durante 24 horas antes del tratamiento. Las células se trataron con conjugados de anticuerpo-fármaco diluidos en serie 4 veces por triplicado. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® 96 (Promega, Madison, WI) 96 horas después del tratamiento. La viabilidad celular relativa se determinó como el porcentaje del control sin tratar. Las CI50 y la concentración de ADC a las que se produce el 50 % de la destrucción celular (es decir, la citotoxicidad) se calculó con el software GraphPad Prism 5 y se expresó como la concentración (nM), la máxima destrucción celular observada a la concentración de ADC ensayado más alta se expresó como el porcentaje del control sin tratar. Los resultados del ensayo de citotoxicidad se muestran en la Figura 2 y se resumen en la Tabla 4. Los ADC con una DAR de 5,85 y por encima conseguían la destrucción celular total. Las tres moléculas específicas del sitio con DAR de 7,71 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 amino- PEG6-C2-MMAD), 7,76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD) y 7,80 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b amino-PEG6-C2-MMAD) eran comparables al ADC conjugado de manera convencional con una DAR de 7,20 (m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD).
Estos resultados demuestran que el aumento de la actividad de destrucción celular y la potencia se correlacionan positivamente con la carga de carga útil de los ADC en las células Colo205 con expresión media de la diana. Solamente las moléculas con mayor carga (por ejemplo, con DAR del 5,85 o por encima) podían conseguir una destrucción celular completa.
Tabla 4
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Ejemplo 3: Citotoxicidad de los ADC anti-Trop-2 cargados cada vez más, conjugados de manera específica del sitio en células con baja expresión de la diana (CF-PAC1, Trop2 (+))
Este ejemplo ilustra la citotoxicidad in v itro de ADC con mayor carga específicos del sitio en células CF-PAC1 con baja expresión de la diana.
Los estudios de citotoxicidad in vitro de los anticuerpos anti-Trop2 quiméricos m7E6 H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, específico del sitio), m7E6 L11b amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, específico del sitio), m7E6 TG6 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,99, específico del sitio), m7E6 LCQ04/K222R amino PEG6-C2-MMAD (DAR 1,97, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,83, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,85, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,71, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,80, específico del sitio) y m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,20, convencional) se llevaron a cabo en células CF-PAC1 que expresaban la diana; la línea celular CF-PAC1 es de un cáncer con niveles bajos de expresión de la diana (Trop-2 (+)). Las células se sembraron en placas con paredes blancas y fondo transparente con 2000 células por pocillo durante 24 horas antes del tratamiento. Las células se trataron con conjugados de anticuerpo-fármaco diluidos en serie 4 veces por triplicado. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® 96 (Promega, Madison, WI) 96 horas después del tratamiento. La viabilidad celular relativa se determinó como el porcentaje del control sin tratar. Las CI50 y la concentración de ADC a las que se produce el 50 % de la destrucción celular (es decir, la citotoxicidad) se calculó con el software GraphPad Prism 5 y se expresó como la concentración (nM), la máxima destrucción celular observada a la mayor concentración de ADC ensayado se expresó como el porcentaje del control sin tratar. La Tabla 5 y la Figura 3 muestran que el aumento de la actividad de destrucción celular y la potencia se correlacionan positivamente con la carga de carga útil de los ADC sobre las células CF-PAC1 con baja expresión de la diana, por ejemplo, a mayor carga de carga útil, mayor es la actividad de destrucción celular. Las tres moléculas específicas del sitio con DAR de 7,71 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 amino- PEG6-C2-MMAD), 7,76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD) y 7,80 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b amino- PEG6-C2-MMAD) eran comparables al ADC conjugado de manera convencional con una DAR de 7,20 (m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD).
Este ejemplo también demuestra que el aumento de la actividad de destrucción celular y la potencia se correlacionan positivamente con la carga de carga útil de los ADC sobre las células tales como las células CF-PAC1 con baja expresión de la diana.
Tabla 5
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Ejemplo 4: Citotoxicidad de los ADC anti-Trop-2 cargados cada vez más, conjugados de manera específica del sitio en células sin expresión de la diana (SW620, Trop2 -)
Este ejemplo ilustra la citotoxicidad no específica in v itro de ADC con mayor carga específicos del sitio en células SW620 sin expresión de la diana.
Los estudios de citotoxicidad in vitro de los anticuerpos anti-Trop2 quiméricos m7E6 TG6 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,99, específico del sitio), m7E6 LCQ04/K222R amino PEG6-C2-MMAD (DAR 1,88, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,92, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,85, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,71, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,80, específico del sitio) y m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,20, convencional) se llevaron a cabo en células SW620 que no expresaban la diana; la línea celular SW620 es de un cáncer sin expresión de la diana (Trop-2 -). Las células se sembraron en placas con paredes blancas y fondo transparente con 2000 células por pocillo durante 24 horas antes del tratamiento. Las células se trataron con conjugados de anticuerpo-fármaco diluidos en serie 4 veces por triplicado. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® 96 (Promega, Madison, WI) 96 horas después del tratamiento. La viabilidad celular relativa se determinó como el porcentaje del control sin tratar. Las CI50 y la concentración de ADC a las que se produce el 50 % de la destrucción celular (es decir, la citotoxicidad) se calculó con el software GraphPad Prism 5 y se expresó como la concentración (nM), la máxima destrucción celular observada a la concentración de ADC ensayado más alta se expresó como el porcentaje del control sin tratar. En este ejemplo, la concentración de partida de los ADC aumentaba por encima de trece veces en comparación con los otros ejemplos in vitro desde 266 nM a 3500 nM con el fin de determinar si había un efecto citotóxico de los ADC no dependiente de la diana. Los resultados del ensayo de citotoxicidad se muestran en la Figura 4 y se resumen en la Tabla 6. Las tres moléculas específicas del sitio con DAR de 7,71 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 amino- PEG6-C2-MMAD), 7,76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD) y 7,80 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/L11b amino- PEG6-C2-MMAD) eran significativamente menos citotóxicos de manera no específica en comparación con el ADC conjugado de manera convencional con una DAR de 7,20.
