WO2010002042A1

WO2010002042A1 - タンパク質ラベル化用酵素基質

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Publication number: WO2010002042A1
Application number: PCT/JP2009/062569
Authority: WO
Inventors: 神谷典穂; 後藤雅宏; 安倍弘喜
Original assignee: 国立大学法人九州大学
Priority date: 2008-07-04
Filing date: 2009-07-03
Publication date: 2010-01-07
Also published as: JPWO2010002042A1; US20110184147A1

Abstract

　本発明は、(蛍光基)－(リンカー)－(トランスグルタミナーゼ(TGase)が認識可能なGln残基を含む部分)－Rで表される、トランスグルタミナーゼ(TGase)の基質を提供する。(式中：蛍光基が、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、テキサスレッド(TR)若しくはダンシル(Dns)又はそれから誘導される基であり、リンカーが、-NH-(CH₂)_n-CO-(nは1～6の整数)で表される基であり、TGaseが認識可能なGln残基を含む部分が、QG等から選択されるペプチドから誘導される基であり、かつRが、水酸基、又はビオチン、核酸、アジド、アルキン、マレイミド若しくはシクロペンタジエン又はそれから誘導される基である。)。

Description

明のタクベ

術分野

本、トラスグタナゼを用て、タンク能性分子を連結す方法、特に、抗体質を連結する方法に関する。はまた、トラスグタナゼの新にも関する。、タクや抗体の化のために用ることができ、また部位を介したアイ成に用ることができる。サプ中の特ホ、、タンク、プなどを検出、定量化するイオは近年、臨床をはじめ、組織、分子生物学、免疫学などの野で欠ことのできな分析である。なでも、目的の子の識に抗原応を利用したは、高感度で特異性の方法して、バイオの心的な位置を占めてる。さらに医療野におての用も盛んであり、イオイメジグドラッグリリステム S おけるタゲテイグ子として、また、医薬品としてのも精力的に検討されてる。

他の物質との異性点におて、抗体は酵素にも特性を示し、抗原とのトは無限とえるほどに大き。しかしながら、抗体はタンであることら、制約を受けることになる。体能性分子を導入しよとした際、活性入されるとが失われてしまれがあるとた問題点が挙げられる。

そこで必要となるのが、抗体のを失させることな、その

択的に識を修飾する術の発である。在、般的に行われてる体の化学修飾である。しし、化学修飾では、抗原を失してしまれがある。また、入数、位の御が困難などとた問題点がある。このよ背景より、新規の発が必要とされてる。

方、トランスグタナゼT sg am面ase TGaseは、ア応をするトラスフラゼの種であ、特定のG Qのアド、ア、ペプタクに存在する特定の ys 結合さる酵素である。また、 1 アも ys 在しな場合には、水分子が容体として働き、 G が加水分解によアドされG Eとなる。これらの全ての離が生じるため衡が大き右に傾た可逆応となる 1)

TGase 然界に広在してお、特にット来のもの GTG 来のものFT 、ヒト子のであるFacoX 1に関しては、詳し研究がなされてきた。そして、 1989年に微生物来のTGase TG)が発見された。乳類来 TGaseは大量生産することが困難であたため、ストの面で問題を抱えてたが、 TG 生物来であるため、大量による大量生産が可能であ、ストで入手能となた。また TG 38０００であ、乳類来のもの 8００００比較して。さらに、乳類来のものは活性現にC 。を必要とするのに対し、 TGは活性現にC辞を必要としな。また応であ G の水分解性が乳類来のものに比て低。このよに TG 、産業利用に当たて有利な特性を有してお、近年 TGに関する研究が活発に行われてる。

TG Cys64であ、その辺に存在するAsp255 s274の用が加わ、性を発現すると考えられてる。 TGの構では、まずCys64のトイオが、アシであるG のを求撃し、ステ間体の成もにアアが離される。て、 ys のよな容体が活性に近接し、活性間体を求撃することで生成離し、反応が終結する 2

TGaseの識に関する研究がされてる。

G 側の基識して、㎞doらはTGaseのとして知られてるZ Gの G 辺のアノ酸を変化て、反応性の価を行てる。その果、 TGase の応におて、 C 端のステ、 G のC 端及び端のGy G の入におて活性の下が見られたこと、またGyの去、 G のAs の、 Z 基の除去におてほ、TGaseに認識されなたことを報告してる 3 また、 Os ka 、 G の辺のアノを変化さた7 基らなる

を合成し、 TGaseのアクセプタであるシ反応さることで、 G 辺の異性にて、検討を行て。その果、 TGaseはG 高、性の環境を好み、 C 立体障害のさなアノ酸を好むことを示してる 4

方で、 gG 、イ、ペプ、トプなどのプロテ用て限定解を行、ヒジ付近で切断されることが知られてるが、Pede se 、 TGaseがCysプテであるイ活性心のた構造を取て、プテ水分解の応に類似の構を示すことを報告してる

5)。また ovaらは、 TGaseはプテら化したのではな推測してる TGaseがプテ類似の、識をすることは、プテによるタク質の限位と TGase 位の性らも支持されてる

そして、現在まで、架橋反応をする TGaseによるタンク質の能性分子の入に関する研究がか告されてる。

To agaらは化学的手法により TGのとして知られてる

c bobe yoxyg am y gyc e ZQGのC アノ D Aを導入したものと、遺伝子工学的法によ ys を導入したものを、 TGによてさせるこによて、タンク A イリッド功してお

D Ad eced mmob za o DD 用してる 8

S らはタク G PEGを結合したン導体を TGによて橋さることに成功してる 9

伝子工学的手法によ G を導入したタンク質を細胞面に発さ、そこ 1 アンプブを T よて入するこに成功してお、細胞でのタク質の挙析やイメジグ用してる

1０

さらに d TGaseを用て、グタ又はリンを介して gGを修飾ることを検討してる o

1 2００8 54658

RCasado C・ Bega BochemJ 368 377396 2００2 T as wag Yo oyama shkawa O o DE ma asES z J o Che 277 442524426０ 2００2

3 A do Adac eda A as a o aka R c o Ta a a ook Agrc Bo C em 53 6132617 1989

4 TO ska Ota o ook Bosc Boech o Boche 64 26０82613 2０００

5 CPede se V・CYee P・DBshop eTo g D・CTe e

R・ES e a p Proe Sc 3 113111 5 1994

6 akaova Aav d E・V oo Poe Sc 8 17141719 1999

7 AFo a a Spoao e A eo F・ Ve o ese Adv D g e v Rev6０ 328 2００8

8 JTo aga Y e o YTa aka T a yama a ya Goo C e Co 4０14０3 2００7

9 Sao E ayash Ya ada Yaaga YTakahaa Boco gae C e 2 7０171０ 2００1

1０ C A・YT g JA Che oc 128 5424543 2００6

Thomas d e a Boco gaeChe 9 7 278 2００8 明の

らは、 TGの飾の用を試みた。としては、安定性が高、分解が良光を選択し、 TGのカを挟み GGyを結合きせたものを用て検討した。その果、タグ択的な組タンク質の蛍に加え、タグの入などの伝子工学的な組み換えを必要とせず、抗体そのもの TG こよを導入できる用性の新規を開発し、明を成すに至た。、以下を提供する

1 リカトラスグタナゼTGase)が認識能なG を含む尺

で表される、 TGaseの。、オセイネト FTC)、テキサスッドTR しは D s又はそれら導される基であ、

ンカが、 C ) C は～6ので表される基であ、

TGaseが認識能なG を含む分が、 QXXはン ys 外のアノであり、 Rが、水酸基、又はオチ、核酸、ポチグ、アジ、アキ、イしはクタジ又はそれら導される基である。 2TGaseが認識能なG を含む分が、 Gであ、酸基オチしはアキら導される墓である、 1に記載のTGaseの

3 下からなるより選択される一である、 2に記載のTGaseの。

2

4TGaseによ、 TGaseが認識能な ys を有するタンク、 1～3のずれ 1項に記載されたTGaseのとを連結することによ得られる、蛍光タク。

5タン、 gG 体である、 4に記載のタク。

6 されたタンク質製法であて

TGaseを用て、 TGaseが認識能な ys 有するタク、 1～3のずれ 1に記載されたTGase とを連結してされたタク質を得工程を含む、製造。

7)タク質が、 gG 体である、 6に記載の。

8TGaseを用て、 TG eが認識能な ys を有する機能性タンク、蛍光カを介してTGaseが認識能なG を含む分を結合さたものとを連結して、機能が維持されたままの、蛍光機能性タク質を得る工程を含む、タンク質の蛍。

g)TGaseを用て、 TGaseが認識能な ys 有するタク、

) ンカ ) TGaseが認識能なG を含む能性で表される、 TGaseのとを連結する工程を含む、タク質の標。、フオセインネト FTC、テキサスッド(TR しほン D s又はそれら導される基であ、

リカが、 C C は～6ので表される基であり、

TGaeが認識能なG を含む分が、 XXは ys 外のアノある。

1０TGaseが認識能なG を含む分が Gであり、能性子オチンアキンら導される基である、 9に記載の。

1 TGaseの

1０

である、 1０に記載の。

面の単な説明

FTCsAcpQGに対する TGの応性。 SDSPAGEのイメによる観察。

2 FTC AaQGに対する TGの応性。 SD PAGEのイメジによる観察。

3 FcQGに対する TGの応性。 SDSPAGEのイメジによる観察 )。

4 TR０ AaQGに対する TGの応性。 D PAGEのイメジによる観察。

5 D s 8Acp Gに対する TGの応性。 SD PAGEのイメジによる観察 )。

6 TG よる、飾の 6APの対性。

7 TG よる 6AP のFTC ０ AaQGの応時変化。

8 TGによる 6AP のFTC p Aa Gの応の度変化。

9 TGaseによる０のの。 SDSPAGEの

イメジによる観察。

1０ TGによる体のFTCsAcpQGの応性。 SDSPAGE

イメジによる観察。

11 TGによる体のFTC p AaQGの応性。 S SPAGEの

イメジによる観察。

12 TGによる体のTR p AaQGの応性。 SDSPAGEの

イメジによる観察。

13 TGによる体のD ssAcpQGの応性。 SDSPAGEの

イメジによる観察。

H 4 E SAによるの FTCsAcp G FTC AaQG 15 APによる度の。

16 イメジによるE SAの。

D p AaQGBo P C 製後 A D OF Sの。

18 SDSPAGE よる確認、トランスイネタによる確認。 19 TGによるD ０ AaQGBo の前後における 6APの。 [ 2０製後 a e化タンク質の吸度測定。

21 アビジトイクロプト d a e化タク質の㎝sy 度測定、。

22 C 製後 A OF Sの。

23 p 件の適化。 SD PAGE 析結果、蛍光析結果。 24 TG 度の適化。 SDSPAGE 析結果、蛍光析結果

25 FTC j AaQGAky eに対する TGの応性。 S SPAGE 析結果。 26 FTC AaQGAky eの前後における 6 の相。

27 クック応によるタンクの。 SDSPAGEの ) メジャによる観察。

28 p 件の適化。 SD PAGE 析結果鎖のド、蛍光析結果。

2g TG 度の適化。 SD PAGE 析結果鎖のンド、蛍光析結果。

3０度の適化。 SD PAGE 析結果鎖のンド) 、蛍光析結果。

31 度の。SD PAGE 析結果A)、蛍光での時変化B 32 アビジ脂のチラ体の定化。 SDSPAGE 析結果 (CBB 、蛍光

明を実施するための

TGaseの新

明によ、下記の造を有する TGaseの新が提供される。

カ TGaseが認識能なグタ O を含む

明でときは、特別な場合を除き、ある波長の、X を吸収し、吸収されたネギをより長波長な放射線として再放射することができる基を。には、フオセインネト FTC、テキサスッドTR ホダン、ダン (D s 5 メチアノタ、 Cy3 Cy5 PECy5) DOXY オキ 44 メチサブジ )、 P OXY オキ 2255テトラメチジン、 TE O オキ 2266テトラメチジ、ウ、ト、アクリジ、クリ、ト、、テトラメチダン、若しは7 トゾ2 キサアゾ B 、又はそれら導される基が含まれる。

明によ体を標識する場合、好ましの、 FTC TR D s ら導される基である。

明におては、蛍光には、ンカを介してTGa eが認識能なG を有するを含む分が結合されてる。

明におてカとときは、特別な場合を除き、蛍光 TGase が認識能なG を含部分とを連結するために用るものであ、熱化学的及び化学的に不性な連結成のための基を。ンカとしてどのよなものを用るは、当業者であれば、その、分子柔軟性、連結ための応のやすさ等の様要因を考慮して択し。

カのとして、 C C ～6ので表される基を挙げることができ、より具体的な例として、アラン Aa又はsアノカプ

sa oc ocacd Acp ら導される基を挙げることができる。

明における TGaseが認識能なG を含むは、できる限小さなであること、また ysにすると自己する可能性があるこを考慮すると、 ys 外のアノである。であることが好まし。 ys 外のアノの、グリ Gy、アランAa)、アラ Phe、アスラギン Asp、グタ G 、イソインne、イシ e 、リ Va) オ e 、ステイ Cys、アスラギンAs )、プ Po、グタンG 、ンTy 、セリン Se)、スオンT )、トプトァンT )、ヒスジン s) はアギ 9のである。数のTGaseによて認識されるとの点からは、TGaseが認識能なG を含む、グタグ QG) として在することが好まし。

また、微生物 TGaseのして、 QG AQG : 2 GQG 番号 3 P AQS 4 FERQ S 5、若しはTEQ SEED 6のアノ列らなる、又は

G GQGGG 7 GFG GGGg3 8 OVGQGGG 9、若しはGG QGGG : 1０のアノ列らなるが知られてる。また、ット TGaseのとして、ゾイグタ

アラ Z F)、ゾイグタグタグリンZ QG又は EA QV のアノ列らなる、 GGGQ GG

12 GGG VGG 13 GGGQRGG 14 O G タ 15 P P PF 16 しはP P，QQF 17のアノらなるが知られてる。 TGaseが認識能なG を含む、用るTGaseの類に応じ、このよな又はら導される基とて在してもよ。

明でに関し、それら導されるとときほ、

の端及び C 端ら、水素原子及び酸基を除ことによりじる基を指す。

えば、カ、 TGaseが認識能なG を含む分の、当業者であれば類似の的で実施されるの法を用て適切に行。

えば、 A 33A型自動合成を用、 w g BocGyPA 脂を出発料して F oc oc法にて合成することができる。 F ocアノ、 F oceAcp Bocアノ酸及びBoc j Aaは、市販のものを用ることができる。より細な条件は、本明細書のを参照することができる。

Rは、水酸基機能性 ( 定の能を有する有機 )とすることができる。能性分子の例は、対象質を標識するための質であ、又は担体に固定化するため、若しほ質に反応サイを提供するための基である。

明におてきほ、それ自体によりしは検出のためのステムの部として検出能な分を有するものを。能な分のしてほ、蛍光これにては後述する、、ト、放射性同位体を含む、 R 影剤、、アカスァタゼ、ペオキシダ、クト、グスオキダ、ビオチ、化学ネセス学反応に光の放出により検出能な、抗体が挙げられる。

明細書でアキンときは、特に示した場合を除き、炭素数2～6のアキを指し、好まし例は末アキ ( 方の端が水素原子と結合してるもの。 ) であり、よ好まし例は、 C アキ (プピ、メチアチ ) である。

対象であるタンク質の機能を維持しするためにほ、機能性、比較的分子であることが好まし場合がある。また、水溶性が高方が、タンク質立体構造に悪影響を与える有機の合を減らす、あるはなすことができるので好まし場合がある。また、分子のささは、細胞の与におても、有利である。

明におてRのまし例は、ビオチより特定するとアノビオチ、アキ、イ、核酸、アジド又はクペタジら導される基である。

明におて、ビオチ、核酸、ポチグ、アジ、アキン、イ又はクペンタジら導されるとときほ、それらの質ら導される基であって、必要に応じ加されたスペサボチオキ PEO。ボチグリ (PEG とも呼ばれる。 )。は～6の数、例え、 2 3を表す。含み、 TGaseが認識能なG を有す部分 C 端に、連結能である、鎖ら水素原子、水酸基除てできるを指す。