Estos resultados demuestran que a una concentración de ADC más alta, no se observaba citotoxicidad dependiente de la diana, y que esta era menor en los ADC específicos del sitio con respecto a los conjugados convencionales.
Tabla 6
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Ejemplo 5: Comparación de manera conjunta de la citotoxicidad de los ADC anti-Trop-2 cargados cada vez más, conjugados de manera específica del sitio vs. conjugados de manera convencional en células con expresión moderada de la diana (Colo205, Trop2 )
Este ejemplo ilustra la citotoxicidad in vitro de ADC con mayor carga específicos del sitio en células Colo205 con baja expresión de la diana.
Los estudios de citotoxicidad in vitro de los anticuerpos anti-Trop2 quiméricos m7E6 maleimido-PEG65-C2-MMAD (DAR 4,13, convencional), m7E6 N297Q/K222R amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,86, específico del sitio), m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD (DAR 6,09, convencional), m7E6 N297Q/LCQ04/K222R amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,86, específico del sitio), m7E6 maleimido- PEG6-C2-MMAD (DAR 7,80, convencional), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,77, específico del sitio) e IgG de control N297Q/LCQ04/K222R amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,84, específico del sitio) se llevaron a cabo en células Colo205 que expresaban la diana; la línea celular Colo205 es de un cáncer con niveles de expresión de la diana moderados (Trop-2 ). Las células se sembraron en placas con paredes blancas y fondo transparente con 2000 células por pocillo durante 24 horas antes del tratamiento. Las células se trataron con conjugados de anticuerpo-fármaco diluidos en serie 4 veces por triplicado. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® 96 (Promega, Madison, WI) 96 horas después del tratamiento. La viabilidad celular relativa se determinó como el porcentaje del control sin tratar. Las CI50 y la concentración de ADC a las que se produce el 50 % de la destrucción celular (es decir, la citotoxicidad) se calculó con el software GraphPad Prism 5 y se expresó como la concentración (nM), la máxima destrucción celular observada a la mayor concentración de ADC ensayado se expresó como el porcentaje del control sin tratar. Los resultados del ensayo de citotoxicidad se muestran en la Figura 5 y se resumen en la Tabla 7. Las tres moléculas específicas del sitio con DAR de 3,86 (m7E6 N297Q/K222R amino- PEG6-C2-MMAD), 5,86 (m7E6 N297Q/LCQ04/K222R amino-PEG6-C2-MMAD) y 7,77 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino- PEG6-C2-MMAD) eran comparables al ADC conjugado de manera convencional con una DAR de 4,13 (m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD), 6,09 (m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD) y 7,80 (m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD), respectivamente.
Estos resultados demuestran que el aumento de la actividad de destrucción celular y la potencia se correlacionan positivamente con la carga de carga útil de los ADC en las células Colo205 con expresión media de la diana (por ejemplo, cuanto mayor es la carga de la molécula, mayor es la potencia).
Tabla 7
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Ejemplo 6: Un conjugado anti-Trop-2 7E6 específico del sitio con auristatina, con una relación fármacoanticuerpo de 7,76 inducía la detención tumoral a largo plazo en un modelo de xenoinjerto Colo205
Este ejemplo ilustra la eficacia de los ADC con mayor carga, específicos del sitio en el modelo de xenoinjerto Colo205.
Los estudios de eficacia in vivo de m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, específico del sitio), m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,20), convencional), m7E6 N297Q/K222R amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,92, específico del sitio) y la IgG de control N297Q/K222R amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,68, específico del sitio, se llevaron a cabo con un modelo de xenoinjerto Colo205 que expresa la diana. La línea células Colo205 es de un cáncer con niveles de expresión de la diana moderados (Trop-2 ). Se implantaron tres millones de células cancerosas Colo205 por vía subcutánea en ratones nu/nu de 5-8 semanas de edad hasta que los tamaños del tumor alcanzaban alrededor de 250 mm3. Los animales se distribuyeron aleatoriamente por tamaños tumorales, y se hizo la dosificación mediante inyección en embolada en la vena caudal. Se administraron los mAb a 6 mg/kg mediante inyección en embolada en la vena caudal un total de 1 dosis. El volumen tumoral se midió dos veces a la semana mediante un dispositivo calibrador y se calculó con la siguiente fórmula: Volumen tumoral = (longitud x anchura2) / 2. Se sometieron los animales a eutanasia si sus volúmenes tumorales alcanzaban los 2000 mm3 o si perdían más del 20 % de su peso corporal. La Figura 6 muestra que una única dosis del conjugado específico del sitio con una DAR de 7,76 daba como resultado la detención tumoral a largo plazo superando significativamente el conjugado convencional con una DAR de 7,2.
Adicionalmente, la diferencia de potencia entre los conjugados de DAR alta específicos del sitio y convencionales no se debía a la unión a la diana diferencial de los ADC, ya que todos los ADC presentaban cinéticas de unión similares. Figura 11 y Tabla 8. Las cinéticas de unión de las interacciones diana/IgG que se muestran en la Figura 11 y la Tabla 8 se determinaron utilizando el biosensor de Resonancia de Plasmones superficiales Biacore T200 (GE Lifesciences, Piscataway NJ).
Tabla 8
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En conjunto, este ejemplo demuestra que el ADC de la presente invención (por ejemplo, con una DAR de 7,76) es más eficaz en la inducción de la detención tumoral a largo plazo que el ADC convencional con una DAR similar o mayor, y que un ADC con DAR menores de 5 esencialmente no es eficaz en este modelo.
Ejemplo 7: Los conjugados anti-Trop-2 7E6 específicos del sitio con auristatina, con una relación fármacoanticuerpo de 5,86 y 7,77 son más eficaces que los conjugados convencionales correspondientes e inducían la detención tumoral a largo plazo en un modelo de xenoinjerto Colo205
Este ejemplo también ilustra la eficacia de los ADC con mayor carga, específicos del sitio en el modelo de xenoinjerto Colo205.