体障害を減らすために、 Rが機能性子である場合、適切な長さのスペを有する基であると。なお、本明細書におては、適当な長さのスペサを有するアノビオチンのことを、単にオチ表してるこがあるが、これは前後の脈などから、適切に解釈することができる。このことは適当な長さのスペサを有するアキにても当てはまる。明の特に好まし態様におては、して、ビオチスペサを有するアノビオチを用るこができる。記のアノビオチ ( 品名 EZ ePEO Bo PE CEとして市販されてる。、このまし例である。

化

Rがオチである明の、当業者であれば、F oc 成法の順に従て、合成することができる。より細な合成のための順及び件ほ、明を参照するこができる。 Rがオチである明の、Tgaseを用て、タク結された後、アビジトされた、固定化することができる。

明の特に好まし態様におては、として、クウッケストの中で代表的な反応である sge 化反応のサイトであるアキを用ることができる。クック、実験作が非常に、を生じずに、中でも率で反応が進行することが可能である。なお、クック応に関しては、 P C S e g C Tse g J L o T a g S・ C Y A・ Ad Y・J・ C e C C A gew C e tEd 2００6 5 286429０ T・S Seo Z ・ Rpae J J Jog Che 2００ 68 6０9612 T O daa P Jo k e m ・ Gogo Schoede C・F・W Becke C・ e eye Wadma Chem Comm2００8 7233725等の文献を参照することができる。

明におてほ Rを、クック応のためのサイトとすることができる。クック応の中でもアキンの、無触媒による sge 化反応は、明に適用することのできるもとも好まし例のである。 Rがアキンである明の、当業者であれ、Fmoc 成法の順に従て、市販のえば、 ve sa PEG ovaTag Res を用て、成することができる。よ細な合成のための順及び、明の例を参照することができる。Rがアキである明の、T aSeを用て、タク結された後、アジドされた他の蛋白質とクッ応により、さらに連結することができる。

明によ、トランスグタナゼの新が提供される。このタク質の蛍う薬、抗体のベキットとして、また部位定化を介したプテインアイ抗体アイ成、蛍光う体を利用する分子イメジングタゲティのために有用である。

・の象となるタンク

明の法におてられる、標識の象となるタク質は、 TGaseが認識能な ys墓を有するか、 C 端にTGaseが認識能な ys を含むを付加したタンク質である。

TGaseが認識能な ys基を有するタンク質の例として、 gG 体、カゼを挙げることができる。

TGaseが認識能な ys 含むのとして、 GS 18) 変型Spep deGSG T E凡 DSGS 1

GGST PGGS 2０、グ em a GGG e a GGGGG 21 、 K GS 対象タクンカ位を伸ばした GSGGGSGGGS 22)がある。

TGaseが認識能な ys を含むを付加したタンク質は、タクとして調製能であるとの点からは、遺伝子工学的に能なタク質が如まし。このよ例として、アカリスァタゼ、緑色タク GFP、グタチオ S トラスラゼ GST、ラゼ、ペオキダ、抗体トプ列を含むが挙げられる。

タンク質は、精製のためにそれぞれ C 端にさらに s を付加してもよ。 TGaseの応性の下を回避するためには、を入れたとは異なる端に s agを入れるよにデザイするとよ。このよタンク質の調、当業者であれば類似の的で実施されるの法を用て適切に行るが、例え、 T e 性な ys を含む K GS を端に有するアカリスァタゼ 6 、次の手順を参考にして調製することができる。すなわち、をドする Aを含むクタを入手調製し、 P によりをドするD Aを増幅するが、このときに適当な制限素に認識さサイト )と K G をドするD Aが、 C に適切な制限位と要に応じ stagをドするD Aが導入されるよにプライを設計する。、生成したD Aを制限素で処理し、同じ制限素で処理した発現クタに入することによ、 6AP ベクタを調製する。られた発現ベクタは、適切なえば大腸に導入し、形質主を得て、この換体を、する。物らのを含む、 s ag ゲカラを利用して精製を行、 APを調製する。 APは必要に応じ、適切な段で配列を確認し、また切な手段で製を確認してもよ。

11・トラスグタナゼによる反応

明におては、トラスグタナゼとして、のものを用。在、TGaseとして、乳類ット、ヒト)、無脊椎動物、カト、、植物、類、原生生物 ) 来のものが知られてお、またの合にては、 8 類のアイソが見てる。業者であれ、明に体的に開示された例を基に、それぞれのTGaseの異性考慮して条件定を行、これらのTGaseのずれをも用ることができる。 TGase まし例は、微生物来のもの T 、ット来のもの GTOである。

明の法におて、トランスグタナゼを用る反応は、な条件で、例え、 4 Cで、数時間～日で、実施することができる。らが実施した条件では、 6AP FTC j AaQGとの TGによる反応は、ほぼ3 間で終した。

また、明におては、標識質を含むえば、蛍光の、比較的低ても反応が進行し、検出に足標識を行ことができる。らが実施した条件におては、最終度でははまで落としても反応が進行した。 Ⅳ その果、用有用性

明によ、新規であるFTC AcpQG FTC a G TR AaQG D s sAcp Gが TGのとなることが確認きれた。これらのを用ることによ、タク質を部位することができる。切な部位を標識されたタンク質は、標識しても機能を消失しな。

明によ体を標識することもでき、この合、標識 eaVyCh ) 行われる。体を標識した場合にも、標識に伴失しな。明のよ得られる、 E SA e yme ed osobe ass 、免疫、・サイトメトにおて、有用である。

明にれば、蛍光したタクとが共存する、トラスグタナゼを添加するだけで、容易にベすることができる。 TGaseが認識能なG を含む分として、 TGaseのである

を利用した明の、プのリのC 端を利用して、さらなる機能性の与が可能である。、ビオチ、 A、磁性子など、ある、アキ、イ、クペタジ導体などと結合さることにより、二重 d a e gが可能となる

例えば、 G のリカ、そしてGyのC 端にアノビオチを導入したd a e 、検出度が高、広ダイナックンジで定量ができ、またイメジグの用も可能にする。また、ビオチンアビジ極めて高親和を持ため、ビオチアビジの用を介して、タンク質の機能を保持したままイクプトドット、蛍光子や性微粒子などに固定化することができる。定化により、ックグラウドの減が可能とな検出度が向上し。また、固定化に対する活性を追ことができ、素の性を算出でき、プテイアイを開発する際の問題点となる定量的な議論の展が期待れる。

、 G のカ、そしてGyのC 端にアキを導入した明の、部位な反応サイ共有合的な反応サイトとを有するであ、異種タク質の連結を可能とする。 1

としては、 TGのとして知られてるZQGをデし、高、性であるジオキカボ墓に代わるものとして、 F o esce TexasRed、D㎝sy の3 類を用た。また、リカとしては、 sAcp oc acd、 3 Aa、なしを選択した。

1 FTC sAcpQGの

2

AB 433A型自動合成を用 w㎝g 学工業製を出発料として F oc法にて合成した。FmocGy FmocG T

究所、F oc eAcp 学工業製) びにF o esce 4 sohocy㎝ae 研究所を用た。

られた脂を、 TFⅣ ソプロピラン(9555)で室温・5 理し、脂らり出して、を得た。

られたを P Cカラム ODS)を用、０・1 TFAを含む

C C の系でグラジント出を行製した。を高度に含むを集めして、黄色のFTC A QGを得た 967

アノ C 1 ０C 2 hs G ０ Gy ００ 1 ０3 Acp ００

ES S 7０63 Theo 7０62 mo osoopc

2FTC B AaQGの

3

AB 4０A型自動合成を用、 BocGyPA

Be Tech を出発料として Bo 法にて合成した。BocG Boc Aa 究所、 F o esce 4 sohocy㎝ e 学研究所を用た。られた脂を、無水フッ水素P ゾ 82で5～2C

理し、脂ら出して、を得た。

られたを P Cカラム OD を用、０・1 TFAを含む

OC C の系でグラジト出を行製した。を高度に含むを集めして、黄色のFTC j AaQGを得た 988

アノ 6 1０C 22hs G ０ Oy ) ００ 1 ０7 p Aa ０6

ES S + 6642Theo 6642 mo osoopc

3 TRsAcpQGの

14

Acp G 33A型自動合成を用 w g 学工業製)を出発料として F oc法にて合成した。 F ocOy FmocG Tt 究所びにF oceAcp 工業製を用た。