Los estudios de eficacia in vivo de m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD (DAR 4,13, convencional), m7E6 N297Q/K222R amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,86, específico del sitio), m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD (DAR 6,09, convencional), m7E6 N297Q/LCQ04/K222r amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,86, específico del sitio), m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,80, convencional), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,77, específico del sitio) y control IgG N297Q/LCQ04/K222R amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,84, específico del sitio) se llevaron a cabo en el modelo de xenoinjerto Colo205 que expresaba la diana; la línea celular Colo205 es de un cáncer con niveles de expresión de la diana moderados (Trop-2 ). Se implantaron tres millones de células cancerosas Colo205 por vía subcutánea en ratones nu/nu de 5-8 semanas de edad hasta que los tamaños del tumor alcanzaban alrededor de 200 mm3. Los animales se distribuyeron aleatoriamente por tamaños tumorales, y se hizo la dosificación mediante inyección en embolada en la vena caudal. Se administraron los mAb a 6 mg/kg mediante inyección en embolada en la vena caudal un total de 1 dosis. El volumen tumoral se midió dos veces a la semana mediante un dispositivo calibrador y se calculó con la siguiente fórmula: Volumen tumoral = (longitud x anchura2) / 2. Se sometieron los animales a eutanasia si sus volúmenes tumorales alcanzaban los 2000 mm3 o si perdían más del 20 % de su peso corporal. La Figura 7 muestra que una única dosis de los conjugados (m7E6 N297Q/LCQ04/K222R amino-PEG6-C2-MMAD) específico del sitio de DAR 5,86 y (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD) específico del sitio de DAR 7,77 daba como resultado la detención del crecimiento tumoral a largo plazo, superaba significativamente a los conjugados (m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD) de DAR 6,09 y (m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD) de DAR 7,80. La diferencia de potencia no se debía a la unión a la diana diferencial de los ADC, ya que todos los ADC presentaban cinéticas de unión similares, como se expone en el Ejemplo 6.
En consecuencia, este ejemplo también demuestra que los ADC de la presente invención (por ejemplo, específicos del sitio con una DAR de 5,86 y 7,77) son más eficaces en la inducción de la detención tumoral a largo plazo que los ADC convencionales con una DAR similar.
Ejemplo 8: Conjugados anti-Trop-2 7E6 específicos del sitio y auristatina con una relación fármaco anticuerpo que muestra mejor perfil farmacocinético (PK) en comparación con los ADC convencionales
Este ejemplo ilustra los perfiles PK para los ADC con mayor carga, específicos del sitio en comparación con los ADC con mayor carga, convencionales tanto en ratones como en ratas.
Los estudios farmacocinéticos de los ADC de la presente invención se llevaron a cabo tanto en ratones como en ratas y se analizaron utilizando un ELISA (Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) y se analizó la DAR por LC/MS (cromatografía líquida-Espectrometría de masas).
Ensayo PK de anticuerpo total
Cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos (NUNC) se revisitó con 100 ul de anticuerpo anti-IgG humana, específico de la Fc (Pierce, Rockford, IL) a 1 ug/ml en IxPBS (Cell Gro). Las placas se incubaron a 4-8 °C durante una noche. Todas las etapas de lavado se llevaron a cabo con una lavadora de placas Biotek ELx405 con 1xPBS/un 0,05 % de Tween. Tras lavar 3 veces, las placas se bloquearon con 200 ul de tampón de ensayo (1xPBS/un 0,5 % de BSA/un 0,05 % de Polisorbato 20) y se incubaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente con agitado suave. Las placas se lavaron 3 veces y se añadieron 100 ul de las referencias, controles y muestras diluidas 1:100 en tampón de ensayo a los correspondientes pocillos. Después de una incubación de dos horas con agitado suave a temperatura ambiente, las placas se lavaron 6 veces antes de distribuir 100 ul del anticuerpo de detección anti-IgG humana, específico del Fab, marcado con HRP de Sigma (St Louis, MO) diluido a 250 ng/ml en tampón de ensayo. Las placas se incubaron durante una hora más con agitado suave a temperatura ambiente antes de lavarlas 6 veces. Luego se añadieron 100 ul de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) (KPL, Gaithersburg, MD) a cada pocillo. Se permitió el desarrollo del color durante aproximadamente 5 minutos antes de parar la reacción con 100 ul de ácido fosfórico 1 M. Se midió la absorbancia a 450 nm con una referencia a 650 nm en un lector de placas SpectraMax 340 (Molecular Devices). Se utilizó el software SoftMax Pro 5.2 para ajustar las curvas de referencia con una regresión de 4 parámetros y calcular las concentraciones de muestra.
Ensayo PK de ADC
Cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos (NUNC) se revistió con 100 ul de anticuerpo anti-IgG humana a 2 ug/ml en 1xPBS (Cell Gro). Las placas se incubaron a 4-8 °C durante una noche. Todas las etapas de lavado se llevaron a cabo en una lavadora de placas Biotek ELx405 con 1xPBS/un 0,05 % de Tween. Tras lavar 3 veces, las placas se bloquearon con 200 ul/pocillo de tampón de ensayo (1xPBS/un 0,5 % de BSA/un 0,05 % de Polisorbato 20) y se incubaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente con agitado suave. Las placas se lavaron 3 veces y se añadieron por duplicado 100 ul de las referencias, controles y muestras diluidas 1:100 en tampón de ensayo a los correspondientes pocillos. Después de una incubación de dos horas con agitado suave a temperatura ambiente, las placas se lavaron 6 veces antes de distribuir 100 ul del anticuerpo de detección (anticuerpo monoclonal anti-MMAD biotinilado) diluido a 4 ug/ml en tampón de ensayo. Las placas se incubaron durante 1,5 horas con agitado suave a temperatura ambiente antes de lavarlas 6 veces. Se diluyó Avidina-HRP (Vector Labs, Burlingame, CA) a 0,5 ug/ml en tampón de ensayo y se distribuyeron 100 ul en cada pocillo. Las placas se incubaron durante otra hora antes de lavarlo 6 veces. Luego se añadieron 100 ul de TMB (KPL, Gaithersburg, MD) a cada pocillo. Se permitió el desarrollo del color durante aproximadamente 5 minutos antes de parar la reacción con 100 ul de ácido fosfórico 1 M. Se midió la absorbancia a 450 nm con una referencia a 650 nm en un lector de placas SpectraMax 340 (Molecular Devices, Downingtown, PA). Se utilizó el software SoftMax Pro 5.2 para ajustar las curvas de referencia con una regresión de 4 parámetros y calcular las concentraciones de muestra.
Análisis de masa intacta de ADC por LC/MS y cálculo de la DAR
Antes del análisis de LC/MS, los ADC (específicos del sitio con DAR 6 y DAR 8 y convencional con DAR 8) se desglicosilaron con PNGasa F (New England Biolabs Inc., Ipswich, MA) en condiciones no desnaturalizantes a 37 °C durante una noche. Los ADC (1 |jg) se cargaron en una columna de fase inversa empaquetada con un material polimérico (Michrom-Bruker, Fremont, CA). Se llevó a cabo el análisis LC/MS utilizando un sistema HPLC Agilent serie 1100, que comprende una bomba HPCL binaria, una desgaseador, auto muestreo de temperatura controlada, calentador de columna y detector de matriz de diodos (DAD), acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap Velos Pro (Thermo Fisher Scientific, Somerset, NJ) con fuente iónica en electropulverizador. Las fases móviles estaban comprendidas por el disolvente A (agua con un 0,1 % de ácido fórmico) y disolvente B (acetonitrilo con un 0,1 % de ácido fórmico). Se llevó a cabo la HPLC utilizando un gradiente creciente de disolvente B durante una ejecución de 30 min, que consiste en un flujo isocrático de un 3 % de disolvente B durante 10 min, seguido por un gradiente de hasta un 97 % de disolvente B durante 1 min, mantenido al 97 % de disolvente B durante 2 min y seguido finalmente por una etapa de equilibrado con un 3% de disolvente B durante 17 min. Los espectros de masas resultantes se desarrollaron utilizando el software ProMass (Thermo Fisher Scientific, Somerset, NJ). Se calculó la DAR para los ADC específicos del sitio utilizando la masa intacta del ADC; Para el ADC convencional se calculó la DAR a partir de los espectros desarrollados de la cadena pesada y ligera ya que el ADC convencional carece de enlaces disulfuro intermoleculares y las cadenas se separan en condiciones de fase inversa. El cálculo de las DAR se basaba en la intensidad relativa de la especie de DAR observada.
Estudios in vivo
En los ratones, se ensayó una dosis única (de 6 mg/kg) de todos los ADC en el modelo de xenoinjerto Colo205. En estas condiciones, el anticuerpo m7E6 conjugado a PEG6MMAD como (1) m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,85, específico del sitio); y 2) m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, específico del sitio) presentaba un perfil farmacocinético similar con respecto al anticuerpo m7E6 no conjugado de tipo silvestre. La comparación de las señales de mAb y ADC totales reveló que los ADC con mayor carga (mAb o ADC m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,85, específico del sitio); o mAb o ADC m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, específico del sitio) presentaban una pérdida de carga útil muy pequeña durante el periodo de dos semanas. Véase las Figuras 8(c) y 8(d). Los datos indican que la unión mediada por la transglutaminasa de amino-PEG6-C2-MMAD da como resultado conjugados estables. Por el contrario, el anticuerpo m7E6 conjugado con maleimido-PEG6-C2-MMAD utilizando el procedimiento convencional (m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,8) presentaba menor exposición de ADC con respecto al mAb total y el anticuerpo no conjugado, sugiriendo la pérdida de carga útil. Véase la Figura 8(b). La pérdida de carga útil por los conjugados basados en maleimida se había descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Alley y col., Bioconj. Chem. 19(3):759-765 (2008); y Shen y col., Nat. Biotechnol. 30(2):184-189 (2012)) y se cree que se produce mediante el mecanismo de adición de retro-MIchael. La diferencia en exposición del ADC entre los conjugados convencionales con una DAR de 8 y los conjugados ADC de la presente invención es probablemente la responsable de la actividad inferior de los conjugados a Dc convencionales in vivo.
La disminución en la exposición que se ve en los ensayos ELISA para los ADC convencionales pueden potenciarse mediante la posibilidad de que el ensayo de ADC utilizado en estos experimentos infraestimaba la pérdida de carga útil de un anticuerpo. Más específicamente el ELISA de ADC presentaba una señal no solo para la DAR de 8, sino también todas las especies con una carga menor que se generaban in vivo. Este efecto era más pronunciado para las especies con mayor carga, como para el ADC con DAR 8 utilizando el procedimiento de conjugación convencional, se podían perder hasta siete fármacos sin cambios significativos en la señal del ELISA. Adicionalmente, para los conjugados no escindibles convencionales tales como m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD (DAR 8), la pérdida de fármaco era probablemente la razón principal para la baja potencia in vivo. Por el contrario, los conjugados ADC no escindibles de la presente invención (por ejemplo, de DAR 6 o DAR 8) no sufre la inestabilidad de la maleimida, y son capaces de inhibir significativamente el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto Colo205 de expresión de diana moderada.
Los estudios PK de los ADC con mayor carga también se llevaron a cabo en ratas para compararlos con los ratones. Los ADC basados en el procedimiento de conjugación convencional (m7E6 maleimido- PEG6-C2-MMAD (DAR 7,8)) seguía teniendo los niveles más bajos de a Dc en la circulación. Véase la Figura 8(e). Los ADC de la presente invención con DAR 8 (por ejemplo, N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,76, específico del sitio)) presentaba niveles intermedios de ADC en la circulación, y los ADC de la presente invención con DAR 6 (por ejemplo, m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 PEG6MMAD (DAR 5,85, específico del sitio)) presentaba los niveles más altos de ADC que eran comparables con el anticuerpo m7E6 no conjugado. Véase la Figura 8(e). Los ADC convencionales con una DAR de 7,8 presentaban las diferencias mayores respecto al anticuerpo no conjugado donde tanto el anticuerpo total, así como el ADC tenía exposiciones muy reducidas en comparación con los niveles del anticuerpo no conjugado. Véase la Figura 8(f). En el caso del m7E6 n 297Q/K222R/LCQ04 PEG6MMAD (DAR 5,85, específico del sitio), los niveles de mAb total y niveles de ADC eran casi equivalentes respecto a los niveles de anticuerpo no conjugado. Véase la Figura 8(g). Los niveles del mAb total, así como de ADC para el m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c PEG6MMAD se redujeron con respecto al anticuerpo no conjugado Figura 8 (h). Al contrario que en los resultados de los ratones, en los que el ADC de DAR 8 de la presente invención presentaba una PK como el anticuerpo no conjugado. Estos resultados sugieren que combinando los sitios de conjugación que presenta individualmente una PK de tipo silvestre puede dar como resultado una disminución de la exposición.