られた脂を、 TFⅣ ソプピラ 9555で室温・5 理し、脂らり出して、 AcpQG を得た。これを

S Ohod e ０ acdC o de 学研究所反応して、目的とする

TR8Acp G を得た。

られたを P Cカラム O Sを用、０・1 TFAを含む

2 3 の系でグラジト出を行製した。を高度に含むを集めして、赤紫色のTR AcpQGを得た 98

アノ 6 1０C 22 s G ００ Gy ０99 1) ０2 p Aa ０99

ES 8 3 8613 o osoopc)

4 D s sAcp G

15

AB 33A型自動合成を用 w㎝g 学工業製を出発料として F oc法にて合成した。FmocGy FmocG T

究所、 Fmoc eAcp 学工業製、並び㎝sy Cho de 業製を用た。

られた脂を、 TF ソプピラン9555で室温・5 理し、脂ら出して、を得た。

られたを P Cカラム ODS)を用、０・1 TFAを含む

2 3C の系でグラジト出を行製した。を高度に含むして、色の的の ssAcpQGを得た 982 アノ (6 C 1 ０C 22hs G ０ Gy ００ 1 ０9 sAcp ０ 8 の件では、 ssAcpはなり切断されに。

ES S 5493 T eo 5496

5・FcQGの

AB 33A型自動合成を用、 w g 学工業製)を出発料として F oc法にて合成した。F ocGy F ocG T

究所びに5 C boxyf oesce To o ese Chemcas を用た。られた脂を、 TFⅣ ソプピラ 9555で室温・5 理し、脂ら出して、を得た。

られたを P Cカラム ODS)を用、０・ Ac を含む C C の系でグラジト出を行製した。を度に含む

して、 FcQGを得た 992

アノ (6 C、 11０C 22 s G ) ０2 Gy ００ 1 66 ES S W 5612 5 2

2 TGによるタンク質のの

1・

実施では、を含む遺伝子工学的に ys を導入した素が部位に修飾される検討することによて、蛍光、 TGが認識するであることを確認、、入に伴性の響を検討した。またを認、する TGaseの来にる，陛を示すために、モット来のTGaseである GTGに対するの，畦を検討した。

デタクとして、天然では TGのとならなことが知られてるアカリスァタゼ APを選択した。

APは、伝子工学的法により ys を導入することによて TG のとなることが知られてお、本実施では ys側の基として、この 6APを用て、蛍光の，陛を検討した。

2

21・

TGは味の素株よ提供してたものを用た。 6APは既報に準じて調製した。 6APの、本願細書の載のほ、前掲 1を参照することができる。として、実施 1で合成したものを用た。その他の市販のものを用た。

22 TGによる 6AP の

それぞれの、 TG となるを確認するために、 G を含むと遺伝子工学的に ys を導入したAP 6AP が部位に修飾れる検討を行た。

０m T s C p 8 中に、最終度が０・ 9 1 となるよに FTCeAcpQG FTC g AaQG FcQG T g A QG s sAcpQG 6AP TGを加え、それらをよ 4 Cで一晩させることで行た。として TGを加えなものを用意した。

サプに対して、 S S アクアドゲ SDSPAGE を行た。 SDSPAGEで得られたをCoomasseB ㎝ e CBB める前に、蛍光メジによて観察した。 D ssAcpQGに関してはラスネタによて観察した。

23・による 6APの

入に伴性の響を検討した。 P ト㊦ PPをして、実験22で調製したサプの定を行た。 APはp Pのン化反応を P トロノ Pを形成する。 A 8 4、。

p PP 、 p 山の反件下、 27Cで行 p Pに由来する 41０の収を追跡することによて活性定を行た。

24 TGによる 6AP のの応の時変化

FTC g Aa Gを用て検討を行た。 6AP のFTC

AaQG 入の s C p 申に、最終度が０・０・5 g ０・となるよにFTC AaQG 6AP TGを加え、それらをよ。

4 Cにおて0～5 間で行た。 SD PAGEを行たをメジによて解析するこによて行た。

25 TGによる 6AP のの応における

、 FTC 8 AaQGを用て検討を行た。 6AP のFTC

A QGの入の s C p 中に、最終度が～1０００は０・5 gm ０・ 1となるにFTC 8 Aa G 6AP TGを加え、それらをよ 4Cにおて 15 間で行た。サプに対する追跡は 24 同様の順で行た。

26・に対するGTGの応性

TGase ysを有するタンクとしてを用、蛍光との反応を行、 GTGに対するの応性を評価した。

5 EPES aC aC p 4中に最終度が 1m ０5mgm ０2 m となよにFTC j AaQG GTGを加え、 27Cで一晩せることで反応を行た。として、 GTGを加えなもの、 TGによて反応さたものを用意した。よる結合０m リン P ) 中に、最終度が０・5m m 1となるよ、 FTC AaQG jg イ、 TGを加え、 27Cで一晩さることで反応を行た。サプに対する追跡は実験22 同様の順で行た。

3・験結果及び

1・に対する TGの応性

G を含むと遺伝子工学的に ys を導入することによて TGのとなることが知られてる 6APとを反応さ、 SDSPAGEを行得られたの光を観察するこによて追跡を行た。

7

3 FTC AcpQGに対する TGの

にFTC E AcpQGと K6APのサンプにおける SDSPAGEの果 S SPAGE よて得られたをイメジによて確認、した結果を示した。 SDSPAGEのよ、 45 a 6AP、 35k aに TGのドが見られた。こののよ、 TGを加えた㎝eの 45k aにFTC 来の蛍光が観測され、 TGを加えなた a eには光が観測されなた。よて、 FTC E AcpQGが TGによて、 6AP 入され、 TGのとして認識されるこが確認された。

3 2 FTC p AaQGに対する TGの，

2にFTC 8 AaQGと K6APのサプにおける SDSPAGEの S SPAGEによて得られたをイメジによって確認、した結果を示した。 SDSPAGEのよ、 45kDaに 6AP 35k aに TGのドが見られた。こののよ、 TGを加えた eの 45kDaにFTC 来の光が観測され、 TGを加えなたこは光が観測されなかた。よて FTC QGが TG こよて、 6AP 入され、 TGのして識されることが確認、された。

3 3 FcQGに対する TGの， 3にFc Gと 6APのサプにおける SDSPAGEの果と SDSPAGEによて得られたをイメジによて確認、した結果を示し。 S SPAGEのよ、 4 k aに K6AP、 3 kDaに TGのドが見られた。このの果では、 F oesce に由来する光が観察されなかた。

て、 FcQGが TGに認識されなことが確認、された。 FcQGが認識れな原因として、 FTC E Acp Gと FTC AaQGが認、されることら、 TGの G を認識する際立体障害だと考えられる。よて、 G面の端カの入の用性が確認れた。

3 4 TR AaQG する TGの， 4にTR B A G 6APのサプにおける S SPAGEの果と S SPAGEによて得られたをイメジによて確認した結果を示した。 S S PAGEのより、 4 k aに 6AP、 3 Daに TGのドが見られた。こののより、 TGを加えた㎝eの 4 k aにTexasRed 来の光が観測され、 TGを加えなた㎝eには光が観測されなかた。よて、 TR AaQGが G よて、 6AP 入され、 TGのして認識されることが確認、された。

3 5 D s E AcpQGに対する TGの， 5に s E AcpQG 6APのサプにおける S SPAGEの果と SDSPAGEによて得られたをトランスイネタによて確認、した結果を示した。 SDSPAGEのよ、 45 aに 6AP、 3 TG のドが見られた。こののよ、 TGを加えた eの 4 k aに D㎝sy 来の光が観測され、 TGを加えなかた㎝eには光が観測されな。よて、 D s AcpQGが TGによて、 6AP 入され、 TGのとして認識されることが確認れた。

32・入による 6APの

6に導入による 6APの性の果を示した。よ、 TGを加えたもの、加えなたものに、 APの性にほとんど変化がなかた。よて、修飾による機能失を伴わな 6AP のの入が可能なことが示唆された。

33 TGによる 6AP のの応の時変化

7に TGによる 6AP のFTC Aa Gの応時変化を示す。よ、この件におてほ、ほぼ、 3 間で反応が終することが明らとなた。

34 TGによる 6AP のの応における

8 TGによる 6AP のFTC 8 Aa Gの応度変化を示す。よ、この件におて、最小度ではまで落としても反応が進行し、出できることが確認された。また、最大度では、におて反応が進行した。これ以上の濃度における検討は、蛍光してるD S の溶液中の合が変わてるため実験が行えなた。

35 GTGに対するの応性

に対するモット来のTGaseである GTGの応性討を、TGaseのとして知られてるを用、 TGaseの反応におて、蛍光が反応性を示すか価することによて行た。

は、そのタク質を構成するアノ酸の、 Se のに酸を結合したリタンク質の代表的な例である。この徴のため、カゼは分子体としてイナスの荷を帯びており、ウムイオナトリウムイオ結びきやす性質を持。またはその子構造、リック０トの二次造を有しておらず、 TGaseに認識される G や ysをしてることが知られてる。そのため、 8 はTG㏄eによて自己応が起こる。そこで、 TGase G を持つを加えることで、が自己応を起こしながら、蛍光を取込み、下記のよ結合応がられると考えられる。実験におては、蛍光 FTC p AaQGを用て、実験を行た。

9に反応サンにおける SD PAGEの果と SD PAGEによて得られたをイメジによて確認した結果を示した。 SDSPAGEの、 GTG TGを加えた e もにj が消失してお、架橋したことがわる。こののよ、 GTG TGと、 FTC 8 AaQGを加えた eにおて、 FTC 来の光が観察された。よて、 FTC AaQGがGTG にも認識されることが確認れた。また、 TGによる理を施した㎝e 方が高度を示し、 TGの方が高反応性を示すことが確認れた。これは TG と GTGの異性に起因するものと考えられる。

4・

実施では、新規であるFTC AcpQG FTC j AaQG FcQG TR AaQG D s AcpQGが TGのとなるを確認した。実験では、 TGのとして知られてる 6APとこれらの TGによてされる検討した。よ、 FcQG 外のにおて反応が進行し、 TGのとなることが確認ほれた。行た 6APに対して活性定を行たところ、修飾に素のも見られず、タグのな修飾が達成された。またFc Gがとして認識されなことよ、 G のにおけるリカの用性が示唆れた。

またを認識する TGaeの来による用性を示すために、モモット来のTGaseであるGTGに対するの応性の討を行た。実験では、 TGaseのとして知られてる g を用、 TGaseの反応におて、 FTC 8 AaQGが反応性を示す価することによて行た。 GTG TGともに、 FTC AaQGを加えた eにおて、 FTC 来の光が観察され、 FTC AaQGがGTGにも認識されることが確認されたが、のC アノ列を変えることで、GTGに対する反応性を高めることが可能であるとえられる。

3 TGによる体のの

1・

実施では、組み換えやを行てなそのままの体接、蛍光 TGによて入することを試みた。

9

2・

21・

スイオから入した。 APのであるECFはGE ea hc eBo Sce ceよ購入した。96 イクプトは cよ購入した。

Trap S ac vaed P GE ea hhcaeBoSce ceよ購入した eha o am e はW oよ購入した。その他の試市販のものを用た。

22 TGによる体のの

1０ン p 申に、最終度が０・5mg となるよに FTC Acp G FTC 8 AaQG TR AaQG D AcpQO ウス ysozy e gG2a (mo oco a TGを加えた。として TG を加えなものを用意した。それらをよ 4 Cで一晩させることで反応を行った。

サプに対して、 S PAGEを行た。 SD PAGEで得られたを CBB 染める前に、蛍光イメジによて観察した。 D s Acp Gに関してほトランスイネタによて観察した。

23 E にるの

22 同条件でラビト BSA gG Poyco a FTC E AcpQG FTC AaQGを導入したサプに関して検討を行た。

E SAは以下の順で実験を行たFg 35

B Paeに mのBSA を 15０ we ず加し Cで一晩した。 2 1をPB Tで5 した。

3 飾した B A gG 体を6０ we ず加し室温で5 した。

4 、

3 PBSTで5 洗浄した。

5 イメジによて観測した。

。

6 3g のAP abb gG gG 体を 15０ we ず加し37Cで3

した。

7 6をTB Tで5 、洗浄した。

8 を添加し1０後に応に由来する光をイメジによて観測した。

24・サンプ

まず下に示すアを用意した。

カツプングア０2 3、０・ aC p 83

ッア A０ eha o a e ０ aC p 3

ア B ０ aceae ０ aC P ０

、

ツア０ gyc e C p 3０

化学修飾によ T S ac v e P o se gG gG 体の

製の作の順を下に示す。

Tap S ac vaed Pを m m1を6 した。

2 ちにプングバフア解した mo e gG gG f 1０mgを加え、 25Cにおて2 させた。

3 剰な活性を不性にし、カツプングしなた体を除去するために、ァ A ツァ B ッァ Aの順にを6 ずした。

4 25度におて2 さた。

ツァ B ツファ A ァ B 順に、 1を6 ずした。 6 P Sを1０、カラを平衡さた。

7 TGによ体 FTC Aa Gを導入したサプをアプライした。

8 PBSを０m 、カラを洗浄した。

9 ツァを3m 、抗体を出さた。

1０ツァ A ッァ Bを 1を交互に送、 PBSを０m 、

させた。

3・験結果及び

3 TGによる体のの応性

TGによてG を含む ysを反応させ、SDSPAGEを行、得られたの光を観察することによて追跡を行た。

TGによる体のFTC Acp Gの

1０こFTC E Acp G 体のサプにおける S SPAGEの果と SDSPAGEによて得られたをイメジによって確認、した結果を示した。 gG 4本の鎖がイド合によて結合してる構造をとてお、分子自体は 1 ０ aである。 SDSPAGE を行ており、ジスフィ合がメカプトタノによてしてる。SDSPAGEのよ、L鎖の約2 a 鎖の約5０1 a、そして TGの 38 № にドが見られた。こののより、 TGを加えた eには 5 kDa にFTCに由来する光が見られ、 TGを加えなた eには見られなた。よて、FTC E AcpQGが TGによりされてると考えられる。

3 2 TGによる体のFTC j AaQGの応性

1 にFTC AaQG 体のサンプにおける SD PAGEの果と SPAGEによて得られたをイメジによて確認、した結果を示した。 SDSPAGEのより、鎖の約2 aと鎖の約5 kDa、そして TGの 3 k aにバドが見られた。こののより、 TGを加えた eには 5０ k aにFT 来する光が見られ、 TGを加えなった eには見られなた。よて、 FTC AaQGが TGによりきれてると考えられる。

313・ TGによる体のTR AaQGの応性

12にTR AaQG 体のサプにおける SDSPAGEの果と SDS PAGEによて得られたをイメジによて確認した結果を示した。 SDSPAGEのよ、鎖の約2 a 鎖の約5０ a、そして TGの 38 a ンドが見られた。こののよ、 TGを加えた eには 5０ aにTexasRedに由来する光が見られ、 TGを加えなた a eには見られなた。よて、 TR AaQGが TGによりされてると考えられる。

314・ TGによる体のD s AcpQGの応性

13 s E AaQG 体のサプにおける SDSPAGEの果とSDSPAGEによて得られたをトラスイネタによて確認した結果を示した。S S PAGEのより、鎖の約25k a 鎖の約5０kDa、そして TG の 3 aにドが見られた。こののより、 TGを加えた。には 5０ aにD sy に由来する光が見られ、 TGを加えなた㎝eには見られなた。よて、 D s 8 AcpQGが TGによされてる考えられる。

32 E SAによるの

14にイメジによる一次体の光の果と度の果を示し、 15にイメジによる二次体のA 来する度の果を示した。これらのよ、入を行た体が抗原を維持してるをした。 14よ FTC Acp G FTC AaQGともに TGを加えたwe におて光が観察され、 15よ TGを加えたwe に TGを加えてな we 度のが検出され、抗原が維持されてることを確認した。 4・