El análisis de espectrometría de masas de las muestras de ratón in vivo revelaba adicionalmente que el ADC convencional (por ejemplo, m7E6 maleimido- PEG6-C2-MMAD) tiene aproximadamente un 28 % de pérdida de enlazador-carga útil, mientras que el engarce de transglutaminasa se mantiene intacto tanto en los conjugados específicos del sitio con una DAR 6 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 PEG6MMAD) una DAR 8_1 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD). Véase la Figura 12(a). El estudio de espectrometría de masas también reveló una degradación del extremo C en el fármaco MMAD que tienen niveles similares en los conjugados con una DAR 6 específico del sitio, SS DAR 8_1 y DAR 8 convencional (Figura 12(b)). La estabilidad de engarce-carga útil combinada de los conjugados se muestra en la Figura 12(c).
En conjunto, este ejemplo demuestra que los ADC con mayor carga de la presente invención tienen perfiles PK similares al anticuerpo de tipo silvestre no conjugado en los ratones, y mejores perfiles PK que los ADC convencionales con mayor carga en ratas.
Ejemplo 9: La combinación de los sitios de conjugación de ADC que presentan individualmente perfiles farmacocinéticos de tipo silvestre puede dar como resultado la dism inución de la exposición en ratas
Este ejemplo ilustra los perfiles PK para los ADC específicos del sitio con mayor carga con diferentes combinaciones de los sitios de conjugación en las ratas.
Los estudios PK de los ADC con mayor carga que tienen combinaciones diferentes de los sitios de conjugación también se llevaron a cabo en ratas. Los ADC específicos del sitio con una DAR de 7,76 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c Amino-PEG6-C2-MMAD) se creó combinando el ADC específico del sitio con DAR 1,99 (m7E6 H7c Amino-PEG6-C2-MMAD) con el ADC específico del sitio con una DAR de 5,85 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 Amino-PEG6-C2-MMAD). Los ADC específicos del sitio con una DAR de 5,85 y 1,99 presentaban perfiles PK de tipo silvestre en ratas individualmente, por presentaban una reducción de la exposición cuando se combinaban juntos como un ADC específico del sitio con una DAR de 7,76. Véase la Figura 9(a). En comparación con el mismo ADC especifico del sitio con una DAR de 5,85 (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 Amino-PEG6-C2-MMAD) se combinó con un ADC específico del sitio diferente con una DAR de 1,96 (m7E6 TG6 Amino-PEG6-C2-MMAD; el sitio de conjugación del extremo C de la cadena pesada del anticuerpo, que está alejado de los sitios de conjugación de m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 Amino-PEG6-C2-MMAD), el ADC resultante (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 Amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,7, específico del sitio)) no presentaba una disminución adicional en la exposición (por ejemplo, una disminución no mayor que m7E6 TG6 Amino-PEG6-C2-MMAD). Véase la Figura 9(b).
Los datos sugieren que demasiadas cargas útiles hidrofóbicas (por ejemplo, MMAD) en estrecha proximidad puede disminuir el perfil PK de los ADC en las ratas. Los datos también sugieren que para los sitios de conjugación que están distantes unos de otros, el perfil PK de los sitios combinados es similar al perfil PK individual más corto en las ratas.
Ejemplo 10: Seguridad y tolerancia de los conjugados anti-Trop-27E6 conjugado específicamente del sitio y auristatina en comparación con los ADC convencionales en el ratón
Este ejemplo ilustra la seguridad y tolerancia de los ADC con mayor carga, específicos del sitio en los ratones C57B1/6.
Se administró a los ratones C57B1/6 una única dosis de 75, 125 o 200 mg/kg de ADC conjugado convencionalmente (m7E6 maleimido-PEG6-C2-MMAD "DAR 8") o ADC específicos del sitio conjugados con una carga útil no escindible PEG6-C2-MMAD (m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD ("DAR 6") y m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/TG6 amino-PEG6-C2-MMAD ("DAR 8_1"). Se evaluaron las observaciones clínicas, peso corporal, farmacocinética, y parámetros de patología clínica. Más específicamente, se observaron los animales inmediatamente y 2 horas después de la inyección, luego diariamente durante dos semanas después de la dosis. Se registraron los pesos corporales los días 0, 2, 5, 7, 9, 12, y 14. Se tomaron muestras de sangre para la farmacocinética a los 5 minutos, 7 días, y 14 días después de la dosis y para los análisis de bioquímica clínica y hematología el día 14.
Tanto los conjugados convencionales y específicos del sitio se toleraban hasta una dosis muy alta de 200 mg/kg. No había observaciones clínicas de cambios significativos en los pesos corporales que indicaran toxicidad. Figura 10(b). Los parámetros de patología clínica se evaluaron al final del estudio (día 14) para los tres conjugados (ADC convencional "DAR 8", y dos ADC específicos del sitio "DAR 8_1, y DAR 6"), y no se observaron cambios significativos o con significado toxicológico. Véase las Figuras 10(c) y 10(d). Por ejemplo, no había cambios significativos en las enzimas hepáticas aspartato aminotransferasa [AST], alanina transaminasas [ALT] y fosfatasa alcalina [ALP] y los parámetros hematológicos clave (neutrófilos, reticulocitos, y plaquetas).
Colectivamente, los resultados indican que tanto los conjugados específicos del sitio como convencionales a altas dosis de 200 mg/kg con DAR de 8 y PEG6-C2-MMAD eran bien tolerados por los ratones. Adicionalmente, con respecto al conjugado convencional de DAR 8, el conjugado específico del sitio DAR 8_1 conseguía aproximadamente una exposición un 55% mayor. Figura 10(a). Adicionalmente, el conjugado convencional con DAR 8 también presentaba concentraciones de anticuerpo menores de lo esperado a altas dosis. Figura 13(a). Este fenómeno no se observaba en el ADC específico del sitio DAR 8_1, que presentaba el aumento esperado en la exposición incluso a la dosis ensayada más alta de 200 mg/kg. Figura 13(b).