でほ、 TGによて体が導入されるか検討した。よ、 TGによる鎖の FTC AcpQG FTC Aa G TR A QG D s E AcpQ叫の部確認された。 E SAによて、の認を行たところ、修飾にの見られなた。

4 の物種来の体に対する反応性

の gG o se Sheep Chcke b に対するの入を試みた。 1

・

スら入した。その他の試市販のものを用た。 2 TGによる体のの

1０m P )中に、最終度が０・ 9㎞となるよに FTC 8 AaQGFTC E AcpQG BSA gG o se Sheep chc b 、 TGを加えた。して TGを加えなものを用意した。それらをよ 4 Cで一晩ることで反応を行た。

3 E SAによるの

E Aは以下の順で実験を行た。

ackPaeに5mg のBSA )を 5 e ず加し37Cで一晩した。 2 をPBSで5 した。

3 飾した B A gG 体を6 e ず加し室温で3 した。

4)3をPBSで5 した。

5 メジによて観測した。

2・験結果及び

2 TGによる体のの応性

16にメジによるE SAの果と度の果を示す。このより、抗体のの入、ならびに導入を行た体が抗原を維持してるを評価した。

よ、 TGを加えたどのwe におて、 TGを加えてな we よ強光が観察された。よて、 TGによる体のの入、体のの持を確認した。

5 TG d a e化の

1・

G のカ、そして yのC 端にアノビオチンを導入したd e化の発を目的とした。、検出度が高、広ダイナックンジで定量化が可能なこと、またイメジグの用も可能にする。また、ビオチンはアビジ極めて高親和 a ０を持ため、バックグラウドの減が可能とな検出度が向上する。これらの識を 1 のに導入することで、固定化に対する活性を追こができ、素の性を算出でき、プテイアイを開発する際の問題点となる定量的な議論の展が期待れる。

回のでは、新規d a abe化であるD s AaQGBo の計、合成を行た。入を行たデタンクとして、端に伝子工学的にジタグを導入することによて TGのとなることが知られてるアカォスァタゼ 6APを選択し、反応性の討を行、入に伴 APの性を評価した。そして入を試みたd a e化タンク質をアビジトイクプトの定化を試みた。究の下に示す。

2０

2

2・1 D s A QGBo D 21

D s Aa Gは、以下に示すF oc 成法の順に従て合成した。

アノ B o Res 脂を用た。スケは０・3 で行た。

成の

０カラを組み立て、その中に０・3 o 分のアノ B osRe を添加した。

2 クメタ DC 5m1で、

3 洗浄した。

3 メチホムアド(D F 5m1で3 した。

4 ０gmmo 6 F ocアノ酸及び０45 BT OB/ F 2 、０ D Ⅳ F 2・を加え、 Vo exを用て、適当な時間でした。

5 F5mで5 した。

この、 aser es によての認を行た。性の合、 4)に戻アノ酸を再長さる。の合、先に進める。

6 DC 5m1で3 した。

7 D F5 1で3 した。

8 2０ ppe d ePPD)D F 5 1を加え、1 Fmocの護を行た。 9 2０ Ppe d ePPD)D F 5 1を加え、15 Fmocの護を行た。 1０ F5m1で3 、洗浄した。

11)4 1０)までを繰返し、アノ酸を伸長させた。

12 長さた樹脂に、０ s

・9 のD y S C 、０・45 T B 2・ m、０・ DEⅣD F 2・ 1を加え、さた。

13 D 5m1で7 、 DC 5mで5 、メタノ 1で5 した。

14 、一晩した。

15 TFA TS、イオ水を95 2 2・5で混合したカクテ 1を添加し、一時、脂らの出しを行た。

16 出しテを添加し出さた後、遠心、デカトを4 繰り返し、一晩した。

17 1０ D s Aa G ０m アノビオチ 1０ BTL OB 2０m EAを Fにし込みさた。

8) られたを P Cで製を行た。

1g A D F Sによて生成の認、を行た。

22 TG よる 6AP の s AaQGBo の

2０m T s C p 8中に、最終度が 1０００・5 ㎞となるよに D s AaQGBo 6AP TGを加えた。として TGを加えなもを用意した。それらをよ、 4 Cで一晩させるこで反応を行た。

23 s AaQGBo に対する TGの応性の

サプに対して、 DS アクアドゲ SDSPAGE を行た。 SDSPAGEで得られたをCoomasseB e CBB 染める前に、トランスイネタによて観察した。

24・による 6APの

P トン ① PPをして、実験12で調製したサプの定を行た。 APはp PPのリ応を、 P トノ Pを形成する。、 28 p PP p 8・０の件下、 27Cで行、 p Pに由来する 41０の収を追跡することによて活性定を行。

25 sTag 製によるd a e タク質の精製及びベの

TAカラを用た ag 製により、過剰のD s AaQGBo ら d a e タク質を分離した。出に用た過剰のゾは、2０m T s C ツァとして、PD ０カラによる製によ除去した。

られたd a e化タク質を吸引ポタにて、d a e 化タク質の28０ 33０の吸度測定することによて、ラの出を試みた。

26 d e化タンク質のイクプトの定化

1 s ag 製後、 2０m T s C p 8に溶解したd a e化タンク (1・5 ) を1００ e となるよにアビジントイクプト c 上に添加し、ビオチンアビジ用で固定化を行た37C 1

2)D㎝y 来の光を観察するために、 2０ T s C p 8を 1００ e となるに添加し、蛍光イメジにより固定化の認を行た。

3 の蛍であるECF 液を T s C p 8で1００倍に希釈したものをプト上に 1００ e となるよに添加し、固定化された反応さた 25oC 5

2) 3 作の前に、イクプトウォッヤを用、 TB T TBS 5 Twee ０ 3００u we で3 行た。

・果と考察

3 D s AaQGBo の

HP Cを用て精製した後の AL T F を行た結果、 886にするど観測された 17。これは、 Dns AaQGBo のナトウム堀の分の 88636に一致する。

32 D s Aa GBo に対する TGの応性の

DSPAG による観察

2０にS SPAGEの果を示した。 4 Daに 6AP、 3 TG のドが見られた。 2の TGを加えた e Cおては、若干分子フトが見られ、 6AP のD spAaQGBo の入が示唆された。

イメジによる観察

18にS S PAGEによて得られたをトラスイネタによてした結果を示した。 2)の TGを加えた eの 4 k aにD sy基に由来する光が見られ、 3の TGを加えなた㎝eにられなかた。よて、 s AaQGBo が 6AP 入されたことを確認、した。

33 TGによるd a e化タク質の活性

TGによるD AaQGBo の入によるタク質に与える影響にて検討するために、前後における 6APの価を行た。果を図19に示した。よ、 TGを加えたもの、加えなたもののAPの性に低とんど変化がなかた。よて、修飾による機能失を伴わな 6AP の

s Aa GBo の入が可能なことが示唆された。

34・ a e化タク質のうの

s ag 製後、 a e化タク質を濃縮、 28０ 33０の度を測定するこによて、ラを算出した。 2０にd e化タンク質の吸度を測定した結果を示す。 6APの 5００００ a 仮定すると、本実験件下で K6APの 28０ 2００００ c 55０。 sy 基の 28０ 246０ c 445０ k cm 。これらのより、ラ 1・1 計算され、 spAaQG o 6APに定量的、高率に導入された。ラベ D sy 墓の数 6APの数) 1・1 1

35 d a e化タンク質のイクプトの定化

s ag 製後のd a e化タク質をアビジトイクプト定化した。 21 に、ラしたD sy 来の度測定果を示し、 21 )に、固定化した 6AP 来の果を示した。 21 ・ ) ともに TGを加えたd a e化タク質におて有意な度差が観察され。 21( の度差は、蛍光位を変えることで改善できる。また、 21 ら、素によるグナ幅によ、大き S a o ose 改善できることが分かる。このことら、ラした㎝sy基の蛍光が発光され、オチアビジの用を介して、タンク質の機能を保持したままイクプ上に固定化されたとえる。

4・

D s AaQGBo の成に成功した。また、 TGによるD s AaQGBo の 6AP の入が確認された。入における 6APの性の見られなた。 №a e化タク質のプトの定化に成功した。

6 FTC AaQGAky eの成とその

1・

実施でほ、多機能性 "FTC Aa GAkⅦe"の成を行 G のンカとしてFTC、そしてGyのC 端にP Gを介し、アキを導入した異種分子の結を目的とした多機能性 FT

Aa GAk e ( を合成た。

化23

実施では、 TGによる agタンク質のFTC p AaQGの件の適化を行た後に、合成したFTC p AaQGA y eが TG こよて認識きれるか価した。また、モデタクとして、 K6AP と SAを用て、 FTC AaQGAk eを導入した 6AP を誘導したBSA クック応にる連結を試みた。究の図を下に示す。

24

2・

2 FTC p AaQGAky eの

FTC g AaQGA y eは、以下に示すF oc 成法の順に従て合成した。 versa PEG ovaTag Res を用た。スケは０・０83 o で行た。

25 成の

1 P ０カラを組み立て、その中に００83 o分の versa PEG ovaTag Res を添加した。

2 メチホムアド F 3m1で3０脂を膨さた。

3 メチホムアド F)3m1で3 した。

4 OB クメタンDC )TFE 1 1 、 S 墓の脱護を行た。

5 DC 3m1で3 した。

6 D F3m1で、洗浄した。

7 ０3mmo 4Pe y ocaC 、０3mmo BT ０6 mo OB を加え、 1 さた。

8 2０ Ppe d e PPD D F 5m1を加え、1 Fmocの護を行た。9 2０ ppe d e PPD F 5 1を加え、 15 F ocの護を行た。 1０ D 3mで5 した。

Gy G 、 Aa FTCの順に伸長さ、切り出したのちに、 P Cで製した。の A OF によて確認、した。

22 TGによる 6AP のFTC AaQGの入における件の

5０ p を5～9までさ、最終度が０・０・ 9 ０・と。なるよにFTC p Aa G 6 P、 TGを加えた。それらをよ 4 C でさるこで反応を行た。サンプに対して、 15 、 6 さたものをサプツァに加えて、 95Cで15 間熱を加えることによて、反応を停止さた。その、S S リアクアドゲ D PAGE を行た。S SPAGEで得られたをCoomasseB B e CBB 、イメジによて観察した。

23 TGによる 6AP のFTC p AaQGの入における TG 度の適化

5０m T s C P 8 申に最終度が０・０・5 g ０・００1～となるよにFTC Aa G K6AP TGを加えた。それ。

らをよ 4 Cでさることで反応を行た。 22 同様の順で反応を停止さ、評価した。 24 TGによる 6AP のFTC A QG Aky eの

5０m T s C p 8 中に、最終度が０・０・5mgm ０となるよに FTC A QGA e、 6AP TGを加えた。として TGを加えなものを用意した。それらをよ 4 Cでさることで反応を行た。

22 同様の順で反応を停止させ、評価した。

25・ 6APの性に与える影響の

P ト PP をとして、実験24で調製したサンプの定を行た。 APは PPの応を、ト

(p PPを形成する ( 。 28 、タ P 、 p ・０の件下、 27㌍で行 Pに由来する 41０収を追跡することによて定を行た。 25

26 sTa 製によるアキタンク質の精製及びの

を用た s ag 製により、過剰の FTC Aa GAky e らアキ APを分離した。出に用た過剰のゾは、 2０

T s C P 8 をツァとして、 PD ０カラによる製により除去した。

られたアキ APを限外過にて、 6APに由来する 28０

Tcに由来する 5００の吸度測定することによて、ラベの出を行た。

97・化学修飾による A の S の

2００m ツァ 83) 中に、最終度が０・5 m m なるよにBSA S を加えた。それらをよ、 4 Cで12 させることで反応を行た。

28・クリツク応によるタンクの結

実験2627で調製したアキ AP ジド BSAのツク応での結を試みた。件の成を下に示す。として、 FTC AaQGA㎏ eを導入してな Pと C S を加えなもを用意した。それらをよ、4 oC で間、静さることで反応を行った。

2

クック

3・果と考察

3 FTC AaQGAky e

22にFTC j AaQG ky eの造、 P Cを用て精製した後の A TOF Sを行た結果を示す。よ、 94632 96934にするどピクが観測れた。これは、 FTC 8 AaQGAky eの (Exac S 94536) に一致した。

32 TG Zよる 6A のFTC Aa Gの入における件の適化 23にp 件を最適化するために、反応 15 6 間後のサンプを S SPAGE 析及びS SPAGEによて得られたの行た結果を示す。 5 後のサプにおては、 p p が速に導入された。この因として、 TGによてFTC AaQGが 6APに導入されることに、二の因が含まれるためであると考えられる。目の要因として、 p 側における FTC 8 Aa Gのオセイのプト FTC p a64) Zよる、性大が考えられる。 TGの異性としてG 高環境が好まれることが知られてお 4 、下が導入率の上にながたと考えられる。目の要因として、 p 近における FTC 1 Aa Gのオセイのプトン化による、アオン性の増大が考えられる。 TGの異性として、 ys o ア ) は TGの電荷を帯びたトてき、アシ間体撃するため、正電荷をびたアノの在によ、反応性が向上することが知られてる

Tag ch s ha a g Tara ook o ose J Bochem 2０００ 28 41 425。この合、オセインのプト化によてオン性が増大し、 agの電荷を帯びたアノ相互用し、反応性が向上したことも示唆される。 p では、 agのチオ性が弱またこと、また TGの

8・9であ APのp 4・5、静電な近接果が弱またためと考えられる。 6 間後のサンプにおては、 p ～8で度の度が観測、応が和してる考えられる。

33 TGによる 6AP のFTC 8 a Gの入における TG 度の化

24に TG 度を最適化するために、反応 15 6 間後のサンプを SDSPAGE 析及び D PAGEによて得られたの行た結果を示す。 TGは水分子もアクセプタとして働き、 G の水分解によりアドされG となる競合応が起こる。そのため、 TG 度が高すぎると、応が起こりやすなる恐れがあり、適切な TG 度を決定する必要がある。よ、０・で十分速に反応が進行することがわた。こおて、のられなた。これは、FTC 8 Aa G agの応性が高ため、水分子より優先的に反応が進行したためだと考えられる。

34 FTC j A GAky eに対する TGの応性の

25に、 5 、 1 間、 6 間後のサプに対して、 S SPAGE 行た結果を示す。 TGを加えなかた a eのAPのドにはFTCに由来する見られなたのに対し、 TGを加えた eのAPのンドには光が見られた。よて、 TGによてFTC Aa GAky eが 6AP 入されたことを確認、した。間もFTC A G 変わらず、速に導入できるこを確認、した。

35 TGによるアキタク質の活性

TGによるFTC AaQGAky eの入によるタク質に与える影響にて検討するために、前後における 6APの価を行た。 26よ、 TG 理を加えたものでAPの性にほんど変化がなたため、機能失を伴わな 6AP のFTC j Aa QOAky eの入が可能なことが示された。

36 クク応によるタンクの

27にアキ BSAのツク応での結を試みたサプに対して、 SDS PAGE 行た結果を示す。 FTC AaQGAky eを導入してな APを用たもの、 C S を加えてなもは、タク質の連見られなかたのに対し、 TG ってFTC AaQGA㎏ eを導入したを用、 C S を加えたものにおてのみ、タク質の連結による高分子化が見られた。これは、 TGによて入したアキジドタンクとがリク応によて連結されたこが示された。

4

FTC 3 Aa GAky eの成に成功した。 FTC 8 Aa GA㎏ eがの活性にほとんど響を与えるこな入されたことを確認した。 FTC

AaQGA y eにようされたタク質は、アジドされたタンク、クリック応によ能なことを確認した。

7 件の適化、抗体のオチ識によるアビジン脂の

1・

実施では、 G の質であるFTC、そしてGyのC 端にオチンを導入したチラ FTC j AaQGBo にて、抗体の件の適化を行、ラの上を目指した。後に、抗体アイ術を目的とした、ビオチによるアビジン脂の定化を行った。化26