En conjunto, los conjugados específicos del sitio presentaban un buen perfil de seguridad con una mayor exposición del ADC en comparación con los conjugados convencionales.
Ejemplo 11: Citotoxicidad de los ADC anti-Trop-2 cargados cada vez más, conjugados de manera específica del sitio en células con alta expresión de la diana (BxPC3, Trop2 ++)
Este ejemplo ilustra la citotoxicidad in vitro de ADC con mayor carga (por ejemplo, con DAR de 5,95-9,4 (conjugación específica del sitio)) en células BxPC3 con alta expresión de la diana.
Los estudios de citotoxicidad in vitro de anticuerpos anti-Trop2 quiméricos m7E6 L11b amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222r amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,9, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,95, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,6, específico del sitio), y N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 9,4, específico del sitio) se llevaron a cabo con células BxPC3 que expresaban la diana. La línea celular BxPc3 es de un cáncer con una alta expresión de niveles de la diana (Trop-2 ++). Las células se sembraron en placas con paredes blancas y fondo transparente con 2000 células por pocillo durante 24 horas antes del tratamiento. Las células se trataron con conjugados de anticuerpo-fármaco diluidos en serie 4 veces por triplicado. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® 96 (Promega, Madison, WI) 96 horas después del tratamiento. La viabilidad celular relativa se determinó como el porcentaje del control sin tratar. Las CI50 y la concentración de ADC a las que se produce el 50 % de la destrucción celular (es decir, la citotoxicidad) se calculó con el software GraphPad Prism 5 y se expresó como la concentración (nM), la máxima destrucción celular observada a la concentración de ADC ensayado más alta se expresó como el porcentaje del control sin tratar. Los resultados del ensayo de citotoxicidad se muestran en la Figura 14 y se resumen en la Tabla 9. Estos resultados demuestran que, aunque todos los ADC conseguían la destrucción celular casi completa independientemente de su carga de carga útil en las células BxPC3 con alta expresión de diana, los conjugados con mayor carga eran más potentes en comparación con los conjugados con menor carga.
Tabla 9
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Ejemplo 12: Citotoxicidad de los ADC anti-Trop-2 cargados cada vez más, conjugados de manera específica del sitio en células con expresión moderada de la diana (Colo205, Trop2 )
Este ejemplo ilustra la citotoxicidad in vitro de ADC con mayor carga (por ejemplo, con DAR de 5,95-9,4 (conjugación específica del sitio)) en células Colo205 con expresión media de la diana.
Los estudios de citotoxicidad in vitro de anticuerpos anti-Trop2 quiméricos m7E6 L11b amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222r amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,9, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,95, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,6, específico del sitio), y N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 9,4, específico del sitio) se llevaron a cabo con células Colo205 que expresaban la diana; la línea celular Colo205 es de un cáncer con niveles moderados de expresión de la diana (Trop-2 ). Las células se sembraron en placas con paredes blancas y fondo transparente con 2000 células por pocillo durante 24 horas antes del tratamiento. Las células se trataron con conjugados de anticuerpo-fármaco diluidos en serie 4 veces por triplicado. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® 96 (Promega, Madison, WI) 96 horas después del tratamiento. La viabilidad celular relativa se determinó como el porcentaje del control sin tratar. Las CI50 y la concentración de ADC a las que se produce el 50 % de la destrucción celular (es decir, la citotoxicidad) se calculó con el software GraphPad Prism 5 y se expresó como la concentración (nM), la máxima destrucción celular observada a la concentración de ADC ensayado más alta se expresó como el porcentaje del control sin tratar. Los resultados del ensayo de citotoxicidad se muestran en la Figura 15 y se resumen en la Tabla 10. Estos resultados demuestran que el aumento de la actividad de destrucción celular y la potencia se correlacionan positivamente con la carga de carga útil de los ADC en las células Colo205 con expresión media de la diana. Solamente las moléculas con mayor carga (por ejemplo, con DAR del 5,95 o por encima) podían conseguir una destrucción celular completa.
Este ejemplo también demuestra que el aumento de DAR a 9,4 con el conjugado N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c amino-PEG6-C2-MMAD daba como resultado un aumento de potencia por encima del conjugado m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD con una DAR of 7,6.
Tabla 10
Figure imgf000045_0002
continuación
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Ejemplo 13: Citotoxicidad de los ADC anti-Trop-2 cargados cada vez más, conjugados de manera específica del sitio en células con baja expresión de la diana (CF-PAC1, Trop2 (+))
Este ejemplo ilustra la citotoxicidad in vitro de ADC con mayor carga (por ejemplo, con DAR de 5,95-9,4 (conjugación específica del sitio)) en células CF-PAC1 con baja expresión de la diana.
Los estudios de citotoxicidad in vitro de anticuerpos anti-Trop2 quiméricos m7E6 L11b amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222r amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,9, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,95, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,6, específico del sitio), y N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 9,4, específico del sitio) se llevaron a cabo con células CF-PAC1 que expresaban la diana; la línea celular CF-PAC1 es de un cáncer con bajos niveles de expresión de la diana (Trop-2 (+)). Las células se sembraron en placas con paredes blancas y fondo transparente con 2000 células por pocillo durante 24 horas antes del tratamiento. Las células se trataron con conjugados de anticuerpo-fármaco diluidos en serie 4 veces por triplicado. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® 96 (Promega, Madison, WI) 96 horas después del tratamiento. La viabilidad celular relativa se determinó como el porcentaje del control sin tratar. Las CI50 y la concentración de ADC a las que se produce el 50 % de la destrucción celular (es decir, la citotoxicidad) se calculó con el software GraphPad Prism 5 y se expresó como la concentración (nM), la máxima destrucción celular observada a la mayor concentración de ADC ensayado se expresó como el porcentaje del control sin tratar. La Tabla 11 y la Figura 16 muestran que el aumento de la actividad de destrucción celular y la potencia se correlacionan positivamente con la carga de carga útil de los ADC sobre las células CF-PAC1 con baja expresión de la diana, por ejemplo, a mayor carga de carga útil, mayor es la actividad de destrucción celular. El conjugado N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c amino-PEG6-C2-MMAD con una DAR de 9,4 aumenta ligeramente la máxima actividad de destrucción celular.