究のを下記に示す。

27

2・

2 TGによる体のFTC AaQGの入におけるp 件の適化 5０を5～9 p 5 aceaeb e p 6～7 P osphaeb erp 8 T s C p g bo cacdb まで変化さ、最終度が、０・5m ㎞なるよ ZFTC Aa G、 PSA pos eSpec c ge gG o se 来、 o oco a 、 TGを加えた。それらをよ、 4 Cでさることで反応を行た。 1 間、 6 させたものをサプツァに加えて、 15 95Cで熱することによて、反応を停止さた。その、 SDS リアクアドゲ DSPAGE) を行た。 S SPAGEで得られたを

Coo seB ㎝ e CBB 、イメジによて解析した。

22 TGによる体のFTC Aa Gの入における TG 度の

5０m T s C p 8 申に、最終度が０5mgm、０００1～となるよにFTC Aa G、㎝ PS gG 体、 TGを加えた。それらをよ、4 Cでさるこで反応を行った。 2 同様の順で反応を停止さ、評価した。

23 TGによる体のFTC AaQGの入における度の適化 5０ T s C p 8 中に、最終度が０００1～、０・5 gm となるよにFTC 8 A G、㎝ PSA gG 体、 TGを加えた。それらをよ、4 Cでさることで反応を行った。 2 同様の順で反応を停止さ、評価した。

23 TGによる体のFTC AaQGの入における度の

5０ T s C p 8 中に、最終度が０・００1～、０・5mgm、 m となるよにFTC AaQG、 a PSA gG 体、 TGを加えた。それらをよ、4 Cでさることで反応を行った。 2 同様の順で反応を停止さ、評価した。

24 TGによる体のFTC Aa Gの入における反応度の適化 PBS中に、最終度が、０・ gm 1 1となるよにFTC AaQG ㎝ SA gG o se 来、 o oco 、 TGを加えた。それらをよ、4 C 4０ oCでることで反応を行た。 2 同様の順で、3 間、 6 間、 18 さたものを停止せ、評価した。

25 TGによる体のFTC AaQGBo の

PBS申に、最終度が、０・ g 、 1 となるよにFTC AaQG ㎝ BSA gG o se 来、 o oco a TGを加えた。それらをよ、 4 Cで18 さることで反応を行た。としてFTC g Aa GBo を加えなもの、ビオチを導入してな FTC p Aa G を反応さたものを用意した。サンプを限外 1 k りによて精製を行た。

26・アビジン脂のチラ BSA gG 体の定化

以下に示す順で、アビジン脂のチラ体の定化を行た Fg e4

アビジン ob zedSepaVd P s PERCE 1００を PB B d gb e m で2 した。

2 サンプ０25 m を樹脂 1００ 1 加し、 3０させた。

3 みを回収するために、遠心離によて脂を沈降さ、回収した。

4 P S によて2 した。

5 2Xサプッァ 2０を添加し、9０まで加熱することにより、脂らチラ体を出た。

6 前のサプ、 3で回収した上澄み、 4で出さたものをSDSPAGE によて確認、した。

化28

アビジン脂のチラ㎝ BSA gG 体の定化

3・果と考察

3 TGにる体のFTC Aa Gの入における件の適化 a PSA gG 28に件を最適化するために、反応 1、6 間後のサプをS SPAGE 析及びによて得られたの行た結果を示す。これまでの、抗体のに反応が進行することがわってお、 S pA 、抗体鎖のンドを示してる。よ、 p 近にお率に導入されることを確認した。この体と FTC 8 AaQGの、イドキサメト法によりめた TGの p ・Anddo ・Adach ・ eda A as a o aka R cho Ta aka ook Ag c Bo Chm 1989 53 26132617 致してた。

39 TGに体のFTC 8 AaQGの入における TG 度の

PSA G

99に TG 度を最適化するために、反応 1、 6 間後のサプを S S 析及びSDSPAGEによて得られたの行た結果を示す。 TGは水分子もアクセプタとして働き G の水分解によりアドされG となる競合応が起こる。そのため、 TG 度が高すぎると、応が起りやすなる恐れがあ、適切な TG 度を決定する必要がある。よ、で率に反応が進行することがわた。 ysの応性が低ため、分量の TG 度がなと、率にうが進行しなと考えられる。

TGにる体のFTC B AaQG 入における度の適化 a PSA G

3 に度を最適化するために、反応 1、 6 間後のサンプを

H 析及び n PAG によて得られたの行た結果を示す。この討も、 TG 度の適化様、濃度加に伴てラベ化が進行することがわかた。

q4・新による化の比㎝ PSA gG )

3 ～3の、系中の適化を行た。後に異なるの応性の討を行た。 31に、反応０161224 間後のサプをSDSPAGE 析及びSDSPAG にて得られたの行た結果を示す。このら、 FTC g AaQG のオチの、抗体の応性を損なことほなことが明らとなた 31A 。さらに、反応 24 間における

準での時変を追跡したところ、 FTC 3 QGbo の方が、 FTC AaQG よりもより早反応することが明らかとなた B 。上のことら、新 C 端に新たな機能性を導入することは、 TGラの害にはならなことが明らかとなた

35 アビジ脂のチラ体の㎝ BSA gG )

までのでは、チラ体のアビジとの合、すなわちチラ体のオチ基の導確認できてなた。回、ラ

適化を行、アビジ脂のチラ体の定化を試みた。果を図32に示す。前の結 O㎝e1～3 より、 FTC 9 Aa G FTC AaQGBo もに抗体入されてることが確認れた。て、アビジ脂を添加し、反応、遠心で脂を沈降さ、その澄みを解析した結果㎝e4～6) を示す。 e5のより、 FTC 来の光が観察され、 FTC

Aa Gラ、アビジ結合されず、上澄みとして回収され、㎝e6のよ、蛍光は確認されず、チラベ、アビジ

結合したことが示唆された。後に、アビジ脂をサプッファに分散さ、加熱することによて、アビジチラ体を遊離さたものを解析した結果を㎝e7 9 を示す。㎝egにおて、強 FTC 来の光が観察され、アビジン脂らチラ体が離したためだと考えられる。よて、抗体質であるFTC ガドであるオチ基が導入されてることを確認した。

4・

TGによる FTC A QGの体の件の適化を行た。チ体のアビジ脂の定化に成功した。

Claims

求の

1

カトラスグタナゼTGaseが認識能なクタン G を含む

で表される、 TGaseの。、オセインネト FTC、テキサスッドTR しは D s はそれから導される基であ、

リカが、 (C ) C 位は～6ので表される基であり、

TGaseが認識能なG 含む分が、 XXは ys) 外アノであ、 Rが、水酸基、又はオチ、核酸、ボリチグ、アジ、アキ、イしはシクタジ又はそれら導される基である。

2

TGaseが認識能なG 含む分が、 Gであ、か Rが、水酸基オチしはアキンから導される墓である、請求 1に記載のTG㏄eの 3

下からなる選択されるである、請求 2に記載のTGaseの。化

4

TGaseによ、 TGaseが認識能な ys 有するタク、請求 1～3のずれ 1項に記載されたTGaseのとを連結することによ得られる、蛍光タク。

5

タンク質が、 gG 体である、請求 4に記載のタク。

6

されたタンク質の製法であて

TGaseを用て、 TGaseが認識能な ys 有するタク、請求 1 ～3のずれ 1項に記載されたTGaseのとを連結してされたタク質を得る工程を含む、製造。

7

タンク質が、 gG 体である、請求 6に記載の。

8

TGaseを用て、 TGaseが認識能な ys を有する機能性タク、蛍光カを介してTGaseが認識能なG を含む分を結合たものとを連結して、機能が維持されたままの、蛍光能性タク質を得る工程を、タンク質の蛍。

9

TGaseを用て、 TGaeが認識能な ys 有するタク、

( ンカ TGaseが認識能なG 含む ( 能性で表れるTGaseのとを連結する工程を含む、タンク質の標。 (

、オセイネト FTC、テキサスッドT しは s又はそれら導される墓であ、

カが、 C C は～6ので表される墓であり、

TGaseが認識能なG を含む分が、 XXは、 ys 外のアノである。

1０

TGaseが認識能なを含む分が、 Gであ、か能性子がオチ又はアキンら導される基である、請求 9に記載の。

11

TGaseの、

０

である、請求 1０に記載の。