Este ejemplo también demuestra que el aumento de la actividad de destrucción celular y la potencia se correlacionan positivamente con la carga de carga útil de los ADC sobre las células tales como las células CF-PAC1 con baja expresión de la diana.
Tabla 11
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Ejemplo 14: Citotoxicidad de los ADC anti-Trop-2 cargados cada vez más, conjugados de manera específica del sitio en células sin expresión de la diana (SW620, Trop2 -)
Este ejemplo ilustra la citotoxicidad in v itro de ADC con mayor carga (por ejemplo, con DAR de 5,95 a 9,40 (conjugación específica del sitio)) en células SW620 sin expresión de la diana.
Los estudios de citotoxicidad in vitro de anticuerpos anti-Trop2 quiméricos m7E6 L11b amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 1,96, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222r amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 3,9, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04 amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 5,95, específico del sitio), m7E6 N297Q/K222R/LCQ04/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 7,6, específico del sitio), y N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c amino-PEG6-C2-MMAD (DAR 9,4, específico del sitio) se llevaron a cabo con células SW620 que no expresaban la diana; la línea celular SW620 es de un cáncer sin expresión de la diana (Trop-2 -). Las células se sembraron en placas con paredes blancas y fondo transparente con 2000 células por pocillo durante 24 horas antes del tratamiento. Las células se trataron con conjugados de anticuerpo-fármaco diluidos en serie 4 veces por triplicado. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® 96 (Promega, Madison, WI) 96 horas después del tratamiento. La viabilidad celular relativa se determinó como el porcentaje del control sin tratar. Las CI50 y la concentración de ADC a las que se produce el 50 % de la destrucción celular (es decir, la citotoxicidad) se calculó con el software GraphPad Prism 5 y se expresó como la concentración (nM), la máxima destrucción celular observada a la concentración de ADC ensayado más alta se expresó como el porcentaje del control sin tratar. Los resultados del ensayo de citotoxicidad se muestran en la Figura 17 y se resumen en la Tabla 12. En el intervalo de concentración ensayado, todos los conjugados presentaban una actividad citotóxica no específica mínima.
Este ejemplo demuestra que el aumento de la DAR a 9,4 con el conjugado N297Q/K222R/LCQ04/L11b/H7c amino-PEG6-C2-MMAD no daba como resultado un aumento de la actividad citotóxica inespecífica en comparación con los conjugados con una DAR menor.
Tabla 12
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Ejemplo 15: Citotoxicidad de los ADC anti-BCMA cargados cada vez más, conjugados de manera específica del sitio en células con alta expresión de la diana BCMA
Este ejemplo ilustra la citotoxicidad in vitro de ADC con mayor carga (por ejemplo, con DAR de 5,95 (conjugación específica del sitio)) en células L363 y MM1.S con baja y media expresión de la diana, respectivamente.
Los estudios de citotoxicidad in vitro del anticuerpo humano anti-BCMA (antígeno de maduración de linfocitos B) (Ab1) conjugado con un engarce-carga útil, incluyendo el Ab1-LCQ05/K222R-empalmoestatina ((2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-hidrazinil-2-oxoetil)-4-hidroxi-1,6-dioxaspiro[2,5]oct-5-il]-3-metilpenta-2,4-dien-1-il}-2,5-dimetiltetrahidro-2H-piran-3-il]amino}-5-oxopent-3-en-2-il acetato) (DAR 1,9, específico del sitio), Ab1-LCQ04/K222R-empalmoestatina (DAR 1,9, específico del sitio), Ab1-N297Q/K222R-empalmoestatina (DAR 3,7, específico del sitio), y Ab1-N297Q/K222R/LCQ05-empalmoestatina (DAR 5,95, específico del sitio) se llevaron a cabo con L363 que expresa la diana (una línea celular de un cáncer con bajos niveles de expresión de diana (BCMA (+)) y MM1.S (una línea celular de un cáncer con niveles de medios de expresión de la diana (BCMA (++)). Las células se sembraron en placas con fondo transparente a 3000 células/pocillo. Las células se trataron con conjugados de anticuerpo-fármaco diluidos en serie 4 veces por triplicado. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® 96 (Promega, Madison, WI) 96 horas después del tratamiento. La viabilidad celular relativa se determinó como el porcentaje del control sin tratar. Se calculó la CE50 con el software Prism. Las Figuras 18A y 18B muestran que el aumento de actividad de destrucción celular y la potencia se correlaciona positivamente con la carga baja de carga útil (por ejemplo, 1,9 y 3,7) en comparación con la alta (por ejemplo, 5,9) de los ADC.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de anticuerpo-fármaco específico del sitio mediado por transglutaminasa que comprende la fórmula: anticuerpo-(T-(X-Y-Za)b)c, en la que:
T es 1) un marcador que contiene glutamina modificada en un sitio específico, 2) una glutamina endógena, y/o 3) una glutamina endógena que se ha hecho reactiva mediante modificación del anticuerpo o una transglutaminasa modificada;
X es una unidad donante de amina; Y es un engarce; y Z es un resto agente;
X-Y-Z es un agente donante de amina conjugado de manera específica del sitio con una glutamina de T mediante gamma-carboxamida;
a es un número entero de 1 a 6;
b es un número entero de 1 a 6;
c es un número entero del 1 al 20; y
en el que el producto (relación fármaco-anticuerpo) de a, b, y c es al menos 5, que comprende
a) sustituciones de aminoácidos en las posiciones N297Q, y K222R, en el que el agente donante de amina está conjugado de manera específica del sitio con la glutamina endógena en la posición 295 y la glutamina sustituida en la posición 297; y
b ) uno o más marcadores que contienen glutamina, en el que el agente donante de amina está conjugado de manera específica del sitio con los marcadores que contienen glutamina en un extremo carboxilo de una cadena ligera del anticuerpo,
en el que la relación fármaco-anticuerpo es de 5-7.
2. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico, un minicuerpo, un diacuerpo, o un fragmento de anticuerpo.
3. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el marcador que contiene glutamina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en Q, LQG, LLQGG (SEQ ID NO: 1), LLQG (SEQ ID NO: 2), LSLSQG (SEQ ID NO: 3), GGGLLQGG (SEQ ID NO: 4), GLLQG (SEQ ID NO: 5), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID NO: 6), GLLQGGG (SEQ ID NO: 7), GLLQGG (SEQ ID NO: 8), GLLQ (SEQ ID NO: 9), LLQLLQGA (SEQ ID NO: 10), LLQGA (SEQ ID NO: 11), LLQYQGA (SEQ ID NO: 12), LLQGSG (SEQ ID NO: 13), LLQYQG (SEQ ID NO: 14), LLQLLQG (SEQ ID NO: 15), SLLQG (SEQ ID NO: 16), LLQLQ (SEQ ID NO: 17), LLQLLQ (SEQ ID NO: 18), LLQGR (SEQ ID NO: 19), LLQGPP (SEQ ID NO: 20), LLQGPA (SEQ ID NO: 21), GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22), GGLLQGA (SEQ ID NO: 23), LLQGPGK (SEQ ID NO: 25), LLQGPG (SEQ ID NO: 26), LLQGP (SEQ ID NO: 27), LLQP (SEQ ID NO: 28), LLQPGK (SEQ ID NO: 29), LLQAPGK (SEQ ID NO: 30), LLQGAPG (SEQ ID NO: 31), LLQGAP (SEQ ID NO: 32), y LLQLQG (SEQ ID NO: 36).
4. El conjugado de la reivindicación 3, en el que el marcador que contiene glutamina es LLQGA (SEQ ID NO: 11), LQG, GGLLQGA (SEQ ID NO: 23), LLQGPA (SEQ ID NO: 21), LLQGPP (SEQ ID NO: 20), GGLLQGPP (SEQ ID NO: 22), LLQGSG (SEQ ID NO: 13), LLQG (SEQ ID NO: 2), LLQYQG (SEQ ID NO: 14), LLQLLQG (SEQ ID NO: 15), LLQLQG (SEQ ID NO: 36), LLQLLQ (SEQ ID NO: 18), LLQLQ (SEQ ID NO: 17), LLQGR (SEQ ID NO: 19), LLQYQGA (SEQ ID NO: 12), SLLQG (SEQ ID NO: 16), o LLQLLQGA (SEQ ID NO: 10).
5. El conjugado de la reivindicación 1, en el que la unidad donante de amina-engarce (X-Y) es lineal o ramificada.
6. El conjugado de la reivindicación 5, en el que la unidad donante de amina-engarce (X-Y) se selecciona de entre el grupo que consiste en Ac-Lys-Gly (acetilo-lisina-glicina), ácido aminocaproico, Ac-Lys-p-Ala (acetilo-lisina-p-alanina), amino-PEG2 (polietilenglicol)-c2, amino-PEG3-C2, amino-PEG6-C2, Ac-Lys-Val-Cit-PABC (acetilo-lisina-valinacitrulina-p-aminobenciloxicarbonilo), amino-PEG6-C2-Val-Cit-PABC, aminocaproil-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC, [(3S,5S)-1-{3-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]propanoil} piperidina-3,5-diil] bis-Val-Cit-PABC, putrescina, y Ac-Lys-putrescina.
7. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el resto agente es un agente citotóxico.
8. El conjugado de la reivindicación 7, en el que el agente citotóxico se selecciona de entre el grupo que consiste en una antraciclina, una auristatina, una camptotecina, una combretastatina, una dolastatina, una duocarmicina, una enedina, una geldanamicina, un dímero indolino-benzodiacepina, una maytansina, una puromicina, un dímero pirrolobenzodiacepina, un taxano, un alcaloide de la vinca, una tubulisina, una hemiasterlina, una empalmoestatina, un pladienólido, y los esteroisómeros, isósteros, análogos o derivados de los mismos.
9. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el agente donante de amina se selecciona de entre el grupo que consiste en Alexa 488 cadaverina, 5-FITC cadaverina, Alexa 647 cadaverina, Alexa 350 cadaverina, 5-TAMRA cadaverina, 5-FAM cadaverina, SR101 cadaverina, 5,6-TAMRA cadaverina, 5-FAM lisina, Ac-Lis-Gly-MMAD, amino-PEG3-C2-MMAD, amino-PEG6-C2-MMAD, amino-PEG3-C2-amino-nonanoil-MMAD, aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAD, amino-PEG3-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, amino-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-MMAD, Ac-Lis-Val-Cit PABC-MMAD, aminocaproil-MMAD, Ac-Lis-p-Ala-MMAD, amino-PEG2-C2-MMAE, aminocaproil-MMAE, amino-PEG3-C2-MMAE, aminocaproil-MMAF, aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAE, amino-PEG-6-C2-Val-Cit-PABC-MMAE, Ac-Lis-Val-Cit-PABC-MMAE, aminocaproil-Val-Cit-PABC-MMAF, amino-PEG-6-C2-Val-Cit-PABC-MMAF, Ac-Lis-Val-Cit-PABC-MMAF, amino-PEG6-C2-Val-Cit-PABC-0101, Ac-Lis-Val-Cit-PABC-0101, putrescinil-geldanamicina, Ac-Lisputrescinil-geldanamicina, aminocaproil-3377, amino-PEG6-C2-3377, aminocaproil-0131, amino-PEG6-C2-0131, aminocaproil-0121, amino-PEG6-C2-0121, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]propanoil}pipendina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC-MMAD, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-aminoetoxi)etoxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC-MMAE, 2-aminoetoxi-PEG6-NODAGA, y N-2-acetil-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-hidroxi-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-hidroxipent-2-enoil]amino}-3,6-dimetiltetrahidro-2H-piran-2-il]-3-metilpenta-1,3-dien-1-il}-1,6-dioxaspiro[2,5]oct-5-il]acetil}hidrazinil)carbonil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida.
10. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
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